JPS59126249A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、オ
ートラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列の決定のためのデジタル信号処理
における放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法
に関するものである。

支持媒体、Ｉ−において少なくとも一次元的方向に分布
して分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を
でするための方法としてオートラジオクラフィーが既に
知られている。

たとえは、蛋白質、核酸などのような生物体由】（の高
分子物質に放射性標識を旧年したのち、その放射性標識
を伺したｊ☆８分子物ｒ′↓、その、１店導体、あるい
はその分解物など（以下、放射性標識物質ともいう）を
ケル状支持媒体」二で電気拡動なとの方陣操作にかけて
分高１１展開を行なうことにより、核皮）−Ｉｌ媒体上
に放射性標識物質の分＃展開列を形成させ、この分離展
開像のオートラジオグラフを放射線フィルムに転写、可
視化し、この可視画像から放射性標識物質の位置情報を
得ている。また、得られた放射性標識物質の位置情報を
基にして、その高分子物質の分離、同定、あるいは高分
子物質の分子量、特性の評価などを行なう方法は既に開
発され、実際に利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様）の塩
基配列の總定に有効（こ利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用すること番こよりＤ
ＮＡの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・ギ
ル八−ｈ　（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およヒ
サンガーΦクールン７　（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ）法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡか二本
の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二
本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ
）なる塩基を有する構成単位から構成されていること、
そして、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基
間の水素結合によって架橋されており、しかも各構成単
位間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合
わせのみ１こおいて実現しているというＤＮＡの特徴的
な構造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定するカフ
人である。

たとえば、マキサム・ギルバート法は、次に述へるよう
な方法により実施される。

まず、Ｊスル２（配列を決定しようとしているＤＮＡあ
るいはＤＮＡの分解物の鎖状分子の−）ｊの側の端部に
燐（Ｐ）の放射性同位元素を含むノ１（を結合させるこ
とにより、その対象物を放射性標識物質としたのち、化
学的な手段を利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を
塩）、（特異的に切断する。次に、この操作により得ら
れるＤＮＡあるいはＤＮＡの分解物の多数の塩）、（特
異的すｊ断分解物のｌ昆合物をケル電気泳動法により分
離ｌＪ４開し、多数の塩基も異的切断分解物かそれぞれ
・；１７状を形成して分、殖された分＃展開列（ただし
、視覚的に１葉見ることかできない）を９１ノ・る。そ
して、この分１４ｆｌ展開物をＸ線フィルム上に可視化
してオートラジオグラフをｌｊ、肖られたオートラジオ
グラフと各々の塩基特異的切断手段、とから、放射性同
位元素か結合された鎖状分子の端部から一定の位ｙＩ関
係にある塩ノ、（を順次決定し、このようにして対象物
のすべての塩基の配クリを決定している。

上述のように従来の放射線写真法を利用するオートラジ
オグラフィーでは、放射性標識物質の位置情報を得るた
めにはこの位置情報を有するオートラジオグラフを放射
線写真フィルム上に可才見化することが必須要件となっ
ている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを視覚的に観察することにより、支持媒体上の放射性
標識物質の分布を判断してｕする。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の旧年され
た塩基特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれ
について、分離展開位置を視覚的（こ判断し、それら塩
基特異的切断分解物の分離展開列を相互に比較すること
により決定されている。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィーては、上
述のようにその解析作業は人間の目（こイ衣存している
ため、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析
して得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によっ
て相違する場合か発生するなどの問題があり、得られる
情報の精度には限界かある。Ｊ、ｌＪに、放射線フィル
ム上に可視化されたオートラジオグラフが良好な画質（
釘鋭度、コントラスト る情報がキＩｊられがたく、またその精度は低下する傾
向にある。従来より、求める位置情報の精度を向」ニさ
せるために、たとえば、その可視化されたオートラジオ
グラフをスキャニングデンシトメーターなどの測定器具
を用いて測定する方法も利用されている。しかしながら
、そのような測定器具を単に用いる方法においては精度
の向上に限界がある。

