JPS6118869A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは本発明は、オー
トラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＩ）ＮＡ
断片物の塩基配列決定のためのデジタル信号処理におけ
る放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法に関す
るものである。

［発明の背景］ 支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分布して
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィーが既に知られ
ている。近年においては、オートラジオグラフィーは、
ＤＮＡ（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）の塩基配列
の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用してＤＮＡの塩基配
列を決定するだめの代表的な方法の一つとして、ザンガ
ー拳り−ルソ７　（、Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）
法が知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状分
子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の鎖状
分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩
基を有する構成単位から構成されていること、そして、
この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水素
結合によって架橋されており、しかも各構成単位間の水
素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせのみ
において実現しているというＤＮＡの特徴的な構造に着
目し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、ゲル電
気泳動およびオートラジオグラフィーの手段を巧みに利
用してＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンカー・クールノン法において、ＩＪｊ、基配列を決
定しようとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後
、これらを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を
合成するためには幾つかの方法があるが、基本的には一
本鎖の検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、上記四
種類の塩基を含むモノヌクレオシドトリフオスフェート
の存在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮ’Ａポリメラーゼ）を
作用させることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長
さのＤＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌク
レオシドトリフオスフェートに放射性標識が付与された
ものを用いること、および合成条件に工夫を凝らして四
種の塩基のいずれか一つに対して特異的になるようにす
ることにより、放射性標識が付与された塩基特異的合成
りＮＡ断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分＃Ｉ
展開する（ただし、視覚的には見ることができない）。

従来においては、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フ
ィルム上に可視化してオートラジオグラフを得、得られ
たオートラジオグラフに基づいて鎖状分子の末端から順
にその塩基配列を決定し、このようにして検体ＤＮＡの
すべての塩基の配列を決定している。

なお、」−記に要約したサンガー・クールラン法の特徴
および操作については、たとえば次の文献に記載されて
いる。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法」三浦謹−朗、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（＠東京化学同人刊）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ’ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ、　７４．　ｐｐ、　５４８３−上記のオー斗ラジ
オグラフィーにおいて、従来の放射線フィルムを用いた
放射線写真法を利用する代りに、人出願人による特願昭
５７−１９３４１８号明細書には、蓄積性蛍光体シート
を用いた放射線像変換方法を利用するオートラジオグラ
フ測定方法が記載されている。

この放射線像変換方法は、試料と蓄積性蛍光体シートと
を重ね合わせることによって試料から放出される放射線
エネルギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、こ
の蓄積性蛍光体シートを可視光線および赤外線から選ば
れる電磁波（励起光）で走査することにより、蓄積性蛍
光体シートに蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（
＃原発光）として放出させ、この蛍光を光電的に読み取
って電気信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデジ
タル信号として得るものである。

また、放射線像変換方法に用いられる蓄積性蛍光体シー
トは、たとえば、二価のユーロピウム賦活アルカリ土類
金属弗化ハロゲン化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含
有するものである。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、
β線、γ線、紫外線などの放射線の照射を受けてそ゛の
放射線エネルギーの一部を蓄積したのち、可視光線およ
び赤外線から選ばれる電磁波（励起光）の照射を受ける
とその蓄積エネルギーに応じて輝尽発光を示す性質を有
している。

上記放射線像変換方法を利用するオートラジオグラフィ
ーは、オートラジオグラフの測定操作を簡略化するもの
であり、また、放射性標識物質の位置情報を有するオー
トラジオグラフを画像化することなく、その位置情報を
デジタル信号として得ることができるものである。

人出願人は、また、放射線像変換方法を利用するオート
ラジオグラフィーにおいて、放射性標識物質の一次元的
な位置情報を記号および／または数値として得るための
デジタル信号処理方法に関する発明について既に出願し
ている（昭和５９年５月４日出願（３）の特願昭５９−
８９６１５号）。

