WO2012026743A2 - 라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법 - Google Patents

라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법 Download PDF

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WO2012026743A2
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윤혜주
정용식
이희윤
서민수
서종철
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    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a labeling agent and a method for quantitative analysis of amino acid sequences and proteins using the same, and more particularly, to a labeling agent capable of displaying strong quantitative signals and a method for simultaneous analysis of amino acid sequences and proteins using the same.
  • Mass spectrometry is widely used to identify and quantify proteins and peptides. For example, peptides resulting from enzyme breakdown of proteins are ionized using Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI) or Electrospray Ionization (ESI), and then mass is accurately measured using a mass spectrometer. The identity of the protein is determined by comparison with the peptide information given by the gene sequence, and more specifically, some peptides are selected by mass spectrometry to obtain a sequence of peptides from fragment ions resulting from collision decomposition with gas. It also reveals the identity of.
  • MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization
  • ESI Electrospray Ionization
  • mass spectrometry In quantitative analysis of proteins and peptides, mass spectrometry is widely used by labeling chemical markers containing isotopes to proteins or peptides to be analyzed. Mass spectrometric analysis of different protein and peptide samples of the same type to be quantitatively labeled with the same chemical label with different isotope labeling results in mass spectrometry or tandem mass spectrometry This appears differently and quantitative analysis is possible by comparing the relative abundance.
  • Homologous chemical labeling is used to simultaneously identify and quantify the proteins or peptides described above.
  • U.S. Patent Publication No. US 2005/0148087 and International Patent Publication No. WO 2005/068446, etc. disclose homopolymer chemical labels designed to show quantitative signals in tandem mass spectrometry upon collisional degradation with peptides.
  • the labeling agents suggested by the literature use isotopes such as carbon-13, nitrogen-15, or oxygen-18, and thus have limitations in the synthesis of various isomers and are expensive.
  • the quantitative analysis using the previously disclosed homopolymer labeling reagents cannot be used in a quadrupole ion trap mass spectrometer such as a Paul trap and a linear ion trap. Accordingly, there is a need for a new homopolymer labeling agent capable of confirming the amino acid sequence and the amount of protein at the same time using hydrogen isotopes that can be variously substituted and relatively inexpensive hydrogen isotopes.
  • Tandem mass spectrometry in this quadrupole ion trap is generally, but not limited to, a technique called Resonant Excitation Collision-Induced Dissociation (RE-CID).
  • RE-CID Resonant Excitation Collision-Induced Dissociation
  • the mass-to-charge ratio of the fragment ions is less than about 1/3 of the mass-to-charge ratio of the mother ion, it is not stably collected in the ion trap and is not detected. This is called a 'low-mass cutoff' effect.
  • the homopolymer labeling agents used in the existing technologies use fragment ions with masses as small as 100-200 Da as the quantitative signal, which prevents the detection of quantitative signal ions due to the low-mass cutoff effect in the quadrupole ion trap mass spectrometer. have. Further, in the mass region of 100-200 Da, internal fragment ions having a small mass derived from an analyte protein or peptide are very likely to interfere with quantitative signal ions, so that accurate quantitative analysis may not be possible.
  • the material described in the above patent has a critical limit that can be used in the quadrupole ion trap mass spectrometer because only a low mass fragment ion can be analyzed. Accordingly, there is a need for the invention of a homopolymer labeling substance which can be used without limitation in the most widely used quadrupole ion trap mass spectrometer and an analysis method using the same.
  • the quantitative signal needs to appear as a fragment ion having a sufficiently large mass. Fragment ions with large masses have a very low probability of being disturbed by noise signals compared with small mass ions and are highly valuable because they are not limited to the low-mass cutoff that can occur in quadrupole ion traps.
  • the present inventors through the Republic of Korea Patent Application No. 2008-0070272, using a hydrogen isotope only, it is possible to control the mass of the quantitative signal, a new homologous labeling named MBIT (Mass-balanced isotope tag) having a dipeptide structure I have presented you.
  • MBIT Mass-balanced isotope tag
  • the mass regulator is modified to vary the physical properties and quantitative signal mass of the homopolymer labeling agent.
  • variable mass labeling agent and the labeling agent set have been presented, and the multi- quantitative method, which is a simultaneous multiple quantitative analysis of three or more samples using two or more labeling agents, has been presented. It is possible to synthesize easy and inexpensive homologous labeling agent by the above method and quantify multiple samples.However, when multi quantification is carried out by multi 2-plex quantitative method, the sample which is used as a reference is high and the sample to be analyzed at one time. There is also a problem that increases the total amount of.
