JPS59126250A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、オ
ートラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列の決定のためのデジタル信号処理
における放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法
に関するものである。

支持媒体上において少なくとも一次元的方向に介在して
分！１１列を形成している放射性標識物質の位置情報を
得るだめの方法としてオートラジオグラフィーか既に知
られている。

たとえば、蛋白質、核醇などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
伺した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分子ｓ操作にかけて分離展開を行な
うことにより該支持媒体上に放射性標識物質の分離展開
列を形成させ、次いでこの分離展開列のオートラジオグ
ラフを放射線フィルムに可視画像として取得し、その可
視画像から放射性標識物質の位置情報を得ている。また
、得られた放射性標識物質の位置情報を基にして、その
高分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量
、特性などの評価などを行なう方法は既に開発され、実
際に利用されている。

特に近年においては、オートレジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様）の塩
基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・キル
パート（Ｍａｘａｍ−Ｇ　ｉ　ｌ　ｂｅ　ｒ　ｔ　）法
、および゛サンカ゛−争り−ルンン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃ
ｏｕ　１ｓｏｎ）法が知られている。これらの方法は、
ＤＮＡが二本の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し
、かつその二本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すな
わちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）　、シトンン（Ｃ
）、チミン（Ｔ゛）なる塩基を有する構成単位から構成
されていること、そして、この二本の鎖状分子の間はこ
れら四種類の塩基間の水素結合によって架橋されており
、しかも各構成単位間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−
Ｔの二種類の組合わせのみにおいて実現しているという
ＤＮＡの特徴的な構造を巧妙に利用して、その塩基配列
を決定する方法である。

たとえば、マキサム・キルパート法は、次に述べるよう
な方法により実施される。

ます、）ハ基配列を決定しようとしているＤＮＡあるい
はＤＮＡの分解物の鎖状分子の−・力の側の端部に燐Ｃ
Ｐ）の放射性同位元素を含む基を結合させることにより
、その対象物を放射性標識物質としたのち、化学的な手
段を利用して鎖状分子の各構成１５．位間の結合を塩基
特異的に切断する。次に、この操作により得られるＤＮ
ＡあるいはＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的切断分解
物の混合物をゲル゛屯気泳動法により分離展開し、多数
の塩ノ１（特異的切断分解物がそれぞれ帯状を形成して
骨部された分子４展開列（ただし、視覚的には見ること
ができない）を得る。そして、この分＃展開列をＸ線フ
ィルム−１−に可視化してオートラジオグラフを得、得
られたオートラジオグラフと対象の塩基特異的！、７ノ
断分解物に適用された切断手段とから、放射性同位元素
が結合された鎖状分子の端部から−・定の位置関係にあ
る塩基を順次決定し、このようにして対象物のすべての
塩基の配列を決定している。

ところで、上述のように従来の放射線写真法を利用する
オートラジオグラフィーでは、放射性標識物質の位置情
報を得るためにはこの位１δ情惨を石するオートフンオ
グラフを放射線写真フィルム上に可視化することが必須
要件となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオート”ラジオグ
ラフを視覚的に観察することにより、支持媒体」二の放
射性標識物質の分布を判断している。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与され
た塩基特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれ
について、分離展開位置を視覚的に判断し、それら塩基
特異的切断分解物の分離展開列を相互に比較することに
より決定されている。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィーでは、上
述のようにその解析作業は人間の目に依存しているため
、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析して
得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によって相
違する場合が発生するなどの問題があり、得られる情報
の精度には限界がある。特に、放射線フィルム上に可視
化されたオートラジオグラフが良好な画質（鮮鋭度、コ
ントラスＩ・）を有していない場合には、満足できる情
報が得られがたく、またその精度は低下する傾向にある
。従来より、求める位置情報の精度を向−１ニさせるた
めに、たとえば、その可視化されたオートラジオグラフ
をスキャニングデンシトメーターなどの測定器具を用い
て測定する方法も利用されている。しかしながら、その
ような測定器具を単に用いる方法においては精度の向上
に限界がある。

