JPS59126254A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理法
に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、写真
感光材料を用いるオートラジオグラフィーにおいて、Ｄ
ＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定のための
デジタル信号処理における放射性標識物質の分離展開位
置の比較同定方法に関するものである。

支持媒体上において少なくとも一次元的方向に分布して
分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得る
ための方法としてオートラジオグラフィー、か既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核醇などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
伺した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物な
ど（以下、放射性標識物質ともいう）をゲル状支持媒体
上で電気泳動などの分離操作にかけて分離展開を行なう
ことにより、該支持媒体」−に放射性標識物質の分離展
開タリを形成させ、この分＃、展開列のオートラジオグ
ラフを放射線フィルムに転写し可視化して、その可視画
像から放射性標識物質の位置情報を得ている。また、得
られた放射性標識物質の位置情報を基にして、その高分
子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量、特
性の評価などを行なう方法は既に開発され、実際に利用
されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ　（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様）の
塩基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサムやキル
パート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およ２びサ
ンガー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）
法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡが二本の鎖
状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の
鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ
）、グアこン（Ｇ）　、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）
なる塩基を有する構成単位から構成されていること、そ
して、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間
の水素結合によって架橋されており、しかも各構成単位
間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わ
せのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構
造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法であ
る。

たとえば、マキサム・ギルバート法は、次に述べるよう
な方法により実施される。

まず、塩基配列を決定しようとしているＤＮＡあるいは
ＤＮＡの分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（Ｐ）
の放射性同位元素を含む基を結合させることにより、そ
の対象物を放射性標識物質としたのち、化学的な手段を
利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的に
切断する。次に、この操作により得られるＤＮＡあるい
はＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的切断分解物の混合
物をゲル電気泳動法により分離展開し、多数の塩基特異
的切断分解物がそれぞれ帯状を形成して分離された分離
展開列（ただし、視覚的には見ることかできない）を摺
る。そして、この部属展開列をＸ線フィルム上に転写、
可視化してオートラジオクラムを得、得られたオートラ
ジオグラムと各々の塩基特異的切断手段とから、放射性
同位元素が結合された鎖状分子の端部から一定の位置関
係にある塩基を１順次決定し、このようにして対象物の
すべての塩基の配列を決定している。

Ｌ述のように放射線写真法を利用するオートラジオグラ
フィーでは、放射性標識物質の位置情報を得るためには
この位置情報を有するオートリジオグラフを放射線写真
フィルム上に可視化することか必須要件となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを視覚的に観察することにより、支持媒体上の放射性
標識物質の分布を判断している。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与され
た特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれにつ
いて、分離展開条件を視覚的に判断し、それら切断分解
物の分離展開列も相互に比較することにより決定されて
いる。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィーでぼ、」
二連のようにその解析作業は人間の目に依存しているた
め、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析し
て得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によって
相違する場合が発生するなどの問題があり、得られる情
報の精度には限界かある。特に、放射線フィルム上に可
視化されたオートラジオグラフが良好な画質（ｇ鋭度、
コントラスト）を有していない場合には、満足できる情
報が得られがたく、またその精度は低下する傾向にある
。従来より、求める位置情報の精度を向上させるために
、たとえば、その可視化されたオーＩ・ラジオグラフを
スキャニングデンシトメーターなとの測定器具を用いて
測定する方法も利用されている。しかしなから、そのよ
うなＡｌ１１定器具を栄に用いる方法においては精度の
向上に限界がある。

また、前記のオートラジオグラフが形成された支持媒体
と放射線フィルムとを布石させて行なわれる露光操作時
にその重ね合わせにズレが生じる場合があり、この場合
には放射線フィルム上に可視画像として得られる分離展
開列（たとえば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対し
て平行でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質
の位置情報を視覚的に判断する際に誤差が生しやすくな
り、その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分
離展開条件によって、得られる分離展開列が支持媒体の
長さ方向に対して平行でなかったり、歪んだりすること
が往々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなとて両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また゛同様な分＃展開の不均
一さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、
ゲルの組成が不均一であったりした場合においても発生
する。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央
伺近における分離展開列の移動距離に比べて両端の分離
展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるス
マイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動
により分＃展開する場合において電圧が支持媒体に均一
に印加ぎれない場合かあり、そのような場合にも分離展
開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得ら
れる分離展開列に歪みが生じがちである。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、す
なわちＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を充
分な精度で得ることは困難である。

