JP5683706B2 - ラベリング剤とこれを用いたアミノ酸配列およびタンパク質多重定量同時分析方法 - Google Patents
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Description
R4はヒドロキシまたは反応性リンカーであり、
R5は水素、C1-4アルキルまたはC2-4アルキニルであり、
R6は水素、C1-4アルキルまたはC2-4アルキニルであり、
nとmはそれぞれ独立して1〜4の整数であり、および
前記R1およびR2は重水素を含まないか、或いは前記R1およびR2の少なくとも一つは重水素を含む。)
R6は水素、プロピルまたはプロプ−1−イニル(prop-1-ynyl)であり、および
nとmはそれぞれ独立して1〜4の整数である。
R1はオクチルであり、R2はヘプチルである。
それぞれCH3C≡CC6H4CH2およびCD3C≡CC6H4CD2CH2であり、
それぞれCH3C≡CC6H4CD2およびCD3C≡CC6H4CH2CH2であり、
それぞれCD3C≡CC6H4CH2およびCH3C≡CC6H4CD2CH2であり、
またはそれぞれCD3C≡CC6H4CD2およびCH3C≡CC6H4CH2CH2である。
1)2−(N−(4−プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
2)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
3)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
4)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イル)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
5)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
6)2−(N−(4−プロピルベンジル)−2−(4−プロピルフェニル)アセトアミド)酢酸、
7)2−(5−フェニル−N−(3−フェニルプロピル)ペンタンアミド)酢酸、および
8)2−(N−オクチルオクタンアミド)酢酸。
本発明で使用される用語「2種以上」とは、互いの化学構造が同一でない化合物が2種以上含まれたことを意味し、2〜4種の化合物を含むことが好ましい。より好ましくは、重水素と水素の置換有無についてのみ化学構造が同一でない化合物を2種以上含む。
1)2−(N−(4−プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
2)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド )酢酸、
3)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イル)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、および
4)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸。
また、本発明は、下記一般式2で表される化合物を含むラベリング剤を分析体と結合させる段階(段階1)と、前記結合体をイオン化して断片イオンを生成させる段階(段階2)と、前記断片イオンのうち、分析体とRCを含む断片イオンを定量する段階(段階3)とを含む、分析体の定量方法を提供する。
RAは直鎖または分岐鎖のC1−C18アルキルであり、RBは質量調節基であり、
RCは直鎖または分岐鎖のC1−C18アルキルであり、
Linkerは分析体との結合を誘導する反応性リンカーであり、
RAおよびRCは、同一のアルキルであり、その少なくとも一つが一つ以上の重水素を含む。)
図13はラベリング剤の化学構造を図式的に示す。特許文献(韓国特許公開第2010−0009466号、韓国特許公開第2010−0009479号、および国際特許公開WO2010/008159号)に開示された化合物を「MBIT」と命名し、理論的に限定されたものではないが、N末端がアシル化され且つC末端にリンカーが付着したジペプチドの構造を持つ。
図14は、理論的に限定されるものではないが、ペプチドおよびタンパク質にMBIT物質が結合する様子を図式的に示す図である。ペプチドおよびタンパク質のN末端の1次アミンだけでなく、リシン側鎖の1次アミンとも結合が起こりうる。よって、一つのペプチドまたはタンパク質にラベリング剤を結合させるとき、タンパク質およびペプチドが含まれるリシンの個数に応じて2つ以上のラベリング剤が多重結合できる。分析体がタンパク質またはペプチドではなくても、分析体が持っている1次または2次アミンの個数だけのラベリング剤が最大に分析体と結合することができる。
ラベリング剤は、図3に示したような順序で合成した。非同重体ラベリング剤の中でも、reporter unitとbalance unitを商業的に入手することが可能なtagγとtagδの場合は、各unit(γのreporter unit、3−ヨードプロピルベンゼン;δのreporter unit、1−ヨードオクタン;γのbalance unit、5−フェニルペンタン酸;およびδのbalance unit、オクタン酸)を購入して各ラベリング剤の合成を行った。tagβの場合は、ラベリング剤を構成するreporter unit(1−(ヨードメチル)−4−プロピルベンゼン)とbalance unit(2−(4−プロピルフェニル)酢酸)は図5の過程で合成し、これらを用いてtagβを合成した。
まず、reporeter unitを合成した過程、および各段階で生成された化合物の核磁気共鳴(NMR)の結果を下記の段階1〜段階8に示す。
アルゴン条件の下で10mLのよく乾燥したテトラヒドロフラン(dry THF)に4−ブロモ安息香酸メチルエステル(500mg、2.33mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムジクロリド(Pd(PPh3)2Cl2:86.1mg、0.116mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3:18.3mg、0.0698mmol)、トリメチルシリルアセチレン(TMSアセチレン:493μL、3.49mmol)、およびトリエチルアミン(Et3N:486μL、3.49mmol)を溶かした後、20分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅(CuI:8.86mg、0.0465mmol)を加え、室温で15時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、n−ペンタン20mLを入れてセライト(celite)パッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を503mg(2.16mmol、93%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLに4−((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸メチルエステル(316mg、1.36mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、LiAlH4(2.04mL、1.0M THF溶液、2.04mmol)をゆっくり加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、順次水77μL、10%水酸化ナトリウム水溶液154μLおよび水231μLを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を258mg(1.26mmol、93%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLに(4−((トリメチルシリル)エチニル)フェニル)メタノール(258mg、1.26mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、イミダゾール(103mg、1.52mmol)とdry THF3mLに溶かしたTBSCl(228mg、1.52mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(10mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を383mg(1.20mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
