JPS59182365A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理方
法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、オ
ートラジオグラフィーにおいて、ＤＮＡもしくはＤＮＡ
部分分解物の塩基配列の決定のためのデジタル信号処理
における放射性標識物質の分離展開位置の比較同定方法
に関するものである。

支持媒体」−において少なくとも−・次元的方向に分！
］Ｊして分布列を形成している放射性標識物質の位ｊδ
情報を得るための方法としてオートラジオグラフィーが
既に知られている。近年においては。

オートラジオグラフィーは、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分
分解物の塩基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサｚ、−ギ
ルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法、およびサ
ンカー・クールソン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）
法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡが二本の鎖
状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の
鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ
）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）な
る塩基を有する構成単位から構成されていること、そし
て、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間の
水素結合によって架橋されており、しかも各構成単位間
の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わせ
のみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構造
を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法である
。

たとえば、マキサム・ギルバート法は、次に述べるよう
な方法により実施される。

まず、塩基配列を決定しようとしているＤＮＡあるいは
ＤＮＡの分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（Ｐ）
の放射性同位元素を含む基を結合させることにより、そ
の対象物を放射性標識物質としたのち、化学的な手段を
利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的に
切断する。次に、この操作により得られるＤＮＡあるい
はＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的切断分解物の混合
物をゲル電気泳動法により分＃展開し、多数の塩基特異
的切断分解物がそれぞれ・；１？状を形成して分１撃：
　ＩＮ開された分離１３′ｒ＜間外（ただし、視覚的に
は見ることかできない）を得る。そして、この分離展開
列のオートラジオグラフをＸ線フィルム」二に可視化し
て、得られた可視画像と各々の塩基特異的切断り段とか
ら、放射性同位元素か結合された鎖状分子の端部から一
定の位置関係にある塩基を順次決定し、このようにして
対象物のすべての塩基の配列を決定している。

ト記のオートラジオグラフィーにおいて、従来の放射線
フィルムを用いた放射線写真法を利用する代りに、本出
願人による特願昭５７−１９３４１８り明細書には、蓄
積性蛍光体シートを用いた放射線像変換方法を利用する
オートラジオグラフ測定方法か記載されている。

この放射線像変換方法は、試ネ［と蓄積性蛍光体シート
とを市ね合わせることによって試料から放出される放射
線エネルギーを蓄積性佑光体シートに吸収させたのち、
この蓄積性蛍光体シートを可視光線および赤外線から選
ばれる電磁波（励起光）で走査することにより、蓄積性
蛍光体シートに蓄積されている放射線エネルギーを蛍光
（輝尽発光）として放出させ、この蛍光を光電的に読み
取って電気信号を得、この電気信号をＡ／Ｄ変換してデ
ジタル信号として得るものである。

また、放射線像変換方法に用いられる蓄積性蛍光体シー
トは、たとえは、二価のユーロピウム賦活アルカリ土類
金属弗化ハロゲン化物系蛍光体などの輝尽性蛍光体を含
有するものである。この輝尽性蛍光体は、Ｘ線、α線、
β線、γ線、紫外線などの放射線の照射を受けてその放
射線エネルキーの一部を蓄積したのち、可視光線および
赤外線から選ばれる電磁波（励起光）の照射を受けると
その蓄積エネルギーに応じて輝尽発光を示す性質を有し
ている。

」二記載射線像変換方法を利用するオートラジオグラフ
ィーは、オートラジオグラフの測定操作を簡略化するも
のであり、また、放射性標識物質の位置情報をイＪする
オートラジオグラフを画像化することなく、その位置情
報をデジタル信号として７１ノ・ることかできるもので
ある。

本出願人は、また、放射線像変換方法を利用するオート
ラジオグラフィーにおいて、放射性標識物質の　次兄的
な位置情報を記号および／または数値として了ｌＪるた
めのデジタル信号処理方法に関する発明について既に出
願している（特願昭５８−１３２６−づト）。

Ｉ−記の上回処理方法によれば、従来においては研究者
の視覚的な二ｒ１］断に頼っていた放射性標識物質の位
置情報を、自動的かつ高精度に所望の記号および／また
は数値として得ることかできるもので−ある。

しかしながら、前記の分ｔｉｌｌ展開列が形成された支
持媒体と蓄積性イｉ光体シートとを電着させて行なう露
光操作時にその重ね合わせにスレが生じる場合があり、
この場合には蓄積性蛍光体シート上に潜像として得られ
る分＃、展開列（例えば、泳動列）は蓄積性蛍光体シー
トの長さ方向に対して平行でなく、ずれる結果となるた
め、放射性標識物質の位置情報に誤差が生じやすくなり
、その精度は低下しがちである。