」二記の信号処理方法によれば、従来においては研究者
の視覚的な判断に頼っていた放射性標識物質の位置情報
を、自動的かつ高精度に所望の記号および／または数値
として得ることができるものである。

しかしながら、前記の分離展開列が形成された支持媒体
と蓄積性蛍光体シートとを密着させて行なう露光操作時
にその重ね合わせにズレが生しる場合があり、この場合
には蓄積性蛍光体シート上に潜像として得られる分離展
開列（例えば、泳動列）は蓄積性蛍光体シートの長さ方
向に対して平行でなく、ずれる結果となるため、放射性
標識物質の位置情報に誤差が生じやすくなり、その精度
は低下しがちである。

また、支持媒体としてゲルを用いる場合において、この
ケルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面を
挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変形
などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあり
、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離展
開されるとは限らない。また同様な分＃展開の不均一さ
はゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲル
の組成が不均一であったりした場合においても発生する
。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央０近
における分離展開列の移動距離に比へて両端の分離展開
列間移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマイ
リング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動によ
り分離展開する場合において電圧が支持媒体に均一に印
・加されない場合があり、そのような場合にも分離展開
条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため・得ら゛
れる分ＭＵ開列に歪みが生じがちである。

以１−のような場合においては１分離展開された放射性
標識物質の位置情報、すなわちＤＮＡもしくはＤＮＡ断
片物の塩基配列を充分な精度で得ることが難しくなる。

［発明の要旨］ 本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決
定するだめのオートラジオグラフィーにおいて、その塩
基配列を高精度に決定するための信号処理方法を提供す
ることをそのｌ］的とするものである。

」二足の目的は、グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニ
ン特異的ＤＮＡ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物およ
びシトシン特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む基準列を、
試料の分ｔｌｌＩ展開操作時に設けることによって得、
かつ検知対象の分離展開列をデジタル画像データ上で合
成することによっても仮想的に得て、これらの基準列に
基づいて分離展開列間の補正を行なうことにより達成さ
れる。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにおけ
る信号処理方法であって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片
物と相補的な塩基配列な有し、かつ放射性標識が付与さ
れている、】）グアニン＃異的ＤＮＡ合成物、アデニン
特異的ＤＮＡ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およ
びシトシン特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む基準混合物
を少なくとも一組、２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、
アデニン特異的ＤＮＡ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成
物、およびシトシン特異的ＤＮＡ合成物の全てを全体と
して含むように任意に組合せられた少なくとも二種の塩
基特撰的ＤＮＡ合成物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物
混合物からなる基準列形成用試料を少なくとも一組、お
よび、 ３）少なくとも一種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
塩基特異的ＤＮＡ合成物もしくはＤＮＡ合成物混合物を
少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の一組の基準混合物の分離展開列と上記２）の
一組の基準列形成・用試料の二以上の分離展開列とが、
少なくとも一列の−に記３）の塩基特異的ＤＮＡ合成物
もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を
挟むようにｑいに平行関係を以って一次元的に分離展開
されてなる少なくとも四列の分離展開列を構成する放射
性標識物質群から放出される放射線エネルギ〜を蓄積性
蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄積性蛍
光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を、有する
オートラジオグラフを蓄積記録したのぢ、該蓄積性蛍光
体シートを電磁波で走査して該オー・トラジオグラフを
輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読
み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
出する工程、 ｉｉ）該基準混合物の分離展開列からなる基準列のサン
プリング点、および該基準列形成用試料の二以上の分離
展開列から合成された基準列のサンプリンク点を、それ
ぞれ基準サンプリング点とし、該複数の基準列間で対応
する基準サンプリング点を結んだ直線、折れ線または曲
線からなる複数の連・続線を設定する工程、そして １１１）該連続線により、各分離展開列のサンプリング
点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理力状を
提供するものである。