また、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放射線
フィルムとを密着させて行なう露光操作時にその重ね合
わせにズレが生しる場合があり、この場合には放射線フ
ィルム上に可視画像として得られる分＃展開列（たとえ
ば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対して平行でなく
、ずれる結果となるため、放射性標識物質の位置情報を
視覚的に判断する際に誤差が生じゃすくなり、その精度
は低下しがちである。また、支持媒体や分離展開条件に
よって、得られる分離展開列が支持媒体の長さ方向に対
して平行でなかったり、歪んだりすることがイ上々にし
て生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通んばカラスなどで両面
を挟持した状態で分＃展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルにＪブさムラが生じたりすることが
あり、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分
＃展開されるとは限らない。また回様な分離展開の不均
一さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、
ゲルの組成が不均一であったりした場合においても発生
する。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央
付近における分離展開列の移動距離に比べて両端の分離
展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるス
マイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動
により分離展開する場合において電圧が支持媒体に均一
に印加されない場合があり、そのような場合にも分離展
開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得ら
れる分離展開列に歪みが生じがちである。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分＃、展開された放射性標識物質の位置情報、
すなわちＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を
充分な精度で得ることは困難である。

本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放射線フィルムを用いる放射線写真法の代
りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を
利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有す
るオートラジオグラフを特に画像化することなく、その
位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデジタ
ル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質の分
布位置を示すデータを得たのち、さらに好適な信吟処理
を行なうことによりＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の
塩基配列を簡易かつ高精度に決定することを実現し、本
発明に到達した。

すな、わち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解
物の塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィー
における信号処理方法であって、放射性標識が付与され
たＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分
解により得られた、■）グアニン特異的切断分解物、ア
デニン特異的切断分解物、チミン特異的切断分解物、お
よびシトシン特異的切断分解物の全てを全体として含む
ように任意に組合せられた少なくとも二種の塩基特異的
切断分解物もしくは塩基特異的切断分解物混合物からな
る一組の基準列形成用試料を少なくとも二組、および、 ２）塩基特異的切断分解物もしくは塩基特異的切断物混
合物を少なくとも一種、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準列形成用試料のそれぞれ二以上の
分離展開列が、少なくとも一列の上記２）の切断分解物
もしくは塩基特異的切断物混合物の分離展開列を挟むよ
うに互いに平行関係を以って一次元的に分ｇＩ展開され
てなる少なくとも玉料の分離展開列を構成する放射性標
識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光
体シートに吸収させることによって、この蓄積性蛍光体
シートに該放射性標識物質群の位置情報を有するオート
ラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シー
トを電磁波で走査して該オートラジオグラフを（Ｌ１！
尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み
出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
出する工程１ 、西）各々の基準列形成用試料の各々二以上の分離展開
列から各々の基準列を合成し、各々の基準列について基
準サンプリング点を検出する工程。

１ｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
線を設定する工程、そしてｉｖ）該連続線により、各分
離展開列のサンプリング点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法か
らなるものである。

本発明において、基準列とは、ＤＮＡの四種類のｉＪ！
基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよびシト
シンの各塩基特異的切断分解物の全てを含む分Ｍ！開動
に相嘉する列を意味し、目的とするＤＮＡもしくはＤＮ
Ａ部分分解物の塩基配列の決定において、その放射性標
識が付与された塩基特異的切断分解物が支持媒体上で分
離展開されてなる分離展開列の内部標準となるものであ
る。

すなわち、本発明は、被測定・試料と蓄積性蛍光体シー
トとを重ね合わせることによって被測定試料から放出さ
れる放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させ
たのち、この蓄積性蛍光体シートを可視光線および赤外
線などの電磁波（励起光）で走査することにより、蓄積
性蛍光体シートに蓄積されている放射線エネルギーを蛍
光（輝尽発光）として放出させ、この蛍光を光電的に読
み取って電気信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換して
デジタル信号として得ることからなる放射線像変換方法
を利用するものである。

上記放射線像変換方法については、たとえば米１Ｊ・１
特詐第３．８５９．５２７号明廁書および特開１１／ｌ
　５５　１２１４５　吋公報等に記載されている。

未発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類全屈弗化ハロケン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものであｇ
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルギーの
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
じて輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、」二足の蓄積性蛍光体シートを用いる
放射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を
特に画像化を経由することなく直接に、一定レベルを有
するデジタル信弓−とじて得るものである。

なあ、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を゛中心と
す４る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放
射性物質の集合体の一存在位置と形状、その位置におけ
る放射性物質の浸度、分布などからなる情報の一つもし
くは任意の組合わせとして得られる各種の情報を意味す
る。