また、支持媒体としてゲルを用いる場合において、この
ゲルは自己支持性がないため通常はカラスなどで両面を
挟持した状態で分剛展開を行なうが、その被覆物の変形
などによってゲルに厚さムラが生じたりすることかあり
、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離展
開されるとは限らない。また同様な分＃Ｅ展開の不均一
さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえは、支持媒体の中央付
近における分＃展開列の移動距離に比べて両端の分＃展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果かしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分離展開する場合において電圧が支持媒体に均一に
印加されない場合があり、そのような場合にも分離展開
条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、得られ
る分離展開列間歪みが生じがちである。

以北のような場合においては、分離展開された放射性標
識物質の位置情報、すなわちＤＮＡもしくはＤ　Ｎ　Ａ
　２；Ｈ分分解物の塩基配列を充分な精度で得ることが
難しくなる。

従って、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の
塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーにお
いて、その塩基配列を高精度に決定するための信号処理
方法を提供することをその目的とするものである。

上記の目的は、グアニン特異的切断分解物、アデニン特
異的切断分解物、チミン特異的切断分解物およびシＩ・
シン特異的切断分解物の全てを含む基準列を、試料の分
＃展開操作時に設けることによって得、かつ検知対象の
分＃展開列をデジタル画像データ上で合成することによ
っても仮想的に得て、これらの基準列に基づいて分離展
開列間の補正を行なうことにより達成される。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーに
おける信号処理方法であって、放射性標識が付与された
ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断分解
により得られた、■）グアニン特異的切断分解物、アデ
ニン特異的切断分解物、チミン特異的切断分解物、およ
びシトシン特異的切断分解物の全てを含む基準混合物を
少なくとも一組、 ２）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的切断分
解物、チミン特異的切断分解物、およびシトシン特異的
切断分解物の全てを全体として含むように任意に組合せ
られた少なくとも二種の塩基特異的切断分解物もしくは
塩基特異的切断分解物混合物からなる基準列形成用試料
を少なくとも一組、および、 ３）少なくとも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
基特異的切断分解物もしくは切断分解物混合物を少なく
とも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記ｌ）の−組の基準混合物の分離展開列と」上記２）
の−組の基準列形成用試料の二重上の分離ｊＧ開間外が
、少なくとも一列の上記３）の塩基特異的切断分解物も
しくは塩基特異的切断物混合物の分〜］ｊ＋間外を挟む
ように互いに平行関係を以って　次元的に分１！ｉ＃展
開されてなる少なくとも凸刻の分Ｒｔｉｃ開列間外成す
る放射性標識物質群から放出される放射線エネルギーを
蓄積性蛍光体シートに吸収させることによって、この蓄
積性蛍光体シートに該放射性標識物質群の位置情報を有
するオートラジオグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性
イ１イ光体シートを電磁波で走査して該オートラジオグ
ラフを輝尽光として放出させ、そしてこの輝尽光を光電
的に読み出すことにより得られるそれぞれの分Ｍ　Ｉｊ
ｉｔ開列の間外トラジオグラフに対応するデジタル信号
について、 １）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
出する工程、 １１）該基準混合物の分離展開列からなる基準列のサン
プリング点、および該、！ｉｔｉ準列形成用試ネ１の二
重上の分離展開列から合成された基準列のサンプリング
点を、それぞれ基準サンプリング点とし、該複数の基準
列間で対応する基準サンプリング点を結んだ直線、折れ
線または曲線からなる複数の連続線を設定する工程、そ
して １ｉｉ）該連続線により、各分離展開列のサンプリング
点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理方法を
提供するものである。

なお、本発明において、基準列とは、ＤＮＡの四種類の
ＦＡ基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよび
シトシンの各塩基特異的切断分解物の全てを含む分１ｌ
ｌｌｋ展開列もしくはその分離展開列に相当する列を意
味し、目的とするＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩
基配列の決定において、その放射性標識が付与された塩
基特異的切断分解物が支持媒体上で分＃展開されてなる
分離展開列間 また、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情ｔμ、たとえは、支持媒体中にイｒ存する放
射性物質の集合体の存在位置と形状、その位置における
放射性物質の濃度、分１ｊ５なとからなる情報の一つも
しくは任灯、の組合わせとして得られる各種の情報を意
味する。

本発明によれば、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物のＪ
ＩＡ２．Ｌ：配列を決定するためのオートラジオグラフ
ィーにおける信号処理方法において、分離展開方法の歪
みに対しては、基準列のノ、（準サンプリング点に基づ
いてその歪みを測定し、歪みの補正を各列について行な
ったのちに各列の分離展開方法を同定することにより、
露光操作時において試料と蓄積性イ１１光体シートとを
重ね合わせる際に生したズレ、あるいは放射性標識物質
を支持媒体上で分Ｍ　ｊｔｊ開させる際に分離展開方法
によって生した分＃１１４開列の歪みなど、蓄積性蛍光
体シー（・」−に転′す゛蓄積されたオートラジオグラ
フ全体にわたってスレ、歪みが生している場合にも、４
られたデジタル画像データ」、で補正することができ、
目的の塩基配列を高精度かつ合理的に決定することかＵ
１能となるものである。