なお、本発明において基準列とは、ＤＮＡの四挿類の塩
基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよびシト
シンの各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む分離展開
列もしくはその分離展開列に相当する列を意味し、検体
ＤＮＡの塩基配列の決定において、その放射性標識が付
与された塩基特異的ＤＮＡ合成物が支持媒体上で分離展
開されてなる分離展開列の内部標準となるものである。

基準列を得るのに用いる標識化されたＤＮＡは、検体Ｄ
ＮＡを用いて作られたものであっても。

よいし、また、別のＤＮＡを用いて作られたものであっ
てもよいが、前者の方がより好ましい。

また１本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濁度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

［発明の構成］ 本発明によれば、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の１を基
配列を決定するためのオートラジオグラフィーにおける
信号処理方法において、分離展開方向の歪みに対しては
、基準列の基準サンプリング点に基づいてその歪みを測
定し、歪みの補正、を各列について行なったのちに各列
の分離展開方向を同定することにより、露光操作時にお
いて試料と蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせる際に生
じたズレ、あるいは放射性標識物質を支持媒体」二で分
離展開させる際に分離展開方向によって生じた分離展開
列の歪みなど、蓄積性蛍光体シート上に蓄積記録された
オートラジオグラフ全体にわたってズレ、歪みが生じて
いる場合にも、得られたデジタル画像データ上で補正す
ることができ、目的の塩基配列を高精度かつ合理的に決
定することが可能となるものである。

さらに、試料として少なくとも一組の基準混合物を用い
ることにより、内部標準となる基準列の基準サンプリン
グ点を精度高く得ることができる。一方、基準列を基準
列形成用試料の分離展開列からも合成して得ることによ
り、この基準列形成用試料は同時に、検知対象物質でも
あることから、分離展開列の数を不必要に増すことなく
、基準列の基準サンプリング点を得ることができる。

このことは、ＤＮＡの塩基配列決定において内部標準と
なる基準列の精度の向上（すなわち、得られる位置情報
の精度の向上）と、−回のオートラジオグラフィーで得
られる情報量の増加とを同時に達成できることを意味す
るものである。

また、基準列を玉料以上得ようとする場合には、上記の
基準混合物および基準列形成用試料の組をそれぞれ少な
くとも一組以に、任意の組合わせを用いて、基準列を得
ることができるものである。そして、放射性標識物質の
一つ一つの分布部位の面積が小さい場合でも高精度にそ
の分布位置を検出することが可能となることから、−回
のオートラジオグラフィーにおいて用いる放射性標識物
質の絶対量を減少させることができる。あるいは、支持
媒体の幅を拡張させることなく分離展開列の数を増加す
ることができ、−回のオートラジオグラフィー操作によ
って従来より多くの情報を得ることが可能となるもので
ある。

本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物をテンプレートとじて、放射性標識
が付与されたデオキシヌクレオシドトリフオスフェート
（ｄＮＴＰ’）とＤＮＡ合成酵素とを用いて合成される
各塩基特異的ＤＮＡ合成物およびそれらの混合物が、−
次元的方向に分離展開されて分離展開列を形成している
支持媒体を挙げることができる。

本発明において、放射性標識に用いられる放射性元素は
、放射線（α線、β線、γ線、中性γ線、Ｘ線など）を
放射するものであれば、どのよラな核種であってもよく
、その具体例として、３２ｐ、＋４Ｃ，”１５Ｓ、３Ｈ
，１２’Ｉなどが挙げられる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分＃展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価ユーロピウム
賦活弗化臭化バリウム（Ｂ　ａＦＢ　ｒ　：　Ｅ　ｕ２
＋）蛍光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステル
との混合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体
シートは、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフ
タレートなどのシートを用い、このシート」二に上記蛍
光体層を設け、さらに蛍光体層」二に保護膜としてポリ
エチレンテレフタレートシートなどを設けたものである
。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の蓄積記録操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定詩間重ね合わせることにより、その支
持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少な
くとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施する
。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとが
近接した状態で配置されていればよく、たとえば常温も
しくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くことによ
り行なうことができる。