本発明によれば、前述のような支持媒体」二における放
射性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−
次元的：方向に分＃展開して分離展開列を形成してい不
放射性標識物質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シ
ートに形成させる操作における位置ズレなどにより、蓄
積性蛍光体シート−ヒに蓄積されたオートラジオグラフ
全体にわたって歪み、ズレが生じている場合にも、高精
度にＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
することができる。

とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、複数の分離
展開列から内部標準となる複数の基準列を合成して得ら
れることにより、デジタル画像データ上においてこの基
準列に基ついてその歪みを４ＩＩＩ足し、得られた歪み
の補正を各列について行なったのちに、各列の分離展開
部位を同定することが可能となる。従って高精度かつ合
理的に目的の１（，４）１（配列を決定することかでき
るものである。

本発明のオートラジオグラフィーにおいて用いられる被
測）ｊｌ試料は、放射性標識が付与されたＤＮＡもしく
はＤＮＡ部分分解物を塩基特異的に切断分解することに
より得られる各塩基特異的切断分解物もしくはそのｑ７
８合物が、−次元的方向に分１２１１ｊ　ＩＡ開された
支持媒体である。

上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分瑚ＩＪｓ開す
るだめの方法としては、たと゛えば、ケル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙なとの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法
が代表的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性゛蛍光体を分散状態で含
有支持する結合剤からなり、たとえば、二ｊ曲のユーロ
ピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ’：Ｅｕ”）
蛍光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステルとの
混合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体シー
トは、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフグレ
ートなどのシートを用い、このシート上に上記蛍光体層
を設け、さら゛（呑蛍光体層上に保護膜とじてポリエチ
レンテレフタレートシートなどを設けたものである。

なお、未発り１に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光
体ンー）・の詳細については、本出願人による特願Ｉ沼
５７−１９３４１９吋明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の転写蓄積操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わせることにより、その支
持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少な
くとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施する
。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとが
近接した状態で配置されていればよく、たとえば、常温
もしくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くことに
より行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、本出願人による特願
昭５７−１９３４１８号明細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シー１−　ｉこ転
写蓄積された支持媒体」二の放射性標識物質の一次元的
な位置情報を読み出してデジタル信号【こ変換するため
の方法について、添付図面の第１図←こ示した読出装置
（あるいは読取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下に′８Ｇ）では、
蛍光体シートと略記することもある）１番こ蓄積記憶さ
れている放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読
み出すための先読み用読出部２と、放射性標識物質の位
置情報を出力するため（こ蛍光体シート１に蓄積記憶さ
れてし）るオートラジオグラフを読み出す機能を有する
本読み用読出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルタ二
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シート１から発生する師，１、壱発光の
波長領域に該当する波長領域の部分がカントされる。次
いでレーザー光は、ガルパ７′ミラー笠の光偏向器７に
より偏向処理され、平面反身４鏡８により反身１された
のち集光体シート１ｊに一次元的に偏向して入射する。

ここで用いるし・−チー光〃：｛４は、そのレーザー光
５の波長領域か、ｉｉ１光休光体）・１から発する輝尽
発光の±要波〜 長領域と．Φ複しないように選択される。

蛍光体シー１・１は、上記の偏向レーザー光の照射下に
おいて、矢印９の方向番こ移送される。従って、ｉｊ１
゜光休シ光体１の全面にわたって偏向レーザー光が照射
されるようになる。なお、レーザー先広（４の出力、レ
ーザー光５のビーム径、レーザーＸ．５の走査速度、蛍
光体シー１−　１の移送速度については、先読み操作の
レーザー光５のエネルギーか本読み操作に用いられるエ
ネルギーよりも小さくなるよう１こ調整される。

タ１ー九体シート１は、上記のようなレーザー光のｊｉ
ｌｔ．射を受けると、蓄積記録されている放射線エネル
ギーに比例する光量の輝尽発光を示し、この光は先読み
用導光性シートｌＯに入用する。この導光性シート１０
はその入射面が直線状で、蛍光体シート１上の走査線に
対向するように近接して配置されており、その射出面は
円環を形成し、フォトマルなどの光検出器１１の受光面
に連絡しそいる。この導光性シート１０は、たとえばア
クリル系合成樹脂なとの透明な熱可塑性樹脂シートを加
工してつくられたもので、入射面より入射した光がその
内部において全反射しながら射出面へ伝達されるように
構成されている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの
導光性シート１０内を導かれて射出面に到達し、その用
出面から射出されて光検化器１１に受光される。

