JPS6118866A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは本発明は、オー
トラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断
片物の塩基配列決定のためのデジタル信号処理における
放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法に関する
ものである。

［発明の背景］ 支持媒体−Ｌにおいて少なくとも一次元的方向に分布し
て分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得
るための方法としてオートラジオグラフィーが既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
付した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分離操作にかけて分離展開を行なう
ことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離展開
列（ただしｌ」には見えない）を形成させ、この分離展
開列のオートラジオグラフを放射線フィルムに可視画像
として取得し、その可視画像から放射性標識物質の位置
情報を得ている。また、得られた放射性標識物質の位置
情報を基にして、その高分子物質の分離、同定、あるい
は高分子物質の分子量、特性の評価などを行なう方法は
既に開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ’（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）の塩基配列の
決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用１７てＤＮＡの塩基
配列を決定するための代表的な方法の一つとして、サン
ガー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−ｃｏｕｌｓｏｎ）法
が知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状分子
からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の鎖状分
子は、各々四種類の塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、
７’アニン（Ｇ）　、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）な
る塩基を有する構成単位から構成され工いること、そし
て、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の
水素結合によって架橋されており、しかも各構成単位間
の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせ
のみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構造
に着目し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、ゲ
ル電気泳動およびオートラジオグラフィーの手段を巧み
に利用して、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンガー・クールノン法において、塩基配列を決定しよ
うとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後、これ
らを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合成す
るためには幾つかの方法があるが、基本的には、−末鎖
の検体ＤＮＡを鋳型（テンブレー１・）とし、上記四種
類の塩基を含むモノヌクレオシドトリフオスフェートの
存在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作用
させることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さの
ＤＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌクレオ
シドｉ・リフオスフェートに放射性標識がイ」与された
ものを用いること、および合成条件に工夫を凝らして四
種の塩基のいずれか一つに対して特異的になるようにす
ることにより、放射性標識が付与された塩基特異的合成
りＮＡ断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体−ヒに分離
展開する（ただし、視覚的には見ることができない）。

従来においては、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フ
ィルム七に可視化してオートラジオグラフを得、得られ
たオートラジオグラフに基づいて鎖状分子の末端から順
にその塩基配列を決定し、このようにして検体ＤＮＡの
すべての塩基の配列を決定している。

なお、」二記に要約したサンガー・クールノン法の特徴
および操作については、たとえば次の文献に記載されて
いる。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法ｊ三浦謹−朗、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人刊）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７４．　ｐｐ、　５４Ｈ−５４ｆｉ７（１９７７
） 一ヒ述のように従来の放射線写真法を利用するオートラ
ジオグラフィーにおいては、放射性標識物質の位置情報
を得るためにこの位置情報を有するオートラジオグラフ
を放射線フ仁ルム」二に可視化することが必須となって
いる。

したがって、研究者は、その可視化されたオートラジオ
グラフを自分自身の目で判断することにより、試料中の
放射性標識物質の分布を測定し、放射性標識が付与され
た特定物質についての位置情報の知見を得ている。すな
わち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与された塩
基特異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物のそれぞれに
ついて分ｇ＆展開位置を視覚的に判断し、それら塩基特
異的ＤＮＡ合成物の分離展開列を相互に比較することに
より決定されている。よって、得られたオートラジオグ
ラフの解析は、通常、人間の視覚を通して行なわれてお
り、そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、そのオートラジオ
グラフを解析して得られる位置情報が研究者によって異
なるなど得られる情報の精度には限界がある。特に、放
射線フィルムードに可視化されたオートラジオグラフが
良好な画質（ｇ鋭度、コントラスト）を有していない場
合には、満足できる情報が得られがたく、またその精度
は低下しがちであるという問題がある。

従来より、求める位置情報の精度を向上させるために、
例えば、その可視化されたオートラジオグラフをスキャ
ニングデンシトメーターなどの測定器具を用いて測定す
る方法も利用されている。

しかしながら、そのような測定器具を単に用いる方法に
おいては精度の向」−に限界がある。

たとえば、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放
射線フィルムとを密着させて行なわれる露光操作時にそ
の重ね合わせにズレが生じる場合があり、この場合には
放射線フィルム」二に可視画像として得られる分離展開
列（例えば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対して平
行でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質の位
置情報を視覚的に判断する際に誤差が生じやすくなり、
その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分離展
開条件によって、得られる分１ｉＩｌＩ展開列が支持媒
体の長さ方向に対して平行でなかったり、歪んだりする
ことが往々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央付
近における分離展開列の移動距離に比べて両端の分離展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分離展開する場合において電圧が支持媒体に抱−に
印加されない場合があり、そのような場合にも分離展開
条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得られ
る分ｇ１１展開列に歪みが生じがちである。

