JPS60233558A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決
定するためのオートラジオグラフイーにおける信号処理
方法に関するものである。

［発明の背景］ 支持媒体上におい、て少なくとも一次元的方向に分布し
て分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得
るための方法としてオートラジオグラフィーが既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
付した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分離操作にかけて分離展開を行なう
ことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離展開
列（ただし目には見ごえない）を形成させ、この分離展
開列のオートラジオグラフを放射線フィルムに可視画像
として取得し、その可視画像から放射性標識物質の位置
情報を得ている。また、得られた放射性標識物質の位置
情報を基にして、その高分子物質の分離、同定、あるい
は高分子物質の分子量、特性誌評価などを行なう方法は
既に開発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ　（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）の塩基配列の
決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用してＤＮＡの塩基配
列を決定するための代表的な方法の一つとして、サンガ
ー拳り−ルソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）法が
知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状分子か
らなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の鎖状分子
は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グア
ニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩基を
有する構成単位から構成されていること、そしてこの二
本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の水素結合に
よって架橋されており、しかも各構成単位間の水素結合
は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせのみにおい
て実現しているというＤＮＡの特徴的な構造に着目し、
ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、ゲル電気泳動
およびオートラジオグラフィーの手段を巧みに利用して
ＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンガー・クールノン法のおいて、塩基配列を決定しよ
うとしてい、るＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後、こ
れらを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合成
するためには幾つかの方法があるが、基本的には一本鎖
の検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、上記四種類
の塩基を含むモノヌクレオシドトリフオスフェートの存
在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作用さ
せることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さのＤ
ＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌクレオシ
ドトリフオスフェートに放射性標識が付与されたものを
用いること、および合成条件に工夫を凝らして四種の塩
基のいずれか一つに対して特異的になるようにすること
により、放射性標識が付与された塩基特異的合成りＮＡ
断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展
開する（ただし、視覚的には見ることができない）、従
来においては、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フィ
ルム上に可視化してオートラジオグラフを得、得られた
オートラジオグラフに基づいて鎖状分子の末端から順に
その塩基配列を決定し、このようにして検体ＤＮＡのす
べての塩基の配列を決定している。

なお、上記に要約したサンガー・クールノン法の特徴お
よび操作については、たとえば次の文献に記載されてい
る。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法」三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人列）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　？４．　ｐｐ、　５４８３−５４８７　（１９７
？） 上述のように従来の放射線写真法を利用するオートラジ
オグラフィーにおいては、放射性標識物質の従量情報を
得るためにこの位置情報を有するオートラジオグラフを
放射線フィルム上に可視化することが必須となっている
。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを自分自身の目で判断することにより、試料中の放射
性標識物質の分布を測定し、放射性標識が付与された特
定物質についての位置情報の知見を得ている。すなわち
、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与された塩基特
異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物のそれぞれについ
て、分離展開位置を視覚的に判断し、それら塩基特異的
ＤＮＡ合成物の分離展開列を相互に比較することにより
決定されている。よって、得られたオートラジオグラフ
の解析は、通常、人間の視覚を通して行なわれており、
そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているためそのオートラジオグ
ラフを解析して得られる位置情報が研究者によって異な
るなど得られる情報の精度には限界がある。特に、放射
線フィルム上に可視化されたオートラジオグラフが良好
な画質（鮮鋭度、コントラスト）を有していない場合に
は満足できる情報が得られがたく、その精度は低下しが
ちであるという問題がある。従来より、位置情報の精度
を向上させるためには、たとえば、その可視化されたオ
ートラジオグラフをスキャニングデンシトメーターなど
の測定器具を用いて測定することが行なわれている。し
かしながら、このことは、オートラジオグラフの解析に
要する時間をふやし、その操作を煩雑にするものである
。

