JPS59126248A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、オ
ートラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列決定のためのデジタル信号処理に
おける放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法に
関するものである。

支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分Ａｊシ
て分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得
るための方法としてオートラジオグラフィーが既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核醇などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
伺した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動なとの分離操作にかけて分離展開を行なう
ことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離展開
列を形成させ、この分＃展開列のオートラジオグラフを
放射線フィルムに転写し可視化して、その可視画像から
放射性標識物質の位置情報を得ている。また、得られた
放射性標識物質の位置情報を基にして、その高分子物質
の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量、特性の評
価などを行なう方法は既に開発され、実際に利用されて
いる。

４Ｎに１斤年においては、オートラジオグラフィーは、
ＤＮＡ　（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様
）・の塩基配列の決定に右動に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・キル
／＜　−）　（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およ
びサンカー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ）法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡが二本
の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二
本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ
）なる塩基を有する構成単位から構成されていること、
そして、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基
間の水素結合によって架橋されており、しかも各構成単
位間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合
わせのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な
構造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法で
ある。

たとえば、マキサム・ギル／スート法は、次に述−るよ
うな方法により実施される。

ま−ｆ　、　ｊｊ、ｉ基配列を決）」！シようとしてい
るＤＮＡあるいはＤＮＡの分解物の鎖状分子の一方の側
の端部に燐（Ｐ）の成用性同位元素を含む基を結合させ
ることにより、その対象物を放射性標識物質としたのち
、化学的な手段を利用して鎖状分子の各構成単位間の結
合を塩基特異的に切断する。次に、この操作により得ら
れるＤＮＡあるいはＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的
切断分解物の混合物をゲル゛電気泳動法により分離展開
し、多数の塩）ｋ＝　４′Ｆ異的切断分解物がそれぞれ
帯状を形成して分離された分離展開列（ただし、視覚的
には見ることかできない）を４４）る。そして、この部
属展開列をＸ線フィルム上に転写、可視化してオートラ
ジオグラムを得、得られたオートラジオグラムと各／２
の塩基特異的切断手段とから、放射性同位元素が々１合
された鎖状分子の端部から一定の位置関係にある１ｎ基
を順次決定し、このようにして対象物のすべての塩基の
配列を決定している。

ヒ述のように従来の放射線写真法を利用するオートラジ
オグラフィーでは、放射性標識物質の位置情報をイ１１
るためにはこの位置情報を有するオートラジオグラフを
放射線写真フィルム」−二に１１ｆ視化することか必須
要件となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを視覚的に観察することにより、支持媒体」二の放射
性標識物質の分！［１を判断している。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与され
た特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれにつ
いて、分離展開位置を視覚的に判断し、それろ切断分解
物の分離展開列を相互に比較することにより決定されて
いる。

しかしなから、従来のオートラジオクラフィーては、に
述のようにその解析作業は人間の目に依存しているため
、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析して
得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によって相
違する場合か発生するなどの問題があり、得られる情報
の精度には限界がある。特に、放射線フィルム」二に可
視化されたオートラジオグラフが糞好な画質（ｇ鋭度、
コントラスト）を有していない場合には、満足できる情
報かイ１１・られがたく、またその精度は低下するＩＶ
目１弓にある。従来より、求める位置情報の精度を向１
６させるために、たとえは、その可視化されたオートラ
ジオグラフをスキャニングデンシトメーターなどの４１
１１定器具を用いて＋！ｌ１１定する方法も利用されて
いる。しかしながら、そのような測定器具を中に用いる
方法においては精度の向」−に限界がある。

また、前記のオートラジオグラフが形成された支持媒体
と放身１線フィルムとを電着させて行なわれる露光操作
時にその重ね合わせにスレが生じる場合かあり、この場
合には放射線フィルム上に可視画像として得られる分離
展開列（たとえば、泳動列）ハフィルムの長さ方向に対
して平行でなく、すれる結果となるため、放射性標識物
質の位置情報を視覚的に判断する際に誤差が生じやすく
なり、その粘度は低ドしがちである。また、支持媒体や
分離展開条件によって、得られる分離展開列が支持媒体
の長さ方向１こ対して平行でなかったり、歪んだりする
ことか往々にして生じる。