  • the inventors found that while using a hydrogen isotope and researching a labeling agent capable of quantitating multiple samples at once while reducing the synthesis cost of the labeling agent, it was confirmed that this object was achieved through a new chemical structure.
  • the present invention was completed.
  • the strength of the quantitative signal is weakened and the quantitative accuracy is reduced by improving the prior art to confirm that the quantitative signal is generated strongly during tandem mass analysis to complete the present invention.
  • the inventors of the present invention while studying the analysis method that can be applied to the quadrupole ion trap mass spectrometer using the homopolymer labeling agent presented by the present inventor, confirmed the method that can be analyzed through the quantitative signal ion having a large mass Using this, it was confirmed how to quantify the relative amounts of peptides and proteins in all mass spectrometers including quadrupole ion trap mass spectrometer, and completed the present invention.
  • the present invention is to provide a compound having a new chemical structure capable of quantifying multiple samples at once while utilizing hydrogen isotopes and at the same time reducing the synthesis cost of the labeling agent.
  • the present invention is to provide a composition comprising two or more kinds of the compound.
  • the present invention is to provide a new quantitative analysis method that can simultaneously quantify two or more types of analytes using the compound or the composition.
  • the present invention is a method for quantitative analysis of two or more amino acid sequences and homologous variable mass labeling agent for protein multiple quantitative simultaneous analysis, including hydrogen isotopes, detected at a mass value greater than the analyte. It is to provide.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1).
  • R 1 is C 1-10 alkyl or ego
  • R 2 is C 1-10 alkyl or ego
  • R 3 is the side chain of the amino acid residue
  • R 4 is hydroxy or a reactive linker
  • R 5 is hydrogen, C 1-4 alkyl or C 2-4 alkynyl
  • R 6 is hydrogen, C 1-4 alkyl or C 2-4 alkynyl
  • n and m are each independently an integer from 1 to 4.
  • R 1 and R 2 do not include deuterium, or at least one of R 1 and R 2 includes deuterium.
  • the quantitative signal of the compound represented by Formula 1 is 4- (1-propynyl) benzyl cation.
  • R 1 contains deuterium, which may result in different quantitative signals.
  • quantitative signals are 129 Th (CH 3 CCHCC 6 H 4 CH 2 + ) and 131 Th (CH 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 + ), it is possible to 132 Th (CD 3 C ⁇ CC 6 H 4 CH 2 +) or 134 Th (CD 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 +).
  • R 1 is C 6-9 alkyl or ego
  • R 2 is C 6-9 alkyl or ego
  • R 5 is hydrogen, propyl or prop-1-ynyl
  • R 6 is hydrogen, propyl or prop-1-ynyl
  • n and m are each independently an integer of 1-4.
  • R 1 is octyl
  • R 2 is heptyl
  • R 1 and R 2 are preferably the same kind, that is, R 1 is C 1-10 alkyl, R 2 is C 1-10 alkyl; Or R 1 is R 2 is Is preferably.
  • R 1 and R 2 are
  • Each is CD 3 C ⁇ CC 6 H 4 CH 2 and CH 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 CH 2 ; or
  • they are CD 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 and CH 3 C ⁇ CC 6 H 4 CH 2 CH 2 , respectively.
  • R 3 is a side chain of a residue of an amino acid, which is attributable to having a structure in which R 1 and R 2 are substituted with an amine group of an amino acid.
  • amino acid as used in the present invention means a natural amino acid or an artificial amino acid, and preferably means a natural amino acid.
  • the amino acid means glycine, alanine, serine, valine, leucine, isoleucine, methionine, glutamine, asparagine, cysteine, histidine, phenylalanine, arginine, tyrosine or tryptophan.
  • side chain of the amino acid residue means a group of the structure of the amino acid substitutions in the remaining structure, that is, the NH 2 CH 2 CH 2 COOH, except the NH 2 CH 2 COOH.
  • side chain of the residue of glycine means hydrogen and for serine the side chain of the residue of serine means hydroxymethyl.
  • the R 3 can be freely adjusted according to the type of amino acid, and thus also the control of the quantitative signal.
  • R 4 is a hydroxy or a reactive linker.
  • the term "reactive linker” refers to a reactor that allows the compound of Formula 1 to be combined with the analyte.
  • a reactor capable of reacting with an amine group or a hydroxyl group present in the protein or peptide is preferable.
  • succinimide-N-oxy, 3-sulfosuccinimide-N-oxy, benzotriazol-1-yloxy, pentahalobenzyloxy, 4-nitrophenoxy or 2-nitrophenoxy This is not restrictive.