アルゴン条件の下でメタノール4mLにtert−ブチルジメチル((4−((トリメチルシリル)エチニル)ベンジル)オキシ)シラン(383mg、2.40mmol)と炭酸カリウム(332mg、2.40mmol)を溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg(1.14mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチル((4−エチニルベンジル)オキシ)ジメチルシラン(247mg、1.00mmol)を溶かした後、−78℃に冷却し、n−ブチルリチウム(805μL、2.49M n−ヘキサン溶液、2.00mmol)をゆっくり加えた。20分間−78℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン(313μL、5.00mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を253mg(0.971mmol、97%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
酢酸エチル20mLにtert−ブチルジメチル((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)オキシ)シラン(252mg、0.968mmol)を溶かした後、20barの水素圧力を有するH−Cube装備に10%Pd/Cカートリッジを装着し、室温で分当り0.5mLの速度で通過させた。通過した溶液を減圧蒸留で濃縮させて目的化合物を251mg(0.949mmol、98%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.12 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.69 (s, 2H), 2.26 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.65-1.58 (m, 2H), 0.94-0.85 (m, 12H), 0.08 (s, 6H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチルジメチル((4−プロピルベンジル)オキシ)シラン(275mg、1.04mmol)を溶かした後、フッ化−n−ブチルアンモニウム(TBAF;1.56mL、1.0Mテトラヒドロフラン溶液、1.56mmol)をゆっくり加え、30分間0℃で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を198mg(0.838mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.25 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.57 (s, 2H), 2.97 (s, 1H), 2.62 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.74-1.62 (m, 2H), 0.99 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
よく乾燥したジクロロメタン(DCM)3mLにアルゴン条件の下で(4−プロピルフェニル)メタノール(100mg、0.666mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸(MsCl:62.1μL、0.799mmol)とトリエチルアミン(Et3N:140μL、0.999mmol)を加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(3mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン6mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウム(NaI:150mg、0.999mmol)を加えた。15分間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(tagβ reporter unit)を157mg(0.604mmol、90%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.44 (s, 2H), 2.53 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.92 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
前記で合成されたtagβのreporter unitからbalance unitを合成する過程、および各段階で生成された化合物のNMR結果を下記の段階9と段階10に示す。
アルゴン条件の下でよく乾燥したN,N−ジメチルホルムアミド(dry DMF)1mLに1−(ヨードメチル)−4−プロピルベンゼン(73.6mg、0.283mmol)を溶かした後、シアン化ナトリウム(NaCN:27.7mg、0.566mmol)を加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加え、反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を41.0mg(0.257mmol、91%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23-7.16 (m, 4H), 3.69 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.69-1.57 (m, 2H), 1.93 (t, 3H, J = 7.3 Hz)
30%水酸化ナトリウム水溶液1mLに2−(4−プロピルフェニル)アセトニトリル(41.0mg、0.257mmol)を溶かした後、4時間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、10%塩化水素水溶液3mLを加えて溶液を酸性化させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(tagβのbalance unit)を34.8mg(0.195mmol、76%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.13 (m, 4H), 3.16 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.70-1.58 (m, 2H), 0.95 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
アルゴン条件の下でdry DMF5mLにグリシンメチルエステル(448mg、3.57mmol)を溶かした後、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA:777μL、4.46mmol)と1−(ヨードメチル)−4−プロピルベンジル(232mg、0.892mmol)を加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水10mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(10mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を152mg(0.687mmol、77%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.20 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.73 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.38 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.94 (br, 1H), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.91 (t, 3H, J = 7.3 Hz)
よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2−((4−プロピルベンジル)アミノ)アセテート(24.5mg、0.0983mmol)と2−(4−プロピルフェニル)酢酸(17.5mg、0.0983mmol)を溶かした後、EDC(56.5mg、0.295mmol)、HOBt(39.8mg、0.295mmol)およびDIPEA(84.3μL、0.491mmol)を加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物31.1mg(0.0789mmol、80%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.62 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.61 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H)
メタノール0.5mLにメチル2−(N−(4−プロピルベンジル)−2−(4−プロピルフェニル)アセトアミド)アセテート(30.0mg、0.0786mmol)を溶かした後、20%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10%塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を26.4mg(0.0718mmol、91%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.54 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.77 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.58 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.63 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H)
購入したreporterおよびbalance unitを用いて、図3のような過程でtagγの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階1〜段階3に示す。
段階1:メチル2−((3−フェニルプロピル)アミノ)アセテートの合成
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.18-7.13 (m, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.39 (s, 2H), 2.68-2.60 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 2H)
よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2−((3−フェニルプロピル)アミノ)アセテート(20.0mg、0.0965mmol)と5−フェニル吉草酸(22.0mg、0.116mmol)を溶かした後、EDC(55.5mg、0.289mmol)、HOBt(39.1mg、0.289mmol)およびDIPEA(82.7μL、0.482mmol)を加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を34.2mg(0.0931mmol、96%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 4.01 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.30 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.24 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 3.95 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.42 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.18 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H)
メタノール0.5mLにメチル2−(5−フェニル−N−(3−フェニルプロピル)ペンタンアミド)アセテート(34.2mg、0.0931mmol)を溶かした後、20%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10%塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を26.2mg(0.0741mmol、80%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.99 (s, 2H), 3.28 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.91 (s, 2H), 3.40 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H)
購入したreporterおよびbalanace unitを用いて、図3のような過程でtagδの合成を行った。具体的な合成方法、および各段階で合成された化合物のNMR結果を下記の段階1〜段階3に示す。
アルゴン条件の下でdry DMF2mLにグリシンメチルエステル(358mg、2.85mmol)を溶かした後、DIPEA(620μL、3.56mmol)と1−ブロモオクタン(123μL、0.712mmol)を加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(4mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を31.6mg(0.157mmol、22%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.68 (s, 3H), 3.36 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 1.77 (s, 1H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.24-1.22 (m, 10H), 0.83 (t, 3H, J = 6.5 Hz)
よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2−(オクチルアミド)アセテート(31.6mg、0.157mmol)とn−オクタン酸(30.0μL、0.188mmol)を溶かした後、EDC(90.3mg、0.471mmol)、HOBt(63.6mg、0.471mmol)およびDIPEA(135μL、0.785mmol)を加え、12時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(4mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を44.7mg(0.136mmol、87%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.00 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.28 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 2.32 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.98 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.15 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H)