光検出″ｉｌｌの受光面には、輝尽発光の波長領域の光
のみを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光を
カットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出
しうるようにされている。光検出器ｌ１により検出され
た輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２に
より増幅され出力ざれる。増幅器ｌ２から出力された蓄
積記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力
される。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じ
て、適正レベルの信号が得られるように、増幅−Ｖ設定
値ａおよび収録スケールファクターｂを出力する。

以」−のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート
１は木読み用読出部３へ移送される。

本読み用１涜出部３においては次のような本読み操作が
行なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガル／ζノミチー等の光偏向器１８により偏
向処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光
体シート１」−に−次元的に偏向して入射する。なお、
光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２
０等が配置され、蛍光体シートｌの上を偏向レーザー光
が走査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するよ
うにされている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体シート１は、上記のようにしてレーザー光の照射
金量けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
１０と同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝尽発
光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光さ
れる。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波長
領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され、光
検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされている
。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信−）に
変換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定され
た増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅され
たのち、Ａ／Ｄ変換器２５に人力される。Ａ／Ｄ変換器
２５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変
動幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換
される。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、−（−記においては先読み操作と
本読み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明
において利用することかできる読出し操作は、上記の例
に限られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射
性標識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性
蛍光体ソートの露光時間が予めわかっていれば、上記の
例しこおいて先読み操作を省略することも可能である。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転＋＋７．
蓄積された支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読
み出すための方法は、上記に例示した方法に限られるも
のではない。

このようシｑして得られた放射性標識物質のオートラジ
オグラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示
される信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２
６では、放射様標識物質の一次元的位置情報を記号およ
び／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基
配列の決定か行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィ〜における信号処理の実施態様を、前記のマキサム
・ギルバート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法を例
にとり、その塩基配列決定のための典型的な塩基特異的
切断分解物の組合わせとして次の四群の塩基特異的切断
分解物の組合わせを用いて、異なる三種類のＤＮＡにつ
いて同−支持媒体上で電気泳動させた場合について説明
する。

１）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ２）チミン特異的切断分解物 トシトシン特異的切断分解物、 ３）グアニン特異的切断分解物、 ４）シトシン特異的切断分解物、 まず、放射性標識（３２Ｐ）が付４された三種類のＤＮ
Ａのそれぞれを常法により各塩基単位で切断することに
より、それぞれ上記１）−４）の四群の塩基特異的切断
分解物からなる三組を得る。

次に」二足四群の塩基特異的切断分解物三組のそれぞれ
を、ゲル支持媒体上で電気泳動により分離展開させてそ
れぞれの分離展開列を得る。ただし、少なくとも上記１
）および２）の二群の塩基特異的切断分解物の分離展開
列を、支持媒体上の少なくとも二箇所において互いに隣
接して配置し。

かつ、その隣接した分離展開列の組が、を記３）および
４）の二群の塩基特異的切断分解物の分離展開列を挟む
ように配置して分離展開操作を行なう。

次に、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持媒
体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わせ
ることにより露光操作を行ない、分離展開列のオートラ
ジオグラフを蓄積性蛍光体シートに蓄積する。上記の露
光操作の詳細１こつｌ、ｚては、前記の特願昭５７−１
９３４１８号明細書に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの塩基特異的
切断分解物が分＃展開されてなる上記四群の泳動列のオ
ートラジオグラフの例を示す。すなわち、第２図の第１
列から第１２列は順に、（１）−ＣＧ）特異的切断分解
物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （２）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （３）−ＣＧ）特異的切断分解物 （４）−（Ｃ）特異的切断分解物 （５）−ＣＧ）特異的切断分解物 （６）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （７）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （８）−（Ｃ）特異的切断分解物 （９）−（Ｇ）特異的すＪ断分解物 （１０）−（Ｃ）特異的νＪ断分解物 （１１）−ＣＧ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （１２）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 の各列（泳動列）を示す。第１列〜第４列、第５列〜第
８列、および第９列〜第１２列は互いに異なるＤＮＡの
分＃；、展開列群である。また、第１列と第２列、第６
列と第７列、および第１１列と第１２列は、それぞれ基
準列形成用試料の組である。

