JPS59126247A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信は処理力
法に関するものである。ざらに詳しくは、本発明は、オ
ートラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列法定のだめのテジタル偶号処理に
おける放射性標識物質の分離展開位ｔξの比較同定方法
に関するものである。

支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分布して
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィーが既に知られ
ている。

たとえは、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
伺した高分子物質、その誘導体、めるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分閏ＩＥ操作にかけて分離展開を行
なうことにより、該支持媒体上に放射性標識物質の分離
展開列を形成させ、この分離展開列のオートラジオグラ
フを放射線フィルムに転写記録したのち、可視化し、可
視画像から放射性標識物質の位置情報を得ている。また
、得られた放射性標識物質の位置情報を基にして、その
高分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量
、特性の評価などを行なう方法は既に開発され、実際に
利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様）の塩
基配列の決定に有効に利用されている。

このオーＩ・ラジオグラフィーを利用することによりＤ
ＮＡの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・ギ
ルパー）　（Ｍａ＋＋ａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およ
びサンカー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕ　１ｓ
ｏｎ）法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡが二
本の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその
二本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニ
ン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（
Ｔ）なる塩基を有する構成単位から構成されていること
、そして、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩
基間の水素結合によって架橋されており、しかも各構成
単位間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組
合わせのみにおいて吏現しているというＤＮＡの特徴的
な構造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法
である。

たとえば、マキサムφギルバート法は、次に述へるよう
な方法により実施される。

まず、堪ス（配列を決定しようとしているＤＮＡあるい
はＤＮＡの分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（Ｐ
）の放射性同位元素を含む基を結合させることにより、
その対象物を放射性標識物質としたのち、化学的な手段
を利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的
に切断する。、次に、この操作により得られるＤＮＡあ
るいはＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的切断分解物の
４昆合−物をケル電気泳動法により分１′８１１′展開
し、多数の塩基特異的切断分解物がそれぞれ帯状を形成
して分ｍｌｔ　ｙＣ開された分離展開列（ただし、視覚
的には見ることができない）を得る。−そして、この分
離展開列のオートラジオグラフをＸ線フィルム」二に可
視化して、得らりだ可視画像と各々の塩基特異的切断手
段とから、放射性同位元素が結合された鎖状分子の端部
から一定の位置関係にある塩基を順次決定し、このよう
にして対象物のすべての塩基の配列を決定している。

ところで、上述のように従来の放射線写真法を利用する
オートラジオグラフィーでは、放射性標識物質の位置情
報を得るためにはこの位置情報を有するオートラジオグ
ラフを放射線フィルム上に可視化することが必須要件と
なっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを視覚的に観察することにより、支持媒体上の放射性
標識物質の分布を判断している。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与され
た塩基特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれ
について、分離展開位置を視覚的に判断し、それら切断
分解物の分離展開列を相互に比較することにより決定さ
れている。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィ−では、上
述のようにその解析作業は人間の目に依存しているため
、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析して
得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によって相
違する場合が発生大るなどの問題があり、得られる情報
の精度には限界かある。特に、放射線フィルム」二に可
視化されたオートラジオグラフが良好な画質（鮮鋭度、
コントラスト）を有していない場合には、満足できる情
報が冑られがたく、またその精度は低ヰする傾向にある
。従来より、求める位置情報の精度を向上させるために
、たとえば、その可視化されたオートラジオグラフをス
キャニングデンシトメーターなどのＡ１１１定器具を用
いて測定する方法も利用されている。しかしながら、そ
の−ような測定器具を単に用いる方法においては精度の
向上に限界がある。

たとえは、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放
射線フィルムとを富着させて行なわれる露光操作時にそ
の重ね合わせにズレが生じる場合かあり、この場合には
放射線フィルム上に可視画像として得られる分Ｎ！、展
開列（たとえば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対し
て平行でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質
の位置情報を視覚的に判断する際に誤差が生しやすくな
り、その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分
離展開条件によって、得られる分＃展開列が支持媒体の
長さ方向に対して平行でなかったり、歪んだりすること
が往々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物声は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはケル中に空％泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央付
近における分＃展開列の移動距離に比べて両端の分離展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分＃展開する場合において電圧が支持媒体に均一に
印加されない場合があり、そのような場合にも分Ｉｎ　
ｎ＋開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、
（’Ｊ・られる分ＰＡ’ｉ　５ｉ（開動に歪みが生じが
ちである。