また、前記のオートラジオグラフが形成された支持媒体
と放射線フィルムとを密着させて行なわれる露光操作時
にその重ね合わせにズレか生じる場合かあり、この場合
には放射線フィルムバーに可視画像として得られる分＃
展開列（たとえは、泳動列）はフィルムの長さ方向に対
して平行てな−く、すれる結果となるため、放射性標識
物質の位置情報を視覚的に判断する際に誤差が生しやす
くなり、その精度は低下しかちである。また、支持媒体
や竹屑１展開条件によって、得られる分囚ＩＪ（間外が
支持媒体の長さ方向に対して平行でなかったり、歪んだ
りすることが往々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分局［展開を行なうが、その被覆物の
変形などトこよってゲル１こ厚さムラが生じたりするこ
とがあり、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様
に分Ｎ［展開されるとは限らない。また同様な分離展開
の不均一さはゲル中に空気泡が含まれている場合、ある
いは、ゲルの組成が不均一であったりした場合において
も発生する。このような理由から、たとえば、支持媒体
の中央付近における分離展開列の移動距離に比べて両端
の分離展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわ
ゆるスマイリンク効果がしばしは現れる。あるいは、電
気泳動により分離展開する場合において電圧が支持媒体
に均一に印加されない場合があり、そのような場合にも
分離展開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため
、得られる分Ｉ帷展開列に歪みが生じがちである。

以」−のような場合においては、放射性標識物質の位置
情報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を
利用しても分＃展開された放射性標識物質の位置情報、
すなわちＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を
充分な精度て得ることは困難である。

本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放射線フィルムを用いる放射線写真法の代
りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を
利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有す
るオートラジオグラフを特に画像化することなく、その
位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデジタ
ル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質の分
布位置を検出するだめのサンプリング点に対して、さら
に好適な信号処理を行なうことによりＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基配列を簡易かつ高精度に決定する
ことを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するだめのオートラジオグラフィーに
おける信号、処理方法であって、放射性標識が付与され
たＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の特異的切断分解に
より得られた、１）グアニン特異的切断分解物、アデニ
ン基末端切断分解物、チミン特異的切断分解物、および
シトシン特異的切断分解物を含む基準混合物を少なくと
も二組、および、 ２）少なくとも一種類の塩特異的切断分解物を含む切断
分解物を少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準ン昆合物の分離展開列が、少なく
とも一列の上記２）の塩基特異的切断分解物の分＃展開
列を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に分離
展開されてなる少なくとも三列の分離展開列を構成する
放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄
積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄積
性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有す
るオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍
光体シートを電磁波で走査して該オートラジオクラブを
輝尽光として放出させ、そしてこの坤Ｔ２々光を光電的
に読み出すことにより得られるそれぞれの分Ｎト展開列
のオートラジオグラフに対応するデジタル信号について
、 ｉ）該基準４ｊｕ合物の分Ｎト展開列のそれぞれを基準
列とし、これらのノ、Ｑ　１（Ｉｉ列について２、（準
サンプリング点を検出する工程、 １１）基準列以外の分＋？ａ展開列についてサンプリン
タ点を検出する工程、 １１１）該複数の基準列間で対応する基檗サンプリング
点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
線を設定する工程、そしてｉｖ）該連続線により、基準
列以外の各分離展開列のサンプリング点を比較同定する
工程、を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理
方法からなるものである。

すなわち、本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重
ね合わせることによって試料から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積性蛍光体シート［コ吸収させたのち、この
蓄積性か光体シートを可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）で走査することにより、蓄積性蛍光体シー
トに蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光
）として放出させ、この蛍光を光電的に読み取って電気
信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号
として得ることからなる放射線像変換方法を利用するも
のである。