ぷ；稙性蛍光体シートに蓄積されたオートラジオグラフ
を第１図に示した読出装置に装填して読み出すことによ
り、信号処理回路２６に人力されたデジタル信号は、蓄
積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番地
（ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル（Ｚ）
とを有しており、その信号００レベルは輝尽光の光量に
対応している。

すなわち、デジタル信号は第２図のオートラジオゲラフ
レこ対応している。従って、信号処理回路２６には、上
記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル画像デー
タが人力されることになる。本発明において、デジタル
画像データとは、放射性標識物質のオートラジオグラフ
に対応するデジタル信号の集合体を意味する。

まず、デジ外ル画像データ上で、」二足１２列のそれぞ
れについて放射性標識物質の分離展開位置を検出し、そ
れらをサンプリング点とする。サンプリング点は、たと
えば、次のようにして得ることかできる。

１−記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元
的分布方向（分離展開列方向）を横断するようにデジタ
ル画像データ上の異なる位置を平行に二回走査すること
によって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布
点を検出しくこの分布点を検出するための走査を予備走
査という）、各列についてそれぞれ二分布点を結んで１
２木の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列における
サンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理力法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において一司メモリーに記憶される（すなわち、
へンファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不揮発
性メモリーに記憶される）。信じ一処理において、デジ
タル画像データ」−を走査するとは、この走査箇所のデ
ジタル信号のみをメモリーから１択的に取り出すとを意
味する。

次いで、デジタル画像データを」−で得たサンプリング
点検出のだめの走査方向に沿って走査することにより、
走査領域上の信号のレベルを表わす関数ｆ　（ｗ）［ｗ
は走査方向上の位置を表わす］を１１）ることができる
。そしてこの関数ｆ（ｗ）に、たとえば適当なフィルタ
ー関数を用いてコンボリューションを行なうことにより
スムージング処理を施し、関数ｇ　（ｗ）を得る。次に
、この関数ｇ（ｗ）に閾値処理を行なう。すなわち、閾
値（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｖ）＝１ｇ　（ｗ）　＜
α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すことにより
、関数ｇ　（ｙ）を１または０の連続関数に変換する。

サンプリング点は、ｇ（ｗ）−１の領域の各中点とする
ことしこより検出される。なお、−１−記の閾値処理に
おける閾値（α０）は、たとえば、走査領域」二のデジ
タＪし信号について、信号のレベルと、その頻度との関
係、すなわちヒストグラムから法定することかできる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｉ＜　ｎ　（Ｘｘ　ｎ　＋　Ｙｘ　ｎ　＋　２．、、ｎ
）　ｌを検出することができる。ここで、ｋは正の整数
であって各列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、
サンプリング点の番号を表わす。なお、サンプリング点
を検出するための方法は、上記の方法番こ限られるもの
ではない。

次に、第１列のサンプリング点と第２列のサンプリング
点とを論理加算することにより、新た番と（Ｇ）特異的
切断分解物、（Ａ）特異的切断分解物、（Ｔ）特異的切
断分解物、および（Ｃ）特異（＋＜、＋すＪ断分解物の
四種類の塩基特異的νＪ断分解物の全てを含むサンプリ
ング点の列、すなわち基１！４（内部標準）列（Ｓ　１
３　ｎ　’ｔを得る。たとえば、この合成を演算として
表わすと次のようになる。

（Ｓｕｎ）　−（Ｓ　＋　ｎ）Ｕ　（Ｓｚｎ）ここで、
（）はサンプリング点の集合を表わし、Ｕは論理和演伸
子を表わす。この基準夕１１は、第１列と第２列との中
間に仮想的に存在するように基べｊ３サンプリング点Ｓ
　１３　ｎの座標を新たに設定する。

同様の処理を第６列のサンプリング点と第７列のサンプ
リング点について行なうことにより基準サンプリング点
（Ｓ　１４　ｎ　）を有する基準列を合成し、また、第
１１列のサンプリング点と第１２列のサンプリング点に
ついても同様の処理を行なうことによりノ１（憎サンプ
リング点（Ｓ＋５ｎ）をイ〕する基準列を合成して得る
。このようにして、分離ｊＪｆＣ開して得られた十三列
の泳動列の両端および中央部にデジタル画像データ」−
において仮想的に三列の基準列を設けることができる。