さらに、試料として少なくとも−・組の基準混合物を用
いることにより、内部標準となる基べに列の基準サンプ
リング点を精度高く得ることができる。−・方、基準列
を基準列形成用試料の分＃Ｆ展開列からも自戒して得る
ことにより、この基準列形成用試料は同時に検知対象物
質でもあることから、分離展開列の数を不必要に増すこ
となく、基準列の基準サンプリング点を得ることができ
る。このことは、ＤＮＡの塩基配列決定において内部標
準となる基準列の精度の向」−（すなわち、得られる位
置情報の精度の向」−）と、−回のオートラジオグラフ
ィーで得られる情報量の増加とを同時に達成できること
を意味するものである。

また、基準列を三列以上得ようとする場合には、上記の
基準混合物および基準列形成用試料の組をそれぞれ少な
くとも一絹以上、任意の組合わせを用いて基準列を得る
ことができるものである。

そして、放射性標識物質の一つ一つの分布部位の面積が
小さい場合でも高精度にその分ノ１位置を検出すること
がｕｆ能となることから、−回のオートラジオグラフィ
ーにおいて用いる放射性標識物質の絶対邦−を減少させ
ることができる。あるいは、支持媒体の幅を拡張させる
ことなく分＃展開列の数を増加することができ、−回の
オー）・ラジオグラフィー操作によって従来より多くの
情報を得ることが可能となるものである。

本発明のオートラジオグラフィーにおいて用いられる被
測定試料は、放射性標識が伺与されたＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物を塩基特異的に切断分解することにより
得られる各塩基特異的切断分解物もしくはその混合物が
、−次元的方向に分離１３４聞された支持媒体である。

上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開するだ
めの方Ｖ、としては、たとえば、ゲル状支手１媒体（形
状は層状、柱状など任意）、アセテートなとのポリマー
成形体、あるいは泣紙なとの各種の支持媒体を用いる電
気泳動、そしてシリカゲルなどの支士）媒体を用いる薄
層クロでトゲラフイーがその代表的な方法として挙げら
れる。このうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動法
が代表的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる蓄積性蛍光体シートは、基本構造と
して、支持体、蛍光体層および透明保護膜とからなるも
のである。蛍光体層は、輝尽性蛍光体を分散状態で含有
支持する結合剤からなり、たとえば、二価のユーロピウ
ム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢ丁・Ｅｕ２＋）　怪
光体粒子をニトロセルロースと線状ポリエステルとの混
合物中に分散含有させて得られる。蓄積性蛍光体シート
は、たとえば、支持体としてポリエチレンテレフタレー
トなどのシートを用い、このシー１・上に」二重蛍光体
層を設け、さらに蛍光体層上に保護膜としてポリエチレ
ンテレフタレートシー［・などを設けたものである。

なお、本発明に用いられる支持媒体および蓄積性郊光体
シートの詳細については、本出願人による特願昭５７−
１９３４１９号明細書に記載されている。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持奴体か
ら放出される放射線エネルギーの蓄積性３゛１？光体シ
ー１への転写蓄積操作（露光操作）は、支持媒体と蓄積
性イ１１光体シートとを一部１１＋ｉ間重ね合わせるこ
とにより、その支持媒体上の放射性標識物質から放出さ
れる放射線の少なくとも一部を蓄積性蛍光体シートに吸
収させて実施する。この露光操作は、支持媒体と蓄積性
蛍光体シートとが近接した状ｍ；で配置されていればよ
く、たとえば、常温もしくは低温で少なくとも数秒間こ
の状態に置くことにより行なうことができる。

なお、露光操作の詳細については、前記の本出願人によ
る特願昭５７−１９３４１８号明細書に記載されている
。

次に、本発明において、蓄積性蛍光体シートに転写蓄積
された支持媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情
報を読み出してデジタル信号に変換するだめの方法につ
いて、添伺図面の第１図に示した読出装置（あるいは読
取装置）の例を参照しながら略述する。