さらに、支持（媒体としてゲルを用いる場合において、
このゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両
面を挟持した状！ルで分離展開を行なうが、その被覆物
の変形などによってゲルに厚さムラが生じたりすること
があり、放射性標識物質は支持媒体」二で必ずしも一様
に分＃展開されるとは限らない。また同様な分離展開の
不均一さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるい
は、ゲルの組成か不均一であったりした場合においても
発生する。このような理由から、たとえば、支持媒体の
中央伺近における分離展開列の移動距離に比へて両端の
分離展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆ
るスマイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気
体動により分離展開する場合において電圧が支持媒体に
均一に印加されない場合があり、そのような場合にも分
離展開条件か支持媒体」二で局部的に異なってくるため
、得られる分離展開列に歪みが生じがちである。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、す
なわちＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配タリを
充分な精度で得ることは困難である。

本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放用線フィルムを用いる放身１線写ｆｔ法
の代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方
法を利用することにより、放射性標識物質の位置情報を
有するオートラジオグラフを特に画像化することなく、
その位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデ
ジタル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質
の分！１ノ位置を検７４３するためのサンプリング点に
対してＳらに好適な信号処理を行なうことによりＤＮＡ
もしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配夕１ｊを簡易かつ高
粘度に決定することを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーに
おける信号処理方法であって、放射性標識が付与された
ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解
により得られた、１）少なくともグアニン特異的切断分
解物を含む塩基特異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物、 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含む塩基特異
的切断分解物、 ４ら少なくともシＩ・シン特異的しＪ断分解物を含む塩
！Ａ特異的切断分解物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的切断分解物のそれぞ
れが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展
開された放射性標識物質群から放出される放射線エネル
ギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、
この蓄積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情
報を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該
蓄積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオ
グラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光
電的に読み出すことにより得られるそれぞれの分子ＡＶ
　９％［’Ｗ列のオートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号について、 ｉ）該分動展開列のそれぞれについてサンプリング点を
検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
列のサンプリング点を基準サンプリング点とするＪ：程
、 １ｉｉ）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
れたサンプリング点に基づき新たに基準サンプリング点
を定める工程、 ｉｔ）上記の１ｉｉ）の工程において新たに定められた
基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定め
られた分離展開列に隣接する分離展開列のサンプリング
点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分離
展開列の２サンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
提供するものであ名。

すなわち、本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重
ね合′わせることによって試料から放出される放射線エ
ネルギーを蓄積性優光体シートに吸収させたのち、この
蓄積性蛍光体シーＩ・を可視光線および赤外線などの電
磁波（励起光）で走査することにより、蓄積性蛍光体シ
ートに蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発
光）として放出させ、この蛍光を光電的に読み取って電
気信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信
号として得ることか″らなる放射線像変換方法を利用す
るものである。

北記放射線像変換方法については、たとえば米国特許＠
３，８５９．’５２７号明細書および特開昭５５−１２
１４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルギーの
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
して輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−次
一元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識
物質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの転
写する操作における位置ズレなどにより、蓄積性蛍光体
シート上に転写蓄積されたオートラジオグラフ全体にわ
たって歪み、ズレが生じている場合にも、精度高＜ＤＮ
ＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定すること
ができる。とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、
分離展開列間でその歪みを補正しなから各列の分離展開
部位を同定することが可能であり、従って高精度に、か
つ合理的にその塩基配列を決定することができるもので
ある。

また、上記のようにデジタル画像データ上で自動的に分
離展開列間でのサンプリング点の比較照合を行なうこと
ができることから、放射性標識物質の一つ一つの分離展
開部位を縮小しても高精度に放射性標識物質の分離展開
部位（サンプリング点）を同定することが可能となる。

すなわち、−回のオートラジオグラフィにおいて用いる
放射性標識物質の絶対量を減少させることができる。あ
るいは、分離展開操作における分離展開列の数を支持媒
体の幅を拡張させることなく増加すること力曾Ｉ目指と
なり、−回のオートラジオグラフ測定操作によって従来
より多くの情報を得ることが可能となる。