たとえば、試料中に放射性標識が付与された不純物が含
まれている場合、支持媒体が自然放射能などによって放
射性汚染されている場合、あるいは、分離展開操作が不
充分である場合には、オートラジオグラフ上にノイズが
現れやすくなるための解析が困難になり、従って得られ
る情報の精度を低下させることになる。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、す
なわちＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を充分な
精度で得ることは困難である。

［発明の要旨］ 本発明者は、従来、のオートラジオグラフィーにおいて
利用されている放射線フィルムを用いる放射線写真法の
代りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法
を利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有
するオートラジオグラフを特に画像化することなく、そ
の位置情報をデジタル信号として得、そして得られたデ
ジタル信号に好適な信号処理を施すことにより、ＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を簡易かつ高精度に、
決定することを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにおけ
る信号処理方法であって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片
物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付与さ
れている、１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
フを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを電磁波
で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放出さ
せ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことにより得
られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号について、 ｉ）該複数の分離展開列より基準列を合成し、該基準列
について基準サンプリング点を決定する工程、 ■）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列のそ
れぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する工
程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
提供するものである。

また、本発明は、試料として、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断
片物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付与
されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物およびシトシン特
異的ＤＮＡ合成物の混合物、 を含む少なくとも五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物もしく
はＤＮＡ合成物混合物のそれぞれが、支持媒体上に平行
関係を以って一次元的に分離展開されて形成された分離
展開列を利用し、それぞれの分離展開列のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）該ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を基準列として
、該基準列について基準サンプリング点を決定する工程
、 ｌｉ）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列の
それぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する
工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
も提供するものである。

さらに１本発明は、試料として、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
断片物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付
与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）上記ｌ）〜４）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の二もし
くは三種の混合物、 を含む少なくとも五群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
フを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを電磁波
で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放出さ
せ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことにより得
られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号について、 ｉ）該５）のＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を基準列
の一部として、それを基にして実験的に定められる数式
に従って基準列をめ、該基準列について基準サンプリン
グ点を決定する工程、 ｉｉ）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列の
それぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する
工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
も提供するものである。

本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重ね合わせる
ことによって試料から放出される放射線エネルギーを蓄
積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄積性蛍光体
シートを可視光線および赤外線などの電磁波（励起光）
で走査することにより、蓄積性蛍光体シートに蓄積され
ている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光）として放出
させ、この蛍光を光電的に読み取って電気信号を得、こ
の電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号として得るこ
とからなる放射線像変換方法を利用するものである。

上記放射線像変換方法については、たとえば特開昭５５
−１２１４５号公報等に記載されている。本発明に用い
られる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、二価ユーロピ
ウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン化物系蛍光体な
どの輝尽性蛍光体を含有するものである。この輝尽性蛍
光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外線などの放射線
の照射を受°けてその放射線エネルギーの一部を蓄積し
たのち、可視光線および赤外線などの電磁波（励起光）
の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応じて輝尽発光
を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、ノイズを含むオートラジオグラフに対
して、デジタル画像データ上で特定の処理を行なうこと
により、容易にノイズのみを除去し、真の画像データを
得ることができる。すなわち、たとえば、試料中に含ま
れる放射性標識が付与された不純物によって発生するノ
イズ、あるいは、分離展開条件が悪いために発生するノ
イズに影響されることなく、高精度でＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ断片物の塩基配列が得られるものである。さらに、
分離展開操作において基準（内部標準）列を設けること
により、放射性標識が付与された検知対象物質の検出を
高精度にかつ容易に行なうことも可能である。

なお、本発明において基準列（内部標準列）とは、その
構成単位である四種のモノヌクレオシドトリフオスフェ
ートを全て用いて得られた塩基非特異的ＤＮＡ合成物の
混合物を分離展開したときに形成される分離展開列を意
味する。ただし、この基準列は必ずしも一列の実在する
分離展開列である必要はなく、信号処理操作の過程にお
いて複数の分離展開列から仮想的に合成して得てもよい
し、二種もしくは三種の塩基特異的ＤＮＡ合成物の混合
物を分離展開して得た分離展開列から得てもよい。