各基準列において対応する基準サンプリング点、すなわ
ち、サンプリング点の番号ｎが等しい基準サンプリング
点を結んで複数の直線（もしくは折れ線）を得る。たと
えば、分離展開位置の最も遠い（ｎ−１の）基準サンプ
リング点５１３１、ｓｅａ＋およびＳ　Ｉ５１を結んで
折れ線を得、さらにｎ＝２　、３　、・・・・・・につ
いても同様にして順次ｉμ線（もしくは折れ線）馨得る
ことにより、各基準列における基準サンプリング点の数
だけの直線（もしくは折れ線）を得る。さらに、得られ
た折れ線を通出な曲線で近似することもできる。これら
の直線、折れ線または曲線からなる連続線群は、分離展
開位置についての等高線群（Ｌｎ、）とみなすことがで
きる。ただし、ｎは基準サンプリング点の番号ｎに一致
する。

第３図４≠、上記のようにして得られる曲線で近似寄れ
た等高線の一部分を示す図である。

この等高線を基に、第３列のサンプリング点について比
較同定を行なう。たとえば、第３列のサンプリング点３
３１については、サンプリング点Ｓ３１の位置（Ｘ３１
．’／３　ｌ）が等高線Ｌ１とＬｌのうちとちらにより
近いかを判定し、近い方の等高線がＬｌであるとすると
、サンプリング点Ｓ３１は基糸サンプリング点５１３１
に帰属することができる。このようにして順に第３列の
全てのサンプリング点を基準サンプリング点のいずれか
に帰属させる。すなわち、第３列のサンプリング点は、
基准サンプリング点の集合（Ｓｕ＋）３で表わされる。

上記の操作により、ｙ座標ＣＶｋｎ）で表わネれるサン
プリング点Ｓｋｎを等高線Ｌｎをもって表わすことがで
き、また、この等高線は泳動座標ともいえるから、この
操作は換言すれば、ｘｙ座標から泳動座標への座標変換
とみなすことができる。

さらに、第３列のサンプリング点の集合は、この基準列
を構成する第２列のサンプリング点の集合（Ｓ１ｎ）に
含まれるので、 （ＳＬ３１）　　３１’１（Ｓｔｎ）−（Ｓｚ６ｎ）な
る論理積演算で表わされる新たなサンプリング点の集合
（Ｓ　ｒｂ　ｎ　）を有する仮想的な第１６列を得、得
られた第１６列は、第１列〜第４列の組におけるアデニ
ン特異的切断分解物の分離展開列に相当する。

同様の操作を第４列と第２列との間において°も行ない
、チミン特異的切断分解物の分離展開列に相当する第１
７列を得る。次に、第３列、第４列、第１６列および８
１７列について、ｎの小さい順に基準サンプリング点Ｓ
ｌｎとサンプリング点Ｓｋｎとを比較していき、それか
合致したとき、その基準サンプリング点Ｓ、。を合致し
たサンプリング点Ｓｋｎで置き換える。そして、基準列
をｎの小さい順にたどれば、たとえば、次のような図式
を得ることができる。

５３１、Ｓ４１．Ｓ１７　　　菖　　ｌ　　３３　２　
１　　Ｓ　１６　　Ｉ　　　　　　＋上記図式において
、Ｓ３ｎ”Ｇ、５４ｎ＝Ｃ１Ｓｌｌ）ｎ”Ａ、ｓ、７ｎ
＝Ｔと置き換えることにより、次のような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−・・・・・・ このようにして、第１列〜第４列の組におけるＤＮＡの
片方の鎖状分子についての塩基配列を決定することかで
きる。

さらに、同様の処理を第５列〜第８列の組および第９列
〜第１２列の組に対しても行なうことにより、それぞれ
のＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基配列を決定す
ることができる。