なお、サンガー・クールラン法によるオートラジオグラ
フィーにおける試料の調整法、蓄積性蛍光体シートおよ
び露光操作の詳細については、本出願人による特願昭５
８−２０１２３１号明細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された支持媒体」−の放射性標識物質の一次元的な位置
情報を読み出してデジタル信号に変換するための方法に
ついて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは
読取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）１に蓄積記録されてい
る放射性標識物質の一次元的な位１６情報を仮に読み出
すための先読み用読出部２と、放射性標識物資の位置情
報を出力するために蛍光体シート１に蓄積記録されてい
るオートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用
読出部３から構成される装置 いる。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したｌ／〜ザー光５はフィルタ
ー６を通過することにより、このレーザー光５による励
起に応じて蛍光体シー１−　１から発生する輝尽発光の
波長領域に該当する波長領域の部分がカットされる。次
いでレーザー光は，カルパノミラー等の光偏向器７によ
り偏向処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍
光体シートｌ１二に一次元的に偏向して入射する。ここ
で用いるレーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領
域が、蛍光体シート１から発する輝尽売先の主要波長領
域と重複しないように選択される。

蛍光体シート１は、上記の偏向１／−グー光の照射下に
おいて、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光体シ
ー１・１の全面にわたって偏向レーザー光が照射される
ようになる。なお、レーザー光源４の出力、レーザー光
５のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シート
１の移送速度については、先読み操作のレーザー光５の
エネルギーが本読み操作に用いられるエネルギーよりも
小さくなるように調整される。

か光体シート１は、上記のようなレーザー光の照射を受
けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例す
る光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シー
トｌＯに入射する。この導光性シート１０はその入射面
が直線状で、蛍光体シート１トの走査線に対向するよう
に近接して配置６されており、その射出面は円環を形成
し、フォトマルなどの光検出器１１の受光面に連絡して
いる。この導光性シート１０は、たとえばアクリル系合
成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工してつく
られたもので、入射面より入射した光がその内部におい
て全反射しながら射出面へ伝達されるように構成されて
いる。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シー
トｌｏ内を導かれて射出面に到達し、その射出面から射
出されて光検出器］、ｌに受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以」二のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート
１は本読み用続出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンター１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１゛９により反射されたのち蛍光
体シート１１：に−次元的に偏向して入射する。なお、
光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２
０等が配置され、蛍光体シートｌの上を偏向レーザー光
が走査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するよ
うにされている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体シート１は、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
１ｏと同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光さ
れる。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波長
領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され、光
検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされている
。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換さ
れる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、上記においては先読み操作と本読
み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明にお
いて利用することができる読出し操作は、上記の例に限
られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射性標
識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性蛍光
体シートの露光峙間が予めわかっていれば、上記の例に
おいて先読み操作を省略することも可能である。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、上記の読出
し操作が完了した後、シートに適当な光を照射または加
熱して残存放射線エネルギーを消去することにより、再
使用することができる。

また１本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
だめの方法としては、上記に例示Ｉ７た以外の任意な方
法を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の一次兄的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたＤＮＡの塩基配列
決定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処理
の実施態様を、前記のサンガー・クールノン法を利用し
た場合を例にとり、次の五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物
およびＤＮＡ合成物混合物の組合わせを用いて、異なる
三種類の検体ＤＮＡについて同一支持媒体−１−で電気
泳動させた場合について説明する。

１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物・ ＋チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 まず、三種類の検体ＤＮＡをテンプレートとじて放射性
標識（３２Ｆ）が付与されたモノヌクレオシドトリフオ
スフェートとＤＮＡポリメラーゼとを用いて常法により
、塩基特異的に合成することにより、それぞれ上記１）
〜５）の五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ合
成物混合物からなる三組を得る。ただし、」−記１）の
基準混合物は少なくとも二組について用意されればよい
。

