DE69812982T2 - Fluoreszierende cyaninfarbstoffe - Google Patents

Fluoreszierende cyaninfarbstoffe

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DE69812982T2
DE69812982T2 DE69812982T DE69812982T DE69812982T2 DE 69812982 T2 DE69812982 T2 DE 69812982T2 DE 69812982 T DE69812982 T DE 69812982T DE 69812982 T DE69812982 T DE 69812982T DE 69812982 T2 DE69812982 T2 DE 69812982T2
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Description

  • Diese Erfindung betrifft neue und nützliche Cyaninfarbstoffe. Die Farbstoffe sind als Fluoreszenzmarkierungen von Biomolekülen, wie etwa Oligonukleotiden und Desoxyribonukleosiden verwendbar. Die Biomoleküle können entweder direkt oder indirekt durch ein Phosphoramidit mit den Farbstoffen markiert werden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die DNA-Sequenzierung ist ein wichtiges analytisches Verfahren der Molekularbiologie. Die Entwicklung von Sequenzierverfahren hat sowohl bei der Analyse als auch der Manipulation von genetischem Material zu Fortschritten geführt.
  • Gut bekannte Verfahren der DNA-Sequenzierung schließen das chemische Degradationsverfahren nach Maxam-Gilbert, beschrieben in Maxam et al., Meth. in Enzym. 65: 499 (1980) und das Didesoxy- Kettenabbruchverfahren nach Sanger, beschrieben in Sanger et al., PNAS, USA 74: 5463 (1977) ein. In jedem Verfahren werden mit ³²P markierte DNA- Fragmente erzeugt, welche mittels Gelelektrophorese analysiert werden. Beide Verfahren sind verwendbar, obwohl sie sich als schwierig und langsam erweisen können.
  • Als ein Ergebnis wurden andere Verfahren gesucht, einschließlich solcher, welche nicht auf kurzlebigen Radioisotopen wie etwa ³²P beruhen. Es wurden mehrere alternative Nachweisverfahren entwickelt, basierend auf Fluoreszenzmarkierungen. DNA-Fragmente werden mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Eine Anregung mit einer geeigneten Lichtquelle (Laser) verursacht eine charakteristische Emission des Farbstoffs, wobei die Bande identifiziert wird. Sogar winzige Mengen eines Biomoleküls können unter Verwendung solch eines Verfahrens nachgewiesen werden.
  • Unter den Fluoreszenzfarbstoffen, die entwickelt wurden, sind eine Anzahl von Cyaninfarbstoffen, welche verwendet worden sind, um verschiedene Biomoleküle für hochsensitive Nachweisschemata zu markieren. Z. B. offenbart und beansprucht das US-Patent 5,268,486, veröffentlicht von Waggoner et al. (1993), fluoreszierende arylsulfonierte Cyaninfarbstoffe mit großen Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeuten zum Zweck des Nachweises und der Quantifizierung markierter Komponenten. Obwohl die in diesem Patent beschriebenen Farbstoffe verwendbar sind, werden zusätzliche Cyaninfarbstoffe gesucht.
  • WO 96/23525 offenbart einen diagnostischen Marker, umfassend ein Detektionssystem und eine fluoreszierende funktionelle Gruppe, die an das Detektionssystem gebunden ist. Der Marker emittiert Fluoreszenz, wenn er mit Infrarotstrahlen bestrahlt wird, und ist für eine endoskopische Infrarotdiagnose oder eine Identifizierung eines Fokus in chirurgischen Operationen verwendbar.
  • S. R. Mujumdar et al. offenbaren in Bioconjugate Chem., 4/2, 105 (1993) Sulfobenzindocyanin-Succinimidylester als fluoreszierende Markierungsreagenzien. Neuere Fortschritte in der Festkörperlasertechnologie haben zur kommerziellen Verfügbarkeit von kostengünstigen verlässlichen Lasern mit Wellenlängen in der Nähe von 680 nm geführt. Geeignete Farbstoffe, die mit solchen Lasern angeregt werden, werden in der nahen Infrarot(NIR)-Region des elektromagnetischen Spektrums fluoreszieren. Diese Fluoreszenzsignale werden frei sein von Hintergrundfluoreszenz der meisten biologischen Systeme. Unglücklicherweise sind wenige Farbstoffe kommerziell erhältlich, welche geeignete Absorptions/Fluoreszenzeigenschaften besitzen und nützliche Bindungsgruppen zur Anheftung an Biomoleküle, und diejenigen, die gegenwärtig erhältlich sind, sind ziemlich teuer.
  • Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Cyaninfarbstoffe bereitzustellen, die bei der Markierung von Biomolekülen verwendbar sind.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Neue sulfonierte Cyaninverbindungen sind zur Markierung verschiedener Arten von Biomolekülen verwendbar. Die Verbindungen besitzen die allgemeine Formel: Formel 1
  • worin R -NCS oder O-Phosphoramidit ist; und jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis etwa 10 ist.