  • R 4 is hydroxy, since the general formula (1) is a compound having a carboxyl group as a whole, the carboxyl group may be a carbonyl group substituted with a reactive linker.
  • the present invention provides a composition comprising two or more kinds of the compound represented by the formula (1).
  • two or more kinds means that two or more kinds of compounds having different chemical structures from each other are included, and preferably two to four kinds of compounds are included. More preferably, it is preferable to include two or more kinds of compounds having the same chemical structure only for the substitution of deuterium and hydrogen.
  • the two or more compounds are preferably the same number of deuterium. Since the chemical structure of each other is not the same, but the number of deuterium is the same, the mass difference of the ions indicating the quantitative signal is generated, so that the mass of each sample appears differently on the mass spectrometry or tandem mass spectrometry. Quantitative analysis is possible by comparing and analyzing quantities.
  • composition containing any one or more compounds chosen from the group which consists of the following compounds is mentioned:
  • the present invention also provides a method for quantitating analytes using a compound represented by Formula 1 or a composition comprising two or more types of compounds represented by Formula 1.
  • the compound In order to quantify the analyte, the compound must be bound to the analyte, and the compound and the analyte are separated by the linker reacting with the amine of the analyte and separating as a living group.
  • the analyte is characterized in that the protein, carbohydrate or lipid. In addition, the analyte is characterized in that the peptide. In addition, the analyte is characterized in that the nucleic acid or a nucleic acid derivative. In addition, the analyte is characterized in that the steroid.
  • the present invention comprises the steps of binding a composition comprising two or more compounds represented by the formula (1) to the analyte; And dissolving the analyte to provide quantitative analysis of amino acid sequence and protein comprising the step of quantifying the analyte.
  • the decomposition method for the quantification is preferably tandem mass spectrometry.
  • the quantitative signal giving the quantitative signal mass is 129 Th (CH 3 C ⁇ CC 6 H 4 CH 2 + ), 131 Th (CH 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 + ), 132 Th (CD 3 a C ⁇ CC 6 H 4 CH 2 +) or 134 Th (CD 3 C ⁇ CC 6 H 4 CD 2 +).
  • the present invention provides a method for preparing a compound represented by Chemical Formula 1, and a specific manufacturing method will be described with reference to FIGS. 3 to 5.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 is synthesized using a reporter unit in the form of a haloalkan, a balance unit in the form of a carboxylic acid, and an esterified amino acid.
  • the compound represented by the formula (1) containing deuterium can be prepared by using the same after the reaction to introduce the deuterium to the reporter unit and the balance unit.
  • a method for introducing deuterium a method known in the art may be used. Specifically, the method described in FIG. 2 can be used.
  • One method for introducing deuterium is to replace hydrogen in terminal alkyne with deuterium in basic deuterium (D 2 O), and one carbonyl group is sodium borohydride (NaBD 4 ) or lithium deuterated aluminum (LiAlD 4 ). There is a method of partially reducing.
  • the introduction of two deuteriums is carried out using a method of reducing alkene to deuterium gas (D 2 ) under a metal catalyst, a method of reducing carbonyl groups of peptide bonds or ester bonds to LiAlD 4 and sodium methoxide (NaOCD 3 ). There is a method of introducing deuterium at the alpha position of the ester compound.
  • Three deuteriums can be introduced by alkylation of secondary amines or terminal alkyne using methane iodide- d 3 (CD 3 I).
  • the introduction of four deuteriums includes the reduction of two carbonyl groups using LiAlD 4 and the reduction of alkyne to D 2 under a metal catalyst.
  • a combination of a method of introducing two deuteriums by reducing a carbonyl group of an ester bond with LiAlD 4 and a method of introducing three deuteriums by alkylating alkyne with CD 3 I 4 was synthesized.
  • the reporter unit was first synthesized, and a part of the synthesized reporter unit was transformed into three additional reactions to synthesize a balance unit.
  • a detailed reporter unit and a method of manufacturing the balance unit will be described with reference to FIG. 4. do.
  • the synthesis method of the reporter unit is as follows.
  • Trimethylsilyl (TMS) protected alkyne is introduced into 4-bromobenzoic acid methyl ester via Sonogashira coupling using a palladium catalyst and cuprous iodide. The ester is then reduced to alcohol.