本発明者は、放射線写真法を利用するオートラジオグラ
フィーにおいて、写真感光材料上に画像化された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフを光電
的に読み取ってデジタル信号に変換し、このデジタル信
号に特定の信号処理を施すことにより、ＤＮＡもしくは
ＤＮＡ部分分解物の塩基配列を簡易かつ高精度に決定す
ることを実現し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するためのオートラジオクラフィーに
おける信号処理法であって、放射性標識が４＝Ｊ与され
たＤＮＡもしくはＤＮＡ１分分解物の塩基特異的切断分
解により得られた、１）少なくともグアニン特異的切断
分解物を含む塩基特異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を−含む塩基
特異的切断分解物、 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含むｊ無基特
異的切断分解物、 ４）少なくともシトシン特異的切断分解物を含む塩基特
異耐切断分解物、 を含む少なくとも画材の塩基特異的切断分解物のそれぞ
れが、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展
開された放射性標識物質群の位置情報を有するオートラ
ジオグラフを写真感光材料−にに記録したのち、該写真
感光材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電的
に読み取ることにより得られるそれぞれの分離展開列の
オートラジオグラフに対応するデジタル信号について、
１）該分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を
検出する工程、 爾）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準列
のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 １１１）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
する分離展開列のサンプリング点と基準列の基準サンプ
リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
る分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定さ
れたサンプリング点に基づき新たに基準サンプリング点
を定める工程、 ｉｖ）上記の１１１）の工程において新たに定められた
基準サンプリング点と、その基準サンプリング点か定め
られた分ｇＩ展開列に隣接する分離展開列のサンプリン
グ点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分
離展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法を提
供するものである。

すなわち、本発明は、試料と蓄積性蛍光体シートとを重
ね合わせることによっ１試料から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、この蓄
積性蛍光体シートを可視光線および赤外線などの電磁波
（励起光）で走査することにより、蓄積性蛍光体シート
に蓄積されている放射線エネルギーを蛍光（＃原発光）
として放出させ、この蛍光を光電的に読み取って電気信
℃を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号と
して得ることからなる放射線像変換方法を利用するもの
である。

上記放射線像変換方法については、たとえば米国特許第
３．８５９．５２７号明細書および特開昭５５−１２１
４５号公報等に記載されている。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
二価のユーロピウム賦活アルカリ土類金属弗化ハロゲン
化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含有するものである
。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、β線、γ線、紫外
線などの放射線の照射を受けてその放射線エネルギーの
一部を蓄積したのち、可視光線および赤外線などの電磁
波（励起光）の照射を受けるとその蓄積エネルギーに応
して輝尽発光を示す性質を有している。

そして本発明は、上記の蓄積性蛍光体シートを用いる放
射線像変換方法により、放射性標識物質の位置情報を特
に画像化を経由することなく直接に、デジタル信号とし
て得るものである。

なお、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布なとからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のような支持媒体上におけるｙＪ
、射性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは
−次元的方向に分布して分布列を形成している放射性標
識物質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの
転写する操作における位置スレなどにより、蓄積性蛍光
体シート上に転写蓄積されたオートラジオグラフ全体に
わたって歪み、ズレが生している場合にも、精度高＜Ｄ
ＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定するこ
とかできる。とりわけ、分離展開操作の歪みに対しては
、分＃展開列間でその歪みを補正しなから各列の分離展
開部位を同定することか可能であり、従って高精度に、
かつ合理的にその塩基配列を決定することができるもの
である。

また、上記のようにデジタル画像データ上で自動的に分
＃展開列間でのサンプリング点の比較照合を行なうこと
ができることがら、放射性標識物質の一つ一つの分離展
開操作を縮小しても高精度に放射性標識物質の分離展開
部位（サンプリング点）を同定することが可能となる。