  • Die Erfindung stellt auch Nukleotidanaloga und DNA- Kettenabbruchstoffe bereit, die mit einem Farbstoff der Formel I markiert sind, worin R OH, -CO&sub2;H, -NH&sub2; oder -NCS ist und x und y jeweils unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R -OH, x ist 6 und y ist 4. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform ist R -CO&sub2;H, x ist 6 und y ist 4.
  • Die Verbindungen der Formei I, worin R -CO&sub2;H ist, können an ein Nukleotidanalogon oder einen DNA-Kettenabbruchstoff angeheftet sein, durch eine Amingruppe, oder am letzteren durch eine Hydroxylgruppe. Die Verbindungen dieser Erfindung, worin R -NCS ist, können durch eine Amingruppe an ein Biomolekül angeheftet sein. Die Verbindungen der Formel I, worin R -OH ist, können an ein Nukleotidanalogon oder einen DNA- Kettenabbruchstoff indirekt durch ein Phosphoramidit angeheftet sein, wobei schließlich eine Phosphatbindung gebildet wird. In jeder Ausführungsform kann das markierte Biomolekül dann mit einem Festkörperlaser angeregt werden und mit hoher Empfindlichkeit durch die Fluoreszenz der Markierung nachgewiesen werden. Die in dieser Erfindung verwendeten Farbstoffe besitzen vorteilhafte Löslichkeits- und Lichtabsorptions/Emissionseigenschaften.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Farbstoffe zur Verwendung in dieser Erfindung besitzen die allgemeine Formei Formel 1
  • worin R -OH, -CO&sub2;H, -NH&sub2; oder -NCS ist und jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus 1 bis 10. In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 2 und 6. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Farbstoff N-(6-Hydroxyhexyl)N'-(4-sulfonatobutyl)-3,3,3',3'-tetramethylbenz[e]indodicarbocyanin mit der Formel: Formel 2
  • In einer zweiten, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Farbstoff N-(5-carboxypentyl)N'-(4-sulfonatobutyl)3,3,3',3'-tetramethylbenz(e)indodicarbocyanin mit der Formel: Formel 3
  • Diese zwei Farbstoffe sind bevorzugt, weil sie kommerziell erhältliche Vorläufer für die Bindungsgruppen besitzen: 6-Bromhexanol, 6-Bromhexylsäure und 1,4-Butansulfon (alle erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Die Bindungsgruppen stellen einen adäquaten Abstand zwischen dem Farbstoff und dem Biomolekül bereit, für eine effiziente Anlagerung, ohne eine übermäßige Hydrophobizität zu verleihen. Die resultierenden markierten Biomoleküle behalten ihre Löslichkeit in Wasser und werden von Enzymen gut erkannt.
  • Die Farbstoffe zur Verwendung in dieser Erfindung, worin R -CO&sub2;H oder -OH ist, können synthetisiert werden wie es ausführlich in den untenstehenden Beispielen dargelegt ist, durch Umsetzen des geeigneten N- (Carboxyalkyl)- oder N-(Hydroxyalkyl)-1,1,2-trimethyl-1 H-benz(e)indoliniumhalogenids, bevorzugt Bromid, mit Sulfonatobutyl-1,1,2-trimethyl-1H- benz(e)indol in einem relativen molekularen Verhältnis von etwa 0.9 : 1 bis etwa 1 : 0.9, bevorzugt 1 : 1, in einem organischen Lösungsmittel wie etwa Pyridin, und Rückflusserhitzen, gefolgt von der Zugabe von 1,3,3-Trimethoxypropen in einem relativen molekularen Verhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 3 : 1 zum Reaktionsprodukt und fortwährendem Rückfluss. Das Gemisch wird anschließend gekühlt und in ein organisches Lösungsmittel wie etwa Ether geschüttet. Der resultierende Feststoff oder halbfeste Stoff kann durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule unter Verwendung einer Reihe von Methanol/Chloroform-Lösungsmitteln gereinigt werden.
  • Als ein alternatives Zweistufensyntheseverfahren, ebenso in den untenstehenden Beispielen ausgeführt, kann N-4-Sulfonatobutyl-1,1,2- trimethyl-1H-benz(e)indol und Malonaldehyd-bis(phenylimin)-monohydrochlorid in einem molekularen Verhältnis von 1 : 1 in Essigsäureanhydrid gelöst und das Gemisch erhitzt werden. Das Essigsäureanhydrid wird unter einem höhen Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Ether gewaschen. Der verbleibende erhaltene Feststoff wird getrocknet und nachfolgend mit den geeigneten N-(Carboxyalkyl)- oder N- (Hydroxyalkyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoliniumhalogenid in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels wie etwa Pyridin gemischt. Das Reaktionsgemisch wird erhitzt, dann wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, wobei die rohe erwünschte Farbstoffverbindung zurückbleibt. Diese Verfahren wurde aus dem Zweistufenverfahren, dargelegt in Ernst, L. A., et al., Cytometry 10: 3-10 (1989), angepasst.