本発明においては、試料のオートラジオグラフに対応す
るデジタル信号を信号処理することによりＤＮＡの塩基
配列を自動的に決定するため、次のような最も単純な組
合わせを利用することができる。

１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異、的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 すなわち、上記四群が互いに排他的な組合わせであるこ
とから、放射性標識物質群の分離展開方向に垂直な方向
には常に一群の塩基“特異的ＤＮＡ合成物しか存在しえ
ないという排他性を利用して、得られたデジタル信号を
合理的に多数決判定することにより各塩基の位置を決定
することができる。従って、人間の視覚判定よりも正確
にその塩基配列を得ることができるものである。

また、上記のようにデジタル画像データ上で合理的に放
射性標識物質の分離展開部位（サンプリング点）を検出
することができることから、放射性標識物質の一つ一つ
の分離展開部位を縮小しても高精度にその分離展開部位
（サンプリング点）を判定することが可能となる。すな
わち、−回のオートラジオグラフィーにおいて用いる放
射性標識物質の絶対量を減少させることができる。ある
い゛は、分離展開操作における分離展開列の数を支持媒
体の幅を拡張させることなく増加することが可能となり
、−回のオートラジオグラフィー操作によって従来より
多くの情報を得ることが可能となる。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物をテンプレートとして、放射性標識
が付与されたデオキシヌクレオシドトリフオスフェート
（ｄＮＴＰ）とＤＮＡ合Ｊｉ酵素とを用いて合成される
各塩基特異的ＤＮＡ合成物および／またはそれらの混合
物が、−次元的に分離展開されて分離展開列を形成して
いる支持媒体を挙げることができる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層り゛ロマトグラフイーなどが挙げられる。このうちで
、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表的な分離展
開方法であり、本発明の実施にとって好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価ユーロピウム
賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢｒ：Ｅｕ２＋）蛍光体
粒子をニトロセルロースと線状ポリエステルとの混合物
中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体シートは、
たとえば、支持体としてポリエチレンテレフタレートな
どのシートを用い、このシート上に上記蛍光体層を設け
、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエチレンテレフ
タレートシートなどを設けたものである。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の蓄積記録操作（露光操作）は。

支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを一定時間重ね合わせ
ることにより、その支持媒体上の放射性標識物質から放
出される放射線の少なくとも一部を蓄積性蛍光体シート
に吸収させて実施する。この露光操作は、支持媒体と蓄
積性蛍光体シートとが近接した状態で配置されていれば
よく、たとえば、常温もしくは低温で少なくとも数秒間
この状態に置くことにより行なうことができる。

なお、サンガー・クールノン法によるオートラジオグラ
フィーにおける試料の調製法、１積性蛍光体シートおよ
び露光操作の詳細については、本出願人による特願昭５
８−２０１２３１号明細書に詳細に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情
報を読み出してデジタル信号に変換するための方法につ
いて、添付図面の第１図に示した続出装置（あるいは読
取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）ｌに蓄積記録されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
ための先読み用読出部２と、放射性標識物質の位置情報
を出力するために蛍光体シートｌに蓄積記録されている
オートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用読
出部３から構成される装置 いる。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シート１から発生する輝尽発光の波長領
域に該当する波長領域の部分がカットされる。次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器７により偏向
処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域が、蛍
光体シート１から発する輝尽発光の主要波長領域と重複
しないように選択される。

蛍光体シートｌは、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印９の方向に移送される．従って、蛍光体シー
トｌの全面にわたって偏向レーザー光が照射されるよう
になる。なお、レーザー光源４の出力、レーザー光５の
ビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シートｌの
移送速度については、先読み操作のレーザー光５のエネ
ルギーが本読み操作に用いられるエネルギーよりも小さ
くなるように調整される。