メタノール0.5mLにメチル2−(N−オクチルオクタアミド)アセテート(44.7mg、0.136mmol)を溶かした後、20%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10%塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物は濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を36.5mg(0.116mmol、86%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.01 (s, 2H), 3.30 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.97 (s, 2H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.19 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H)
まず、4種のreporter unitの中でもreporter−d5とreporter−d0を合成する過程、および各段階で生成された化合物のNMR結果を下記の段階1〜段階7に示す。
4−((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸メチルエステルの合成
アルゴン条件の下で10mLのdry THFに4−ブロモ安息香酸メチルエステル(500mg、2.33mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムジクロリド(Pd(PPh3)2Cl2:86.1mg、0.116mmol)、トリフェニルホスフィン(PPh3:18.3mg、0.0698mmol)、トリメチルシリルアセチレン(TMSアセチレン:493μL、3.49mmol)、トリエチルアミン(Et3N:486μL、3.49mmol)を溶かした後、20分間室温で攪拌した。ここにさらにヨウ化第一銅(CuI:8.86mg、0.0465mmol)を加え、室温で15時間攪拌した。反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で除去した後、n−ペンタン20mLを入れ、セリットパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を503mg(2.16mmol、93%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H)
1)(4−((トリメチルシリル)エチニル)フェニル)メタノール−d2の合成
アルゴン条件の下でdry THF20mLに4−((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸メチルエステル(1.00g、5.16mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、LiAlD4(217mg、5.16mmol)をゆっくり加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、水220μL、10%水酸化ナトリウム水溶液440μLおよび水660μLを順次加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を788mg(3.82mmol、89%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLに4−((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸メチルエステル(316mg、1.36mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、LiAlH4(2.04mL、1.0M THF溶液、2.04mmol)をゆっくり加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、順次水77μL、10%水酸化ナトリウム水溶液154μL、水231μLを加えて反応を終結させた。白色の粘性沈殿が生成されると、シリカパッドでフィルタリングして沈殿物を除去した。得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を258mg(1.26mmol、93%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H)
1)tert−ブチルジメチル((4−(トリメチルシリル)エチニル)ベンジル)オキシ)シラン−d2の合成
アルゴン条件の下でdry THF15mLに(4−((トリメチルシリル)エチニル)フェニル)メタノール−d2(600mg、2.94mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、イミダゾール(240mg、3.52mmol)とdry THF5mLに溶かした塩化tert−ブチルジメチルシラン(TBSCl:531mg、3.52mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液20mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(20mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を895mg(2.79mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLに(4−((トリメチルシリル)エチニル)フェニル)メタノール(258mg、1.26mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、イミダゾール(103mg、1.52mmol)とdry THF3mLに溶かしたTBSCl(228mg、1.52mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、15時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(10mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を383mg(1.20mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)
1)tert−ブチル((4−エチニルベンジル)オキシ)ジメチルシラン−d2の合成
アルゴン条件の下でメタノール12mLにtert−ブチルジメチル((4−((トリメチルシリル)エチニル)ベンジル)オキシ)シラン−d2(1.16g、3.62mmol)と炭酸カリウム(1.00g、7.24mmol)を溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液15mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(10mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を858mg(3.45mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
アルゴン条件の下でメタノール4mLにtert−ブチルジメチル((4−((トリメチルシリル)エチニル)ベンジル)オキシ)シラン(383mg、2.40mmol)と炭酸カリウム(332mg、2.40mmol)を溶かした後、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg(1.14mmol、95%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H)
1)tert−ブチルジメチル((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)オキシ)シラン−d5の合成