次に一ヒ記五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ
合成物混合物からなる三組のそれぞれを、ゲル支持媒体
上で電気泳動により分＃展開させてそれぞれの分Ｉｌｌ
＆展開列を得る。ただし、少なくとも上記１）の基準混
合物の二分離展開列と、一種類の検体ＤＮＡについての
上記２）〜５）の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物（基準
列形成用試料）の分離展開列とが、残りの二種類の検体
ＤＮＡについての上記２）〜５）の四群の塩基特異的Ｄ
ＮＡ合成物の分離展開列を挟むように配置し７て分離展
開操作を行なう。

次に、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持奴
体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わせ
ることにより露光操作を行ない、分離展開列のオートラ
ジオグラフを蓄積性蛍光体シートに蓄積記録する。

第２図は、三種類の検体ＤＮＡについての、放射性標識
の付与されたＤＮＡの塩基特異的Ｉ）ＮＡ合成物および
ＤＮＡ合成物混合物が分ｐ＃展開されてなる上記五群の
泳動列のオー・トラジオグラフの例を示す。すなわち、
第２図の第１列から第１４列は順に、 （１）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 →−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （２）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （３）−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （４）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （５）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （６）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （７）−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （８）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （９）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （１０）−、（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物（＋、、１）−
（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物（１２）−（Ｔ）特異的ＤＮ
Ａ合成物 （ｔ　３）−、（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物（１４）−（
Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 の各列（泳動列）を示す。第１列〜第５列、第６列〜第
９列、および第１０烈〜第１４列は互い番こ異なる検体
ＤＮＡについての分離展開列群である。また、第１列と
第１４列は基準混合物であり、第６列〜第９列は基準列
形成用試料の組である。

蓄積性蛍光体シートに蓄積記録されたオートラジオグラ
フを第１図に示した読出装置に装填して読み出すことに
より、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は、
蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番
地（ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル（２
）とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に
対応している。すなわち、デジタル信号は第２図のオー
トラジオグラフに対応している。従って、信号処理回路
２６には１．Ｌ記放射性標識物質の位置情報を有するデ
ジタル画像データが入力されることになる。なお、本明
細書において、デジタル画像データとは、放射性標識物
質のオートラジオグラフに対応するデジタル信号の集合
体を意味する。

まず、デジタル画像データ上で、−、Ｌ記１４列の分離
展開列のそれぞれについて放射性標識物質の分離展開位
置を検出し、それらをサンプリング点とする。サンプリ
ング点は、たとえば、次のようにして検出することがで
きる。

−に記デジタル信号に対して、放射性標識物質の−・軟
元的分布方向（分離展開方向）を横断するようにデジタ
ル画像データ上の異なる位置を二回走査することによっ
て、各走査領域−ヒで各列の放射性標識物質の分布点を
検出しくこの分布点を検出するための走査を予備走査と
いう）、各分１ｉ１１Ｊｔｕ開列についてそれぞれ二分
布点を結んで１４木の直線を得、得られた直線をそれぞ
れ各列におけるサンプリング点検出のための走査方向と
する。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において一旦メモリーに記憶される（すなわち、
へンファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不揮発
性メモリーに記憶される）。信号処理において、デジタ
ル画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタ
ル信号のみをメモリ、−から選択的に取り、出すことを
意味する。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位１ξを表わす］を得
ることができる。そしてこの間数ｆ　（ｗ）に、たとえ
ば適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを
行なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ（ｗ
）を得る。次に、この関数ｇ（ｗ）に閾値処理を行なう
。すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ　（ｗ）　＝　１ｇ　（ｗ
）　＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すこと
により、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数に変換す
る。サンプリング点は、ｇ（ｗ）＝１の領域の各中点と
することにより検出される。なお、上記の閾値処理にお
ける閾値（α０）は、たとえば、走査領域上のデジタル
信号について、信号のレベルと、その頻度との関係、す
なわちヒストグラムから決定することができる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｋｎ　（Ｘｋｎ　＋　’ｌｋｎ　、Ｚｋｎ）ｌを検出す
ることができる。ここで、ｋは正の整数であって各列の
番号を表わし、ｎはｊＦの整数であって、サンプリング
点の番号を表わす。すなわち、サンプリング点５ｉｃｎ
は、第に列のｔ５ｎ番目のサンプリング点を意味する。