すなわち、−！可のオートラジオグラフィにおいて用い
る放射性標識物質の絶対量を減少させることができる。

あるいは、分離展開操作における分離展開列の数を支持
媒体の幅を拡張させることなく増加することか可能とな
り、−回のオートラジオグラフ測定操作によって従来よ
り多、〈の情報を得ることが可能となる。

本発明において用いちれる試料の例としては。

放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解
物を塩基特異的に切断分解することにより得られる各塩
物異的切断分解物もしくはその混合物が、−次元的方向
に分離展開された支持媒体を挙げることができ６゜ また、放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開する
ための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（形状
は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマー成
Ｈ体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる電気
泳動、そしてシリカゲルなど′の支持媒体を用いる薄層
クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げられ
るが、分離展開方法はこれらの方法に限定されるもので
はない。

本発明に用いられる写真感光材料は、基本構造として、
支持体および写真乳剤層からなるものである。写真乳剤
層は、ハロゲン化銀を分散状態で含有支持するセラチン
などの結合剤からなるものである。感光材料は、たとえ
ば、支持体としてポリエチレンテレフタレートなどの透
明なシートを用い、このシート上に上記写真乳剤層を設
けたものであり、その例としては高感度Ｘ線フィルムな
どの放射線フィルムを挙げることかできる。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線による写真感光材料。

の感光操作（露光操作）は、支持媒体と写真感光材料と
を一定時間重ね合わせることにより、その支持媒体上の
放射性標識物質から放出される放射線の少なくとも一二
部はよって写真感光材料中の感光物・質に吸収声゛せて
実・施する。この露光操作は、支持媒体と写真感光材料
とを密着した状態で配置し、たとえば、氷点下のような
低温で数日間この状態に置くことにより行、なうことか
できる。なお、露光操作に蔓いては増感紙の使用、ある
いはフランシュ露光等の前露光の適用によって増感を行
、なってもよい。

なお、オートラジオグラフィーにおける試料の写真感光
材料への露光操作および感光材料の現像処理については
、既に良く知られており、それらの操作および処理につ
いては、たとえば、次に示す文献に記載されている。

生化学実験講座６　トレーサー実験法（上）２７１〜２
．８９頁、ＩＩ’　８　、、　　オートラジオグラフィ
ー」末吉徹、重末昭世（１９７７年、■東京化学同人列
） 次に、本発明において、写真感光材料に記録された支持
媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情報を有する
オートラジオグラフを読み取ってデジタル信号に変換す
るためのブｊ法について、添イ・１図面の第１図に示し
た読取装置の例を参照しながら略述する。

第１図は、写真感光材＃Ｊ１に可視画像として記録され
ている放射性標識物質の一次元的な位置情報を崩するオ
ート・ラジオグラフを読み取るための画像読取装置の例
の概略図を示している。

中空の回転トラム２には、その外側に可視画像を有する
感光材料１が装着されている。この回転ドラム２は、一
定速度で回転すると同時に軸方向に一走ピンチで移動す
るようにされている。また、この回転ドラム２内にはミ
ラー３か挿入されており、光源４からの光ビーム５はレ
ンフ６を通って入射する。この光源４からの光ビーム５
は、ミラー３で」二方１こ反射され、透明ドラム２に装
着した感光材料１を一透過して光電子増倍管７に入射す
る。このようにして、感光材料１の画面が光ビーム５に
よる光点でＸＹ方向に走査される。

光電子増倍管７は、感光材料１の各点の透過光を電％信
号に変換する。この電気信号は、増幅器８により増幅さ
れたのち、Ａ／Ｄ変換器９に入力される。Ａ／Ｄ変換器
９で、電気信号はデジタル信号に変換される。なお、画
像の読み取り操作の詳細については、たとえば、特開昭
５４−　’１２１０４３号公報に記載されている。