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチル((4−エチニルベンジル)オキシ)ジメチルシラン−d2(263mg、1.06mmol)を溶かした後、−78℃に冷却し、n−ブチルリチウム(851μL、249M n−ヘキサン溶液、2.12mmol)をゆっくり加えた。20分間−78℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン−d3(331μL、5.30mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を280mg(1.05mmol、99%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチル((4−エチニルベンジル)オキシ)ジメチルシラン(247mg、1.00mmol)を溶かした後、−78℃に冷却し、n−ブチルリチウム(805μL、2.49M n−ヘキサン溶液、2.00mmol)をゆっくり加えた。20分間−78℃で攪拌した後、ここにさらにヨウ化メタン−d0(313μL、5.00mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液10mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を253mg(0.971mmol、97%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)
1)(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)メタノール−d5の合成
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチルジメチル((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)オキシ)シラン−d5(280mg、1.05mmol)を溶かした後、フッ化−n−ブチルアンモニウム(TBAF:1.58mL、1.0Mのテトラヒドロフラン溶液、1.58mmol)をゆっくり加え、30分間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を198mg(0.838mmol、88%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
アルゴン条件の下でdry THF5mLにtert−ブチルジメチル((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)オキシ)シラン−d0(326mg、1.25mmol)を溶かし後、フッ化−n−ブチルアンモニウム(TBAF:1.88mL、1.0M テトラヒドロフラン溶液、1.88mmol)をゆっくり加え、30分間0℃で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、酢酸エチルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を182mg(1.24mmol、99%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.56 (s, 2H), 2.44 (br, 1H), 2.01 (s, 3H)
1)1−(ヨードメチル)−4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンゼン−d5の合成
よく乾燥したDCM5mLにアルゴン条件の下で(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)メタノール−d5(140mg、0.926mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸(MsCl:86.3μL、1.11mmol)とトリエチルアミン(Et3N:194μL、1.39mmol)を加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(5mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン10mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウム(NaI:207mg、1.39mmol)を加えた。1時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出して(10mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(reporter−d5)を220mg(0.843mmol、91%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H)
よく乾燥したDCM4mLにアルゴン条件の下で(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)メタノール−d0(182mg、1.24mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、塩化メタンスルホン酸(MsCl:116μL、1.49mmol)とトリエチルアミン(Et3N:260μL、1.87mmol)を加えた。30分間0℃で攪拌した後、反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(5mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去し、沈殿物を濾別した。得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、これをさらにアセトン12mLに溶かした後、ヨウ化ナトリウム(NaI:280mg、1.87mmol)を加えた。1時間室温で攪拌した後、反応が完結すると、溶媒を減圧蒸留で乾燥させる。ここに水10mLを加え、酢酸エチルで抽出し(10mLずつ合計3回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(reporter−d0)を279mg(1.09mmol、88%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H), 4.42 (s, 2H), 2.02 (s, 3H)
1)ジエチル−2−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)マロネート−d5の合成
アルゴン条件の下でdry DMF2mLに1−(ヨードメチル)−4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンゼン−d5(0.392mmol)と水酸化ナトリウム(NaH:19.8mg、60%ミネラルオイル混合物、0.473mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、ジエチルマロン酸(89.8μL、0.592mmol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、3時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を88.5mg(0.302mmol、77%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.11-7.07 (m, 2H), 4.17-4.06 (m, 4H), 3.57 (s, 1H), 1.21-1.14 (m, 3H)
アルゴン条件の下でdry DMF3mLに1−(ヨードメチル)−4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンゼン−d0(98.0mg、0.383mmol)と水素化ナトリウム(NaH:18.4mg、60%ミネラルオイル混合物、0.459mmol)を溶かした後、0℃に冷却し、ジエチルマロン酸(87.2μL、0.574mol)を加えた。その後、室温に温度を上げ、3時間室温で攪拌した。反応が完結すると、飽和塩化アンモニウム水溶液5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を94.8mg(0.329mmol、86%)得た。