上記放射線像変換方法については、たとえは米国特許第
３，８５９，５２７号明ｍ書および特開昭５５−１２１
４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルギーの
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線なとの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
して輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を勃
に画像化を経由することなく直接に、一定レベルを有す
るデジタル信号として得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位１δを中心と
する各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射
性物質の集合体の存在位置と形状、その位巧における放
射性物質の濃度、分布なとからなる情報の一〇もしくは
任意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−次
元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識物
質のオルトラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの転写
する操作における位罵ズレなとにより、蓄積性蛍光体シ
ート上に転写蓄積されたオートラジオグラフ全体にわた
って歪み、ズレが生している場合にも、精度高＜ＤＮＡ
もしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定することが
できる。とりわけ、分１殖展開方向の歪みに対しては、
分離展開時に内部標準として複数の基準列を設けること
によ、す、デジタル画像データ上において基準列に基づ
いてその歪みを測定し、（ηられた歪みの補ｉ−％各列
について行なったのちに、各列の分＃展開部位を同定す
ることが可能となる。従って高精度に、かつ合理的にそ
の塩基配列を決定することができるものである。

本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識か付与されたＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物を塩基
特異的に切断分解することにより得られる各塩基特異的
切断分解物もしくはその混合物が、−次元的方向に分離
展開された支持媒体を挙げることができる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカケルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーかその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル軟支持ｂＷ体を州いる電気泳動法が代
表的な分子ｌ＋　Ｉｊｉｓ開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。室光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価のユーロピウ
ムル（油室化臭化バリウム（Ｂ　ａＦＢ　ｒ　：　Ｅ　
ｕ”）蛍光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステ
ルとの１昆合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍
光体シートは、たとえば、支持体としてポリエチレンテ
レフタレートなどのシートを用い、このシート上に上記
蛍光体層を設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリ
エチレンテレフタレートシートなどを設けたものである
。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の転写蓄積操作（Ｒ光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わ七ることにより、その支
持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少な
くとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施する
。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとが
近１妾した４大態で配ｊとされて急）れは゛よく、たと
えば゛、常温もしくは低温で少なくともａ秒間この状態
に置くことにより行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、本出願人による特願
昭５７−１９３４１８号明細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに転写蓄積
された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情
報を読み出してデジタル信号に変換するだめの方法につ
いて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは読
取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）１に蓄積記憶されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
だめの先読み用読出部２と、放射性標識物質の位置情報
を出力するため番こ蛍光体シート１に蓄積記憶されてい
るオートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用
読出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シートｌから発生する輝尽発光の波長領
域に該当する波長領域の部分がカントされる。次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器７により偏向
処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここて用いる
レーザー光ｒＡ４は、そのレーザー光５の波長領域が、
蛍光体シート１から発する輝尽発光の主要波待領域と重
複しないように選択される。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光体シー
ト１の全面にわたって偏向レーザー光が照射されるよう
になる。なお、レーザー光源４の出力、レーサー光５の
ビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シートｌの
移送速度については、先読み操作のレーザー光５のエネ
ルギーか本読み操作（こ用いられるエネルギーよりも小
さくなるように調整される。

蛍光体シート１は、上記のようなレーサー光のｉｉ１４
射を受けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに
比例する光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光
性シート１０に入射する。この導光性シート１０はその
入射面が直線状で、蛍光体シート１上の走査線に対向す
るように近接して配置されており、その射出面は円環を
形成し、フォトマルなどの光検出器１１の受光面に連絡
している。この導光性シート１０は、たとえはアクリル
系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工して
つくられたもので、入射面より入射した光かその内部に
おいて全反射しながら射出面へ伝達されるように構成さ
れている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性
シート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出面か
ら射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器１ｌの受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターか貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力ざれた蓄積
記録情報は、本読み用続出部３の制御回路１３にスカさ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
およひ収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シー１・
１は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作が行
なわれる。