このような分１ｉ１１！展開列の歪みは人為−的に補正
する以外には適当な方法がなく、従って、以上のような
場合において、は、放射性標識物質の位置情報の解析が
特に困難になり、前記のような測定器具を利用しても分
＊展開された放射性標識物質の位置情報、すなわちＤＮ
ＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を充分な精度で得る
ことは困難である。

［発明の要旨コ 本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放射線′フィルムを用いる放射線写真法の
代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
を利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有
するオートラジオグラフ番特に画像化することなく、そ
の位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデジ
タル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質の
分布位置を検出するためのサンプリング点に対して、さ
らに好適な信号処理を行なうことによりＤＮＡもしくは
ＤＮＡ断片物の塩基配列を簡易かつ高精度（こ決定する
ことを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにおけ
る信号処理方法であって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片
物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付与さ
れている、１）少なくともグアニン特異的ＤＮＡ合成物
を含む塩基特異的ＤＮＡ合成物、 ２）少なくともアデニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基
特異的ＤＮＡ合成物、 ３）少なくともチミン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特
異的ＤＮＡ合成物、 ４）少なくともシトシン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基
特異的ＤＮＡ合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
フを蓄積記録したのち、この蓄積性蛍光体シー　トを電
磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放
出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことによ
り得られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフ
に対応するデジタル信号について、 ■）該分ｇＩ展開列のそれぞれについてサンプリング点
を検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
列のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 ｉｉｉ）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
れたサンプリング点に基づき新たに基準サンプリング点
を定める工程、 ｉｉ）上記のｉｉｉ）の工程において新たに定められた
基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定め
られた分離展開列に隣接する分離展開列のサンプリング
点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分離
展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
提供するものである。

本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせる
ことによって試料から放出される放射線エネルギーを蓄
積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄積性蛍光体
シートを可視光線および赤外線などの電磁波（励起光）
で走査することにより、蓄積性蛍光体シートに蓄積され
ている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光）として放出
させ、この蛍光を光電的に読み取って電気信号を得、こ
の電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号として得るこ
とからなる放射線像変換方法を利用するものである。

」二記放射線像変換方法については、たとえば、特開昭
５５−１２１４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルギーの
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
じて輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濤度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

また、本発明において基準列とは、ＤＮＡの四種類の塩
基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよびシト
シンの各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む分離展開
列に相当する列を意味し、検体ＤＮＡの塩基配列の決定
において、その放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮ
Ａ合成物が支持媒体上で分離展開されてなる分離展開列
の内部標準となるものである６ 基準列を得るのに用いる標識化されたＤＮＡは、検体Ｄ
ＮＡを用いて作られたものであってもよいし、また、別
のＤＮＡを用いて作られたものであってもよいが、前者
の方がより好ましい。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−次
元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識物
質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの転写
する操作における位置ズレなどにより、蓄積性蛍光体シ
ート上に蓄積記録されたオートラジオグラフ全体にわた
って歪み、ズレが生じている場合にも、精度高＜ＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定することができ
る。とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、分離展
開列間でその歪みを補正しながら各列の分離展開部位を
同定することが可能であり、従って高精度に、かつ合理
的にその塩基配列を決定することができるものである。

また、上記のようにデジタル画像データ上で合理的に分
離展開列間でのサンプリング点の比較照合を行なうこと
ができることから、放射性標識物質の一つ一つの分離展
開部位を縮小しても高精度に放射性標識物質の分離展開
部位（サンプリング点）を同定することが可能となる。

すなわち、−回のオートラジオグラフィにおいて用いる
放射性標識物質の絶対量を減少させることができる。あ
るいは、分離展開操作における分離展開列の数を支持媒
体の幅を拡張させることなく増加することが可能となり
、−回のオートラジオグラフ測定操作によって従来より
多くの情報を得ることが可能となる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物をテンプレートとして、放射性標識
が付与されたデオキシヌクレオシトトリフォスフェー）
　（ｄＮＴＰ）とＤＮＡ合成酵素とを用いて合成される
各塩基特異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物が、−次
元的方向に分離展開された支持媒体を挙げることができ
る。