1)3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロピオン−d5エチルエステルの合成
アルゴン条件の下でdry DMF2mLにジエチル2−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)マロネート−d5(88.5mg、0.302mmol)を溶かした後、塩化ナトリウム(35.3mg、0.604mmol)と水100μLを加え、2日間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を50.0mg(0.226mmol、75%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.56 (s, 2H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
アルゴン条件の下でdry DMF2mLにジエチル2−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)マロネート−d0(94.8mg、0.329mmol)を溶かした後、塩化ナトリウム(38.5mg、0.658mmol)と水200μLを加え、2日間還流(reflux)条件の下で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を50.0mg(0.231mmol、70%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.89 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
1)3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロピオン酸−d5 メタノール0.5mLに3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロピオン−d5エチルエステル(43.0mg、0.194mmol)を溶かした後、20%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10%塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物(balance−d5)を32.2mg(0.167mmol、86%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.64 (s, 2H)
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H)
メチル2−((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)アミノ)アセテート−d0の合成
アルゴン条件の下でdry DMF2mLにグリシンメチルエステル(169mg、1.34mmol)を溶かした後、DIPEA(292μL、1.68mmol)と1−(ヨードメチル)−4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンゼン−d0(reporter−d0:232mg、0.892mmol)を加え、1日間室温で攪拌した。反応が完結すると、水5mLを加えて反応を終結させ、ジエチルエーテルで抽出し(5mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を58.6mg(0.270mmol、80%)得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d. 2H, J = 8.2 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 3.72 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.35 (s, 2H), 2.20 (br, 1H), 1.99 (s, 3H)
メチル2−(N−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロパンアミド)アセテート−d5の合成
よく乾燥したDCM1mLにアルゴン条件の下でメチル2−((4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)アミノ)アセテート−d0(18.3mg、0.0845mmol)と3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロパン酸−d5(balance−d5:13.6mg、0.0704mmol)を溶かした後、EDC(40.5mg、0.211mmol)、HOBt(28.5mg、0.211mmol)およびDIPEA(60.3μL、0.352mmol)を加え、20時間室温で攪拌した。反応が完結すると、水3mLを加えて反応を終結させ、DCMで抽出し(3mLずつ合計4回)、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを処理して水分を除去した。沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して目的化合物を25.0mg(0.0759mmol、91%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.51 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.65 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.58 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.60 (s, 3H), 2.52 (s, 2H), 2.02 (s, 3H)
2−(N−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル−3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロパンアミド)酢酸−d5の合成
メタノール0.5mLにメチル2−(N−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イン−1−イル)フェニル)プロパンアミド)アセテート−d5(25.0mg、0.0637mmol)を溶かした後、20%水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、2時間室温で攪拌した。反応が完結すると、酢酸エチル3mLを加えて希釈し、10%塩化水素水溶液200μLを加えて溶液を中和させた。無水硫酸マグネシウムで水分を除去し、沈殿物を濾別し、得られた溶液を減圧蒸留で濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して同重体ラベリング剤tagα129を21.0mg(0.0554mmol、87%)得た。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 77.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H)
同重体ラベリング剤tagα129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter−d2を使用し、段階12にはbalance−d3
を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H)
同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter−d3を使用し、段階12にはbalance−d2を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H)
同重体ラベリング剤α129と同様の過程で合成するが、合成過程中における段階11にはreporter−d5を使用し、段階12にはbalance−d0を使用して合成した。