また１本発明における写真感光材料に記録された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフを読み
取るための方法について、上記においては光ビームを用
いた光透過法による読み取り操作を説明したが、光反射
法による読み取り操作も適用できる。本発明において利
用することができる読み取り操作は、上記の例に限られ
るものではなく、たとえば、テレビカメラによる読み取
り操作など各種の方法が可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路１０に入力される。信り処理回路１０
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の一決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィーにおける信号処理の実施態様を、前記ツマキサム
・キルバート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法を例
にとり、その塩基配列決定のだめの典型的な塩基特異的
切断分解物の組合わせとして、次の四種類の塩基特異的
切断分解物を用いた場合について説明する。

１）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 ４）シトシン特異的切断分解物 まず、放射性標識（”Ｐ）が付与されたＤＮＡを常法に
より各塩基単位で切断することにより、上記１）〜４）
の四群の塩基特異的切断分解物を得る。

次に上記四群の塩基特異的切断分解物を、ゲル支持媒体
上で電気泳動により分離展開させてそれぞれの分離展開
列（泳動列）を得る。

次いで、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持
媒体）と放射線フィルムとを−７０〜−８０°Ｃの低温
で数日間重ね合わせることにより露光操作を行ない、試
料のオートラジオグラフを放射線フィルムに転写記録す
る。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡの塩基特異的
切断分解物か分＃展開されている分離展開列のオートラ
ジオグラフを示す。すなわち、第２図の第１列から第４
列は順に、 （１）’−ＣＧ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （２）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （３）−（Ｇ）特異的切断分解物 （イ）−（Ｃ）特異的切断分解物 の各分離展開列を示す。

放射線フィルムに転写記録されたオートラジオグラフを
第１図に示した読出装置に装填して読み出すことにより
、信号処理回路１０に入力されたデジタル信鴎は、放射
線フィルムに固定された座標系で表わされた番地（ｘ’
、ｙ）とその番地における信号のレベル（２）とを有し
ており、その信号のレベルは輝尽光の光量に対応してい
る。すなわち、そのデジタル信号は第２図のオートラジ
オグラフに“対応している。従って信号処理回路１゜に
は、上記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル画
像データか入力ごれることになる。本発明において、デ
ジタル画像データとは、放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号の集合体を意味する。

まず、デジタル画像データ上で、上記凹刻の分離展開列
のそれぞれについて放射性標識物′質の分離展開方向を
検出し、それらをサンプリング点とする。サンプリング
点は、たとえば、次のようにして積用することができる
。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展開方向）を横断するようにデジタル画
像データ上の異なる位置を二回走査することによって、
各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点を検出し
くこの分布点を検出するための走査を予備走査という）
、各分＃展開列についてそれぞれ二分布点を結んで四本
の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけるサン
プリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、放射線フィルム
を読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回路１
０において一旦メモリーに記憶される（すなわち、パン
ファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発性メモ
リーに記憶される）。信号処理において、デジタル画像
データ上を走査するとは、この走査箇所のデジタル信号
のみをメモリーから選択的に取り出すことを意味する。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ（ｗ）［ｗは走査方ζ上の位置を表わすコを得るこ
とができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえば適
当なフィルター関数を用いてコンボリューションを行な
うことによりスムージンク処Ｊｒｐを施し、関数ｇ−（
ｗ）を得る。次に１　この関１ａｇ（ｗ）に閾値処理を
行なう。すなわち、ｌλ１イ直（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）−１ ｇ（ｗ）＜α０のとき、ｇ（ｗ）＝０ とする処理を施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１または
ＯのＸ！Ｊ！統関数に変換する。サンプリング点は、ｇ
（ｗ）＝１の領域の各中点とすることにより検出される
。なお、上記の閾値処理における閾値（αｏ）Ｉｆ、た
とえば、走査領域上のデジタル信号について、信号のレ
ベルと、その頻度との関係、すなわちヒストグラムから
決定することかで′きる。