本発明において、放射性標識に用いられる放射性元素は
、放射線（α線、β線、γ線、中性子線、Ｘ線など）を
放射するものであれば、どのような核種であってもよく
、その具体例として”Ｐ、１４　Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ，１
２５１などが挙げられる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトクラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価ユーロピウム
賦活弗化臭化バリウム（Ｂ　ａＦＢ　ｒ　：　Ｅ　ｕ２
＋）蛍光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステル
との混合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体
シートは、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフ
タレートなどのシートを用い、このシート上に上記蛍光
体層を設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエチ
レンテレフタレートシートなどを設けたものである。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の蓄積記録操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わせることにより、その支
持媒体」二の放射性標識物質から放出される放射線の少
なくとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施す
る。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートと
が近接した状態で配置されていればよく、たとえば常温
もしくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くことに
より行なうことができる。

なお、サンカー・クールノン法によるオートラジオグラ
フィーにおける試料の調製法、蓄積性蛍光体シニ１およ
び露光操作の詳細については、本出願人による特願昭５
８−２０１２３１号明−細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情
報を読み出してデジタル信号に変換するための方法につ
いて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは読
取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、宴光
体シートと略記することもある）１に蓄積記録されでい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
ための先読み用読出部２と、放射性標識物質の位置情報
を出方するために蛍光体シーｈｌに蓄積記録されている
オートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用読
出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シー｝１から発生する輝尽売先の波長領
域に該当する波長領域の部分がカットされる。次いでレ
ーザー光は、ガル／゛・ノミラー等の光偏向器７により
偏向処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光
体シート】上に一次元的に偏向して入射する。ここで用
いるレーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域が
、蛍光体シート１から発する輝尽売先の主要波長領域と
重複しないように選択される。

蛍光体シートｌは、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光体シー
ト１の全面にわたって偏向レーザー光が照射されるよう
になる。なお、レーザー光源４の出力、レーザー光５の
ビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シート１の
移送速度については、先読み操作のレーザー光５のエネ
ルギーが木読み操作に用いられるエネルギーよりも小さ
くなるように調整される。

蛍光体シート１は、上記のようなレーザー光の照射を受
けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例す
る光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シー
ト１０に入射する。この導光性ジートド０はその入射面
が直線状で、蛍光体シート１トの走査線に対向するよう
に近接して配置ｙれており、その射出面は円環を形成し
、フォトマルなどの光検出器１１の受光面に連絡してい
る。この導光性シート１０は、たとえばアクリル系合成
樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工してつくら
れたもので、入射面より入射した光がその内部において
全反射し−から射出面へ伝達されるように構成されてい
る。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シート
１ｏ内を導かれて射出面に到達し、その射出面から射出
されゼ光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シートｌ
は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーザー光源１４））ら発せられたレーザー光
１５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィ
ルター１６を通過したのちビーム−エクスパングー１７
によりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏
向処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光
体シートｊ上に−・次元的に偏向して入射する。なお、
光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆＯレンズ２
０等が配置され、蛍光体シート１の上を偏向レーザー光
が走査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するよ
うにされている。

蛍光体シート１は、−１−記の偏向レーザー光の照射ド
において、矢印２１の方向に移送される。従って、先読
み操作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたっ
て偏向Ｌ／−ザー光が照射されるようになる。

蛍光体シート１は、−ｈ記のようにしてレーザー光の照
射を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録
されている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光
を発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する
。この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シー
ト１ｏと同様の材質、構造を有しており、本読み用導光
性シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽
発光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光
される。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波
長領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され、
光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされてい
る。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２′５に入力される。Ａ／Ｄ変換器
２５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変
動幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換
される。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体−４二の放射性標識物質の位置情報を読み
出すための方法について、ｈ記においては先読み操作と
本読み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明
において利用することができる読出し操作は、上記の例
に限られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射
性標識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性
蛍光体シートの露光時間が予めわかっていれば、上記の
例において先読み操作を省略することも可能である。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、上記の読出
し操作が完了した後、シートに適当な光を照射または加
熱して残存放射線エネルギーを消去することにより、再
使用することができる。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法としては、上記に例示した以外の任意な方法
を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたＤＮＡの塩基配列
決定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処理
の実施態様を、前記のサンガー・クールノン法を利用し
た場合を例にとり、異なる二種類の検体ＤＮ、Ａについ
て、次の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物の組合わせによ
り形成された泳動列（分離展開列）を用いた場合につい
て説明する。

１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物゛、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 まず、二種類の検体ＤＮＡをテンプレートとして放射性
標識（３２Ｆ）が付与されたモノヌクレオシドトリフオ
スフェートとＤＮＡポリメラーゼとを用いて常法により
塩基特異的に合成することにより、二組の、上記１）〜
４）の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物を得る。