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H)
段階1:ラベリングジと分析体の結合
実施例1−2の化合物とペプチドの結合反応を図7に示した。実施例1−2の化合物とEDCとN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)をDMFに溶かし、それぞれの濃度が60、35および40mMとなるように混ぜて室温で45分間反応させ、ラベリング剤のカルボン酸の末端基をシクインイミジルエステルで活性化させた。
ウシ血清アルブミンをトリプシン酵素で分解して得たペプチド(tryptic BSA)またはアンジオテンシンII(DRVYIHPF)を炭酸水素ナトリウム水溶液(Na
HCO3、100mM)に溶かした後、活性化されたラベリング剤を入れて6時間反応を行った。ヒドロキシル基に起こる標識反応は、エステル結合を形成して不安定な結合を形成し、反応の効率も低いから、正確な定量のために、炭酸水素ナトリウム水溶液(100mM)に溶かしたヒドロキシルアミン(80mM)を用いて、ペプチドのヒドロキシル基に標識された副反応を除去した。全体反応はトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて終結させた。
標識されたアンジオテンシンIIは、50TA溶液(0.1%TFA/50%アセトニト
リル/50%H2O)で希釈した後、HCCAマトリックス溶液(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid、5mg/mL、50TA)と1:1で混ぜてMALDIプレートにのせて乾燥させた後、タンデム飛行時間型質量分析器(time-of-flight/time-of-flight(TOF/TOF) mass spectrometry)を用いて分析した。タンデム質量分析によって設計したとおりに定量信号および標識信号が観測されるか、また、その強さがどれほどであるかを確認した。
標識されたtryptic BSAを用いて同重体ラベリング剤で測定可能な分析試料の濃度或いは量の範囲を確認し、液体クロマトグラフィー(LC)と連動して多重の試料を同時に定量分析することができるかを確認した。同重体ラベリング剤で測定可能な試料の濃度範囲を確認するために、多重同重体のうちtagα129とtagα131で標識された試料を3:1の比率で混ぜた後、50TAを用いて希釈する過程を繰り返し行った。各濃度の試料をHCCAマトリックス溶液と1:1の比率で混ぜてMALDIプレートにロードした。この際、ロードされたペプチドの量はスポット当たり約4200、1300、420、130、42および13フェムトモルである。LCと連動した多重定量分析をテストするためには、4種の同重体で標識されたtryptic BSAを2:1:4:8の比率で混ぜてnanoLCで分離し、LCから溶出されるペプチドをHCCAマトリクス溶液と共にMALDIプレートにロードしてMALDI−TOF/TOFで分析した。
1)モデルペプチドを用いたラベリング剤の検証
各ラベリング剤と結合したモデルペプチド(angiotensin II、DRVYIHPF)を質
量分析した結果、一つのラベリング剤と結合した質量値(tagα129−α134は1406.7、tagβは1395.7、tagγは1381.7、そしてtagβは1341.8Th)でイオンが観測された。さらに正確な検証のために、質量スペクトルで観測されたイオンを選択してタンデム質量分析を行った。結果は図8に示す。
多重同重体を用いて測定することが可能なペプチドの量または濃度の範囲を図11に示す。BSAの絶対量をよく反映することができるように、同重体で標識されたtryptic BSAのうち、比較的強く観測されたペプチドであるFGER、VASLR、およびSEIAHRを用いて実験を行った。tagα129とtagα131で標識されたペプチドを3:1の比率で混ぜ、全体タンパク質の量を4.2ピコモルから13フェムトモルまで変化させながらタンデム質量分析を行った。MALDI質量分析器は、レーザーによってイオン化される量が制限されて試料の量が少ないときに比べて、量が多いときはロードされた試料の量に対する親イオンの強さが小さく測定されるが、タンデム質量分析による定量分析には関係ないことを確認した。
また、LCとMALDI質量分析器を連動した定量分析結果を図12に示す。図12(a)はLCから溶出した親イオンの強さを示し、図12(b)は各スポットで測定された定量信号の量をtagα129の定量信号と比較して示す。総6種のペプチド(FGER、VASLR、QEPER、AWSVAR、SEIAHR、およびYLYEIAR)をタンデム質量分析で定量した。ペプチドの種類を問わず、各同重体ラベリング剤によって一定の比率(tagα129:α131:α132:α134=1:0.51:1.96:3.81)で測定された。また、同一ペプチドの場合にはLCから溶出する間に同一の定量信号の比率で測定された。これは本発明の同重体で多重標識されたペプチドがnanoLC上で同時に移動しており、これにより特定時点の溶出液のみでも正確な定量が行われることを意味する。また、モデルペプチドを介して観測されたように、観測される定量信号の比率が試料の全体量には影響されないことを確認した。
韓国特許公開第10−2010−0009466号、韓国特許公開第10−2010−0009479号および国際特許公開WO2010/008159号を参照して、本発明の一般式2のラベリング剤を製造した。
まず、同位元素暗号化基であるRAとRCがメチル(CH3またはCD3)であり、質量調節基であるRBがバリン(Val)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、フェニルアラニン(Phe)およびアルギニン(Arg)の側鎖であるラベリング剤を製造した。質量調節基がバリン(Val)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、フェニルアラニン(Phe)およびアルギニン(Arg)の側鎖であるものを、便宜上、それぞれVal−tag、Gln−tag、His−tag、Phe−tag、およびArg−tagと命名した。また、同位元素暗号化基であるRAとRCがエチル(C2H5またはC2D5)であり、質量調節基RBがメチルであるラベリング剤を製造した。これは、便宜上、Ethyl−tagと命名した。
実施例2−1)で製造されたラベリング剤を、3種のモデルペプチドLISFYAGRまたはLISFYAGKまたはYGGFLにVal−、Gln−、His−、Phe−、Arg−tagおよびEthyl−tagを結合させた。また、ウシ血清タンパク質(bovine serum albumin)、ミオグロビン(myoglobin)、およびユビキチン(ubiquitin)タンパク質を相異なる量で混合した2つのタンパク質混合物試料を準備した。混合試料Aにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ4mg/mL、2mg/mL、および0.2mg/mLの濃度で準備され、混合試料Bにはウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンがそれぞれ2mg/mL、0.5mg/mL、および0.4mg/mLの濃度で準備された。混合試料AとBをそれぞれトリプシンで酵素分解した後、混合試料AにはLMBITを、混合試料BにはHMBITを結合させた。この際、Gln−tagをMBIT標識で使用した。ペプチド試料にMBITで結合させる方法は韓国特許公開第10−2010−0009466号、韓国特許公開第10−2010−0009479号および国際特許公開WO2010/008159号を参照した。
ラベリング剤で結合したモデルペプチドは、ZipTip−C18(Millipore社)で塩を除去した後、最終的に各5Mの濃度でアセトニトリルと水が体積比1:1で混合され且つ0.5%のギ酸が添加された溶液に溶けている状態で準備した。ラベリング剤で結合した混合試料AとBは、1:1の体積比で混合され、真空で完全に溶媒が除去された後、0.5%のギ酸が添加された水溶液に溶けている状態で準備した。
実施例2−2の結合体を用いて、下記のとおり定量分析を行った。