このような分ｔＪｈ　Ｋ開列の歪みは人為的に補正する
以外には適当な方法がなく、従って、以上のような場合
においては、放射性標識物質の位置情報の解析が特に困
難になり、前記のような測定器具を利用しても分＃展開
された放射性標識物質の位置情報、すなわちＤＮＡもし
くはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を充分な精度で得るこ
とは困難である。

本発明者は、従来のオートラジオグラフィーにおいて利
用されている放射線フィルムを用いる放射線写真法の代
りに、蓄積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を
利用することにより、放射性標識物質の位置情報を有す
るオートラジオグラフを特に画像化することなく、その
位置情報をデジタル信号として得たのちに、このデジタ
ル信号に信号処理を施して得られた放射性標識物質の分
布位置を検出するためのサンプリング点に対して、さら
に好適な信号処理を行なうことによりＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基配列を簡易かつ高精度に決定する
ことを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーに
おける信号処理方法であって、放射性標識が付与された
ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の特異的切断分解によ
り得られた、１）グアニン特異的切断分解物、アデニン
特異的切断分解物、チミン特異的切断分解物、およびシ
トシン特異的切断分解物の四種類の塩基特異的切断分解
物を含む特異的切断分解物のン昆合物、および、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
基特異的切断分解物、 を含む少なくとも二群の切断分解物試料のそれそれか、
支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分囚展開され
た放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを
蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄
積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有
するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性
蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグラフ
を輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に
読み出すことにより得られるそれぞれの分＋’！’、Ｉ
　Ｋ開動のオートラジオグラフに対応するデジタル信号
゛号について、 ｉ）該四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物
の分離展開列を基準列とし、この基準列について基準サ
ンプリング点を検出する工程、 １１）基準外以外の分離展開列についてサンプリング点
を検出する工程、そして １１１）該基準列の基準サンプリング点を基準として隣
接する分離展開列のサンプリング点の比較照合を行なう
ことにより、その隣接する分＃展開列のサンプリング点
を同定する工程、５を含啄むオートラジオグラフィーに
おける信号処理方法を提供するものである。

すなわち、本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重
ね合わせることによって試料から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄
積性蛍光体シートを可視光線および赤外線などの電磁波
（励起光）で走査することにより、蓄積性蛍光体シート
に蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（輝尽発光）
として放出させ、この蛍光を光電的に読み取って電気信
号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号と
して得ることからなる放射線像変換方法を利用するもの
である。

上記放射線像変換方法については、たとえば米国特許＄
３，８５９，５２７号明細書および特開昭５５−１２１
４５号公報等に記載されている。

本発明誹こ用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば
、二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲ
ン化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含イｊするもので
ある。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α曾）メ、β線、γ
線、紫外線な、どの放射線の照射を受けてその放射線エ
ネルギーの一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線
などの電磁波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネ
ルギーに応じて輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質ｄ位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のような支持媒体」二における放
射性標識物質の分＃展開時の位置的な歪み、あるいは−
次元的方向に分布して分布列を形歳。

している放射性標識物質のオートラジオグラフを蓄積性
蛍光体シートへの転写する操作（こおける（＜装置ズレ
などにより、蓄積性蛍光体シート出番こ転写蓄積された
オートラジオグラフ全体（こわたって歪み、ズレが生じ
ている場合にも、精度高＜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分
解物の塩基配列を決定することができる。とり□わけ、
分離展開方向の歪み（こ対しては、分離展開列間でその
歪みを補正しな力ζら各列の分離展開部位を同定するこ
とが可能−であり、従って高精度に、かつ合理的にその
塩基配列を決定することができるものである。