なお、本発明においてサンプリング点を検出するための
方法は、上述の方法に限られるものではない。

次に、第６列〜第９列のサンプリング点を論理加算する
ことにより、新たに（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物、（Ａ）
特異的ＤＮＡ合成物、（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物および
（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物の四種類の塩基特異的ＤＮＡ
合成物の全てを含むサンプリング点の集合、すなわち基
準サンプリング点の集合（Ｓ　Ｉｓ　ｎ　）を得る。こ
の合成を演算として表わすと次のようになる。

（Ｓ＋５ｎ）　−（Ｓｓｎ）　Ｕ　（Ｓ７ｎ）Ｕ　（Ｓ
ｅｎ）　Ｕ　（Ｓｓｎ） ここで、（）はサンプリング点の集合を表わし、Ｕは論
理和演算子を表わす。この基準列は、第７列と第８列と
の中間に仮想的に存在するように、基準サンプリング点
Ｓ　Ｉｓ　Ｈの座標を新たに設定する。

また、第１列および第１４列は基準混合物の分離展開列
、すなわち基準列であるから、そのサンプリング点は基
準サンプリング点である。このようにして、分ｇｌ展開
して得られた１４列の泳動列の両端および中央部にデジ
タル画像デ〜り上において、玉料の基準列（仮想的な基
準列を含む）を得ることができる。

次に、各基準列において対応する基準サンプリング点、
すなわち、サンプリング点の番号ｎが等しい基準サンプ
リング点を結んで複数の直線（もしくは折れ線）を得る
。まず、分離展開位置の最も遠い（ｎ＝　１の）基準サ
ンプリング点ＳＫＩ、Ｓ　Ｉｓ１およびＳ　１４１を結
んで折れ線を得、さらにｎ＝２　、３．・・・・・・に
ついても同様にして順次直線（もしくは折れ線）を得る
ことにより、各基準列における基準サンプリング点の数
のうち基準サンプリング点の最少数と同数の直線（もし
くは折れ線）を得る。さらに、得られた折れ線を適当な
曲線で近似することもできる。これらの直線、折れ線ま
たは曲線からなる連続線群は、分離展開位置についての
等高線群（Ｌｎｌとみなすことができる。ただし、ｎは
基準サンプリング点の番号ｎに−・致する。

第３図は、−１−記のようにして曲線で近似された等高
線の一部分を示す図である。

この等高線を基に、残りの列のサンプリング点について
比較同定を行なう。例えば、第２列のサンプリング点Ｓ
２１については、サンプリング点Ｓ２１の位置（Ｘ２　
Ｉ＋　ｙｚ　ｔ）が等高線群（Ｌｎｌの中のどの等高線
に最も近いかを判定する。今、それがり、であるとする
と、サンプリング点３２１をり、に帰属させる。このよ
うにして、順に第２列のすべてのサンプリング点Ｓ２ｎ
を等高線群（Ｌｎ）のうちのどれかにに帰属させる。す
なわち第２列のサンプリング点は、基準サンプリング点
の部分集合（Ｓ１ｎ）ｚあるいは等高線の部分集合（Ｌ
ｎ）２で表わされる。