実施例2−2に記述されたモデルペプチドとMBITとの結合体の定量分析実施に活用された質量分析器は、エレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ装備としてBruker社製のEsquire HST製品またはThermo社製のLTQ Velosを使用した。試料溶液100μLが注射器ポンプ(syringe pump)にロードされた後、1μL/minの流速でエレクトロスプレーチップに運搬された。エレクトロスプレーは4kVの電圧で行われた。1周期に一つのスペクトル測定のためにイオントラップの内部に最大200msの間試料イオンが捕集されて質量分析されたうえ、1分間最大250周期の反復測定が行われた。
LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal−、Gln−、His−、Phe−、およびArg−tagを結合させた場合について定量分析を行った。結果を図17に示す。
LISFYAGRおよびLISFYAGKにそれぞれVal−、Gln−、His−、Phe−、およびArg−tagを結合させた場合のタンデム質量分析を行った。この際、LMBITで標識されたペプチドとHMBITで標識されたペプチドを1:1の比率で混合して実験した。その結果を図18〜図21に示す。
図22および図23は、ラベリング剤で標識されたモデルペプチドをタンデム質量分析したときに現れるyS定量信号の強さが全体断片イオンの信号の強さの総和において占有する比率を示す図である。図22は、ラベリング剤で標識されてエレクトロスプレーイオン化された後、+2価電荷を帯びる親イオンを選択して分解した結果を示している。一つのラベリング剤が結合したLISFYAGRの場合に比べて、2つのラベリング剤がN末端とC末端に結合したLISFYAGKの場合、定量信号イオンySの強さが2倍以上強く発生することを確認することができた。
図24はN末端とリシンの側鎖にそれぞれ1個ずつ総2個のアミンを持っているペプチドLISFYAGKにラベリング剤が結合した親イオンのうち、+2価電荷を帯びるイオンを四重極イオントラップ内で選択して共鳴励起衝突由来分解して生成された+1価のySイオンを再びイオントラップ内で選択してさらに衝突由来分解して得たMS3タンデム質量分析スペクトルを示す。
図25はHMBITとLMBITで区分標識して多様な比率で混ぜたモデルペプチドをタンデム質量分析して生成されたLySおよびHySイオンの強さで定量分析を行って得た標準定量分析曲線を示す図である。実施に活用されたラベリング剤はGln−tagであり、モデルペプチドとしてはLISFYAGKが活用された。+1価、+2価の電荷を帯びるペプチドイオンについてそれぞれ実施結果を得た。ラベリング剤で標識されたペプチド溶液の濃度は混合比を問わずに約5μMに維持された。図25に示すように、強い信号の強さを示すySイオンを活用した定量分析は、実際混合比によく合う測定比を示していることが分かった。特に+1価親イオンを選択した場合、ySの信号の強さが上述の如く特異的に強く示されるため、1:64の混合比に達するまで非常に良い定量分析結果を得ることができることが分かる。+2価親イオンを選択して定量分析する場合も、1:36の混合比まで非常に優れた線形性を示す。既存の小さい質量を有するbS定量信号を活用した場合には、1:16の混合比が定量限界であったことを考えると、ySを導入しながら最大約4倍程度定量限界が改善された。
同位元素暗号化基であるRAおよびRCとしてメチル基を活用する場合、定量信号イオンの質量差が3Daであって、LyS定量信号イオンの自然同位元素パターンによってHyS定量信号イオンが干渉される可能性がある。このような問題点は、同位元素暗号化基であるRAおよびRCとしてエチル基を使用すると、定量信号イオンの質量差が5Daと十分に大きくなって克服が可能である。これを実施するためにモデルペプチドにEthyl−tagを結合させてタンデム質量分析した。
実際タンパク質をMBITのySイオンで定量分析した実施を行うために、3種のタンパク質が相異なる比率で混合されている2つのタンパク質混合試料(混合試料AとB)を準備し、Gln−tagを用いて分析した。混合試料Aのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンは混合試料Bのウシ血清タンパク質、ミオグロビン、およびユビキチンに比べて量的にそれぞれ2倍、4倍および0.5倍となるように準備した。これをトリプシンで酵素分解し、Gln−tagのLMBITおよびHMBITで標識して液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析によって定量分析した結果が図28に示されている。
Claims (11)
- R1はオクチルであり、および
R2はヘプチルであることを特徴とする、請求項2に記載の化合物。 - 前記R1およびR2は、
それぞれCH3−C≡C−C6H4−CH2およびCD3−C≡C−C6H4−CD2−CH2であるか、
それぞれCH3−C≡C−C6H4−CD2およびCD3−C≡C−C6H4−CH2−CH2であるか、
それぞれCD3−C≡C−C6H4−CH2およびCH3−C≡C−C6H4−CD2−CH2であるか、または
それぞれCD3−C≡C−C6H4−CD2およびCH3−C≡C−C6H4−CH2−CH2であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 - R3は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基の側鎖であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
- R4は、ヒドロキシ、スクシンイミド−N−オキシ、3−スルホスクシンイミド−N−オキシ、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ、ペンタハロベンジルオキシ、4−ニトロフェノキシまたは2−ニトロフェノキシであることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物は、
1)2−(N−(4−プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
2)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
3)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
4)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イル)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
5)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸、
6)2−(N−(4−プロピルベンジル)−2−(4−プロピルフェニル)アセトアミド)酢酸、
7)2−(5−フェニル−N−(3−フェニルプロピル)ペンタンアミド)酢酸、および
8)2−(N−オクチルオクタンアミド)酢酸よりなる群から選ばれるいずれか一つの化合物であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 - 請求項1〜8のいずれか1項の化合物を2種以上含む組成物。
- 前記2種以上の化合物は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項9に
記載の組成物。 - 前記組成物は、
1)2−(N−(4−プロプ−1−イニル)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、
2)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)フェニル)プロパンアミド )酢酸、
3)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル)−3−(4−(プロプ−1−イル)フェニル)プロパンアミド−3,3−d2)酢酸、および
4)2−(N−(4−(プロプ−1−イニル−3,3,3−d3)ベンジル−1,1−d2)−3−(4−(プロプ−1−イニル)フェニル)プロパンアミド)酢酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
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