また、効率良く実験を行なうために、一般しこ、支持媒
体上にはできるだけ多くの分離展開列をＷＱけることが
行なわれている。その結果、前述のスマイリング効果な
どの分離展開列の歪みを生じやすいものであるが、本発
明は、内部標準としてＤＮＡの四種類の塩基特異的切断
分解物の全てを含む基準列を設けることにより、支持媒
体上の分甜り展開列の全てについてそ４歪みを補正する
ことを可能にするものである。

本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付与されたＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物を塩基
特異的に切断分解することにより得られる各塩基特異的
切断分解物もしくはその混合物が、−次元的方向に分離
展開された支持媒体を挙げることができる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマ
ー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる
電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄
層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げら
れる。

このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法が代表
的な分離展開方法であり、好ましい、。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価のユーロピウ
ム賦活弗化臭化バリウム（Ｂ　ａＦＢ　ｒ　：　Ｅ　ｕ
”）蛍光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステル
との混合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体
シートは、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフ
タレートなどのシートを用い、このシート上に上記蛍光
体層を設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエチ
レンテレフタレートシートなどを設けたものである。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性蛍光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性蛍光体シートへ
の転写蓄積操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積性蛍光
体シートとを一定時間重ね合わせることにより、その支
持媒体上の放射性標識物質から放出される放射線の少な
くとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸収させて実施する
。この露光操作は、支持媒体と蓄積性蛍光一体シートと
が近接した状態で配置されていればよく、たとえば、常
温ぎしくは低温で少なくとも数秒間この状態に置くこと
により行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、本出願人による特願
昭５７−１９３４１８号明細書に記載されている。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに転写蓄積
された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情
報を読み出してデジタル信号に変換するだめの方法につ
いて、添付図面の第１図に示した読出装置（あるいは読
取装置）の例を参照しなから略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）１に蓄積記憶されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
だめの先読み用読出部２と、放射性標識物質の位置情報
を出力するために蛍光体シートｌに蓄積記憶されている
オートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用読
出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シー｝１から発生する輝尽発光の波長領
域に該当する波長領域の部分がカットされる。次いでレ
ーザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器７により偏向
処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光体シ
ート１上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域が、蛍
光体シート１から発する輝尽発光の主要波長領域と重複
しないように選択される。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印９の方向に移送される。従って、蛍光体シー
ト１の全面にわたって偏向レーザー光か照射されるよう
になる。なお、レーザー光源４の出力、レーザー光・５
のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シート１
の移送速度については、先読み操作のレーザー光５のエ
ネルギーが不読み操作に用いられるエネルギーよりも小
さくなるように調整される。

蛍光体シート１は、上記のようなレーザー光の照射を受
けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例す
る光量の輝尽発光を示し、この光は先読み用導光性シー
）・１０に入射する。この導光性シート１０はその入射
面が直線状で、蛍光体シー）・１上の走査線に対向する
ように近接して配置首されており、その射出面は円環を
形成し、２第１・マルなどの光検出器１１の受光面に連
絡している。この導光性シートＩＯは、たとえばアクリ
ル系合成樹脂などの透明な熱可創性樹脂シートを加工し
てつくられたもので、入射面より入射した光かその内部
において全反射しながら射出面へ伝達される。よらに構
成されている。蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導
光性シート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出
面から射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１１により検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器１２によ
り増幅され出力される。増幅器１２から出力された蓄積
記録情報は５本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、−適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値
ａおよび収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シートｌ
は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次、のような木読み操作が
行なわれる。

本読み用レーザー光源１４かや発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能を有するフィル
ター１６を通過したのちビーム・エクスパンダ−１７に
よりビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレー
ザー光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向
処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。なお、光偏
向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆＤレンズ２０等
が配置され、イハ゛光体シートｌの上を偏向レーザー光
が走査した場合に、常に均一なビーム−速度を維持する
ようにされている。

蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射下にお
いて、矢印２１の方向に移送される。従って、先読み操
作におけると同様に蛍光体シート１の全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蛍光体ンート１は、上記のようにしてレーザー光の照射
を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録さ
れている放射線エネルギーに比例する光量の一尽発光を
１発し、この光は本読み用導光性シート２２に人、射す
る。この本読み用導光性シート２２は先読み用導光性シ
、−）　１０と同様の相貫、構造を有しており、本読み
用導光性シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれ
た輝尽発光はその射出面からｔ射出されて、光検出器２
３に受光される。なお、光検出器２．３の受光面には輝
尽発光の波長領域のみを選択的に透過するフィルターが
貼着され、光検出器２３が輝尽発光のみを検出するよう
にされている。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換さ
れる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法について、上記においては先読み操作と本読
み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明にお
いて利用することができる読出し操作は、上記の例に限
られるものではない。たとえば、支持媒体上の放射性標
識物質の量、およびその支持媒体についての蓄積性蛍光
体シートの露光時間が予めわかっていれば、上記の例に
おいて先読み操作を省略することも可能である。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体上の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための方法は、−上記に例示した方法に限られるもので
はない。

このようにして得られた放射性標識物質のオーｉ・ラジ
オクラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示
される信号処理回路２６に入力される。信号処理回路２
６では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号およ
び／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基
配列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィーにおける信号処理の実施態様を、前記のマキサム
・キルバート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法を例
にとり、その塩基配列決定のための典型的な塩基特異的
切断分解物の組合わせとして次の五種類の切断分解物試
料を用いた場合について説明する。

■）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物、 ３）アデニン特異的切断分解物、 ４）チミン特異的切断分解物、 ５）シトシン特異的切断分解物、 まず、試料は常法により、３２　ｐによる放射性標識が
付与された上記五群の切断分解物および切断分解物混合
物をゲル支持媒体上で電気泳動により分離展開させて得
ることができる。次に、この試料（支持媒体）と蓄積性
蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わせることにより
露光操作を行ない、試料のオートラジオグラフを？Ｉ　
ＷＲ性蛍光体シー［・に転写蓄積する。上記の露光操作
の詳細については、前記の特願昭５７　１９３４１８号
明細書に記載されている。

第２図は、放射性標識の付与されたＤ’　Ｎ　Ａが分＋
？、ＪトＩｊｓ開されている上記五種類からなる泳動列
のオートラジオグラフを示す。すなわち、第２図の第１
列から第５列は順に、 （１）−ＣＧ）特異的切断分解物 （２）−（Ａ）特異的切断分解物 （３）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （４）−（Ｔ）特異的切断分解物 （５）−（Ｃ）特異的切断分解物 の各列（泳動列）を示す。第３列は、（Ｇ、　Ａ、Ｔ、
Ｃ）の全ての塩基特異的切断分解物を含んでおり、塩基
配列決定のだめの内部標準列（基準夕１１）である。

蓄積性蛍光体シートに転写蓄積されたオートラジオグラ
フを第１図に示した読出装置に装填して読み出す′こと
により、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は
、蓄積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた
番地（ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル（
Ｚ）とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量
に対応している。すなわち、デジタル信号は第２図のオ
ートラジオグラフに対応している。従って、信号処理回
路２６には上記放射性標識物質の位置情報を有するデジ
タル画像データが入力されることになる。

本発明において、デジタル画像データとは、放射性標識
物質のオートラジオグラフに対応するデジタル信号の集
合体を意味する。

まず、デジタル画像データ上て、上記孔列のそれぞれに
ついて放射性標識物質の分Ｍ展開位置を検出し、それら
をサンプリンク点とする。サンプリング点は、たとえば
、次のようにして検出することができる。