  • Die Farbstoffe können auch mit einem Amin oder Isothiocyanat- Terminationsgruppe hergestellt werden. Z. B. kann N-(ω-Aminoalkyl)-1,1,2- trimethyl-1H-benz(e)indoleniumbromidhydrobromid (synthetisiert wie in N. Narayanan und G. Patonay, J. Org. Chem. 60: 2391-5 (1995)) umgesetzt werden, um Farbstoffe der Formel 1 zu bilden, worin R -NH&sub2; ist. Salze dieser Aminofarbstoffe können zu den entsprechenden Isothiocyanaten umgewandelt werden durch Behandlung bei Raumtemperatur mit Thiophosgen in einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Chloroform, und wässrigem Natriumcarbonat.
  • Die Farbstoffverbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung besitzen eine maximale Lichtabsorption, welche in der Nähe von 680 nm auftritt. Sie können somit durch kommerziell erhältliche Laserdioden, die kompakt, verlässlich und kostengünstig sind, effizient angeregt werden und Licht bei dieser Wellenlänge emittieren. Geeignete kommerziell erhältliche Laser schließen beispielsweise Toshiba TOLD9225, TOLD9140 und TOLD9150, Phillips CQL806D, Blue Sky Research PS 015-00 und NEC NDL 3230SU ein. Die Weffenlänge im nahen Infrarot/langwelligen Rot ist auch darin vorteilhaft, dass die Hintergrundfluoreszenz in dieser Region normalerweise in biologischen Systemen gering ist und eine hohe Empfindlichkeit erzielt werden kann.
  • Die Isothiocyanatgruppen der erfindungsgemäßen Farbstoffe stellen Bindungsgruppen zur Anheftung an eine große Vielfalt von biologisch wichtigen Molekülen bereit, einschließlich Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Avidin, Streptavidin, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Desoxynukleinsäuren, Fragmenten von DNA oder RNA, Zellen und synthetischen Kombinationen von biologischen Fragmenten, wie etwa Peptidnukleinsäuren (PNAs).
  • Die Farbstoffe zur Verwendung in dieser Erfindung besitzen eine ausreichende Löslichkeit in wässrigen Lösungen, so dass, wenn sie an ein lösliches Biomolekül angeheftet sind, das Biomolekül seine Löslichkeit beibehält. Sie besitzen auch eine gute Löslichkeit in organischen Medien, was eine beachtliche Vielseitigkeit in synthetischen Versuchsansätzen für die Markierung von erwünschten Materialien bereitstellt.
  • In Abhängigkeit davon, ob der Farbstoff eine reaktive Carboxylgruppe, Isothiocyanatgruppe oder Hydroxylgruppe besitzt, ist die Verbindung entweder direkt an das interessierende Biomolekül gebunden oder indirekt durch Phosphoramiditchemie gebunden. Die Phosphoramidite sind nützlich zur Markierung solcher Biomoleküle wie DNA, RNA und Peptidnukleinsäuren. Sie sind verwendbar in trockenen (d. h. wasserfreien) Bedingungen, wie etwa trockenem Acetonitril. Die Carboxylsäure-reaktiven Gruppen können mit Amingruppen von Biomolekülen in Wasser oder wässrigen organischen Lösungsmittelgemischen reagieren.
  • Wenn erfindungsgemäß eine Farbstoffcarbonsäure an ein aminhaltiges Biomolekül gebunden wird, wird die Farbstoffcarbonsäure zuerst in eine reaktivere Form, wie etwa N-Hydroxysuccinimid(NHS)-ester oder ein gemischtes Anhydrid umgewandelt. Das aminhaltige Biomolekül wird dann mit der resultierenden aktivierten Säure behandelt, um eine Amidbindung zu bilden. Typischerweise wird diese Reaktion in Gemischen von wässrigem Puffer und einem organischen Lösungsmittel wie etwa DMF bei pH 8 bis 9 durchgeführt.
  • Die Anheftung eines Isothiocyanatfarbstoffs erfolgt analog zu dem Verfahren für den Carboxyfarbstoff, es ist aber kein Aktivierungsschritt erforderlich. Das aminhaltige Biomolekül wird direkt mit dem NCS-Farbstoff behandelt, um eine Thioharnstoffbindung zu bilden. Typischerweise wird die Reaktion in Gemischen von wässrigem Puffer und einem organischen Lösungsmittel, wie etwa DMF bei pH 8 bis 9 durchgeführt.
  • Wenn die Farbstoffverbindung eine reaktive Hydroxylgruppe besitzt, wird sie durch eine Phosphoramiditchemie an ein Biomolekül, wie etwa DNA oder RNA, gebunden. Die Verwendung des Phosphoramidits erlaubt die Markierung der DNA oder RNA während des Syntheseverfahrens. Das geschützte Nukleotid wird markiert, während es an einen Festphasenträger angeheftet ist. Die freie 5'-OH-Gruppe wird mit dem Phosphoramidit und einem Tetrazolaktivator umgesetzt, um eine Phosphitbindung zu bilden, welche nachfolgend zu Phosphat oxidiert wird. Die markierte DNA oder RNA wird dann unter Verwendung von Ammoniak oder anderen standardisierten Verfahren von der Festphase abgespalten.