第１図は、蓄積性集光体シート（以下においては、蛍光
体シートと略記することもある）ｌに蓄積記録されてい
る放射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出す
ための先読み用読出部２と、放射性標識物質の位１δ情
報を出力するために蛍光体シートｌに蓄積記録されてい
るオートラジオグラフを読み出す機能を有する本読み用
読出部３から構成される装置 る。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフィルター
６を通過することにより、このレーザー光５による励起
に応じて蛍光体シー１−　１から発生する輝尽発光の波
長領域に該当する波長領域の部分がカットされる。次い
でレーザー光は、カルパノミラー等の光偏向器７により
偏向処理され、平面反射鏡８により反射されたのち蛍光
体シー１・ｌ上に一次元的に偏向して入射する。ここで
用いるレーザー光ＰＡ４は、そのレーザー光５の波長領
域か、−！′ハ光体シー１・１から発する輝尽発光の主
要波長領域と重複しないように選択される。

イｊ１光体シー１・１は、上記の偏向レーザー光の照射
下において，矢印９の方向に移送される。従って、届先
体シート１の全面にわたって偏向レーザー光か照射され
るようになる。なお、レーザー先番（４の出力、レーザ
ー光５のビーム径、レーザー光５の走査速度、蛍光体シ
ー１−　１の移送速度については、先読み操作のレーザ
ー光５のエネルギーが本読み操作に用いられるエネルギ
ーよりも小さくなるように調整される。

蛍光体シー１・１は、上記のようなレーザー光の照射を
受けると、蓄積記録されている放射線エネルギーに比例
する光量の輝尽発光を示し、この光はｉ読み用導光性シ
ートｌＯに入射する。この導光性シートｌＯはその入射
面が直線状で、蛍光体シー１−　１上の走査線に対向す
るように近接して配置されており、その射出面は円環を
形成し、フォトマルなとの光検出器１１の受光面に連絡
している。この導光性シー｝１０は、たとえばアクリル
系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹脂シートを加工して
つくられたもので、入射面より入射した光がその内部に
おいて全反射しながら射出面へ伝達されるように構成さ
れている。蛍光体シートｌからの輝尽発光はこの導光性
シー｝１０内を導かれて射出面に到達し、その射出面か
ら射出されて光検出器ｌ１に受光される。

光検出器１ｌの受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ントするフィルターが貼着され、輝尽発光のみを検出し
うるようにされている。光検出器１ｌにより検出された
輝尽発光は電気信号に変換され、さらに増幅器ｌ２によ
り増幅され出力される。増幅器ｌ２から出力された蓄積
記録情報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路ｌ３は、得られた蓄積記録情報に応じて
、適正レベルの信号が得られるように、増幅率設定値ａ
および収録スケールファクターｂを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蛍光体シート〕
は本読み用読出部３へ移送される。

本読み用読出部３においては次のような本読み操作か１
１なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレーザー光１
５は、前述のフィルター６と同様な機能をイ」するフィ
ルター１６を通過したのちヒームΦエクスパングー１７
によりビーム径の大きさが厳に：に調整される。次いで
レーザー光は、ガル／＼ノミラー等の光偏向器１８によ
り偏向処理され、平面反射鏡１９により反射されたのち
蛍光体シートｌ上に一次元的に偏向して入射する。なお
、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆＯレンス
２０等が配置され、蛍光体シート１の−にを偏向レーザ
ー光が走査した場合に、常に均一なヒーム速度を維持す
るようにされている。

イｉ光体シートｌは、上記の偏向レーザー光の照射１・
゛において、矢印２１の方向に移送される。従って、先
読み操ｒ１におけると同様に祉光体シーＩ・１の全面（
こわたって偏向レーザー光か照射されるようになる。

蛍光体シート１は、」１記のようにしてレーザー光の照
射を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積記録
されている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽発光
を発し、この光は本読み用導光性シート２２に入射する
。この本読み川導光性シーＩ・２２は先読みｍｍ光性シ
ートｌＯと同様の材質、構造を有しており、本読み用導
光性シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた輝
尽発光はその射出面から射出されて、光検出器２３に受
光される。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発光の
波長領域のみを選択的に透過するフィルターが貼着され
、光検出器２３か輝尽発光のみを検出するようにされて
いる。

光検出器２３により検出された輝尽発光は′電気信号に
変換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定され
た増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅され
たのち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器
２５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変
動幅に適したスケールファクターでデジタル信号に変換
される。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写に・積
された支持媒体」二の放射性標識物質の位置情報を読み
出すための方法について、上記においては先読み操作と
本読み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発明
において利用することかできる読出し操作は、」１記の
例に限られるものではない。たとえば、支持媒体−にの
放射性標識物質の竜、およびその支持媒体についての蓄
積性蛍光体シーＩ・の露光時間が予めわかっていれば、
上記の例において先読み操作を省略することも可能であ
る。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに転写蓄積さ
れた支持媒体」二の放射性標識物質の位置情報を読み出
すだめの方法は、」１記に例示した方１人に限られるも
のではない。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は１次に、第１図に示さ
れる信号処理回路２６に人力される。信号処理回路２６
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
夕ηの決定が行なわれる。