本読み用レーサー光源１４から発せられたレーサー光１
５は、前述のフィルクーロと同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンク−１７に
よりビーム径の大きさが散音に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−！′（°・の光偏向器１８に
より偏向処理され、平面反射鏡１９により反射されたの
ちコ１１゛光体シート１−にに一次元的に偏向して入射
する。なお、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間には
ｆＯレンズ２０等が配置され、イｉｆ光体シート１の」
−を偏向レーザー光が走査した場合に、常に均一なビー
ム速度を肩１持するようにされている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様にイｊｔ光体シート１の全面にわたっ
て偏向レーザー光が照射されるようになる。

頌゛光体シート１は、上記のようにしてレーザー光の照
射を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録
されている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光
を発し、この光は木読み用導光性シート２２に入射する
。この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シー
ト１０と同様の材質、構造を有しており、本読み用導光
性シート２２の内部を全反則を繰返しつつ導かれた輝尽
発光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受光
される。なあ、光検出器２３の受光面には輝尽発光の波
長領域のみを選択的に透過するフィルターか貼着され、
光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされてい
る。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換さ
れる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、上記においては先読み視・１′１
と本読み操作とからなる読出し操（／ｊを、：ｓｑ明１
−だか　本発明において利用することがてきる読出し＋
９．　（’＋は、上記の例に限られるものではない。た
とえは、支持媒体上の放射性標識物質のＨ，＋、および
その支持媒体についての蓄積性蛍光体シートの露光時間
が予めわがっていれば、上記の例において先読み操作を
省略することも可能である。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転すＪ″′
蓄植５れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情ｔμを
読み出すだめの方法は、−１−記に例示した方Ｖ：に限
られるわけてない。

このようにしてｑ′−ｊられた放射性標識物質のオーＩ
・ラジオグラフに対応するデジタル信号は、次に、イ目
図に示される信号処理回路２６に人力される。信じ処理
回路２６では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記
号および／または数値化することにより）、目的のＤＮ
Ａの塩基配列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィーにおける信号処理の実施ｙパ；様を、前記のマキ
サム・ギルバート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法
を例にとり、その塩基配列決定のための典型的な塩基特
異的切断分解物の組合わせとして、次の五種類の塩基特
異的切断分解物もしくは切断物＃シ合物を用いた場合に
ついて説明する。

１）基準混合物ニ グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物、 ３）アデニン特異的切断分解物、 ４）チミン特異的切断分解物、 ５）シトシン特異的切断分解物、 ます、放射性標識（３２Ｐ）か旧年されたＤＮＡ８１；
分分解物を常法により各塩基単位で切断することにより
、上記２）〜５）の四群の塩基特異的切断分解物を得る
。また上記１）の基準混合物は、２）〜５）の四群の１
ｎノ、（希異的切１！Ｉｉ分解物を４昆合して調製する
。

次に基Ｊ＜ｌ；　４７６合物および上記四群の塩基特異
的切ｔｌｉ分解物を、ケル支持媒体」二で電気泳動によ
り分７４　ＪＪ＜開させてそれぞれの分離展開列をイ１
する。ただし、−１−記１）の基べ（、混合物の分Ｎ［
展開列は、後に述べる信号処理操作における基べ１・列
となるものであり、本発明においては、少なくとも二列
（奸才しくは三列以」−）１没け、かつ互いに隣接する
二列のＪ、Ｉ（７！Ｉｊ列が上記２）〜５）の四群の塩
基特異的切断分解物の分ＮＦ′展開列のいずれかを挟む
ように配置させるようにして分離展開操作を行なう必要
がある。