上記デジフルル信号に対して、放射性標識？Ｉ買の−次
元的分布方向を横断するようにデジタル画像データ」二
の異なる位置を二回走査することによって、各走査領域
上で各列の放射性標識物質の分布点を検出しくこの分布
点を検出するための走査を予備走査という）、各列につ
いてそれぞれ二分布点を結んで五本の直線を得、得られ
た直線をそれぞれ各列におけるサンプリング点検出のた
めの走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性蛍光体シ
ートを読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回
路２６において一旦メモリーに記憶される（すなわち、
パｒンファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不揮
発性メモリーに記憶される）。信号処理において、デジ
タル画像データ上を走査するとは、この走査箇所のデジ
タル信号のみをメモリーから選択的に取り出すとを意味
する。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得るこ
とができる。そしてこの間数ｆ　（ｗ）に、たとえば適
当なフィルター関数を用いてコンポリュージョイを行な
うことによりスムージング処理を施し、関数ｇ（ｗ）を
得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行なう。

すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ　（ｗ）　＝　１ｇ　（ｗ）
　＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０とする処理を施すことに
より、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数に変換する
。サンプリング点は、ｇ（ｗ）＝１の領域の各中点とす
ることにより検出される。なお、上記の閾値処理におけ
る閾値（α０）は、たとえば、走査領域上のデジタル信
号について、信号のレベルと、その頻度との関係、すな
わちヒストグラムから決定することができる。

このようにして各列についてサンプリング点Ｓｋｎを検
出することができる。ここで、ｋは正の整数であって各
列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリン
グ点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出する
ための方法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、各列間の比較同定は、具体的には各列の間で同じ
分＃：展開物を探し出す作業が含まれる（たとえば、（
Ｇ）＋　（Ａ）の列と（Ｇ）の列とを比較する場合には
ＣＧ）＋　（Ａ）の列から（Ｇ）の要素となっている分
離展開物を探し出す）。しかし、この比較同定は、前記
歪みのある場合には、第３図のように各列の等価な分離
展開列の位置が必ずしもＸ座標上で等しくはならない。

従来、このような歪みの補正は人間の視覚的な判断にま
かせられていた。しかし、本発明の方法によれば、基準
列および基準サンプリング点を用いることにより１人に
頼ることなく自動的に歪みを補正し、各列間の正確な比
較同定を行なうことができるにのことを第３図に基づい
て説明する。

第３図は、基準列（第３列）および第４列の一部分を示
す図である。ここで、黒四角は放射性標識物質の分＋？
＆展開部位に相当する各列のサンプリング点を表わし、
中空四角は内挿された基準サンプリング点を表わす。

基準列である第３列のサンプリング点Ｓ３ｎを基準サン
プリング点として、隣接する第４列のサンプリング点Ｓ
４ｎとの比較同定を行なうことにより、第４列について
基準サンプリング点の内挿を行なう。

たとえば、第４列のサンプリング点ｓ　４；　ｉ：つい
ては、サンプリング点Ｓ４１の位置（Ｘ４ｔ）と第３列
の基準サンプリング点Ｓ３２の位置（Ｘ３２）およびＳ
３３の位置（Ｘ３３）とを比較する。たとえば、 ＋Ｘ３２　　Ｘａ＋Ｉ＝ａ ＩＸ３３　　Ｘａｔｌ＝ｂ とすると、この場合にはａ＞ｂであるから、サンプリン
グ点３４１は、基準サンプリング点３３３と同じＸ座標
をもつものと帰属される。このようにして順に第４列の
全てのサンプリング点を基準サンプリング点のいずれか
に帰属させる。そして帰属された第４列のサンプリング
点ｓａｎを基にして、残りの第３列の基準サンプリング
点のそれぞれを第４列に内挿することにより、第４列に
おいて仮想的な基準サンプリング点の集合（Ｓａｍ）を
作成する。ただし、ｍは正の整数であり、第３列のサン
プリング点の番号ｎに一致する。このようにして第４列
の位置に第３列で求めた基準列を移動させた仮想的基準
列を得ることができる。

次に、作成した第４列の基準サンプリング点３４ｍを基
に、隣接する第５列のサンプリング点Ｓ５０について基
準サンプリング点ｓ４□を介して基準サンプリング点３
３ｎへの帰属を行ない、さらに第４列の基準サンプリン
グ点ｓａｍを内挿することにより、第５列において仮想
的な基準サンプリング点の組（３５ｍ　）を作成する。