このようにして各列についてサンプリング点Ｓｋｎを検
出することができる。ここで、ｋは止の整数であって各
列の番号を表わし、ｎは正の整数であっ；、す、プ１リ
ッグ点。＠＠を表わす。４お、サンプリング点を検出す
るための方法は、上記の方法に限られるものではない。

次に、各列間の比較同定には、具体的には各列の間で同
じ分離展開物を探し出す作業か含まれる［たとえば、（
Ｇ）＋　（Ａ）の列とＣＧ）の列とを比較する場合には
（Ｇ）＋　（Ａ）の列から（Ｇ）の要素となっている分
離展開物を探し出−ｔ］。

しかし、この比較同定は、前記歪みのある場合には、第
３図のように各列の等価な分離展開列の位置か必ずしも
Ｘ座標上で等しくはならない。従来、このような歪みの
補正は人間の視覚的な判断にまかせられていた。しかし
、本発明の方法によれば、基錐列および基準サンプリン
グ点を用いることにより、人に頼ることなく自動的に歪
みを補正し、各列間の正確な比較同定を行なうことがで
きる。このことを第２図および第３図に基づいて説明す
る。第２図において、第１列から第４列までの間には前
記歪みが存在するが、第１列と第２列という狭い領域に
注目すれば、この歪みの影響ｌオ小ざい。

そこで、ｆｊｓ　１列のサンプリング点と第２列のサン
プリング点とを論理加算することにより、新たに（Ｇ）
特異的νＪ断分解物、（Ａ）特異的切断分解物、（Ｔ）
特異的切断分解物、および（Ｃ）特異的切断分解物の四
種類の切断分解物の全−Ｃを含むサンプリング点の列、
すなわち基準（内部標準）列を合成する。この基準列の
サンプリング点Ｓｏｎを基準サンプリング点とすると、
基準サンプリング点Ｓｏｎは、サンプリング点Ｓｌｎお
よびサンプリング点Ｓ２ｎから構成される。たｔどし、
０は基準列を表わす。

たとえば、この合成を演算として表わすと次のようにな
る。すなわち、 （Ｓｏｎ）＝　　（Ｓｔｎ）Ｕ　（Ｓｚｎ）ここで、（
）は、サンプリング点の集合を表わし、Ｕは論理和演算
子を表わす。

得られた基準列の基準サンプリング点Ｓｏｎと、基準列
の構成要素である第２列に隣接する第３列のサンプリン
グ点Ｓ３ｎとの比較同定を行なうことにより、第３列に
ついて基準サンプリング点の内挿を行なう。

たとえば、第３列のサンプリング点Ｓ３２については、
サンプリング点Ｓ３２の位置（Ｘ３２）と基準列の基準
サンプリング点ＳＯ３の位置（Ｘ　’０３　）およびｓ
ｏａの位置（’ｘ　ｏ　ａ　）とを比較する。たとえば
、 ｌＸｏ：ａ　　Ｘ３２１＝ａ ｌＸｏ４　Ｘ３ｚｌ＝ｂ とすると、この場合にはａ＞ｂであるから、サンプリン
グ点Ｓ３２は、基準列の基準サンプリング点ＳＯ４と同
じＸ座標をもつものと帰属される。

このようにして願に第３列の全てのサンプリング点を基
準サンプリング点のいずれかに帰属させる。そして、帰
属された第３列のサンプリング点Ｓ３ｎを基にして、残
りの基準列の基準サンプリング点のそれぞれを第３列に
内挿することにより、第３列において仮想的な基準サン
プリング点の集合（Ｓ３ｍ）を作成する。ただし、ｍは
正の整数であり、基鵠列の基準サンプリング点の番号ｎ
に一致する。このようにして、第３列の位置に第０列で
求めたノ＾型刻を移動させた仮想的基準列を得ることか
できる。

第３図は、デジタル画像データ」−で合成された基準列
および第３列の一部分を示す図である。ここで、黒四角
は放射性標識物質の分離展開部位に相当する各列のサン
プリング点を表わし、中空四角は内挿された基準サンプ
リング点を表わす。