本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が旧年されたＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物を塩基
特異的に切断分解することにより得られる各塩特異的切
断分解物もしくはその混合物が、−次元的方向に分離展
開された支持媒体を挙げることができる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ケル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、実用的に好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価のユーロピウ
ム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ２＋）蛍光
体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステルとの混合
物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体シートは
、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフタレート
などのシートを用い、このシート上に」−記蛍光体層を
設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエチレンテ
レフタレートう・−トなどを設けたものである。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性イ）を
光体シートの詳細については、本出願人による特願昭５
７−１９３４’１９号明細書に記載されている・ 本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルキーの蓄積性蛍光体シー１・
への転写蓄積操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍
光体シートとを一定時間重ね合わせることにより、その
支持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少
なくとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実′施
する。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シート
とが１近接した状態で配置されていればよく、たとえば
、常温もしくは低温で少なくとも数秒間どの状態に置く
ことにより行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、本出願人による特願
昭５７−１９３４１８号明細書に記載さ次に、本発明に
おいて、蓄積性蛍光体シートに転写蓄積された支持媒体
上の放射性標識物質の一°次元的な位置情報を読み出し
てデジタル信号に変換゛するための方法にろいて、原料
図面の第１図に示した読出装置（あるいは読取装置）の
例を参照しなから略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）１に蓄積記憶されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
だめの先読み用読出部２と、放射性標識物質の位置情報
を出力するために蛍光体シート１に蓄積記憶されている
オートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用読
出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次・のような先読み操作が
行なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シートｌから発生する輝尽発光の波長領
域に該当する波長領域の部分がカットされる。次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器７により偏向
処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域か、蛍
光体シート１から発する輝尽発光の主要波長領域と重複
しないように選択される。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光のｊｌ（４射
下において、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光
体シー１・１の全面にわたって偏向レーザー光が照射さ
れるようになる。なお、レーザー光７ｇ．４の出力、レ
ーザー光５のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光
体シート１の移送速度については、先読み操作のレーザ
ー光５のエネルギーか本読ガ゛操作に用いも．れるエネ
ルギーよりも小さくなるように調整される。

蛍光体シー］・１は、上記のようなレーザー光のＦ１ａ
用を受けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに
比例する光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光
性シートｌＯに入射する。この導光性シートｌＯはその
入射面が直線状で、蛍光体シート１」二の走査線に対向
するように近接して配置されており、その射出面は円環
を形成し、フォトマルなどの光検出器ｌ１の受光面に連
絡している。この導光性シート１０は、たとえばアクリ
ル系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工し
てつくられたもので、入射面より入射した光かその内部
において全反射しなから用出面へ伝達されるように構成
されている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光
性シート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出面
から射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器ｌ１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し，励起光（レーザー光）の波長領域の光を力
・ン卜するフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出
しうるようにされている。光検出器１１により検出され
た輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器ｌ２に
より増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄
積記録情報は、木読み用読出部３の制御回路１３に入力
される。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じ
て、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値
ａおよび収録スケールファクターｂを出力する。

以」二のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート
１は木読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

木読み用レーザー光源１４がら発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２０等
が配置され、蛍光体シート１の上を偏向レーザー光が走
査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するように
されている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体シート１は、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
１０と同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光さ
れる。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波長
領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され、光
検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされている
。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に人力すれる。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換さ
れる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写ａ積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、」−記においては先読み操作と禾
読み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明に
おいて利用することができる読出し操作は、上記の例に
限られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射性
標識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性蛍
光体シートの露光時間が予めわかっていれば、上記の例
において先読み操作を省略することも可能である。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法としては、」ニー記に例示した以外の任意な
方法を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィーにおける信号処理の実施態°様を、前記のマキザ
ム・ギルバート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法を
例にとり、その塩基配列決定のための典型的な塩基特異
的切断分解物の組合わせとして、次の四種類の塩基特異
的切断分解物を用いた場合について説明する。

１）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アゾ−Ｅン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 ４）シトシン特異的切断分解物 まず、放射性標識（３２Ｆ）が付与されたＤＮＡを常法
により各塩基単位で切断することにより、上記１）〜４
）の四群の塩基特異的切断分解物を得る。