以下１本発明の信号処理方法を用いたオートラジオグラ
フィーにおける信号処理の実施ｙハ（様を、前記のマキ
サム・キルパート法を利用したＤＮＡの塩基配列決定法
を例にとり、その塩基配列決定のだめの典型的な塩基特
異的切断分解物の組合わせとして次の五群の塩基特異的
切断分解物の組合わせを用いて、異なる三種類のＤＮＡ
について同−支持媒体上で電気泳動させた場合について
説明する。

１）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 十シ（・シン特異的切断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ３）チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ４）グアニン特異的切断分解物、 ５）シ）・シン特異的切断分解物。

ます、放射性標識（３２Ｆ）か伺与された三種類のＤＮ
Ａのそれぞれを常法により各塩基単位で切断することに
より、それぞれ上記ｌ）〜５）の五群の塩ノル特異的！
ｉｌＪ断分解物からなる三組を得る。

ただし、上記ｌ）の基準混合物は少なくとも一組につい
て用意されればよい。

次に」−１記Ｉ１０群の塩基特異的切断分解物からなる
二組のそれぞれを、ゲル支持媒体上で電気泳動により分
＃展開させてそれぞれの分離展開列を得る。ただし、少
なくとも上記ｌ）の基４＋！混合物の分＃展開列と上記
２）および３）の１群の塩基特異的切断分解物の程合物
（基準列形成用試料）の１分ａ　ＩｔＧ開列間外、上記
４）および５）の１群の塩基特異的切断分解物の分離展
開列を挟むように配置して分Ｉｌｌ展開操作を行なう。

次に、この試料（分離展開列が形成されたゲル状支持媒
体）と蓄積性蛍光体シートとを室温で数分間重ね合わせ
ることにより露光操作を行ない、分＃展開列のオートラ
ジオグラフを蓄積性蛍光体シートに転写蓄積する。

第２図は、放射性標識の付与された三種類のＤＮＡの塩
基特異的切断分解物が分離展開されてなる上記五群の泳
動列のオートラジオグラフの例を示す。すなわち、第２
図の第１列から第１３列は順に、 （１）−ＣＧ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （２）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （３）−ＣＧ）特異的切断分解物 （４）−（Ｃ）特異的切断分解物 （５）−（Ｇ）特異的切断分解物 （６）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 （７）−（Ｇ）特異的切断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （８）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （９）−（Ｃ）特異的切断分解物 （１０）−（Ｇ）特異的切断分解物 （１１）−（Ｃ）特異的切断分解物 （１２）−（Ｇ）４＋ｊ異的切断分解物＋（Ａ）特異的
切断分解物 （１３）−（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 の各列（泳動列）を示す。第１列〜第４列、第５列〜第
９列、および第１Ｏ列〜第１３列は互いに異なるＤＮＡ
の分離展開列群である。また、第７列は基準混合物であ
り、第１列と第２列および第１２列と第１３列は、それ
ぞれ基準列形成用試料の組である。

蓄積性蛍光体シートに蓄積されたオートラジオグラフを
第１図に示した読出装置に装填して読み出すことにより
、信号処理回路２６に入力されたデジタル信号は一１蓄
積性蛍光体シートに固定された座標系で表わされた番地
（ｘ　、　ｙ）とその番地における信時のレベル（２）
とを有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に対
応している。

すなわち、得られたデジタル信号は第２図のオートラジ
オグラフに対応している。従って、信号処理回路２６に
は、上記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル画
像データがλカされることになる。なお、本発明におい
て、デジタル画像データとは、放射性標識物質のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号の集合体を意味す
る。

まず、デジタル画像データ上で、上記１３列のそれぞれ
について放射性標識物質の分離展開位置を検出し、それ
らをサンプリング点とする。サンプリング点は、たとえ
ば、次のようにして得ることができる。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展開位置）を横断するようにデジタル画
像データ上の異なる位置を平行に１回走査することによ
って、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点を
検出しくこの分布点を検出するための走査を予備走査と
いう）、各列についてそれぞれ二分布点を結んで１３本
の直線をｔ（１、ｔｌｌられた直線をそれぞれ各列にお
けるサンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理方法において、蓄積性イｉり光
体シートを読み出して得られたテシタル信月は、信じ処
理回路２６において一旦メモリーに記憶される（すなわ
ち、八ツファーメモリー、あるいは磁気ディスク等の不
揮発性メモリーに記憶される）。信号処理において、デ
ジタル画像データ１、を走査するとは、この走査箇所の
デジタル信号のみをメモリーから選択的に取り出すとを
意味する。