  • Als Beispiele für die Verwendungen der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen dieser Erfindung als Markierungsreagenzien für eine analytische Bestimmung von Proteinen oder für ein automatisiertes Sequenzieren von DNA verwendet werden. Methodiken der Standardsequenzierung, die mit markierten Primern durchgeführt werden, können Sequenzleitern mit hoher Qualität und präzise DNA-Sequenzdaten erzeugen.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können z. B. an Analoga von Nukleotidtriphosphaten (dNTPs und ddNTPs) angeheftet werden, um ein Reagenz für ein enzymatisches Markieren verschiedener DNA-Moleküle und zur Erleichterung deren Detektion mit einem automatisierten DNA-Sequenzier- und Analysesystem bereitzustellen. Produkte einer DNA-Sequenzierreaktion können innen markiert werden mittels Durchführung einer beschränkten Polymerisation unter Verwendung des markierten dNTP als einzige Quelle eines bestimmten Desoxynukleotids vor einer Didesoxy-spezifischen Terminationsreaktion. PCR- Produkte können auch fluoreszenzmarkiert werden durch die Zugabe von begrenzten Mengen des markierten dNTPs zu der Amplifizierungsreaktion. Solch eine Markierung kann z. B. nützlich sein für die Detektion von kurzen Tandern-Repeat-Polymorphismen (STRPs, "short tandern repeat polymorphism"), welche wiederum für Genkartierung, genetische Diagnostik, forensische Analysen und Vaterschaftstests nützlich sind.
  • Beispiele für Nukleotidanaloga und DNA-Kettenabbruchstoffe, welche mit den Farbstoffen dieser Erfindung markiert werden können, schließen beispielsweise die in den US-Patenten 5,332,666; 5,151,507; 5,047,519; 5,091,519; 4,711,955 und 5,241,060 und in der Veröffentlichung der PCT- Anmeldung WO 95104747 aufgezählten ein. Zwei spezielle Beispiele für Nukleotidtriphosphatanaloga, die mit einem Farbstoff der vorliegenden Erfindung markiert sind, sind unten dargestellt:
  • worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist und jedes M jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Li, Na, K, NH&sub4;, (CH&sub3;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub4;N oder (CH&sub3;)&sub4;N.
  • Beispiele für Abbruchstoffe, an welche Fluoreszenzfarbstoffe angeheftet worden sind, schließen ein:
  • worin x und y wie oben definiert sind.
  • Die Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Kettenabbruchstoffe werden für die Erzeugung von Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sequenzierfragmenten angewendet. Ein photometrisches Detektionssystem weist die Fragmente nach, die durch Elektrophorese aufgetrennt worden sind. Ein Fluoreszenznachweis erlaubt es entweder, ein Gel, das räumlich aufgelöste Banden enthält (d. h. eine räumliche Auflösung) zu scannen, oder an einem einzelnen Punkt auf dem Gel zu sitzen und Banden nachzuweisen, wenn sie nacheinander durch die Nachweiszone wandern (d. h. eine zeitliche Auflösung).
  • Die vorliegende Erfindung wird unten durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele sind lediglich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und sollen nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung gedeutet werden.
    • Beispiel 1 Synthese von N-(6-Hydroxyhexyl)N'-(4-sulfonatobutyl)-3,3,3',3'-tetramethylbenz(e)indodicarbocyanin
  • 9,0 g 6-Brom-1-hexanol (105 mmol), erhalten von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, und 21,96 g 1,1,2-Trirrfethyl-1H-benz(e)indol (105 mmol), erhalten von ACROS Organics, einer Tochtergesellschaft von Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, wurden in einem Druckschlauch unter Rühren auf 95-100ºC erhitzt. Die Schmelze verfestigte sich nach dreistündigem Erhitzen. Das Gemisch wurde für weitere 3 h erhitzt, abgekühlt und in 200 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde 3x mit 100 ml-Portionen Wasser extrahiert. Die Wasserschichten wurden vereinigt und 3x mit 100 ml-Portionen Ether extrahiert. Die wässrige Phase wurde in Vakuum verdampft, um N-(5- Hydroxyhexyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoliniumbromid in Form eines farblosen Öls (26,4 g, 65% Ausbeute) bereitzustellen, welches ohne weitere Aufreinigung verwendet werden konnte.
  • 390 mg des N-(6-Hydroxyhexyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoliniumbromids (390 mg, 1 mmol) und N-Sulfonatobutyl-1,1,2-trimethyl-1H- benz(e)indol (395 mg, 1 mmol) (erhalten in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das von Hamer, F. M. in "Cyanine Dyes and Related Compounds", Weissberger, M. A., Ed., Wiley Interscience, N.Y., 1964 gelehrt wird) wurden in Pyridin (10 ml) gelöst und unter Rückfluss für 30 min erhitzt, dann wurden 250 ul (265 mg, 2,0 mmol) 1,3,3-Trimethoxypropen (ebenso erhalten von ACROS Organics) tropfenweise zugegeben und der Rückfluss wurde für 45 min weitergeführt. Das resultierende Gemisch wurde abgekühlt und in 100 ml Ether gegossen und der resultierende Feststoff wurde mehrere Male mit zusätzlichen 10 ml-Portionen Ether gewaschen. Das rohe gewaschene Produkt wurde nach Verdampfung des Lösungsmittels wiedergewonnen und durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule durch Elution der Säule nacheinander mit 2 l von 10%, 15% und 20% Methanol in Chloroform gereinigt. Die Ausbeute des rückgewonnenen reinen Hydroxyfarbstoffs betrug 97 mg (14%).