このようにして基準列の基準サンプリング点Ｓ３ｎに基
づいて、順々に各列において仮想的な基準サンプリング
点の組（ＳＫｍ）を作成しながら、全てのサンプリング
点Ｓｋｎを基準サンプリング点Ｓ３ｎのいずれかに帰属
させる。

すなわち、以上の方法は、 １）グアニン特、異イ可表り断分解物、アデニン特異的
切断分解物、チミン特異的切断分解物、シトシン蒔異的
切断分解物の四種類の切断分解物混合物、および、 ２）それぞれが互いに異なる少なくとも一種類の塩基特
異的切断分解物を含む少なくとも二群の塩基特異的切断
分解物、 を含む少なくとも正群の切断分解物試料のそれぞれが、
支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展開され
た放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを
蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄
積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有
するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性
蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグラフ
を輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に
読み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオ
ートラジオグラフに対応するデジタル信号について、 ｉ）該四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物
の分離展開列を基準列とし、この基準列について基準サ
ンプリング点を検出する工程、 ｉｉ）基準列以外の各分１撃展開夕０についてサンプリ
ング点を検出する工程、 １１１）基準列の基準サンプリング点を基準として該基
準列に隣接する分離展開列のサンプリング点の比較照合
を行なうことにより、その隣接する分離展開列のサンプ
リング点を同定し、ここで同定されたサンプリング点に
基づき新たに基準サンプリング点を定める工程、ｉｖ）
上記の１１１）の工程において新たに定められた基準サ
ンプリング点と、その基準サンプリング点が定められた
分ＭＵ開動に隣接する分離展開列のサンプリング点との
比較照合を行なうことにより、その隣接する分離展開列
のサンプリング点を同定する工程、 を含む信号処理方法とまとめることができる。

次に、第１列、第２列、第４列および第５列について、
ｍの小さい順にそれぞれの列における仮想的基準サンプ
リング点（Ｓｋｍ）とその列における実在のサンプリン
グ点Ｓｋｎとを比較していき、それが合致したとき、基
準列（第３列）のｍに対応するサンプリング点Ｓ３ｍを
合致したサンプリング点Ｓｋｎで置き換える。そして、
基準列をｍの小さい順にたどれば、たとえは、次のよう
な図式を得ることができる。

Ｓｌ　１　＋　Ｓ　５１　＋　Ｓ　４１　＋　Ｓ　１２
　＋　Ｓ　２１　＋Ｓ２２＋Ｓ４２＋Ｓ宜３＋Ｓ５２＋
・・・・・・上記図式において、Ｓ　１　ｎ＝Ｇ、Ｓ２
　ｎ＝Ａ、５４ｎ−Ｔ、５５ｎ＝Ｃと置き換えることに
より、次のような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基
配列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの
塩基配列についての′情報は、上記の表示形態に限られ
るものではなく、任意の表示形態゛が可能である。たと
えば、所望により、ざらに各列の走査方向上における信
号のレベルを任意に演算処理することにより、分離展開
された各切断分解物の相対量をも表示することが可能で
ある。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ＋Ｔ、Ｇ＋Ｃ５Ｃ＋Ｇ、Ｔ＋Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−・・・・・・なお
、本発明あ信号処理方法により、上記の（Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋
Ｃ，Ｇ、Ａ、Ｔ、　ｃ）（７）Ｍ合ワセヲ利用したＤＮ
Ａの塩基配列決定法は、Ｄ’　Ｎ　Ａの塩基配列決定方
法の一例であって、本発明の信号処理方法は、上記の組
合わせに限定されるものはなく、種々の組合わせが可能
であり、またその組合わせを利用して、上記の方法に準
じる方法により同様にして塩基配列を決定するどとがで
きる。ただし、いずれの組合わせにおいても内部標準と
して、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩特異的切断分解物の混
合物の列（基準列）を設けることが必要である。この基
準列の分離展開位置は、上記のように必ずしも支持媒体
の中央部に配置する必要はないが、より高精度にＤＮＡ
の塩基配列を決定するためには、支持媒体の中央部に配
置するのが好ましい。また、基準列は、−組のＤＮＡの
特異的切断分解物の組合わせにのみ適用されるものでは
なく、同一種類のＤＮＡであれば、支持媒体上に分離展
開された放射性標識物質群のそれぞれに適用することが
できる。