次いで、デジタル画像データを」二でイ１１たサンプリ
ング点検出のための走査方向に沿って走査することによ
り、走査領域上の信号のレベルを表わす関数ｆ　（ｗ）
［ｗは走査方向」二の位１古を表わす］を得ることがで
きる。そしてこの関数ｆ（ｗ）に、たとえば適当なフィ
ルター漠１数を用いてコンボリューションを行なうこと
によりスムージング処理を施し、関数ｇ　（ｗ）を得る
。次に、この関数ｇ（ｗ）に閾値処理を行なう。すなわ
ち、閾値（α０）に対し、 ｇ　（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）＝１ｇ（ｗ）＜００
のとき、ｇ（ｗ）−〇 とする処理を施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１または
Ｏの連続関数に変換する。サンプリング点は、ｇ　（ｗ
）＝　１の領域の各中点とすることにより検出ぶれる。

なお、上記の閾値処理における閾値（αｏ）は、たとえ
ば、走査領域上のデジタル信号について、信号のレベル
と、その頻度との関係、すなわちヒストダラムから決定
することができる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｋ　ｎ　（Ｘｋ　ｎ　＋　Ｖ　ｋ　ｎ　＋　ｚｋ　ｎ　
）　）を検出することができる。ここで、ｋは正の整数
であって各列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、
サンプリンタ点の番号を表わす。すなわち、サンプリン
グ点Ｓｋｎは、第に列の第ｎ番目のサンプリング点を、
＆、味する。

なお、本発明においてサンプリング点を検出するだめの
方法は、上述の方法に限られるものではない。

次に、ｉ１列のサンプリング点と第２列のサンプリング
点とを論理加算することにより、新たに（Ｇ）特異的切
断分解物、（Ａ）特異的切断分解物、（Ｔ）特異的切断
分解物および（Ｃ）特異的！、ＩＪ断分解物の四種類の
塩基特異的切断分解物の全てを含むサンプリング点の集
合、すなわち基２１Ｂサンプリング点の集合（Ｓ　＋ａ
　ｎ　’ｔを得る。この合成を演算として表わすと次の
ようになる。

（Ｓ＋４ｎ）＝　（Ｓｔｎ）［１（Ｓｚｎ）ここて、（
）はサンプリング点の集合を表わし、Ｕは論理和演算子
を表わす。この基準列は、第１列と第２列との中間に仮
想的に存在するように１．！１（準サンプリング点Ｓ　
１４　Ｈの座標を新たに設定する。

同様の処理を第１２列のサンプリング点と第１３列のサ
ンブリンク点についても行なうことにより、基準サンプ
リング点（Ｓ　Ｉｓ　ｎ　）を有する基べ１・列を合成
して得る。

また、第７列は基準混合物の分ｔｉｌｌ展開列、すなわ
ち基準列であるから、そのサンプリング点は基準サンプ
リング点である。このようにして、分離展開して得られ
た１３列の泳動列の両端および中央部にデジタル画像デ
ータ上において、三列の基準列（仮想的な基準列を含む
）を得ることができる。

各基準列において対応する基準サンプリング点、すなわ
ち、サンプリング点の番号ｎが等しい基準サンプリング
点を結んで複数の直線（もしくは折れ線）を得る。まず
、分離展開位置の最も遠い（ｎ　＝　１　（７））　ｕ
準４ｊ　ンプｌ）ンク点５１４１．３７１および５１６
１を結んで折れ線を得、さらにｎ−２，３，・・・・・
・につぃても同様にしてＩＩＩＱ次直線（もしくは折れ
線）を得ることにより、各基準列における基準サンプリ
ング点の数のうち基準サンプリング点の最少数と同数の
直線（もしくは折れ線）を得る。さらに、得られた折れ
線を適当な曲線で近似することもできる。これらの直線
、折れ線または曲線からなる連続線群は、分離展開位置
についての等高線群［、ｎ）とみなすことができる。た
だし、ｎは基準サンプリング点の番号ｎに一致する。

第３図は、上記のようにして曲線で近似された等高線の
一部分を示す図である。

この等高線を基に、残りの列のサンプリング点について
比較同定を行なう。たとえば、第３列のサンプリング点
Ｓ３１については、サンプリング点Ｓ３１の位置ＣＸ３
１．　ｙ３　ｔ）が等高線Ｌ１とＬｌのうちどちらによ
り近いかを判定し、近い方の等高線がＬｌであるとする
と、サンプリング点Ｓ３１は基準サンプリング点５１４
１に帰属することができる。このようにして順に第３列
の全てのサンプリング点を基準サンプリング点のいずれ
かに帰属させる。すなわち、第３列のサンプリング点は
、基準サンプリング点の部分集合（Ｓ１４ｎ）３あるい
は等高線の部分集合（Ｌｎｌ：ｓで表わされる。