次に、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支十）
媒体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わ
せることにより露光操作を行ない、試料のオートラジオ
グラフを蓄積性ず光体シートに転写蓄積する。」二足の
先光操作の詳細については、前記の特１頭昭５７−１９
３４１８号明細書に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの塩基異的切
断分解物が分閃Ｆ展開されてなる上記五線類からなる分
＋’ｉｌｔ展開列（泳動列）のオートラジオグラフの例
を示す。すなわち、第２図の第１列から第７列は順に、 （１）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （２）−（Ｇ）特異的切断分解物 （３）−（Ａ）特異的切断分解物 （４）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （５）Ｌ　（Ｔ）特異的切断分解物 （６）−（Ｃ）特異的切断分解物 （７）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）ギｊ異的すＪ断分解物 の名体動列を示す。第１列、第４列および第７クリは、
（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の全ての塩基異的切断分解物を含ん
だ混合物の分＃展開列であり、これが■瀉、Ｊ１（配列
決定のための内部標準列（〕、（準外型となる。

蓄積性”Ａｔ光体シートに転写蓄積されたオートラジオ
グラフを第１図に示した読出装置に装填して読み出すこ
とにより、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号
は、蓄積性偵光体シートに固定された座標系で表わされ
た番地（ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル
（Ｚ）とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光
量に対応している。すなわち、デジタル信号は第２図の
オートラジオグラフに対応している。従って、信号処理
回路２６には、上記放射性標識物質の位置情報を有する
デジタル画像データが入力されることになる。本発明に
おいて、デジタル画像データとは、放射性標識物質のオ
ートラジオグラフに対応するデジタル信号の集合体を意
味する。

ます、テジクル画像テータ上で、上記上列のそれぞれに
ついて放射性標識物質の分離展開操作を検出し、それら
をサンプリング点とする。サンプリング点は、たとえは
、次のようにして検出することかできる。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展開列方向）を横断するようにデジタル
画像データ」二の異なる位置を平行に二回走査すること
によって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布
点を検出しくこの分布点を検出するだめの走査を予備走
査という）、各列についてそれぞれ二分布点を結んで七
本の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけるサ
ンプリング点検出のだめの走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において一旦メモリ一手段に記憶される（すなわ
ち、バッファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不
揮発性メモリーに記憶される）。信号処理において、デ
ジタル画像デ−タ上を走査するとは、この走査箇所のデ
ジタル４’ｊ冒のみをメモリーから選択的に取り出すと
を京。

味する。

吹いて、デジタル画像データを上で得たサンプリング点
検出のための走査方向に沿って走査することにより、走
査領域上の信胃のレベルを表わす関数ｆ　（ｗ）［ｗは
走査力向上の位置を表わす］を得ることかてきる。そし
てこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえは適当なフィルター関
数を用いてコンボリューションを行なうことによりスム
ージング処理を施し、関数ｇ（ｗ）をイＨる。次に、こ
の関数ｇ（ｗ）に悶イＩＣ（処理を行なう。すなわち、
間（ｉｊｉ　（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ　（ｗ）　−１ｇ　（ｗ）　
＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すことによ
り、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数に変換する。

サンプリング点は、ｇ　（ｗ）＝　１の領域の各中点と
することにより検出される。なお、上記の閾値処理にお
ける閾値（α０）は、たとえば、走査領域上のデジタル
信号について、信号のし“ベルと、その頻度との関係、
すなわち色ストグラムから決定することができる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合、（
Ｓｋｎ　（Ｘｋｎ、”／ｋｎ、Ｚｋｎ））を検出するこ
とができる。ここで、ｋは正の整数であって各列の番号
を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリング点の番
号を表わす。なお、サンプリンタ点を検出するための方
法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、基準列である第１列、第４列および第７列のサン
プリング点Ｓ１ｎ、ＳａｎおよびＳ７ｎをそれぞれ基準
サンプリング点とし、各基準列において対応する基準サ
ンプリング点、すなわちサンプリンク点の番号ｎが等し
い基準サンプリング点を結んで複数の直線（もしくは折
れ線）を得る。たとえば、分離展開位置の最も遠い（ｎ
−１の）基準サンプリング点Ｓｌｌ、Ｓ４１およびＳ７
１を結んで折れ線を得、さらにｎ＝２．３’。