    • Umwandlung des Hydroxyfarbstoffs zum Phosphoramidit
  • Der oben erhaltene Hydroxyfarbstoff (97 mg, 0,140 mmol) wurde in 10 ml trockenem Methylenchlorid gelöst und unter Argon für 30 min bei 0ºC gerührt. Eine Lösung von bis-(N,N-Diisopropylamino)-cyanoethylphosphin (2,13 ml, 0,15 M in Methylenchlorid) (Monomer Sciences, Huntsville, Ala) wurde zu der Farbstofflösung zugegeben. Es wurde Tetrazol (0,128 ml, 0,5 M) (erhalten von PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.) in Acetonitril zugegeben wobei die Lösung bei 0ºC gehalten wurde. Die Kühlung wurde nach 20 min entfernt und die Reaktion wurde für weitere 1,5 h bei Raumtemperatur weitergeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5% NaHCO&sub3; gequencht, 2x mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und das rohe Produkt wurde in 1,5 ml Methylenchlorid aufgenommen. Das Produkt wurde durch Präzipitation in Hexan erhalten.
    • Markierte Oligonukleotide
  • Das Phosphoramidit des Fluoreszenzfarbstoffs N-(6-Hydroxyethyl)N'- (4-sulfonatobutyl)-3,3,3',3'-tetramethyl-benz(e)indodicarbocyanin kann verwendet werden, um DNA-Moleküle zu markieren, die in einem DNA- Syntheseapparat hergestellt werden. Der Farbstoff wird mittels einer Standard- Phosphoramiditchemie an das 5'-Ende des geschützten, trägergebundenen Oligonukleotids angeheftet. Bei Synthesen im 200 nmol-Maßstab betragen typische Rohausbeuten farbstoffmarkierter Oligonukleotide 150 nmol oder mehr.
  • Jedes der DNA-Oligonukleotide M13 vorwärts (-29), M13 revers, T7, T3 und SP6 wurde im PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA- Syntheseapparat in Übereinstimmung mit Standardreagenzien und der vom Hersteller gelehrten Methodik synthetisiert. Derselbe Apparat wurde dann verwendet, um durch Behandlung mit einer 0,1 M-Lösung des oben hergestellten Farbstoffphosphoramidits in Acetonitril die Fluoreszenzmarkierung an das 5'-Ende jedes Oligonukleotids anzuheften. Für die Anheftung des Farbstoffphosphoramidits wurde eine dreiminütige Verzögerung nach der Lieferung des Farbstoffs in das Tetrazol zu der Synthesesäule eingefügt, um zusätzliche Zeit für die Ankopplungsreaktion zu ermöglichen.
  • Das 5'-fluoreszenzmarkierte DNA-Oligonukleotid wurde nach Oxidation, Spaltung, Deprotektion und Reinigung durch HPLC hergestellt. Zur HPLC- Reinigung des markierten Oligonukleotids wurde eine Umkehrphasensäule C18 mit 5 u Partikeln, 300 A Porengröße (Waters DeltaPak), 1,7 ml/min verwendet. Lösungsmittel A war 4% Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat und Lösungsmittel B war 80% Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat. Das Gradientenprofil war 10 zu 45% B über 35 Minuten, 45 bis 100% B über 10 Minuten, 100 bis 10% B in 10 Minuten. Das markierte Oligonukleotid eluierte bei etwa 40 Minuten.
  • Das markierte Oligonukleotid kann z. B. als ein Primer im Sanger- Verfahren der DNA-Sequenzierung, oben angegeben, als ein angepasster Primer zur Genotypisierung oder als eine Hybridisierungssonde verwendet werden.
    • Beispiel 2 Synthese von N-(5-Carboxypentyl)N'-(4-sulfonatobutyl)-3,3,3',3'-tetramethylbenz(e) indodicarbocyanin
  • N-(5-carboxypentyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoliniumbromid (100. mg, 0,25 mmol) (hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das von Hamer, F. M. in "Cyanine Dyes and Related Compounds", Weissberger, M. A., Ed., Wiley Interscience, N. Y., 1964 gelehrt wird) und N-Sulfonatobutyl-1,1,2- trimethyl-1 H-benz(e)indol (85 mg, 0,25 mmol) (ebenso in Übereinstimmung mit den Verfahren in "Cyanine Dyes and Related Compounds", s. o.) wurden in 10 ml Pyridin gelöst und unter Rückfluss für 1 h erhitzt. Anschließend wurde 1,3,3-Trimethoxypropen (66 mg, 0,50 mmol) (erhalten von ACROS Organics) tropfenweise zu der refluxierenden Lösung zugegeben und das Erhitzen wurde für 2 h fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule unter Verwendung eines Methylenchlorid- und Methylenchlorid/Methanol-Gradienten wie in Beispiel 1 gereinigt. Die Ausbeute betrug 89 mg (0,126 mmol, 50%) der erwünschten Farbstoffcarbonsäure.