蛍光体シー｝１は、上記のようなレーザー光の照射を受
けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例す
る光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シー
｝１０に入射する．この導光性シー｝１０はその入射面
が直線状で、蛍光体シート１上の走査線に対向するよう
に近接して配置されており、その射出面は円環を形成し
、フォトマルなどの光検出器ｌ１の受光面に連絡してい
る．この導光性シー｝１０は、たとえばアクリル系合成
樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工してつくら
れたもので、入射面より入射した光がその内部において
全反射しながら射出面へ伝達されるように構成されてい
る。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シート
１０内を導かれて射出面に到達し、その射出面から射出
されて光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート１
は本読み用続出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビームφエクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光体
シートｌ上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆθレンズ２０等
が配置され、蛍光体シートｌの上を偏向レーザー光が走
査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するように
されている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体シートｌは、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を
発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する。

この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シート
ｌＯと同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれ、た輝尽
発光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光
される。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波
長領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され、
光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされてい
る。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスなお、本発明における蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録された支持媒体上の放射性標識物質の位置情
報を読み出すための方法について、上記においては先読
み操作と本読み操作とからなる読出し操作を説明したが
、本発明において利用することができる読出し操作は、
上記の例に限られるものではない。たとえば、支持媒体
上の放射性標識物質の量、およびその支持媒体について
の蓄積性蛍光体シートの露光時間が予めわかっていれば
、上記の例において先読み操作を省略することも可能で
ある。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法としては、上記に例示した以外の任意な方法
を利用することも当然可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は１次に第１図に示され
る信号処理回路２６に入力され次元的位置情報を記号お
よび／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩
基配列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたＤＮＡの塩基配列
決定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処理
の実施態様を、前記のサンガーΦクールソン法を利用し
た場合を例にとり、次の四種類の塩基特異的ＤＮＡ合成
物の組合わせにより形成された泳動列（分離展開列）を
用いた場合について説明する。

ｌ）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物 まず、検体ＤＮＡをテンプレートとして放射性標識（３
２Ｆ）が付与されたモノヌクレオシドトリフオスフェー
トとＤＮＡポリメラーゼとを用いて、常法により塩基特
異的に合成するすることにより、上記１）〜４）の四群
の塩基特異的ＤＮＡ合成物を得る。

次に上記四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物を、ゲル支持媒
体上で電気泳動により分離展開させてそれぞれの分離展
開列を得る。

次いで、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持
媒体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わ
せることにより露光操作を行ない、試料のオートラジオ
グラフを蓄積性蛍光体シートに蓄積記録する。上記の露
光操作の詳細については、前記の特願昭５８−２０１２
３１号明細書に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの各塩基特異
的ＤＮＡ合成物が分離展開されている分離展開列゛′（
泳動列）のオートラジオグラフの例を示す。

すなわち、第２図の第１列から第４列は順に、（１）−
（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （２）−（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （３）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 （４）−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 の各分離展開列を示す。

蓄積性蛍光体シートに蓄積記録されたオートラジオグラ
フを第１図、に示した続出装置に装填して読み出すこと
により、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は
、蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた
番地（ｘ、ｙ）とその番地における信号のレベル（２）
とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に対
応している。すなわち、デジタル信号は第２図のオート
ラジオグラフに対応している。従って、信号処理回路２
６には上記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル
画像データが入力されることになる。本明細書において
、デジタル画像データとは放射性標識物質のオートラジ
オグラフに対応するデジタル信号の集合体を意味する。

まず、基準（内部標準）列は、たとえば、以下のような
信号処理により得ることができる。

デジタル画像データ上で、上記凹刻の分離展開列のそれ
ぞれについて信号処理のための走査方向を決定する。す
なわち、上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の
一次元的分布方向（分離展開方向）を横断するようにデ
ジタル画像データ上の異なる位置を二回走査することに
よって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点
を検出しくこの分布点検出するための走査を予備走査と
いう）、各分離展開列についてそれぞれ二分布点を結ん
で四本の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけ
るサンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において−Ｈメモリーに記憶される（すなわち、
バッファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発性
メモリーに記憶される）。信号処理において、デジタル
画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタル
信号のみをメモリーから選択的に取り出すことを意味す
る。