次に上記四群の塩基特異的切断分解物を、ゲル支持奴体
上で電気泳動により分離展開させてそれぞれの分離展開
列（泳動列）を得る。

次いで、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持
媒体）と蓄積性蛍光体シ、−トとを室温で数分間重ね合
わせることにより露光操作を行ない、試料のオートラジ
オグラフを蓄積性蛍光体シートに転写蓄積する。上記の
露光操作の詳細については、前記の特願昭５７−１９３
４１８号明細書に記載されている。　第２図は、放射性
標識の付与されたＤＮＡ切断分解物が分離展開されてい
る分ＭＵ開動のオートラジオグラフを示す。すなわち、
第２図の第１列から第４列は順に、（１）−（Ｇ）特異
的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （２）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （３）−（Ｇ）特異的切断分解物 （４）−（’Ｃ）特異的切断分解物 の各分離展開位置示す。

蓄積性蛍光体シートに転写蓄積されたオートラジオグラ
フを第１図に示した読出装置に装填して読み出すことに
より、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は、
蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番
地（Ｘ、　ｙ　）とその番地における信号のレベル（Ｚ
）とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に
対応している。すなわち、そのデジタル信号は第２図の
オートラジオグラフに対応している。従って、信号処理
回路２６には、上記放射性標識物質の位置情報を有する
デジタル画像データが入力されることになる。本発明に
おいて、デジタル画像データとは、放射性標識物質のオ
ートラジオグラフに対応するデジタル信号の集合体を意
味する。

まず、デジタル画像データ上で、上記凹刻の分離展開列
のそれぞれについて放射性標識物質の分離展開位置を検
出し、それらをサンプリング点とする。サンプリング点
は、たとえば、次のようにして検出することができる。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展開方向）を横断するようにデジタル画
像データ上の異なる位置を二回走査することによって、
各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点を検出し
くこの分布点を検出するための走査を予備走査という）
、各分離展開列についてそれぞれ二分布点を結んで四本
の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけるサン
プリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において一旦メモリーに記憶される（すなわち、
バッファーメモＩＪ−あるいは磁気ディスク等の１１発
性メモリーに記憶される）。信号処理において、デジタ
ル画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタ
ル信号のみをメモリーから選択的に取り出すことを意味
する。

次いで、デジタル画像データ」二を走査方向に沿って走
査することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす
関数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得
ることができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえ
ば適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを
行なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ　（
ｗ）を得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行
なう。すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）＝１ ｇ　（ｗ）　＜α０のとき、ｇ（ｗ）〜０とする処理を
施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数
に変換する。サンプリング点は、ｇ　（ｗ）＝　１の領
域の各中点とすることにより検出される。なお、上記の
閾値処理における閾値（αｔ−は一丈とえば、走査領域
上のデジタル信号について、信号のレベルと、その頻度
との関係、すなわちヒストグラムから決定することがで
きる。

このようにして各列についてサンプリング点Ｓｋｎを検
出することができる。ここで、ｋは正の整数であって各
列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリン
グ点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出する
ための方法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、各列間の比較同定には、具体的には各列の間で同
じ分離展開物を探し出す作業か含まれる［たとえば、（
Ｇ）＋　（Ａ）の列と（Ｇ）の列とを比較する場合には
（Ｇ）＋　（Ａ）の列から（Ｇ）の要素となっている分
離展開物を探し出す］。

しかし、この比較同定は、前記歪みのある場合には、第
３図のように各列の等価な分＃展開列の位置が必ずしも
Ｘ座標上で等しくはならない。従来、このような歪みの
補正は人間の視覚的な判断にまかせられていた。しかし
、本発明の方法によれば、基準列および基準サンプリン
グ点を用いることにより、人に頼ることなく自動的に歪
みを補正し、各列間の正確な比較同定を行なうことがで
きる。このことを第２図および第３図に基づいて説明す
る。第２図において、第１列から第４列までの間には前
記歪みが存在するが、第１列と第２列という狭い領域に
注目すれば、この歪みの影響は小さい。。

そこで、第１列のサンプリング点と第２列のサンプリン
グ点とを論理加算することにより、新たに（Ｇ）特異的
切断分解物、（Ａ）特異的切断分解物、（Ｔ）特異的切
断分解物、および（Ｃ）特異的切断分解物の四種類の切
断分解物の全てを含むサンプリング点の列、すなわち基
ｍ（内部標準）列を合成する。この基準列のサンプリン
グ点Ｓｏｎを基準サンプリング点とすると、基準サンプ
リング点Ｓｏｎは、サンプリング点Ｓｉｎおよびサンプ
リング点Ｓｉｎから構成される。ただし、０は基準列を
表わす。