」１記の処理によりｘ−ｙ座標（Ｘｉ＜ｎ＋Ｙｉｃｎ）
で表わされるサンプリング点５ｉｃｎを等高線Ｌｎをも
って表わすことができる。この等高線は泳動座標ともい
えるから、この処理は！！！！看すれば、ｘ−ｙ座標か
ら泳動座標Ｌｎへの座標変換とみなすことができる。

基準サンプリング点に帰属された第３列のサンプリング
点の集合は、この基準列を構成する第１列のサンプリン
グ点の集合（Ｓ＋ｎ）に含まれるので、 （ｓ＋ａｎ）３　ｎ　　（Ｓ　　１　ｎ）＝　　（Ｓｔ
ｓｎｌなる論理積演算で表わされる新たなサンプリング
点の集合（Ｓ　１６ｎ　Ｉを有する仮想的な第１６列を
得る。得られた第１６列は、第１列〜第４列の組におけ
るアゾこン特異的切断分解物の分離展開列に相当する。

同様の処理を第４列と第２列との間においても行ない、
チミン特異的切断分解物の分ｔｉｌ＆展開列に相当する
第１７列を得る。次に、第３列、第４列、第１６列およ
び第１７列について、ｎの小さい１１１４に基準サンプ
リング点５１４　ｎとサンプリング点Ｓｋｎとを比較し
ていき、それが合致したとき、その基準サンプリング点
Ｓ　１４　ｎを合致したサンプリング点Ｓｋｎで置き換
える。そして、基準列をｎの小さい順にたどれば、たと
えば、次のような図式を得ることができる。

Ｓ３１　・Ｓａｔ　・Ｓ　１７１・３３２・５１６１・
°゛。

上記図式において、５３ｎ＝Ｇ、５４ｎ＝Ｃ１ＳＩ６ｎ
＝Ａ、ＳＩ７゜−Ｔと置き換えることにより、次のよう
な図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−・・・・・・ このようにして、第１列〜第４列の組におけるＤＮＡの
片方の鎖状分子についての塩基配列を決定することがで
きる。

さらに、同様の処理を第５列〜第９列の組および第１０
列〜第１３列の組に対しても行なうことにより、それぞ
れのＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基配列を決定
することができる。

なお、得られたＤＮＡの塩基配列についての情報は、上
記の表示形態に限られるものではなく、任意の表示形態
が可能である。たとえば、所望により、さらに各列の走
査方向上における信号のレベルを任意に演算処理するこ
とにより、分離展開された各切断分解物の相対量をも表
示することが可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わ
せとして、Ａ、Ｔ、Ｇ＋Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−・・・・・・ Ｃ−Ｇ−Ａ−（、−Ｔ−・・・・・・ なお、本発明の信号処理方法による、上記の（Ｇ＋Ａ、
Ｔ＋Ｃ，Ｇ、Ｃ，Ｇ＋Ａ十Ｔ＋Ｃ）の組合わせを利用し
たＤＮＡの塩基配列決定法は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ部
分分解物の塩基配列決定法の一例であり、本発明の信号
処理方法は」−記の組合わせに限定されるものではなく
種々の組合わせが可能であり、その組合わせを利用して
上記の方法に準じる方法により同様にして塩基配列を決
定することができる。

ただし、いずれの組合わせにおいても、Ｇ、　Ａ、Ｔ、
Ｃの全ての塩基特異的切断分解物を含む基べ１１程合物
、および全体として四種類の塩基特異的切断分解物の全
てを含むように組合わせられたノンべ１・列形成用試料
とをイｑすることが必要である。さらに、−組の）ｊ、
：ａＩｉ列形成用試料の１以」二の分離展開列は、近接
して配置されていなければならない。また、この基準列
を得るだめの分ｇｌ展開列（基準混合物の分離展開列を
含む）の組は、塩基配列決定対象の塩基特異的切断分解
物の分＃展開列を挟むように配置ｙれて分＃展開を行な
うことが必要である。

このＡ％　’？ｉ　＃ａ合物および基準列形成用試料の
分離Ｉｊｉ＜間外の分離展開位置は、高精度にＤＮＡの
塩基配列を決定するためには、各組かできる限り離れて
いるのが好ましい。すなわち、この組が二組からなる場
合には、複数の分離展開列の両端部に配置するのが好ま
しく、三組からなる場合には、複数の分離展開列の両端
および中央部に配置するのが好ましい。この組か三組よ
りも多い場合には、検知対象の分離展開列の間に適当な
間隔をもって配置されるのが好ましい。三組以上の設置
は、放射性標識物質が分離展開された支持媒体にスマイ
リング効果などが生している場合には特に有効であり、
ＤＮＡの塩基配列を高精度に決定することができる。設
置する基準混合物および基準列形成用試料の分離展開列
の組数が増加するほど得られる等高線は正確なものとな
り、従ってＤＮＡの塩基配列を高精度に決定することが
可能となる。