次いで、デジタル画像データ上を各走査方向に沿って走
査することにより、仮想的に各列についてそれぞれ横軸
に走査方向上の位置（Ｗ）をとり縦軸に信号のレベル（
Ｚ）をとったグラフを得る。ここで、走査方向上の位置
は、たとえば各列の泳動開始位置（ｗｋｏ）をマーカー
などにより検出することにより、泳動開始位置からの泳
動距離で表わすのが好ましい。ただし、ｋは正の整数で
あり、各列の番号を表わす。

得られた第１列〜第４列のグラフについて、各走査方向
上の同一位置（Ｗ）においてその信号のレベル（２）が
最大値を示す列の信号のレベル値を取り出して合成する
ことにより、（Ｇ）特異的Ｄ　、Ｎ　Ａ合成物、（Ａ）
特異的ＤＮＡ合成物、（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物、およ
び（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物の四種類の塩基特異的ＤＮ
Ａ合成物の全てを含むグラフが得られる。得られたグラ
フは、すなわち基準（内部標準）列とも呼ぶべき列につ
いてのグラフである。

なお、基準列を上記のように各塩基特異的ＤＮＡ合成物
の分離展開列から合成することなく、予め上記四種類の
各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む泳動列を実際に
設け、これを基準列とじてもよい。あるいは、二種もし
くは三種の塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列
を基にして、この分離展開列上のサンプリング点につい
て実験的にめられる数式（例えば、（１）式で表わされ
る後記の関数）を用いて演算処理することによっても得
ることができる。

次に、上記基準列についての基準サンプリング点は、た
とえば、以下のような信号処理により決定することがで
きる。すなわち、上記の基準列に相応するグラフを関数
ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］で表わす
と、この関数ｆ　（ｗ）に、たとえば適当なフィルター
関数を用いてコンボリューションを行なうことによりス
ムージング処理を施し、関数ｇ（ｗ）を得る。次に、こ
の関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行なう。すなわち、閾値
（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ　（ｗ）　＝　１ｇ　（ｗ
）　＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すこと
により、関数ｇ　（ｗ）を１または０の連続関数に変換
する。サンプリングの候補点Ｓｏｎは、ｇ（ｗ）＝１の
領域の各中点とすることにより検出される。ただし、０
は基準列を表わし、ｎは正の整数であって、その候補点
に対応するサンプリング点の番号を表わす。なお、上記
の閾値処理における閾値（α０）は、たとえば、走査領
域上のデジタル信号について、信号のレベルと、その頻
度との関係、すなわちヒストグラムから決定することが
できる。

次いで、得られたサンプリングの候補点Ｓｏｎに対し、
統計処理を行なう。すなわち、基準列上のサンプリング
の候補点に存在する放射性標識物質には、泳動距離が小
さくなる順に、すなわちサンプリング点の番号が大きく
なる順に四種類の塩基のいずれかを含む構成単位が１つ
ずつ多く結合しているとみなすことができ、かつ、それ
らの放射性標識物質の泳動距離と放射性標識物質の分子
量の対数をとった値とが直線関係にあることが実験的に
判明しているので、サンプリングの候補点に対して次の
ような関数で近似することにより統計処理を行なうこと
ができる。