たとえば、この合成を演算として表わすと次のようにな
る。すなわち、 （Ｓｏｎ）＝　　（Ｓ＋ｎ１Ｕ（Ｓｚｎ）得られた基準
列の基準サンプリング点Ｓｏｎと、基準列の構成要素で
ある第２列に隣接する第３列のサンプリング点Ｓ３ｎと
の比較同定を行なうことにより、第３列について基準サ
ンプリング点の内挿を行なう。

たとえば、第３列のサンプリング点Ｓ３２については、
サンプリング点Ｓ３２の位置（Ｘ３２）と基準列の基準
サンプリング点Ｓ。３の位置（ＸＯ３）およびＳＯ４の
位置（ｘｏ４）とを比較する。たとえば、 １ＸＯ３Ｘ３２１＝ａ ｌＸｏ、ａ　　Ｘ３ｚｌ＝ｂ とすると、この場合にはａ＞ｂであるから、サンプリン
グ点Ｓ３□は、基準列の基準サンプリング点Ｓ０４と同
じＸ座標をもつものと帰属される。

゛このようにして順に第３列の全てのサンプリング点を
基準サンブリイーグ一点のいずれかに帰属させる。そし
て、帰属された第３列のサンプリング点Ｓ３ｎを基にし
て、残りの基準列の基準サンプリング点のそれぞれを第
３列に内挿することにより、第３列において仮想的な基
準サンプリング点の集合（５３ｍ　）を作成する。ただ
し、ｍは正の整数であり、基準列の基準サンプリング点
の番号ｎに一致する。このようにして、第３列の位置に
第０列で求めた基準列を移動させた仮想的基準列を得る
ことができる。

第３図は、デジタル画像データ上で合成された基準列お
よび第３列の一部分を示す図である。ここで、黒四角は
放射性標識物質の分離展開部位に相当する各列のサンプ
リング点を表わし、中空四角は内挿された基準サンプリ
ング点を表わす。

作成した第３列の基準サンプリング点３３ｍを基に、隣
接する第４列のサンプリング点Ｓ４ｎについて基準サン
プリング点５３ｍを介して基準サンプリング点Ｓｏｎへ
の帰属を行なう。

このようにして基準列の基準サンプリング点５ｏｎ４こ
基づいて、順々に各列において仮想的な基準サンプリン
グ点の集合（Ｓｘｍ）を作成しながら、全てのサンプリ
ング点Ｓ　ｋ’　ｎを基準サンプリング点Ｓｏｎのいず
れかに帰属させる。

次いで上記第１列〜第４列の再編成を行なう。−すなわ
ち、第１列と第３列とを用いて、（Ｓ　＋　ｎ）（’Ｉ
　（Ｓ３　ｎ）＝　（Ｓｓｎ）なる演算で表わされる新
たなサンプリング点の集合（Ｓ５ｎ）を有する仮想的な
第５列を得る。得られた第５列は、アデニン（Ａ）のみ
の位置情報を有するものである。同様の減算処理を８２
列と第４列とを用いても行なうことにより、サンプリン
グ点Ｓｅｎを有する仮想的な第６列を得る。この第６列
は、チミン（Ｔ）のみの位置情報を有するものである。

このようにして、新しく次の四列を得る。

（３）−（Ｇ）特異的切断分解物 （４）−（Ｃ）特異的切断分解物 （５）−（Ａ）特異的切断分解物 （６）−（Ｔ）特異的切断分解物 上記の第３列、第４列、第５列および第６列について、
ｍの小さい順にそれぞれの列における仮想的基準サンプ
リング点（Ｓ＋−ｍ）とその列（こおける実在のサンプ
リング点Ｓｋｎとを比較してｌ、％き、それが合致した
とき、基準列（第０列）のｎに対応するサンプリング点
ＳＯｎを合致したサンプリング点Ｓｋｎで置き換える。