    • Markierung von Nukleotiden mit der Farbstoffcarbonsäure
  • Die Farbstoffcarbonsäure (5 mg, 0,07 mmol) wurde in trockenem DMF gelöst und mit N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) (2,75 mg, 0,021 mmol) und dann mit Ethylchloroformiat (1,5 mg, 0,014 mmol) behandelt und bei Raumtemperatur für 4 h gerührt. Das Reaktionslösungsmittel, DIPEA, und Ethylchloroformiat wurden unter Vakuum entfernt. Das resultierende gemischte Anhydrid wurde ohne weitere Behandlung oder Reinigung im folgenden Schritt verwendet.
  • Ein Nukleotidtriphosphat, 8-(5-Aminopentylamino)-2'-desoxyadenosin- 5'-triphosphat (von Boehringer Mannheim Biochemicals) (4,5 mg, 0,0073 mmol, 1,04 eq.) wurde in Boratpuffer bei pH 8,5 gelöst und das gemischte Anhydrid aus der vorhergehenden Reaktion (0,007 mmol) in -DMF (beides gleiche Volumen) wurden zusammengemischt und die Reaktion wurde von einer HPLC gefolgt. Das markierte Nukleotidkonjugat wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung von N6-Deaza-dATP als das Nukleotidtriphosphat (erhalten von DuPont NEN) befolgt.
  • Das markierte Oligonukleotid kann z. B. bei einer Genotypisierung oder einer zyklischen Markierung und Sequenzierung (CLS, "cycle labeling and sequencing") verwendet werden.
    • Beispiel 3 Anderer Syntheseweg
  • N-4-Sulfonatobutyl-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indol (690 mg, 2,0 mmol), synthetisiert in Übereinstimmung mit dem oben angeführten Verfahren, das in "Cyanine Dyes and Related Compounds" dargelegt wird, und Malonaldehyd-bis(phenylimin)monohydrochlorid (518 mg, 2,0 mmol) erhalten von Aldrich Chemical Co. (Katalog-Nr. 38353-8) wurden in 50 ml Essigsäureanhydrid gelöst und das Gemisch wurde für 30 min über einem Ölbad auf 125ºC erhitzt. Das Essigsäureanhydrid wurde unter einem hohen Vakuum entfernt und mit Ether (3 · 100 ml) gewaschen. Der erhaltene braune zurückbleibende Feststoff wurde getrocknet (900 mg, 93%) und ohne weitere Aufreinigung für die Synthese eines erwünschten Farbstoffs verwendet.
  • Um den Farbstoff von Beispiel 1 herzustellen, wurden 276 mg (0,57 mmol) des im vorhergehenden Verfahren erhaltenen Salzadduktes mit N-(6- Hydroxyethyl) 1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoleniumbromid (224 mg, 0,57 mmol) in einem Kolben gemischt und die Feststoffe wurden in Pyridin (15 ml) gelöst. Das Gemisch wurde für 30 min auf 125ºC für 30 min erhitzt. Das Pyridin wurde unter Vakuum entfernt. Der gebildete asymmetrische Farbstoff war gemäß TLC das einzige Farbstoffprodukt. Die Rohausbeute betrug etwa 400 mg. Eine Aufreinigung unter Verwendung einer Silikagel- Säulenchromatographie ergibt voraussichtlich > 90% Ausbeute.
  • Um den Farbstoff von Beispiel 2 herzustellen, wurden dieselben Verfahren befolgt, Mischen von 100 mg (0,208 mmol) des Salzaddukts mit 84 mg (0,208 mmol) N-(Carboxypentyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz(e)indoleniumbromid in 10 ml Pyridin. Die rohe Ausbeute des erwünschten Produkts betrug ungefähr 150 mg. Es wird erwartet, dass eine Aufreinigung unter Verwendung einer Silikagelchromatographie eine Ausbeute > 90% ergibt.
    • Beispiel 4 Markierter Primer
  • Der M13 Vorwärts(-29)-Primer (1,5 umol), markiert mit dem Cyaninfarbstoff über das Phosphoramidit in Beispiel 1, wurde verwendet, um den M13-Vektor (bezogen von Epicentre Technologies Corporation, Madison, WI) (0,2 umol) zu sequenzieren, in Übereinstimmung mit dem SequiThermTM Cycle Sequencing Protocol (Sequencing Bulletin #13, veröffentlicht von LI-COR, Inc., Lincoln, NE). Kurz, die Verfahren waren wie folgt:
  • Die folgenden Komponenten wurden in einem 0,5 ml- Mikrozentrifugenröhrchen vereinigt:
  • M13-Vektor: 0,2 pmol
  • 680 nm farbstoffmarkierter M13 Vorwärts(-29)-Primer: 1,5 umol
  • 10x Sequenzierpuffer
  • SequiThermTM thermostabile DNA-Polymerase
  • ddH&sub2;O, um ein Gesamtvolumen von 17 ul zu ergeben.