なお、得られたＤＮＡの塩基配列についての情報は、−
１−記の表示形態に限られるものではなく、任意、の表
示形態が可能である。たとえば、所望により、さらに各
タフの走査方向」−における信号のレベルを任意に演算
処理することにより、分離展開された各！、ＴＪ断分解
物の相対量をも表示することが０丁能である。〜 あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ＝Ｔ、Ｇ＋Ｃ、Ｃ−＋Ｇ、Ｔ＋Ａなる情報
を与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮ
Ａ（７）塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ　−・・・・・・ Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−・・・・・・ なお、本発明の信号処理方法により、上記の（Ｇ＋Ａ、
Ｔ＋Ｃ，Ｇ、Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩基配
列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定法の一例であって、
本発明の信号処理方法は、上記の組合わせに限定される
ものではなく種々の組合わせか可能であり、またその組
合わせを利用して、」−２の方法に準じる方法により同
様にして塩基配列を決定することかできる。

ただし、いずれの組合わせにおいても、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ
の全ての塩基特異的切断分解物からなる基準（内部標準
）列を合成して得ることかできるような組合わせを有す
ることが必要である。さらに、基準列形成用試料の分離
展開列は、近接して配置されていなければならす、かつ
、この基準列を得るための分離展開列の組は、塩基配列
決定対象の塩基特異的切断分解物の分離展開列を挟むよ
うに配置されて分離展開を行なうことが必要である。

このＪ、（外型形成用試料の分離展開列の分＃展開位置
１走、高精度にＤＮＡの塩基配列を決定するためには、
各組ができる限り離れているのが好ましい。すなわち、
この組か二組からなる場合には、複数の分＃展開列の両
端部に配置するのが好ましく、三Ｍ１からなる場合には
、複数の分離展開列の両端および中央部に配置するのが
好ましい。この組が五組よりも多い場合には、検知対象
の分離展開夕１）の間に適当な間隔をもって配置される
のが好ましい。三組以上の設置は、放射性標識物質が分
離展開された支持媒体に前述のスマイリング効果か生し
ている場合には特に有効であり、ＤＮＡの１′Ａ基配列
を高精度番こ決定することができる。設置する基準列形
成用試料の分離展開列の組数が増加するほと得られる等
高銀は正確なものとなり、従ってＤＮＡの塩基配列を高
精度に決定することがｉｉ丁イ范となる。

この基準列形成用試料は基準列を単に形成するのみなら
ず、同時に一分離展開列としてそのＤＮＡの塩基配列決
定に関与するものである。従って、分離展開列の数が多
ければ多いほど、基準列を多く合成できることになり、
よって正確な等高銀を得ることが可能となる。すなわち
、一層高精度に１ｎ基配列を決定することができるもの
である。

上記の例においては、支持媒体上で−・次元的方向に分
離展開している１２列の放射性標識物質群を用いて説明
したが、分離展開列は１２列に限定されるものではない
。あるいは、同時に数種類以上のＤＮＡの塩基配列を決
定することも可能である。

」―記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力
されたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁
気テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）
へ伝送ごれる。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ’Ｊに電子
的に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値を
ビデオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感
熱記録材料上に記録するものなど種々の原理に基ついた
記録装置を用いることかできる。