作成した第３列の基準サンプリング点３３ｍを基に、隣
接する第４列のサンプリング点ｓ４ｎについて基僧サン
プリング点５３ｍを介して基準サンプリング点Ｓｏｎへ
の帰属を行なう。

このようにして基準列の基準サンプリング点Ｓｏｎに基
ついて、順々に各列において仮想的な基準サンプリング
点の集合（ｓｋｍ）を作成しながら、全てのサンプリン
グ点Ｓｋｎを基準サンプリンタ点Ｓｏｎのいずれかに帰
属させる。

次いで上記第１列〜第４列の再編成を行なう。

すなわち、第１列と第３列とを用いて、（Ｓ　　１　ｎ
）ｎ　（Ｓ３　　ｎ）＝　　ｆｓ５ｎ）なる演算で表わ
される新たなサンプリング点の集合（Ｓ５ｎ）を有する
仮想的な第５列を得る。得られた第５−列は、アデニン
（Ａ）のみの位置情報を有するものである。同様の減算
処理を第２列と第４列とを用いても行なうことにより、
サンプリング点Ｓ６ｎを有する仮想的な第６列を得る。

この第６列は、チミン（Ｔ）のみの位置情報を有するも
のである。このようにして、新しく次の凹刻を得る。

（３）−、（Ｇ）特異的切断分解物 （４）−（Ｃ）特異的切断分解物 Ｃ３）−（Ａ）特異的切断分解物 （６）−（Ｔ）特異的切断分解物 上記の第３列、第４列、第５列および第６）列について
、ｍの小さい順にそれぞれの列における仮想的基準サン
プリング点（Ｓｋｍ）とその列における実在のサンプリ
ング点Ｓｋｎとを比較していき、それが合致したとき、
基準列（第０列）のｎに対応するサンプリング点Ｓｏｎ
を合致したサンプリング点５ｐａｎで置き換える。そし
て、基準列をｎの小ごい順にだとれば、たとえば、次の
ような図式を得ることかできる。

Ｓ３　ｌ、ｓ４１　、Ｓ６１　、Ｓ３２・Ｓ５１　・Ｓ
５□、Ｓ６２．Ｓ３３．Ｓ４２．・・・・・・］二記図
式において、Ｓ３　ｎ＝Ｇ、Ｓａ　ｎ＝Ｃ１５５ｎ　＝
　Ａ　、Ｓ　６　ｎ　＝　Ｔと置き換えることにより、
次のような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基
配列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの
塩基配列についての情報は上記の表示形ｊ魚に限られる
ものではなく、任意の表示形態が可能である。たとえば
所望により、さらに各列の走査方向上における（ｉ号の
レベルを任意に演算処理することにより、分離展開され
た各切断分解物の相対量をも表示することか可能である
。

あるいはさらにＤＮＡの二本の鎖状分子の両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、Ｃ，Ｇ、Ｔ−Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−・・・・・・なお
、本発明の信号処理方法により、上記の（Ｇ、Ｇ＋Ａ、
Ｔ＋Ｃ，Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩基配列決
定法は、ＤＮＡの塩基配列決定方法の一例であって、本
発明の信号処理方法は、上記の組合むせに限定されるも
のはなく、種々の組合わせが可能であり、またその組合
わせを利用して、上記の方法に準じる方法により同様に
して塩基配列を決定することができる。ただし、いずれ
の組合わせにおいても、その組合わせの全部または一部
を用いてＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩物異的切断分解物か
らなる基準（内部標準）列が得られるような組合わせで
あることが必要である。

本発明においては、たとえば（Ｇ、ｐ、、Ｔ、Ｃ）の組
合わせを利用しても、ＤＮＡの塩基配列を決）Ｊどする
ことかできる。

また、−１−記の例においては、支持媒体上で一次元的
方向に分＃：展開している四列の分＃展開列を構成する
放射性標識物質群を用いて説明したが、分１＃展開列は
四列に限定されるものではなく、凹刻以上である場合に
は本発明の信号処理方法は特に有効なものである。すな
わら、本発明は、分離展開方向のスレを基準列を中心と
して順々に補正しながら同定を行なう方法であるため、
分離展開列の数か多ければ多いほど本発明は有効に利用
されうるちのである。あるいはまた、一つの支持媒体を
用いて同時に二種類以上のＤＮＡの塩基配列を決定する
ことも可能である。