・・・・・・についても同様にして順次直線（もしくは
折れ線）を得ることにより、各基準列における基準サン
プリング点の数だけの直線（もしくは折れ線）を得る。

さらに、得られた折れ線を適当な曲線で近似することも
できる。これらの直線、折れ線または曲線からなる連続
線群は、分用展開位置についての等高銀１’ｆ　（Ｌ　
ｎ　ｌ　とみなすことかできる。ただし、ｎは基準サン
プリング点の番号ｎに一致する。

第３図は、上記のようにして（！ｊられる曲線で近似さ
れた富、高銀の一部分を示す図である。

この′：９高線高銀に、第２列のサンプリング点につい
て比較同定を行なう。たとえば、第２列のサンプリング
点５２１については、サンプリンク点Ｓ２１の位置（Ｘ
２　ｒ　＋　”／２　＋）が等高銀り、とＬ２のうちと
ちらにより近いかを判定し、近い方の等高銀かり、であ
るとすると、サンプリング点Ｓ２１は）、Ｉｗ　ｙ、（
＋Ｈサンプリング点Ｓ、＋１に帰属することかできる。

このようにして順に第２列の全てのサンプリンタ点を基
準サンプリンク点のいずれかに」１ｊ：属させる。

また、同様の操作を第３列、第５列および第６列につい
ても行ない、２；ｕ　ｉ＜ｊ利足外の分離展開列の全て
のサンプリング点Ｓｋｎを基準サンプリング点Ｓｌｎの
いずれかに帰属させる。

上記の操作により、ｙ座標（ｙｋｎ）で表わされるサン
プリング点Ｓｋｎを等高銀Ｌｎをもって表わすことがで
き、また、この等高銀は泳動座標ともいえるから、この
操作は換言すれば、ｘｙ座標から泳動座標への座標変換
とみなすことができる。

次に、第２列、第３列、第５列および第６列について、
ｎの小さい順に基準サンプリンク点Ｓｌｎとサンプリン
グ点Ｓｋｎとを比較していき、それか合致したとき、そ
の３％Ｂサンプリング点３３ｍを合致したサンプリング
点Ｓｋｎで置き換える。そして、基準列をｎの小さい順
にたどれば、たとえば、次のような図式を得ることがで
きるＳｉｔ、Ｓ６＋　・Ｓ５１　・Ｓ２２・Ｓ３１　・
Ｓ３２　＋　Ｓ　５２　＋　Ｓ　２３　＋　Ｓ　６２　
＋・・・・・・上記図式において、Ｓ２　ｎ＝Ｇ、Ｓ３
　ｎ＝Ａ、Ｓ５ｎ：Ｔ、５６ｎ＝Ｃと置二き換えること
により、次のような図式を得る。

Ｇ−（、−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・
このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩
基配列を決定することかできる。なお、得られたＤＮＡ
の塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られ
るものではなく、任意の表示形態が可能である。たとえ
ば、所望により、ざらに各列の走査方向上における信号
のレベルを任意に演算処理することにより、分離展開さ
れた各え塩基特異的切断分解物の相対量をも表示するこ
とが可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式におｌ／＼て各塩基に対応する組
合わせとして、Ａ→Ｔ、Ｇ＋Ｃ、Ｃ＋Ｇ、Ｔ−＋Ａなる
情報を与えることにより、次のような図式で表わされる
ＤＮＡの塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・Ｃ
−Ｇ　−Ａ　−Ｃ−Ｔ　−Ｔ　−Ａ　−Ｃ−Ｇ−・・・
・・・なお、本発明の信号処理方法により、上記の（Ｇ
＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ，Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組合わせを利用した
ＤＮＡの塩基配列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定方法
の一例であって、本発明の信号処理方法は、上記の組合
わせに限定されるものではなく種々の組合わせか可能で
あり、またその組合わせを利用して、上記の方法に準じ
る方法により同様にして塩基配列を決定することができ
る。