なお、１−記のようにして得られた情報は、このほかに
も、たとえは、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩
基配列と１１６合するなどの潰伝言バハ学師情報処理を
１１なうことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートにΦＩ−
写蓄積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み
出すための読出装置δ（あるいは読取装置）の例を示す
ものである。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３　木
読み用読出部、４：レーザー光源、５レーザー光、６・
フィルター、７　光偏向器、８　平面反射鏡、９：移送
方向、１０：先読み用導光性シート、１１　光検出器、
１２：増幅器、１３　制ｊコ゛０回路、１４・レーザー
光源、１５．レーザー光、１６：フィルター、１７．ビ
ーム・エクスパングー、１８．光偏向器、１９：平面反
射鏡、２０：ｆＯレンス、２】：移送方向、２２：本読
み用導光性シート、２３・光検出器、２４゜増幅器、７
５：Ａ／Ｄ変換器、２６．イｈ号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的１）Ｊ断分解物の分離展
開列のオートランオグラフの例を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高銀の一部分を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 ″ｒ−−ｆｔ、：ｉ”ｔ”ｉ’山−−＋、ｌＥ’ｒｌ；
：昭和５８イ１１月２５１」 ’ｌ−Ｉ’ｉ！’ｌｌ’１′長官　　若杉和夫　殿昭和
５ｇ＜＋１月８１−１提出の特１１１瞭＜ｊ（１３）２
゜発明の名称 オートラジオクラフィーにおけるイ１２号−処理方法３
゜袖山をする名 ・Ｉｔ　（Ｉｉとの関係　　　　４シ＋−’ｌ’ｉ、ｌ
：願人＋１　＋９ｉ　　　　　（５２０）　’ｒ；？１
：’す゛真フィルム株式会社氏名　　　　　代表者　大
　西　　：）′Ｙ４゜代理人 ６゜補止により増加する発明の数　　　　　　なし手続
補正書 昭和５＆年１０月／７日 特許庁長官　若杉和夫　殿 ］　事件の表示 昭和５８年　　特許願第　１３３３号 ２　発明の名称　　　オートラジオクラフィーにおける
信号処理方法３　補正をする者 事件との１ｙ］係　　特許出願人 ４　代　　理　　人 ６　補正により増加する発明の数　　　　な　　し７　
補正の対象 別紙の通り　　　　　　　　　　　　　　　　方式　了
鎌明細；−ＩＪのｒ、６明の詳細な説明」の欄を下記の
如く補正致します。 記 ４１１書および （２）＋５頁１５行１］一定レベルを有す　→　削除る （　３）２０頁８行目　　記憶　　　　　　　→　記憶
（４）２０頁１２行目　　記憶　　　　　　　→　ツ（
５）３ＱＪ　２行目　　ｇ　（ｙ）　　　　　　→　ｌ
ｘｙア（６）３５頁８行目　　東金（Ｓ１３１）３　　
→　部力」イＬ土ジ旦工上Ｊ工（７）３５頁１７行目　
　第２列　　　　　→　第１烈（８）３５．ｉｆ！］行
目　　（Ｓｅｘ〒）３ｎ（Ｓ　Ｉｎ）＝　（Ｓ１６ｎ）
↓ （３］肩−３（Ｓｅｎ）−（Ｓ　　ｎ）（９）３６頁９
行目　　Ｓ１９　　　　　　＋　旦旦１（ｌＯ）図　　
面　　　第３図の補正図面を添付する。 以　　　ヒ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するだめのオートラジオグラフィーにおける信号−処理
   方法であって、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくは
   ＤＮＡ部分分解物の１ｎ基特異的切断分解により、得ら
   れた、 ｌ）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的切断分
   解物、チミン特人的切断分解物、およびントンン特異的
   切断分解物の全てを全体として含むように任意に組合せ
   られた少なくとも二種の塩基特異的切断分解物もしくは
   塩基特異的切断分解物混合物からなるーＭ１の基準列形
   成用試料を少なくとも二組、および、 ２）ｊ）、ｉ基特異的切断分解物もしくは塩基特異的′
   ９Ｊ断物混合物を少なくとも一種、 のそれぞれが、支持媒体上において、 十記ｌ）の二組の基準列形成用試料のそれぞれパ二以上
   の分＃展開列が、少なくとも一列の」−記２）の切断分
   解物もしくは塩基特異的切断物混合物の分＃展開列を挟
   むように互いに平行関係を以って一次元的に分離展開さ
   れてなる少なくとも孔列の゛分離展開列を構成する放射
   性標識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄積性
   蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄積性蛍
   光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有するオ
   ートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積刊蛍光体
   シートを電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽
   光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出
   すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオートラ
   ジオグラフに対＋５するデジタル信号について、 １）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
   出する工程、 ｉｉ）各々の基準列形成用試料の各々二以上の分離展開
   列から各々の基準列を合成し、各々の基僧列について基
   準サンプリング点を検出する工程、 １１１）該複数の基べち列間で対応する基準サンプリン
   グ点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連
   続線を設定する工程、そしてｉｗ）該連続線により、各
   分離展開列のサンプリング点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２゜上記１）の基準列形成用試料の各々二以上の分離展
   開列が少なくとも三組配置され、がっ、カーいに隣接す
   る二組の基準列形成用試料の分離展開列が、少なくとも
   一列の上記２）の切断分解物もしくは切断分解物混合物
   の分ａ展開列を挟むように配置されていることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィ
   ーにおける信号処理方法。 ３゜サンプリング点が、複数の分ＭＵ開動のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ４゜−組の基準列形成用試料が、 ｌ）グアーニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的すｊ断分解物、および、２）チミン特
   異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 の二種の塩基特異的切断分解物混合物から構成されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項の
   いずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信
   号処理方法。