ｗ□　ｎ＝　ａ　−ｂ　ｌｏｇ（Ａ＋Ｍｎ）　（１）（
ただし、ａおよびｂは電気泳動条件により実験的にめら
れる数値であり、ＡおよびＭはＤＮＡの塩基特異的ＤＮ
Ａ合成物の分子量に関係する数値である。） 各サンプリングの候補点Ｓｏｎの泳動距離Ｗｏｎと各々
に対応するサンプリング点の番号ｎとを（１）式に代入
して統計処理を行なうことにより、最確値ａ□およびす
、を算出し、そしてこのａ□およびｂｏを（１）式に再
び代入することより、最確泳動距離（Ｗｏｎ’）で表わ
される基準サンプリング点Ｓｏｎ°を決定することがで
きる。

なお、統計処理に用いられる関数は上記（１）式で表わ
される関数に限定されるものではなく、実験値によく一
致するように決定された他の関数を用いてもよい。

この基準サンプリング点Ｓｏｎ′を基にして、上記日月
のそれぞれの各走査方向上において、各基準サンプリン
グ点ごとに基準サンプリング点を中心とする一定幅内に
存在するデジタル信号のうちで、前記の閾値処理で決定
された閾値以上の信号レベルを示すデジタル信号の数を
算出する。すなわち、基準サンプリング点のそれぞれに
ついてその位置（Ｗｏｎ’）を中心とする一定幅（サン
プリングマスク）を設定し、上記四列の各走査方向上に
おいて各々のサンプリングマスクでの閾値以上のデジタ
ル信号の数を算出する。

第３図は、本発明の信号処理方法により検出されたＤＮ
Ａの塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列上のサンプリ
ングマスクおよびサンプリング点を模式的に示す図であ
る。この第３図において四角で囲まれた領域がサンプリ
ングマスクである。

本発明において、上記四列のそれぞれに含まれる各塩基
特異的ＤＮＡ合成物は相互に排他的であることから、基
準サンプリング点の数は、上記四列のそれぞれにおける
サンプリング点を合計した数に一致する。このことは、
一つの基準サンプリング点に対応する一つのサンプリン
グ点が四列のうちのいずれか一列において検出されるこ
とを意味する。従って、同一サンプリングマスクにおい
ては、検知対象のサンプリング点は、四列のうち一列に
おいてでのみ検出されなければならない。

上記の各列間における排他性を利用することにより、サ
ンプリングマスクのそれぞれについて、同一サンプリン
グマスク内の信号のレベルの評価値の最も高い一列を選
出し、この列にサンプリング点があるものと決定し、他
の三列にはないものと決定する。ここで、信号のレベル
の評価値とは、マスク内に含まれる信号のレベルの積分
値、あるいは閾値処理を行なった場合には信号のレベル
が閾値を越えるものの数のことをいう。このようにして
、全てのサンプリングマスクについて、四泳動列のうち
いずれか一列においてサンプリング点をそれぞれ検出す
る。従って、基準列の基準サンプリング点に対応して、
上記四列のいずれかにおいてサンプリング点が検出され
る。

従って、上記の処理により、各々の列は最確泳動距離（
ｗｏｎ’）を有する基準サンプリング点Ｓｏｎ゛の乗合
（Ｓｏｎ’）ｘで表わされることになる。なお、ｋは列
の番号を表わす。

基準サンプリング点Ｓｏ・。°について。

（Ｓｏｎ’　）＊に属するサンプリング点をＧ、（Ｓｏ
ｎ’）ｚに属するサンプリング点をＡ、（Ｓｏｎ’）３
に属するサンプリング点をＴ、（Ｓｏｎ’）ａに属する
サンプリング点をＣ１と置き換えたのちサンプリング点
の番号ｎの順に並べると、次のような図式が得られる。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−・・・・・・こ
のようにして、検体ＤＮＡ　（あるいはＤＮＡ断片物）
と相補的なりＮＡ鎖状分子についての塩基配列を決定す
ることができる。なお、得られたＤＮＡの塩基配列につ
いての情報の表示は、上記の表示形態に限られるもので
はなく、各種の任意の表示形態が可能である。たとえば
、所望により、ざらに各列の走査方向上における信号の
レベルを任意に演算処理することにより、分離展開され
た各塩基特異的ＤＮＡ合成物の相対量をも表示すること
が可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ−Ｔ、Ｇ→Ｃ，Ｃ−Ｇ、　Ｔ＋ａなる情報
を与えることにより次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ　ＬＣ−Ｔ　−Ａ　−Ｃ−Ｇ　−Ｔ　−Ａ　−Ａ　−
−−・・−・Ｃ−Ｇ　−Ａ　−Ｔ　−Ｇ　−Ｃ−Ａ　−
Ｔ　−Ｔ　−・・・−・・また、上記の例においては、
支持媒体上で一次元的方向に分離展開している四列の放
射性標識物質群を用゛いて説明したが、分離展開列は四
列に限定されるものではなく、四列より多くてもよい。