  • Es wurden vier 0,2 ml Thermocyclerröhrchen mit A, T, G und C markiert. In jedes Röhrchen wurden 0,2 ul des passenden SequiThermTM Long-Read Terminationsgemischs platziert. Es wurden 4,0 ul des Templat/Primer/Enzym- Gemisches aus dem obigen Mikrozentrifugenröhrchen in jede der vier Thermocycler-Terminationsröhrchen pipettiert.
  • Ein Tropfen (10-15 ul) Mineralöl wurde am oberen Ende des Reaktionsgemisches der vier Thermocyclerröhrchen platziert. Die vier Röhrchen wurden in den Thermocycler hineingesteckt und der Thermocycler wurde gestartet. Der Thermocycler wurde für die folgenden Zyklen programmiert:
  • a. 95ºC für 2 min
  • b. 95ºC für 30 sek
  • c. 60ºC für 15 sek
  • d. 70ºC für 15 sek
  • Schritte b-d wurden in insgesamt 30 Zyklen wiederholt
  • e. 4ºC Durchtränken
  • Nachdem die Zyklen vollständig waren, wurden 4,0 ul der SequiThermTM-Stopplösung in jedes der Reaktionsgemische unter das Mineralöl injiziert und sorgfältig gemischt. Die Proben wurden durch Erhitzen bei 95º für 3 min denaturiert.
  • Die resultierende Anordnung markierter DNA-Fragmente wurde auf ein 41 cm-Elektrophoresegel (6% entionisierte LongRangerTM-Lösung) in einem automatisierten DNA-Sequenzierapparat des Modells LI-COR 4200 geladen. Die Lösung wurde wie folgt hergestellt:
  • 25,2 g Harnstoff wurden zu 7,2 ml LongRangerTM 50% Gelkonzentrat (FMC Bioproducts Rockland, Maine) zugegeben und das Volumen wurde mit ddH&sub2;O auf 52,8 ml aufgefüllt. 7,2 ml des Standard-10x-TBE-Puffers wurden zugegeben und die Lösung wurde gemischt. Die Gellösung wurde zu einem Extraktionseinsatz zugegeben und filtriert.
  • Es wurde ein elektrischer Strom angelegt. Die Elektrophoreseparameter waren diejenigen, die im Sequencing Bulletin #28, veröffentlicht von LI-COR, Inc. dargelegt sind:
  • Parameter 41 cm-Apparat
  • Geldicke 0,25 mm
  • Gelzusammensetzung 5% LongRangerTM
  • Puffertyp 10 · TBE (890 mM TRIS, 890 mM Borsäure, 20 mM EDTA)
  • Gelpuffer 1,2 · TBE
  • Laufpuffer 1,0 · TBE
  • Volt 1500 V
  • Stromstärke 35,0 mA
  • Leistung 31,5 W
  • Temperatur 50ºC
  • Vorlaufzeit 30 min
  • Gesamtlaufzeit 7 h
  • Als die Fragmente den Detektor am anderen Ende des Gels passierten, wurde eine Fluoreszenz mit einer 680 nm-Laserdiode angeregt und von 710 bis 750 nm detektiert. Es wurde eine Sequenzleiter mit hoher Qualität erhalten.