本発明においては、たとえば、ＣＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組
合わせを利用しても、ＤＮＡの塩基配列を決定すること
ができる。あるいは、少なくとも一群の塩特異的切断分
解物と連出な参照物質（たとえば、各塩特異的切断分解
物の混合物）との組合わせから、特定の塩基についての
配列を決定することも可能である。

また、上記の例においては、″支持媒体上で一次元的方
向に分離展開している五列の放射性標識物質群を用−い
て１明したが、分離展開列は五列に限定されるものでは
なく、五列より多くある場合には本発明の信号処理方法
は特に有効である。すなわち、本発明は、分離展開方向
のズレを基準列を中心として順々に補正しながら同定を
行なう方法であるため、分離展開列の数が多ければ多い
ほど本発明は有効に利用されうるちのである。あるいは
また、同時に二種類し、またそれ以下であってもよい。

あるいは、一つの支持媒体を用いて同時に二種類以上の
ＤＮＡの塩基配列を決定することも可能である。

」−記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力
されたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁
気テープなどの保存手段を介して記録ζ置（図示なし）
へ伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号命数値をビ
デオ中プリンター等に記録するもの−１−漁、ｍ！／）
て感熱記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づ
いた記録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 ｌ：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読山部、３二本
読み用読山部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、１０：先読み用導光性シート、１１：光検出器
、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７・ビーム
・エクスパングー、１８：光偏向器、１９：平面反射鏡
、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２：本読み用
導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器、２５　
：　Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物がゲル支持媒
体上で分離展開された試料のオートラジオグラフの例を
示す図である。 第３図は°、第２図のオートラジオグラフを部分的に拡
大した図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 −ｆ−糸プ己ネ山ｊ１三ｆＬｔ ［固相５８年ＩＪ１２５日 特許庁長官　　若杉和夫　殿 Ｉ周相５８年１月８日提出の特５乍願（１０）２゜発明
の名称 オートラジオクラフィーにおける信−号処理方法３゜補
正をする者 小イ１との関係　　　　特訪出願人 住所　　　　（５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
　　　　　代表者　大　西　　７°３ｊ４゜代理人 ６゜補正により増加する発明の数　　　　　　なし手続
補正書 昭和１年７θ月／７日 特許庁長官　　若杉和夫殿 ］　事件の表示 昭和５８年　　特許願第１３３０　　号２　発明の名称
　　オートラジオグラフィーにおける信号処理方法３　
補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 任　　所 氏　　名（名称）　　　（５２０）富士写真フィルム株
式会社４、代理人 明細書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正致
します。　　　　　　１記 一二１月側−補正後 （１）１Ｂ頁１５行目　　米国特許第３，８　→　削除
から同頁１６行目　　５９．５２７号明細書および （２）２１頁２０行目　　記憶　　　　　　　→　四（
３）２２頁３行目　　記憶　　　　　　　→　四（４）
３５頁１１行目　　Ｓ４ｍを内挿　　　→　Ｓｍ　　　
５Ｅ内押（５）３Ｅｉ頁５行目　　塩基特異的切断物　
→　塩基特異伯以逝分解物解物 ３ｍ （７）３Ｂ頁５行目　　ｍ＋Ｑ （８）３９頁２０行目　　塩基異的切断物解　→　　　
、゛異＋　９）４０頁１４行目　　党Ａ特Ｗ的９Ｊ断分
解　−広益特、累ｆのノ声ｒ予１解物物 （１０）４０頁１５行目　　各塩基異的切断物　−芥Ｗ
）１的ｆｆｉ惠■分解解物　　　　　　　　　じ （１１）４１頁７行目　　同時に二種類し、　　−九列
以下またそれ以下 （１２）図　　面　　　第３図の補正図面を添イ・１す
る。 以　　ｌ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するだめのオートラジオグラフィーにおける信号処理方
   法であって、放射性標識が付手されたＤＮＡもしくはＤ
   ＮＡ部分分解物の４．＋ｉ異的切断分解により彷・られ
   た、 １）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的切断分
   解物、チミン特異的切断分解物、およびシトシン特異的
   切断分解物の四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断
   分Ｍ、物４昆合物、および、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
   基特異的切断分解物、 を含む少なくとも二群の切断分解物試料のそれぞれが、
   支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展開され