同様の処理を、第３列、第４列および第５列についても
行ない、各列の全てのサンプリング点Ｓｋｎを゛（Ｌｎ
）のいずれかに帰属させる。

」−記の処理によって、ｘ−ｙ座標（Ｘｋ　ｎ　＋”／
ｘｎ）で表わされるサンプリング点Ｓｋｎを等高線Ｌｎ
をもって表わすことができる。この等高線は泳動座標と
もいえるから、この処理は換言すれば、ｘ−ｙ座標から
泳動座標Ｌｎへの座標変換とみなすことができる。

次に、（Ｌｎｌについてｎの小さい順にたどりて、上記
の操作でＬｎに帰属されたＳｋｎを順にならへると、た
とえば、次のような図式を得ることができる。

Ｓ２１．３５貫・Ｓ４１・３２２・Ｓ３１・°°。

上記図式において、５２ｎ＝Ｇ、５３ｎ−Ａ、５ａｎ＝
Ｔ、５５ｎ＝Ｃと置き換えることにより、次のような図
式を得る。

Ｃ，Ｃ−Ｔ−（、Ａ−・・・・・・ このようにして、第２列〜第５列の組において、検体Ｄ
ＮＡと相補的な゛塩基配列を有する、塩基特異的ＤＮＡ
合成物の鎖状分子についての塩基配列を決定することが
できる。

さらに、同様の処理を第１Ｏ列〜第１３列の組に対して
も行なうことにより、検体ＤＮＡと相補的な塩基配列を
有する、それぞれの塩基特異的ＤＮＡ合成物の鎖状分子
についての塩基配列を決定することができる。

なお、得られたＤＮＡの塩基配列についての情報は、上
記の表示形態に限られるものではなく、任意の表示形態
が可能である。たとえば、所望により、さらに各列の走
査方向上における信号のレベルを任怠に演算処理するこ
とにより、分離展開された各ＤＮＡ合成物の相対量をも
表示することが可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩ノ、（に対応する組
合わせとして、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ａなる情
報をＪｊ−えることにより、次のような図式で表わされ
るＤＮＡの塩基配列を〒１１る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−・・・・・・ Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−・・・・・・ なお、本発明の信号処理方法による、上記の（ｃ、Ａ、
Ｔ、Ｃ，Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡ
の塩基配列決定法は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列決定法の一例であり、本発明の信号処理方法は上
記の組合わせに限定されるものではなく種々の組合わせ
が可能であり、その組合わせを利用して上記の方法に準
じる方法により同様にして塩基配列を決定することがで
きる。

ただし、いずれの組合わせにおいても内部標準として、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
基準混合物、および全体として四種類の塩基特異的ＤＮ
Ａ合成物の全てを含むように組合わせられた基準列形成
用試料とを有することが必要である。さらに、一組の基
準列形成用試料の二以上の分離展開列は、近接して配置
されていなければならない。また、この基準列を得るた
めの分離展開列（基準混合物の分離展開列を含む）の組
は、塩基配列決定対象の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離
展開列を挟むように配置されて分離展開を行なうことが
必要である。

この基準混合物および基準列形成用試料の分離展開列の
分離展開位置は、高精度にＤＮＡの塩基配列を決定する
ためには、各組ができる限り離れているのが好ましい。

すなわち、この組が二組からなる場合には、複数の分離
展開列の両端部に配置するのが好ましく、三組からなる
場合には、複数の分離展開列の両端および中央部に配置
するのか好ましいにの組が三組よりも多い場合には、検
知対象の分離展開列の間に適当な間隔をもって配置ｙれ
るのが好ましい。三組以上の設置は、放射性標識物質が
分＃展開された支持媒体にスマイリング効果などが生じ
ている場合にはｉに有効であり、ＤＮＡの塩基配列を高
精度に決定することかできる。設置する基準混合物およ
び基準列形成用試料の分離展開列の組数が増加するほど
得られる等高線は正確なものとなり、従ってＤＮＡの塩
基配列を高精度に決定することが可能となる。