本発明においては、たとえば、（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組
合わせを利用しても、ＤＮＡの塩基配列を決定すること
ができる。

たたし、いずれの組合わせにおいても内部標準として、
末端塩基がＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの四種類の塩基特異的切断分
解物の混合物の列（基準列）を複数列設け、塩基配列決
定対象の塩基特異的切断分解物の分離展開列をこの複数
の基準列の間に配置するような分離展開を行なうことが
必要である。

この基準列の分離展開位置は、高精度にＤＮＡの塩基配
列を決定するためには、各列かできる限り耀［れている
のが好ましい。すなわち、基準列が三列である場合には
、複数の分離展開列の両端部に配置するのが好ましく、
三列である場合には、複数の分局１展開列の両端および
中央部に配置するのが好ましい。基準列が三列よりも多
い場合には、検知対象の分＃展開列の間に適当な間隔を
もって配置されるのが好ましい。三列以上の基準列の設
置は、放射性標識物質か分＃、展開された支持媒体に前
述のスマイリング効果が生じている場合には特に有効で
あり、ＤＮＡの塩基配列を高精度に決定することができ
る。設置する基準列の数が増加するほど得られる等高線
は正確なものとなり、従ってＤＮＡの塩基配列を高精度
に決定することが可能となるが、基準列をそれだけ多く
配置しなければならないという短所もあるため、それら
の基準列の数および配置なとは、分＋？ａ展開の条件、
目的とする塩基配列決定の精度などにより適宜設定する
ことが好ましい。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離展開している七列の放射性標識物質群を用いて説
明したが、分離展開列は七列に限定されるものではなく
、分離展開列の数か多いほど有用なものである。少なく
とも三列の基準列を支持媒体上に設けることにより、デ
ジタル画像データ上で等高線を得、この等高線によって
位置を決定することができるため多数の分離展開列に適
用することができ、かつ、歪みの大きな場合にも高精度
でＤＮＡの塩基配列を決定することができる。あるいは
、一つの支持媒体を用いて同時に二種類以上のＤＮＡの
塩基配列を決定することも可能である。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえは、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記弓・数仙をヒ
テオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料」二に記録するものなと種々の原理に基ついた
記録装置を用いることかてきる。