あるいは、一つの支持媒体を用いて同時に二種類以上の
ＤＮＡの塩基配列を決定することも可能である。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの一
基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、ｌＯ：先読み用導光性シート、ｌｌ：光検出器
、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：ど−ム
・エクスパングー、１８：光偏向器、１９二平面反射鏡
、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２二本読み用
導光性シート、２３；光検出器、２４：増幅器、２５　
：　Ａ／Ｄ変換器、２６：＠号処理回路 第２図は、検体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物がゲル
支持媒体上で分離展開された試料のオートラジオグラフ
の例を示す図である。 第３図は、本発明の信号処理方法により検出された検体
ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列上のサン
プリングマスクおよびサンプリング点を模式的に示す図
である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代−理人　弁理
士　柳川泰男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている。 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 を含む少なくとも四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
   ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
   展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
   ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
   吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
   放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
   フを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを電磁波
   で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放出さ
   せ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことにより得
   られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフに対
   応するデジタル信号について。 ｉ）該複数の分離展開列より基準列を合成し、該基準列
   について基準サンプリング点を決定する工程、 ■）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列のそ
   れぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する工
   程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ２、上記ｉ）の工程が、 （１）°該複数の分離展開列より基準列を合成し、この
   基準列について横軸に麦査方向上の位置をとり、縦軸に
   信号のレベルをとったグラフを得る工程、 （２）該グラフにスムージングおよび／または閾値処理
   を行なう、ことによりサンプリングの候補点を検出する
   工程、 （３）該サンプリングの候補点に対し統計処理を行なう
   ことにより、基準サンプリング点を決定する工程、 からなることを特徴とする第１項記載のオートラジオグ
   ラフィーにおける信号処理方法。 ３゜サンプリングの候補点に対して統計処理を行なうこ
   とにより基準サンプリング点を決定することからなる工
   程における該統計処理が、サンプリングの各候補点を、 ｗＯｎ＝　ａ−ｂｌｏｇ（Ａ＋Ｍｎ）　（１）なる関数
   （ただし、Ｗｏｎは、サンプリングの候補点の走査方向
   上における基準点からの距離を表わし；ｎは、該候補点
   に対応するサンプリング点の番号を表わし；ＡおよびＭ
   は定数である）で近似することにより、ａおよびｂを決
   定し、次いで、このａおよびｂに基づく（１）式により
   基準サンプリング点を決定することを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理方法。 ４゜上記ｉｉ）の工程が。 該基準サンプリング点に基づいて設定されたサンプリン
   グマスク内に分布している各分離展開列の放射性物質の
   信号を互いに比較し、各分離展開列間の想定サンプリン
   グ点の排他性を利用して各分離展開列におけるサンプリ
   ング点を検出することからなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理方法。 ５゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物およびシトシン特
   異的ＤＮＡ合成物の混合物、 を含む少なくとも１群の塩基特異的ＤＮＡ合成物もしく
   はＤＮＡ合成物混合物のそれぞれが、支持媒体上に平行
   関係を以って一次元的に分離展開されて形成された分離
   展開列の放射性標識物質群から放出される放射線エネル
   ギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、
   この蓄積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情
   報を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該
   蓄積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオ
   グラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光
   電的に読み出すことにより得られるそれぞれの分離展開
   列のオートラジオグラフに対応するデジタール信号につ
   いて、 ｉ）該ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を基準列として
   、該基準列について基準サンプリング点を決定する工程
   、 ｉｉ）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列の
   それぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する
   工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ６゜上記ｉ）の工程が、 （１−）該ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を基準列と
   して、この基準列について横軸に走査方向上の位置をと
   り、縦軸に信号のレベルをとったグラフを得る工程、 （２）該グラフにスムージングおよび／または閾値処理
   を行なうことによりサンプリングの候補点を検出する工
   程、 （３）該サンプリングの候補点に対し統計処理を行なう
   ことにより、基準サンプリング点を決定する工程、 からなることを特徴とする第５項記載のオートラジオ−
   グラフィーにおける信号処理方法。 ７゜サンプリングの候補点に対して統計処理を行なうこ
   とにより基準サンプリング点を決定することからなる工
   程における該統計処理が、サンプリングの各候補点を、 Ｗ□ｎ＝ａ−ｂｌｏｇ（Ａ＋Ｍｎ）　（１）なる関数（
   ただし、Ｗｏｎは、サンプリングの候補点の走査方向上
   における基準点からの距離を表わし；ｎは、該候補点に
   対応するサンプリング点の番号を表わし；ＡおよびＭは
   定数である）で近似することにより、ａおよびｂを決定
   し、次いで、このａおよびｂに基づく（１）式により基
   準サンプリング点を決定することを特徴とする特許請求
   の範囲第６項記載のオートラジオグラフィーにおける信
   号処理方法。 ８゜上記ｉｉ）の工程が、 該基準サンプリング点に基づいて設定されたサンプリン
   グマスク内に分布している各分離展開列の放射性物質の
   信号を互いに比較し、各分離展開列間の想定サンプリン
   グ点の排他性を利用して各分離展開列におけるサンプリ
   ング点を検出することからなることを特徴とする特許請
   求の範囲第５項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理“方法。 ９゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方法で
   あって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基
   配列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、 ２）アデニン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）チミン特異的ＤＮＡ合成物、 ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ５）上記１）〜４）の塩基特異的ＤＮＡ合成物の二もし
   くは三種の混合物、 を含む少なくとも１群の塩基特異的ＤＮＡ合成物のそれ
   ぞれが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離
   展開されて形成された分離展開列の放射性標識物質群か
   ら放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートに
   吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シートに該
   放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグラ
   フを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを電磁波
   で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として放出さ
   せ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことにより得
   られるそれぞれの分離展開列のオートラジオグラフに対
   応するデジタル信号について、 ｉ）該５）のＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を基準列
   の一部として、それを基にして実験的に定められる数式
   に従って基準列をめ、該基準列について基準サンプリン
   グ点を決定する工程、 ｉｉ）該基準サンプリング点より、残りの分離展開列の
   それぞれの走査方向におけるサンプリング点を検出する
   工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 １０、上記ｉ）の工程において、実験的に定められる数
   式が、 ＷＱ　ｎ　＝　ａ　−ｂｌｏｇ（Ａ＋Ｍｎ）　（１）（
   ただし、ｗ□Ｈは、サンプリング点の走査方向上におけ
   る基準点からの距離を表わし；ｎは、該サンプリング点
   の番号を表わし；ＡおよびＭは定数である） であることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載のオ
   ートラジオグラフィーにおける信号処理方法。 １１゜上記ｉｉ）の工程が、 該基準サンプリング点に基づいて設定されたサンプリン
   グマスク内に分布している各分離展開列の放射性物質の
   信号を互いに比較し、各分離展開列間の想定サンプリン
   グ点の排他性を利用して各分離展開列におけるサンプリ
   ング点を検出することからなることを特徴とする特許請
   求の範囲第９項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理方法。