従って、得られた基準列は、上記のような一組のＤＮＡ
の塩基特異的切断分解物の組合わせにのみ適用されるも
のではなく、同一種類のＤＮＡであれば、支持媒体上に
分離展開された放射性標識物質群のそれぞれに適用する
ことができる。この場合、基準列は、支持媒体上のどの
近接した複数列を用いてでも合成することが可能である
が、より高精度にＤＮＡの塩基配列を決定するためには
、支持媒体上の中央部の複数の分離展開列を用いて基準
列を得るのが好ましい。また、基準列を合成するための
分＃展開列は、好ましくは互いに隣接しているのがよい
。そして、基準列を構成する分＃展開列を中心としてそ
の分離展開列に隣接する分離展開列を順次同定すること
かできる。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路１０から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を分身 して記録装置（図示なし）へ伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基ついた記
録装置を用いることかできる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡｌ７）
塩基配列と照合するなどの遺伝言ｔｂ学的情報処理を行
なうことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明において感光材料上に記録された試料
中の放射性標識物質の位置情報を有するオートラ・ノオ
グラフを読み取るための読取装置の例を示すものである
。 ｌ：写真感光材料、２：透明ドラム、３：ミラー、４：
光源、５：光ビーム、６・レンズ、７：光電子増倍管、
８．増幅器、９　：　Ａ／Ｄ変換器、１−０−：信冗−
処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物がゲル支持媒
体上で分離展開された試料のオートラジオグラフの例を
示す図である。 第３図は、基準列および＠３列の分離展開列の−・部分
を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社君−■耶大　　
　　４Ｏ−Ｊ−柳川泰男第　　２　　；ゴ１ｉ 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 ３５４− ３ ユ丁に糸プ己ネ山ＩＩ三ｇ 昭和５８年１月２５日 勤訂庁長官　　名杉和夫　殿 ＋’１′（和５８年１月８日提出の特許１ｉ（２０）２
゜発明の名称 オートラジオグラフィーにおけ２）信号処理法３゜補正
をする者 事件との関係　　　　特許出願人 住所　　　　（５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
　　　　　代表渚　大　西　　賞 ４゜代理人 ６゜補正により増加する発明の数　　　　　　なし手続
補正書 昭和Ｓ２年／９月／／日 特許庁長官　若杉和夫殿 ］　事件の表示 昭和５８イ１　　特　許随筆　１３４０　号２　発明の
名称　　オートラジオグラフィーｉこおける信号処理法
３　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 ４代理人 ８　補正の内容 別紙の通り　　　　　　　　　　　　　　方式　と菖）
特許請求の範囲 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
するためのオートラジオグラフィーにおける信号処理Ｕ
、てあって、放射性標識がｌ４されたＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基特異的りＪ断分解により１１）ら
れた、 １）少なくともクアニン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を含む塩基特
異的切断分解物。 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含むｊブ、Ａ
基特異的切断分解物、 ４）少なくともシｉ・シン特異的切断分解物を含む塩基
特異的切断分解物、 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物のそれぞ
れが、支持媒体上に平行関係を以って−・次元的に分離
展開された放射性標識物質ＩＴの位置情報を有するオー
トラジオグラフを写真感光材料」二に記録したのち、該
写真感光材料−ヒに可視化されたオートラジオグラフを
光電的に読み取ることにより得られるそれぞれの分１１
ｊ　１７４開列のオートラジオグラフに対応するデジタ
ル信−ヒについて、ｉ）該分離展開列のそれぞれについ
てサンプリング点を検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
列のサンプリング点を大事サンプリング点とする工程、 １１１）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
する分離展開列のサンプリング点と基へ（夕１）の基準
サンプリング点との比較照合をＱｊなうことにより、そ
の隣接する分離展開列のサンプリング点を同定し、ここ
で同定されたサンプリング点に基づき新たに基準サンプ
リング点を定める工程、 ｉｖ）上記の１１１）の工程において新たに定められた
基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定め
られた分離展開列に隣接する分＃展聞列のサンプリング
点との比較照合を行なうことシこより、その隣接する分
離展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオクラフィーにおける信号処理ン大　