そして、基準列をｎの小さい順にたどれば、たとえば、
次のような図式を得ることができる。

−５３１・ＳａＳ　・Ｓ６１．Ｓ３ｚ・Ｓ５１゜Ｓ５□
＋　Ｓ６２　＋　Ｓ３３　＋　Ｓ　４□、・・・・・・
上記図式において、５３ｎ＝Ｇ、５ａｎ＝Ｃ。

５５ｎ＝＝Ａ、５ｓｎ＝Ｔと置き換えることにより、次
のような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基
配列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られる
ものではなく、任意の表示形態が可能である。たとえば
、所望により、さらに各列の走査方向上における信号の
レベルを任意に演算処理することにより、分離展開され
た各し］断分解物の相対量をも表示することが可能であ
る。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ＋Ｔ、Ｇ＋ｃ、Ｃ＋Ｇ、Ｔ−Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ、−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・旧・・Ｃ−
Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−町・・なお、本発明
の信号処理方法により、上記の（Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，
Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩基配列決定法は、
ＤＮＡの塩基配列決定方法の一例であって、本発明の信
号処理方法は、」二足の組合わせに限定されるものはな
く、種々の組合わせが可能であり、またその組合わせを
利用して、」二足の方法に準じる方法により同様にして
塩基配列を決定することができる。ただし、いずれの組
合わせにおいても、その組合わせの全部または一部を用
いてＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩特異的切断分解物からな
る基準（内部標準）列が得られるような組合わせである
ことが必要である。

本発明においては、たとえば（ｃ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組合
わせを利用しても、ＤＮＡの塩基配列を決′　定するこ
とができる。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離展開している四列の分離展開列を構成する放射性
標識物質群を用いて説明したが、分離展開列は四列に限
定されるものではなく、凹欠以上である場合には本発明
の信号処理方法は特に有効なものである。すなわち、本
発明は、分離展開方向のズレを基準列を中心として順々
に補正しながら同定を行なう方法であるため、分離展開
列の数が多ければ多いはと本発明は有効に利用されうる
ものである。あるいはまた、一つの支持媒体を用いて同
時に二種類以上のＤＮＡの塩基配列を決定することも可
能である。

従って、得られた基準列は、上記のような−組のＤＮＡ
の塩基特異的切断分解物の組合わせにのみ適用されるも
のではなく、同一種類のＤＮＡであれば、支持媒体上に
分離展開された放射性標識物質群のそれぞれに適用する
ことができる。この場合、−２，５準列は、支持媒体上
のどの近接した複数列を用いてでも合成することが可能
であるが、より高精度にＤＮＡの塩基配列を決定するた
めには、支持媒体上の中央部の複数の分離展開列を用い
て基準列を得るのが好ましい。また、基準列を合成する
だめの分＃展開列は、好ましくは互いに隣接しているの
がよい。そして、基準列を構成する分離展開列を中心と
してその分離展開列に隣接する分離展開列を順次同定す
ることができる。