また、基準混合物の分離展開列からなる基準列は、支持
媒体上に一列として設けられるので、合成される仮想的
な基準列よりも正確なものとなり、等高線の精度を上げ
ることができる。すなわち、試料に基準列を設けておく
ことにより、より高精度に塩基配列を決定することがで
きる。

また、この基準列形成用試料は基準列を単に形成するの
みならず、同時に一分＃展開列としてそのＤＮＡの塩基
配列決定に関与するものである。

従って、分＃展開列の数が多ければ多いほど、基準列を
多く合成できることになり、よって正確な“９高線をｌ
ｊ）ることか可能となる。すなわち、一層高精瓜に塩基
配列を決定することができるものである。従って、」１
記の例においては、支持媒体上で一次元的方向に分＃　
ｌｊ？開している１３列の放射性標識物質群を用いて説
明したが、分離展開列は１３列に限定されるものではな
い。

１、記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、信号処理回路２６から出力
されたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁
気テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）
へ伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電ｆ−
的に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値を
ビデオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感
熱記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることかできる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩基
配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なうこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 ｌ：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出部、３：本
読み用読出部、４：レーザー光源、５、レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、１ｏ：先読み用導光性シート、１１：光検出器
、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：ビーム
・エクスパングー、１８：光偏向器、１９：平面反射鏡
、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２二本読み用
導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器、２５　
：　Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物の分離Ｄｕ間
外のオートラジオグラフの例を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高線の一部分を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １゜ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける信り処理方
   法であって、放射性標識が伺惧されたＤＮＡもしくはＤ
   ＮＡ部分分解物の塩基特異的１）Ｊ断分解により得られ
   た、 ｌ）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的ジノ断
   分解物、チミン特異的切断分解物、およびシトシン特異
   的切断分解物の全てを含ちり＋ｋ　Ｊ＜”混合物を少な
   くとも一組、２）グアニン特異的切断分解物、アデニン
   特異的ジノ「１１分解物、チミン特異的切断分解物。 およびシトシン特異的切断分解物の全てを全体として含
   むように任意に組合せられた少なくとも二種の塩基＃異
   的切断分解物もしくは塩基特異的切断分解物混合物から
   なる基準列形成用試料を少なくとも一組、および、 ３）少なくとも−・種類の塩基特異的切断分解物を含む
   塩基特異的切断分解物もしくは切断分解物混合物を少な
   くとも一組、 のそれぞれが、支持媒体上において、 」二重１）の−組の基準混合物の分離展開列と上記２）
   の−組の基準列形成用試料の二以上の分離展開列とが、
   少なくとも一列の上記３）の塩基特異的切断分解物もし
   くは塩基特異的切断物混合物の分離展開列を挟むように
   互いに平行関係を以って一次元的に分離展開されてなる
   少なくとも門外の分離展開列を構成する放射性標識物質
   群から放出される放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シー
   トに吸収させることによって、この蓄積性蛍光体シート
   に該放射性標識物質群の位置ｔｈ報を有するオートラジ
   オグラフを蓄積記録したのち、該蓄積性蛍光体シートを
   電磁波で走査して該オートラジオグラフを輝尽光として
   放出させ、そしてこの輝尽光を光電的に読み出すことに
   より得られるそれそれの分離１１ｉ；間外のオートラジ
   オグラフに対応するテシクル信を号について、 ｌ）分＋２７＋：　ＩＪｔ；間外のそれぞれについてサ
   ンプリング点を検出する工程、 １１）該基帖混合物の分離展開列からなる基準列のサン
   プリング点、および該基準列形成用試料の二辺上の分離
   展開列から合成された基準列のサンプリング点を、それ
   ぞれ基準サンプリング点とし、該複数の基準列間で対応
   する基へ６サンプリング点を結んだ直線、折れ線または
   曲線からなる複数の連続線を設定する工程、そして １１１）該連続線により、各分離展開列のサンプリング
   点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理力ｌノ
   、。 ２゜］二二重）の基準混合物の分＃展開列と上記２）の
   基準列形成用試料の二辺上の分離展開列とが合わせて少
   なくとも三組配置され、かつ、互いに近接する二組の分
   １１１１ｍ展開列が、少なくとも−・列の上記３）の塩
   基特異的切断分解物もしくは切断分解物混合物の分離展
   開列を挟むように配置されていることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフィーにおけ
   る信号処理方法。 ３゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理方法
   。 ４゜上記２）の−組の基準列形成用試料が、（１）グア
   ニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物、および、（２）チミン特
   異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 の二種の塩基特異的切断分解物混合物から構成されてい
   ることを特徴とする特許請求のａ囲第１項乃至第３項の
   いずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける信
   号処理方法。