    • Beispiel 5 Markierte dATP-Analoga (innere Markierungen)
  • N6-Deaza-dATP, markiert mit N-(5-Carboxypentyl)N'-(4- sulfonatobutyl)-3,3,3',3'-tetramethyl-benz(e)indodicarbocyanin (10 umol), hergestellt in Übereinstimmung mit den Verfahren in Beispiel 2, wurde mit unmarkiertem M13 Vorwärts(-29)-Primer (4 umol) verwendet, um den M13- Vektor (0,3 umol) (erhalten von Epicentre Technologies Corporation, Madison, WI) zu sequenzieren. Das zyklische Markierungs- und Sequenzier(CLS)- Verfahren zum Sequenzierung von DNA ist ein Zweistufenverfahren, welches ein zyklisches Markieren, wobei ein nicht markierter Primer teilweise verlängert und mit drei dNTPs und Infrarotfarbstoff-markiertem dATP markiert wird und zyklisches Sequenzieren beinhaltet, wobei der markierte Primer in Didesoxykettenabbruchreaktionen verwendet wird. Das Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Lehren des Sequencing Bulletin #41, veröffentlicht von LI-COR, Inc. durchgeführt. Das Verfahren war kurzgesagt wie folgt:
  • Die folgenden Reagenzien wurden in einem 0,2 ml-PCR-Röhrchen vereinigt:
  • M13-Vektor: 0,3 pmol
  • Primer: 4 pmol
  • dNTP-Gemisch (5 uM dCTP, dGTP und dTTP)
  • Farbstoffmarkiertes N6-Deaza-dATP: 10 pmol
  • 10x SequiThermTM-Reaktionspuffer
  • SequiThermTM-DNA-Polymerase: 5 U/ml
  • Steriles, entionisiertes Wasser, um ein Gesamtvolumen von 17 ul zu erbringen
  • Die Reagenzien wurden gut gemischt, ein Tropfen Mineralöl wurde oben auf das Reaktionsgemisch platziert und das Röhrchen wurde in einen MJ Research Thermal Cycler eingesetzt. Das folgende Markierungsreaktionsprogramm wurde für den Thermocycler festgesetzt:
  • a. 92ºC für 2 min
  • b. 92ºC für 30 sek
  • c. 40ºC für 10 sek
  • d. 50ºC für 15 sek
  • e. 70ºC für 15 sek
  • Schritte b bis e wurden in insgesamt 30 Zyklen wiederholt
  • f. 4% Durchtränken
  • Vier 0,2 ml PCR-Röhrchen wurden als A, T, G und C beschriftet. 2 ul des passenden LongReadTM-LC-Terminationsgemischs wurden jedem Röhrchen zugegeben. 4 ul der obigen Markierungsreaktion (4,2 ul-Einstellung mit einer P20-Gilson®-Pipetman®, berechnet für Mineralöl) wurden zu jedem Terminationsgemisch zugegeben. Die Inhalte wurden gut gemischt und ein Tropfen Mineralöl wurde oben auf jedem Reaktionsgemisch platziert. Die Röhrchen wurden im Thermal Cycler platziert und das Zyklussequenzier- Reaktionsprogramm wurde verwendet. Als das zyklische Sequenzieren abgeschlossen war, wurde jedes Reaktionsgemisch von unter dem Mineralöl in ein 0,5 ml-Röhrchen pipettiert. Die Proben wurden bei 95ºC für 2 min denaturiert, auf Eis abgekühlt und 2,0 ul jeder Probe wurden auf ein Elektrophoresegel in einem automatisierten DNA-Sequenzierapparat des Modells LI-COR 4200 geladen und ein elektrischer Strom wurde angelegt, in Übereinstimmung mit den in Beispiel 4 oben dargelegten Bedingungen. Als die Fragmente den Detektor am anderen Ende des Gels passierten, wurde eine Fluoreszenz mit einer 680 nm-Laserdiode angeregt und von 710 bis 750 nm detektiert.

Claims (17)

1. Fluoreszenzfarbstoff mit der allgemeinen Formel:
Formel 1
worin R -NCS ist, und x und y jeweils unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind.
2. Farbstoff-markiertes Nukleotid-Analogon, umfassend die allgemeine Struktur
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist, und jedes M jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Li, Na, K, NH&sub4;, (CH&sub3;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub4;N oder (CH&sub3;)&sub4;N.
3. Farbstoff-markiertes Nukleotid-Analogon, umfassend die allgemeine Struktur
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist, und jedes M jeweils unabhängig ausgewählt ist aus Li, Na, K, NH&sub4;, (CH&sub3;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub3;NH, (CH&sub3;CH&sub2;)&sub4;N oder (CH&sub3;)&sub4;N.
4. Farbstoff-markiertes Nukleotid-Analogon nach Anspruch 2 oder 3, worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist.
5. Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA-Kettenterminator mit der allgemeinen Struktur:
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 1 bis 10.
6. Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA-Kettenterminator mit der allgemeinen Struktur:
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 1 bis 10.
7. Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA-Kettenterminator mit der allgemeinen Struktur:
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 1 bis 10.
8. Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA-Kettenterminator mit der allgemeinen Struktur:
worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 1 bis 10.
9. Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA-Kettenterminator nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin jedes von x und y jeweils unabhängig eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist.
10. N-(6-Hxdroxyhexyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz[e]-indoliniumhalogenid.
11. N-(6-Hxdroxyhexyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benz[e]-indoliniumbromid.
12. Phosphoramiditderivat eines Farbstoffs mit der allgemeinen Formel
Formel 1
worin R O-Phosphoramidit ist, und x und y jeweils unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind.
13. Nukleotid-Analogon, markiert mit einem Farbstoff der allgemeinen Formel
Formel 1
worin R -OH, -CO&sub2;H, -NH&sub2; oder -NCS ist, und x und y jeweils unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind.
14. DNA-Kettenterminator, markiert mit einem Farbstoff der allgemeinen Formel:
Formel 1
worin R -OH, -CO&sub2;H, -NH&sub2; oder -NCS ist, und x und y jeweils unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 sind.
15. Farbstoff-Phosphoramidit (Phosphoramidit-Farbstoff) mit der Formel
16. Oligonukleotid, markiert mit einem Farbstoff-Phosphoramidit nach Anspruch 12.
17. Oligonukleotid, markiert mit einem Farbstoff-Phosphoramidit nach Anspruch 15.
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