次に、上記四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物からなる二組
を、ゲル支持媒体上で電気泳動により分離展開させてそ
れぞれの分離展開列（泳動列）を得る。ただし、一種類
のＤＮＡについての四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分
離展開列を三群ずつに分け、支持媒体上の二箇所におい
て互いに隣接して配置し、かつ、その隣接した分離展開
列の組が、他の一種類のＤＮＡについての四群の塩基特
異的ＤＮＡ合成物の分離展開列を挟むように配置して分
離展開操作を行なう。

次いで、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持
媒体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わ
せることにより露光操作をおこない、試料のオートラジ
オグラフを蓄積性蛍光体シートに蓄積記録する。上記の
露光操作の詳細については、前記の特願昭５８−２０１
２３１号明細書に記載されている。

第２図は、異なる二種類の検体ＤＮＡについての、放射
性標識の付与された各塩基特異的ＤＮＡ合成物が分離展
開されている、上記四群からなる分離展開列（泳動例）
のオートラジオグラフの例を示す。

すなわち、第２図の第１列から第８列は順に、（１）−
（Ｇ）特異的、Ｄ　Ｎ　Ａ合成物（２）−（Ａ）特異的
ＤＮＡ合成物 （３）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （４）−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （５）−、（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （６）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （７）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （８）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 の各分離展開列を示す。第１．２列と第７．８列および
第３列〜第６列は〃いに異なる検体ＤＮＡについての分
離展開列群である。

蓄積性蛍光体シートに蓄積記録されたオートラジオグラ
フを、第１図に示した読出装置に装填して読み出すこと
により、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は
、蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた
番地（ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル（
２）とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量
に対応している。すなわち、そのデジタル信号は第２図
のオートラジオグラフに対応している。従って、信号処
理回路２６には、上記放射性標識物質の位置情報を有す
るデジタル画像データが入力されることになる。本明細
書において、デジタル画像データとは、放射性標識物質
のオートラジオグラフに対応するデジタル信号の集合体
を意味する。

まず、デジタル画像データ上で、」二記へ列の分＋＊ｉ
開列のそれぞれについて放射性標識物質の分＋１ｊ％開
位置を検出し、それらをサンプリング点とする。サンプ
リング点は、たとえば、次のようにして検出することが
できる。

Ｌ記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展′開方向）を横断するようにデジタル
画像データ上の異なる位置を二回走査することに″よっ
て、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点を検
出しくこの分布点を検出するための走査を予備走査とい
う）、各分離展開列についてそれぞれ二分布点を結んで
八木の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列における
サンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において−Ｈメモリーに記憶される（すなわち、
バッファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発性
メモリーに記憶される）。信号処理において、デジタル
画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタル
信号のみをメモリーから選択的に取り出すことを意味す
る。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域」二の信号のレベルを表わす
関数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得
ることができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえ
ば適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを
行なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ（ｗ
）を得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行な
う。すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）＝１ ｇ　（ｗ）　＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を
施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数
に変換する。サンプリング点は、ｇ（ｗ）−１の領域の
各中点とすることにより検出される。なお、上記の閾値
処理における閾値（α０）は、たとえば、走査領域上の
デジタル信号について、信号のレベルと、その頻度との
関係、すなわちヒストグラムから決定することができる
。

このようにして各列についてサンプリング点５ｋｒｌを
検出することができる。ここで、ｋは正の整数であって
各列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリ
ング点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出す
るための方法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、各列間の比較同定は、具体的には基準列と残りの
分離展開列との間で同じ分離展開物を探し出す作業が含
まれる［例えば、ＣＧ）＋　（Ａ）＋　（Ｔ）＋　（Ｃ
）の列と（Ｇ）の列とを比較する場合には（−Ｇ）＋　
（Ａ）＋　（Ｔ）＋　（Ｃ）の列から（Ｇ）の要素とな
っている分離展開物を探し出す］。しかし、この比較同
定は前記歪みのある場合には、第３図のように各列の等
価な分離展開列の位置が必ずしもＸ座標上で等しくはな
らない。

従来、このような歪みの補正は人間の視覚的な判断にま
かせられていた。しかし、本発明の方法によれば、基準
列および基準サンプリング点を用いることにより、人に
頼ることなく自動的に歪みを補正し、各列間の正確な比
較同定を行なうことができる。このことを第２図および
第３図に基づいて説明する。第２図において、第１列か
ら第８列までの間には前記歪みが存在するが、第３列か
ら第６列までの間という狭い領域に注目すれば、この歪
みの影響は小さい。