また、基準混合物の分！展開列からなる基準列は、支持
媒体」−に−列として設けられるので、合成される仮想
的な基準列よりも正確なものとなり、等高線の精度を−
ｈげることができる。すなわち、試料に基準列を設けて
おくことにより、より高精度に塩基配列を決定すること
ができる。−また、この基準列形成用試料は基準列を単
に形成するのみならず、Ｊ開時に−・分離展開列として
そのＤＮＡの塩基配列決定に関与するものである。

従って、分離展開列の数が多ければ多いほど、基準列を
多く合成できることになり、よって正確な等高線を得る
ことが可能となる。すなわち、一層高精度に塩基配列を
決定することができるものである。従って、上記の例に
おいては、支持媒体−１−で−次元的方向に分離展開し
ている１４列の放射性標識物質群を用いて説明し虻が、
分＊ｉ開列は１４列に限定されるものではない。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装ｍ（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料」二をレーザー
光等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子
的に表示するもの、Ｃ’　ＲＴ等に表示された記号・数
値をビ′デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用
いて感熱記録材料」二に記録するものなど種々の原理に
基づいた記録装置を用いることができる。

なお、」−記のようにして得られた情報は、このほかに
も、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩
基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なう
ことも可能である。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録された、試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出
すための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもの
である。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４：レーザー光源、５゛レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、１０：先読み用導光性シート、１１．光検出器
、１２：増幅器１、　１３　制御回路、１４：レーザー
光源、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：ビ
ーム・エクスパングー、１８：光偏向器、１９：平面反
射鏡、２０：ｆＯレンズ、２１：移送方向、２２：木読
み用導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器、２
５　：　Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理Ｍ第２図は、検
体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物がゲル支持媒体上で
分離展開された試料のオートラジオグラフの例を示す図
である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリングへを結ぶ
等高線の一部分を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
   特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む基準混合物を少なくと
   も一組、 ２）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
   特異的ＤＮＡ合成物の全てを全体として含むように任意
   に組合せられた少なくとも二種の塩基特異的ＤＮＡ合成
   物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物からなる基準
   列形成用試料を少なくとも一組、および、 ３）少なくとも一種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物を含む
   塩基特異的ＤＮＡ合成物もしくはＤＮＡ合成物混合物を
   少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の一組の基準混合物の分離展開列と上記２）の
   一組の基準列形成用試料の二以上の分離展開列とが、少
   なくとも一列の上記３）の塩基特異的ＤＮＡ合成物もし
   くは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を挟む
   ように互いに平行関係を以って一次元的に分離展開され
   てなる少なくとも四列の分離展開列を構成する放射性標
   識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光
   体シートに吸収させることによって、この蓄積性蛍光体
   シートに該放射性標識物質群の位置情報を有するオート
   ラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シー
   トを電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すこ
   とにより得られるそれぞれの分離展開列のオートラジオ
   グラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
   出する工程、 ｉｉ）該基準混合物の分離展開列からなる基準列のサン
   プリング点、および該基準列形成用試料の二以上の分離
   展開列から合成された基準列のサンプリング点を、それ
   ぞれ基準サンプリング点とし、該複数の基準列間で対応
   する基準サンプリング点を結んだ直線、折れ線または曲
   線からなる複数の連続線を設定する工程、そして ｉｉｉ）該連続線により、各分離展開列のサンプリング
   点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２、上記１）の基準混合物の分離展開列と上記２）の基
   準列形成用試料の二以上の分離展開列とが合わせて少な
   くとも三組配置され、かつ、互いに近接する二組の分離
   展開列が、少なくとも一列の上記３）の塩基特異的ＤＮ
   Ａ合成物もしくはＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を挟
   むように配置されていることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処
   理方法。 ３、サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ４、上記２）の一組の基準列形成用試料が、（１）グア
   ニン特異的ＤＮＡ合成物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 の四種の塩基特異的ＤＮＡ合成物から構成されているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処
   理方法。