」−記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力
されたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁
気テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）
へ伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ芦に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝官話学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 にＭ積積置蛍光体シート２：先読み用読出部、３：本読
み用読出部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６：
フィルター、７：光偏向器、８・平面反射鏡、９：移送
方向、１０・先読み用導光性シート、１１．光検出器、
１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源、
１５・レーザー光、１６：フィルター、１７：ビーム・
エクスパンター、１８：光偏向器、１９：平面反射鏡、
２０：ｆＯレンス、２１：移送方向、２２：本読み用導
光性シート、２３：光検出器、２４：＃増幅器、２５　
：　Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物がゲル支持媒
体上で分＃展開された試料のオートラジオグラフの例を
示す図である。 第３図は、基準列および第３列の分＃展開列の一部分を
示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 手続補正書 昭和５８年１月２５日 特許庁長官　　若杉和夫　殿 １１？３和５８年１月８日提出の特許願（１１）２ｏ発
明の名称 オートラジオグラフィーにおける信号処理方法３゜補正
をする者一 つ１−件との関係　　　　特許出即人 住所　　　　（５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
　　　　　代表者　大　西　　實 ４゜代Ｊ！ｌ！人 手続補正書 昭和！：２年７年月０月７ ７日庁長官　　若杉和夫殿 １、事件の表示 ２・発明の名称　オートラジオグラフィーにおける信号
処理力法３、　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 ４代理人 ６　補正により増加する発明の数　　　　　な　　し別
紙の通り 特許請求の範囲 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
するだめのオートラジオグラフィーにおける信号処理方
法であって、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解により得られた、 ｌ）少なくともグアニン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物、 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含む塩基特異
的切断分解物、 ４）少なくともシトシン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的切断分解物のそれぞ
れが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展
開された放射性標識物質群から放出される放射線エネル
ギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、
この蓄積性蛍光体シートに該放射性標識−物−算群の位
置情報を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち
、該蓄積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラ
ジオグラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光
を光電的に読み出すことにより得られるそれぞれの分離
展開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号に
ついて、 ｉ）該分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を
検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
列のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 １１１）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
れたサンプリング点に基づさ新たに基準サンプリング点
を定める工程、 ｉｖ）上記の１ｉｉ）の工程において新たに定められた
基準サンプ１フング点−と　その墓、進サンプ゛ノング
点が定められた分離展開列に隣接する竹屑［展開列のサ
ンプリング点との比較照合を行なうことにより、その隣
接する分ｇｌｉｌ展開列のサンプリング点を同定する工
程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２゜基準列の合成に用いられる分離展開列の両隣に、分
離展開列を配置し、上記目ｉ）の工程を該両隣の分＃展
開列の双方について実施することを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおける信
号処理方法。 ３゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
。 ４゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断
分解物が、 １）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断性゛解物 ＋シトシン特異的切断分解物 Ａ）シトシン特異的切断分解物 を含Ｑ少なくとも四群の塩基特異的切断分解物であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
れかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処
理方法。 明細書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正致
します。 記 一一烈匡浦Ｌ−補正後 （１）７頁１３行目　　部属展開列　　　　→　公離脹
朋グ細書および （３）２０頁１０行目　　記憶　　　　　　　→　四（
４）２０頁１３行目　　記憶　　　　　　　→　記憶（
５）３４頁８行目　　０列で　　　　　　→　、Ｌ烈者
碧慴ノ課ケ合成ズ（６）３４頁８行目　　基準列　　　
　　　→　基至刀■第麿グΣ（７）３Ｂ頁２行目　　全
ての塩特　　　　→　全二例虫基竹（８）図　　面　　
　第３図の補正図面を添付する。 以　　上 　　　　３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方
   法であって、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤ
   ＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解により−得られた
   、 ■）少なくともグアニン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含む塩基特異
   的切断分解物、 ４）少なくともシトシン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的切断分解物のそれぞ
   れか、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展
   開された放射性標識物質群から放出される放射線エネル
   キーを蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、
   この蓄積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情
   報を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該
   蓄積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオ
   グラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光
   電的に読み出すことにより得られるそれぞれ（７）分１
   展開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号に
   ついて、 ｉ）該分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を
   検出する工程、 １１）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
   列のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 １１１）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
   する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
   リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
   る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
   れたすンプリング点に基づき新たに基僧サンプリング点
   を定める工程、 ｉｖ）　Ｊ、記の１１１）の工程において新たに定めら
   れたノ、Ｂ　ｇ＋−サンプリング点と、その基準サンプ
   リング点が定められた分＃展開列に隣接する分子ｉｔ；
   　ｌｉ開開動サンプリング点との比較照合を行なうこと
   により、その隣接する分＃展開列のサンプリング点を同
   定する工程、 を含むオートラジオグラフィ〜における信号処理力法。 ２゜基準列の合成に用いられる分＃展開列の両隣に、分
   Ｎ１展開列を配置し、上記１ｉｉ）の工程を該両隣の分
   離展開列の双方について実施することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおけ
   る信号処理方法。 ３゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スＪ・−ジ
   ングおよび／または閾値処理を行なうことにより検出５
   れることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第
   ２項記載のオートラジオグラフィー′における信号処理
   方法。 ４゜ＤＮ、ＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切
   断分解物が、 ■）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 十アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 ５）シトシン特異的切断分解物 を含む少なくとも四群の塩基特異的切断分解物であるこ
   とを４．￥徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項の
   いずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信
   号処理方法。