そこで、第３列から第６列までのサンプリング点を論理
加算することにより、新たに（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物
、（Ａ）特異的Ｉ）ＮＡ合成物、（Ｔ）特異的ＤＮＡ合
成物、および（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物の四種類の塩基
特異的ＤＮＡ合成物の全てを含むサンプリング点の列、
すなわち基準（内部標準）列を合成する。この基準列の
サンプリング点ｓｏｎを基準サンプリング点とすると、
基準サンプリング点Ｓｏｎは、サンプリング点ｓ３ｎ、
ｓ４ｎ、ｓｓｎおよびＳｅｎから構成される。ただし、
Ｏは基準列を表わす。

たとえば、この合成を演算として表わすと次のようにな
る。すなわち、 （Ｓｏｎｌ　＝　（Ｓ３ｎｌ　Ｕ　（ＳａｎｌＵ　ｆｓ
ｓｎ）、Ｕ　（Ｓｓ　ｎｌ ここで、（）は、サンプリング点の集合を表わし、Ｕは
論理和演算子を表わす。

得られた基準列の基準サンプリング、点ＳＯｎと、基準
列の構成要素である第３列に隣接する第２列のサンプリ
ング点Ｓ２ｎとの比較同定を行なうことにより、第２列
について基準サンプリング点の内挿を行なう。

たとえば、第２列のサンプリング点３２２については、
サンプリング点３２２の位１ｔ（Ｘ；ｚｚ）と、基準列
の゛基準サンプリング点３０３の位置（ＸＯ３）および
ＳＯａの位置（Ｘｏ、ｓ）とを比較する。たとえば、 １ＸＯ３ｘｚ２１＝ａ ｌＸＯ４ｘ２２１＝ｂ とすると、この場合にはａ＞ｂであるから、サンプリン
グ点Ｓ２２は、基準列の基準サンプリング点Ｓ０４と同
じＸ座標をもつものと帰属される。

このようにして順に第２列の全てのサンプリング点を基
準サンプリング点のいずれかに帰属させる。そして、帰
属された第２列のサンプリング点Ｓ２ｎを基にして、残
りの基準列の一基準サンプリング点のそれぞれを第２列
に内挿することにより、第２列において仮想的な基準サ
ンプリング点の集合（３２ｍｌを作成する。ただし、田
は正の整数であり、基準列の基準サンプリング点の番号
ｎに一致する。このようにして、第２列の位置に第３列
から第６列までの合成で求めた基準列（第０列）を移動
させた仮想的基準列を得ることができる。

第３図は、デジタル画像データ上で合成された基準列お
よび第２列の一部分を示す図である。ここで、黒四角は
放射性標識物質の分離展開部位に相当する各列のサンプ
リング点を表わし、中空四角は内挿された基準サンプリ
ング点を表わす。

作成した第２列の基準サンプリング点３２ｍを基に、隣
接する第１列のサンプリング点ｓｔｎについて基準サン
プリング点８２ｍを介して基準サンプリング点Ｓｏｎへ
の帰属を行なう。

このようにして基準列の基準サンプリング点Ｓｏｎに基
づいて、順々に各列において仮想的な基準サンプリング
点の集合（Ｓｘｍ）を作成しながら、全てのサンプリン
グ点ＳＸｎを基準サンプリング点Ｓ。ｎのいずれかに帰
属させる。

次に、第１列、第２列、第７列および第８列について、
それぞれの列における仮想的基準サンプリング点（Ｓｋ
ｍ）とその列における実在のサンプリング点Ｓｋｎとを
比較していき、それが合致したとき、基準列（第０列）
のｎに対応するサンプリング点Ｓｏｎを、合致したサン
プリング点Ｓｋｎで置き換える。そして、基準列をｎの
小さい順にたどれば、たとえば、次のような図式を得る
ことができる。

Ｓ　Ｉ　１　＋　Ｓ２１　＋　３８１　＋　Ｓ　ｌ　２
　、Ｓ７　トＳ７２・Ｓ８２，３重３＋Ｓ２２＋・・・
・・・上記図式において、Ｓ　ｔ　ｎ　＝　Ｇ　、　Ｓ
　２　ｎ＝　Ａ、５７ｎ−Ｔ、５８ｎ＝Ｃと置き換える
ことにより、次のような図式を得る。

Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−（、−Ａ−・・・・・・
このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩
基配列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡ
の塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られ
るものではなく、任意の表示形態が可能である。たとえ
ば、所望により、さらに各列の走査方向−１−における
信号のしくルを任意に演算処理することにより、分離展
開された名ＤＮＡ合成物、の相対量をも表示することが
可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち上記の記
号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わせ
として、Ａ−＋Ｔ、Ｇ−＋Ｃ１Ｃ−Ｇ、Ｔ＋Ａなる情報
を与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮ
Ａの塩基配列を得る。

Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−（、−Ａ−・・・・・・
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−・・・・・・な
お、本発明の信号処理方法により、上記の（Ｇ、Ａ、Ｔ
、Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩基配列決定法は
ＤＮＡの塩基配列決定方法の一例であって、本発明の信
号処理方法は、上記の組合わせに限定されるものではな
く種々の組合わせが可能であり、またその組合わせを利
用して、１−記の方法に準じる方法により同様にして塩
基配列を決定することができる。ただし、いずれの組合
わせにおいても、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩基特異的Ｄ
ＮＡ合成物を含む基準（内部標準）列が得られるような
組合わせであることが必要である。ここで、基準列は必
ずしも四種の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列から
合成する必要はなく、二乃至三種のＤＮＡ合成物混合物
の分離展開列から合成することも可能である。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離：展開している八列の分離展開列を構成する放射
性標識物質群を用いて説明したが、分離展開列は八列に
限定されるものではない。複数の分離展開列から基準列
を合成することができる限り、分子ｉｌ展開列が八列以
下またはそれ以上であっても本発明の信号処理方法を適
用することができる。そして、本発明は分離展開方向の
ズレを基準列を中心として順々に補正しながら同定を行
なう方法であるため、分離展開列の数が多ければ多いほ
ど本発明は有効に利用されるものである。

あるいはまた、一つの支持媒体を用いて同時に二種類具
−［−のＤＮＡの塩基配列を決定することが可能である
。

従って、得られた基準列は、−組のＤＮＡの塩基特異的
ＤＮＡ合成物の組合わせにのみ適用されるものではなく
、上記のような二種類以上のＤＮＡであっても支持媒体
上に分離展開された放射性標識物質群のそれぞれに適用
することができる。

この場合に基準列は、支持媒体上のどの近接した複数列
を用いてでも合成することかり能であるが、より高精度
にＤＮＡの塩基配列を決定するためには、支持媒体−Ｈ
の中央部の複数の分離展開列を用いて基準列を得るのが
好ましい。また、基準列を合成するための分離展開列は
好ましくは互いに隣接しているのがよい。そして、基準
列を構成する分離展開列を中心としてその分離展開列に
隣接する分離展開列を順次同定することができる・Ｌ−
記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩基
配列についての情報は、信号処理回路２６から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気テ
ープなどの保存手段を介し５て記録装置（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学伯情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 ｌ：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、ｌＯ：先読み用導光性シート、ｌ】：光検出器
、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：ビーム
ｓ　、ｒクスパ／ダー、１８：光偏向器、１９二平面反
射鏡、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２二本読
み用導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器、２
５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、検体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物がゲル
支持媒体上で分離展開された試料のオートラジオグラフ
の例を示す図である。 第３図は、基準列および第２列の分離展開列の一部分を
示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）少なくともグアニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基
   特異的ＤＮＡ合成物、 ２）少なくともアデニン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基
   特異的ＤＮＡ合成物、 ３）少なくともチミン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基特
   異的ＤＮＡ合成物、 ４）少なくともシトシン特異的ＤＮＡ合成物を含む塩基
   特異的ＤＮＡ合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
   ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
   展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
   ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
   吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
   放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
   フを蓄積記録したのち、この蓄積性蛍光体シートを電磁
   波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放出
   させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことにより
   得られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフに
   対応するデジタル信号について、 ｉ）該分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を
   検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
   列のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 ｉｉｉ）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
   する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
   リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
   る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
   れたサンプリング点に基づき新たに基準サンプリング点
   を定める工程、 ｉｖ）上記のｉｉｉ）の工程において新たに定められた
   基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定め
   られた分離展開列に隣接する分離展開列のサンプリング
   点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分離
   展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２、基準列の合成に用いられる分離展開列の両隣に、分
   離展開列を配置し、上記ｉｉｉ）の工程を該両隣の分離
   展開列の双方について実施することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理方法。 ３、サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ４、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基特異的ＤＮＡ合
   成物が、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
   ずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号
   処理方法。