。 ２゜基準列の合成に用いられる分離展開列の両隣に、分
動展開列を配置長、−に記１ｉｉ）の工程を該両隣の分
離展開列の双方について実施することを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおけ
る信号処理法。 ３゜サンプリング点か、複数の分離展開列のそれぞれの
走査方向上のテシタル画像データに対して、スムージン
グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
項記載のオートラジオクラフィーにおける信号処理法。 ４゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断
分解物が、 ■）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アテニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 Ａ）シトシン特異的切断分解物 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
れかの項記載のオートラジオグラブイーにおける信号処
理法。 すＪ証書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正
致します。 記 −」上前−−］延腹− （１）７頁８行目　　部属展開列　　　　→　分辺底朋
刀（３）１５頁９行目　　蓄積性蛍光体シー　→　写真
感光材料ト （４）１５頁１０行目　　蓄積性蛍光体シー　−写真感
光材料ト （５）１５頁１１行目　　蓄積　　　　　　　→　記録
（６）１Ｂ頁１５行目　　各塩物異的切断分　→　各夷
遅匣（支）瞼９男１泣解解物 （？）２３頁５行目　　読出装置　　　　　→　読取装
置（８）２３頁６行目　　出す　　　　　　　→　取擾
（９）２３頁１０行目　　輝尽光　　　　　＋　透過Ｘ
（１０）２９頁３行目　　０列で　　　　　→　１外と
筋＆烈の金或工（＋１）２９頁３行目　　基準列　　　
　　　→　基準烈Ｘ第旦刀Σ（１２）３２頁１６行目　
　塩物　　　　　　→　塩基特（１３）図　　面　　　
第３図の補正図面を添付する。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■。ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける信号処理法
   であって、放射性標識が付与されたＤＮＡもしくはＤＮ
   Ａ部分分解物の塩基特異的切断分解により得られた、 ｌ）少なくともグアニン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 ２）少なくともアデニン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 ３）少なくともチミン特異的切断分解物を含む塩基特異
   的切断分解物、 ４）少なくともシトシン特異的切断分解物を含む塩基特
   異的切断分解物、 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物のそれぞ
   れか、支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分＃展
   開された放射性標識物質群の位置情報を有するオートラ
   ジオグラフを写真感光材料」−に記録したのち、該写真
   感光材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電的
   に読み取ることにより得られるそれぞれの分離展開列の
   オートラジオグラフに対応するデジタル信号について、
   １　）　６１分Ｍ展開列のそれぞれについてサンプリン
   グ点を検出する工程、 ｉｉ）複数の分離展開列より基準列を合成し、この基準
   列のサンプリング点を基準サンプリング点とする工程、 １ｉｉ）該基準列の合成に用いられた分離展開列に隣接
   する分ＡＩ展開列のサンプリング点と基準列の基準サン
   プリング点との比較照合を行なうことにより、その隣接
   する分離展開列のサンプリング点を同定し、ここで同定
   されたサンプリング点に基づき新たに基準サンプリング
   点を定める工程、 ｉｖ）上記の１１１）の工程において新たに定められた
   基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定め
   られた分離展開列に隣接する分＃展開列のサンプリング
   点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分＃
   展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ２゜法型刻の合成に用いられる分離展開列の両隣に１分
   離展開列を配置し、上記１１１）の工程を該両隣の分離
   展開列の双方について実施することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理法。 ３゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ４゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的りＪ
   断分解物か、 １）グアニン特異的切断分解物 ２）グアニン特異的切断分解物　・ ＋アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物 ５）シトシン特異的切断分解物 を含む少なくとも四本の塩基特異的切断分解物であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処
   理法。