   た放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを
   蓄積性蛍光体シートｔこ吸収させることによって、この
   蓄積性が光体シート番こ該放射性標識物質群の位置情報
   を有するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄
   積性蛍光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグ
   ラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電
   的に読み出すことにより得られるそれぞれの分離展開列
   のオートラジオグラフに対応するデジタル信号について
   、 ｌ）該四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物
   の分離展開列を基準列とし、この基壁列について基準サ
   ンプリング点を検出する工程、 １１）基準列以外の分離展開列についてサンプリング点
   を検出する工程、そして １１１）該基準列の基準サンプリング点を基準として隣
   接する分離展開列のサンプリンク点の比較照合を行なう
   ことにより、その隣接する分離展開列のサンプリング点
   を同定する工程、を含むオートラジオグラフィーにおけ
   る信号処理カフノー。 ２゜サンプリング点か、複数の分蘭展開列のそレソれの
   走査方向」二のデジタル画像データに対して、７ムージ
   ングおよび／または閾値処理を行なうことにより検出さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオー
   トラジオグラフィーにおける信号処理方法。 ３゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける信号処理方
   法であって、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤ
   ＮＡ部分分解物の特異的切断分解により得られた、 １）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的切断分
   解物、チミン特異的切断分解物、シトシン特異的切断分
   解物の四種Ｉ−ｎの切断分解物４昆合物、および、 ２）それぞれか互いに異なる少なくとも一種類め塩基特
   異的切断分解物を含む少なくとも三群の塩基特異的切断
   分解物、 を含む少なくとも正群の切断分解物試料のそれぞれが、
   支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展開され
   た放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを
   蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄
   積性蛍光体シートに該放射性標識物質、群の位置情報を
   有するオートラジオグラフをＮ　Ｎｋ記録したのち、該
   蓄積性蛍光体シートを電磁額で走査して該オートラジオ
   グラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光
   電的に読み出すことにより得られるそれぞれの分離展開
   列のオートラジオグラフに対応する一デジタル信号につ
   いて、 ｌ）該四種類の切断分解物混合物の分離展開列を基準列
   とし、この基準列について基準サンプリング点を検出す
   る工程、 百）基準クリ以外の各分離展開列についてサンプリング
   点を検出する工程、 １ｉｉ）基準列の基準サンプリング点を基準として該基
   準列に隣接する分離展開列のサンプリング点の比較照合
   を行なうことにより、その隣接する分離展開列のサンブ
   リンク点を同定し、ここで同定されたサンプリング点に
   基づき新たに仮想的な基準サンプリング点を定める工程
   、 １ｖ）Ｊ：１記の１１１）の工程において新たに定めら
   れた基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が
   定められた分離展開列に隣接する分＃展開列のサンプリ
   ング点との比較照合を行なうことにより、その隣接する
   分ｇＩＵ開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィ゛−における信号処理方法
   。 ４゜基べち列の両隣に、基準列以外の分＃展開列を配置
   し、上記ｌ１１）の工程を該両隣の分＃ＥＫ開列の双方
   について実施することを特徴とする特許請求の範囲第３
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ５゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３項もしくは第４
   項記載のオーｉ・ラジオグラフィーにおける信号処理方
   法。 ６゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ、部分分解物の塩基特異的切
   断分解物が、 １）グアニン特異的切断分解物 十アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ３）アデニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ４）チミン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分解
   物 ５）シトシン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 からなる少なくとも三群の切断分解物試料を含むること
   を特徴とする特許請求の＠間第３項乃至第５項のいずれ
   かの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理
   方法。