なお、］−記のようにして（Ｈられた情報は、このほか
にも、たとえは、既に記録保存されている他のＤＮＡの
塩基配列と照合するなどの遺伝名語学的情報処理を行な
うことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいはＦＣ取装置）の例を示すもの
である。 １：蓄積性蛍光体シート、２°先読み用読出部、３　本
読み用読出部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６
　フィルター、７・光偏向器−１８：平面反射鏡、９：
移送方向、１０：先読み用導光性シート、Ｊｌ、光検出
器、１２：増幅器、１３：制御３１回路、１４．レーザ
ー光源、１５　レーサー光、１６、フィルター、１７・
ビームφエクスパンター、１８：光偏向器、１９：平面
反射鏡、２０．ｆθレンズ、２１：移送方向、２２゜本
読み用導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器、
２５・Ａ／Ｄ変換器、２６・信号処理回路　　　　　。 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物がゲル支持体
上で分出ＩＦ展開された試料のオートラジオグラフの例
を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高銀の一部分を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 し□□ ＋＋　　３　４　　＋２ 　１ Ｌ−糸シ′己ネ市−ｊ土ミ、ｌ） 昭和５８イ１１月２５１１ ′ｌ１１訂庁に官　　ジ゛１杉和夫　殿１゜　中ぼＩの
表ンバ　　　　／”　　−ｃｒ−；７−’ぐＪ　＋’　
　　　　、、−−− １召和５８　＜（′を月８１１提出の特１．１原ｊｉ（
１２）２゜発明の名称 オートラジオグラフィーにおける信り処理力法３゜補止
をする渚 ・ＩＩイ１１との関係　　　　′持訂出１ｊ／ｉ友住所
　　　　（５２０）７：り＋′す４１（フィル１、株式
会社氏名　　　　　代表者　犬　西　　Ｌｉｔ’４゜代
理人 ６゜袖ｉＥにより増加する発明の数　　　　　　なし−
ｘ′ 手続補正書 昭和θ年７ρ月）７日 特許庁長官　若杉和夫殿 １　事件の表示 昭和５８＜１　　特許願第　１３３２号２　発明の名称
　　オートラジオグラフィーにおけるイ厄号処理方法３
　補正をする者 ４１ｆ１との関係　　特許出願人 ４代理人 別紙の通り Ｑｌ撞Ｉ＋、’；の「発明の＾゛ｆ岬な説明」の欄を下
記の如く補正致します。 記 一二順貝馴一　　　　　−二肛月組＝ （］）１２２５５行１−１　　特異的切断分解　　→　
塩基特異的以逝分解（２）１２頁１０行１１１ｎ特異的
切断分解　→　堪基詩異伯辺瓶分解物物 （３）＋２頁１１行口　　切断分解物　　　　→　塩基
牡踵的以題分解物細書および （５）１５頁５行目　　一定レベルを有す　→　削除る （６）＋９頁２０行口　　記憶　　　　　　　→　記憶
（７）２０頁３行「；　　記憶　　　　　　　→　吊屡
（８）２９頁３行１１　　　塩基異的切断　　　→　塩
基異的切断（９）３４頁１５行目　　３３ｍ　　　　　
　＋　各１１（１０）３５頁１２行［１え　　　　　　
　　→　削除（１１）図　　面　　　第２図、第３図の
補正図面を添付する。 以」二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配クリを決
   定するだめのオートラジオグラフィーにおける信号処理
   方法であって、放射性標識か（ｑ与されたＤＮＡもしく
   はＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解により得られ
   た、 １）クアニン特異的切断分解物、アテニン特異的切断分
   解物、チミン特異的切断分解物、およびシトシン特異的
   切断分解物を含む基準ン昆合物を少なくとも二組、およ
   び、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
   基特異的切断分解物を少なくとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 二足１）の二組の基準混合物の分＃展開列が、少なくと
   も一列の上記２）の塩基特異的切断分解物の分＃展開列
   を挟むように互いに平行関係を以って一次元的に分離展
   開されてなる少なくとも三列の分離展開列を構成する放
   射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを蓄積
   性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄積性
   蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有する
   オートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光
   体シートを電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝
   尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み
   出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
   ラジオグラフに対応するデジタル１８号について、 １）該基準４昆合物の分離展開列のそれぞれを基準列と
   し、これらの基準列について基準サンプリング点を検出
   する工程、 １１）基準外以外の分＃展開列についてサンプリンク点
   を検出する工程、 １１１）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
   点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
   線を設定する工程、そしてｉ　！’）・１ネ建航に！）
   ）により、ノ、にべ１列以外の各分ｊ礁展開、′／ｉ１
   のサンプリング点を１１較同道テする−「程、を含む゛
   オートラジオクラフィーにおける信号処理力１人。 ２゜Ｉ−記１）のノ、（皓混合物の分出１［展開列が少
   なくとも三列配置され、かつ、互いに隣接する二重の）
   、１（Ｊ（Ｂ　：、昆合物の分剛°展開列か、少なくと
   も一列のト記２）の塩基特異的切断分解物の分子４展開
   列を挟むように配置されていることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のオートラジオクラフィーにおける
   信号処理方法。 ３゜サンプリング点か、複数の分軸展開列のそれぞれの
   走査力向上のデシクル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許Ａｌ１求の範囲第１項もしくは
   第２項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理
   方法。 ４゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的ジノ
   断分飴′物が、 １）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ３）アデニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ４）チミン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分解
   物 ５）シトシン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 を含む少なくとも五群の塩基特異的切断分解物であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れかの項記載のオートラジオグラ２イーにおける信号処
   理方法。