  • TMS Trimethylsilyl
  • LiAlH 4 lithium aluminum hydride
  • LiAlD 4 lithium deuterated aluminum
  • TBSCl butyl-dimethylsilane
  • TBS dimethylsilane
  • Methyl iodide- d 0 (CH 3 I) or -d 3 (CD 3 I) is introduced into the terminal alkyne thus produced, to introduce methyl- d 0 or -d 3 .
  • the TBS is then removed using tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF).
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the resultant compound is treated with methanesulfonic acid chloride and replaced with iodine using sodium iodide to synthesize a reporter unit.
  • a total of four reporter units are obtained according to the combination of LiAlH 4 / LiAlD 4 and CH 3 I / CD 3 I.
  • Using LiAlH 4 and CH 3 I produces deuterium-free reporter- d 0
  • using LiAlD 4 and CH 3 I produces reporter- d 2 containing two deuteriums
  • LiAlH 4 and CD 3 I When used, reporter- d 3 containing three deuteriums is generated, and reporter- d 5 containing five deuteriums is generated by using LiAlD 4 and CD 3 I.
  • Part of the synthesized reporter unit is used to alkylate diethyl malonic acid. After removing one carboxylic group of malonic acid through reflux, a balance unit is synthesized by hydrolyzing ethyl ester with an aqueous sodium hydroxide solution. Since deuterium is not used to transform the reporter unit into the balance unit, the number of deuteriums in the balance unit is determined by the reporter unit used.
  • the synthesized compound and balance- d 5-n were converted into 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), and N, N-diisopropyl.
  • the coupling reaction was carried out using ethylamine (DIPEA), and hydrolysis of the methyl ester with an aqueous sodium hydroxide solution yielded an acid homologous labeling agent tag ⁇ 129 + n having a mass value of 129 + n.
  • tag ⁇ may be manufactured by a method similar to the above.
  • the present invention comprises the steps of combining the labeling agent comprising a compound represented by the formula (2) with the analyte (step 1); Ionizing the conjugate to generate fragment ions (step 2); And quantifying fragment ions comprising the analyte and R C in the fragment ions (step 3).
  • R A is straight or branched C 1 -C 18 alkyl
  • R B is a mass regulator
  • R C is straight or branched C 1 -C 18 alkyl
  • Linker is a reactive linker that induces binding with the analyte
  • R A and R C are the same alkyl and at least one comprises at least one deuterium.
  • Step 1 is a step of binding the labeling agent represented by the formula (2) with the analyte, the step of binding the labeling agent to the analyte for use in subsequent quantitative analysis.
  • the linking is a linker of the labeling agent and an amine group of the analyte react to be bound.
  • the binding method is as described in Korean Patent Publication No. 2010-0009466, Korean Patent Publication No. 2010-0009479, and International Patent Publication No. WO 10/008159, which bind by linker reaction of an amine group and Linker known in the art. You can.
  • two or more labeling agents represented by Formula 2 may be combined.
  • labeling agent used in the present invention means a compound represented by Chemical Formula 2, and the compound is Korean Patent Publication No. 2010-0009466, Korean Patent Publication No. 2010-0009479, and International Patent Publication. As described in No. WO 10/008159, which is incorporated by reference.
  • Linker means an active ester which becomes a living group in the nucleophilic attack of amines.
  • the amine is characterized in that the primary amine.
  • the reactive linker is a group consisting of N -hydroxysuccinimidyl group, N -hydroxysulfosuccimidyl group, benzotriazol-1-yloxyl group, pentahalobenzyl group, 4-nitrophenyl group and 2-nitrophenyl group. Can be selected from.
  • the term "the mass regulator (R B )" used in the present invention when combined with the analyte and decomposed in the mass spectrometry, controls the mass of the N -acylated amino acid fragment so that the quantitative signal is different in the spectrum. Introduced so as not to overlap with the fragments. By changing the type of R B , the mass of the quantitative signal can be varied in various ways.
  • the mass regulator may be one of the side chains of natural or artificial amino acid residues of similar or identical properties.
  • the mass regulator is characterized by having similar or identical physical properties.
  • the mass control group may be C 1-18 linear or branched alkyl, and for example, may be linear or branched alkyl such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, or octyl. .
  • the R A and R C are the same alkyl and at least one includes deuterium, and serves to enable quantitative analysis by mass difference of isotopes.
  • R A and R C are methyl or methyl comprising one or more deuterium, or wherein R A and R C are each ethyl and at least one of R A and R C comprises one or more deuterium It features.
  • R A and R C are made of alkyl having the same number of carbons, the number of deuterium included should be different.
  • R A and R C are preferably CH 3 and CD 3 or CD 3 and CH 3 , respectively.
  • R A and R C in the compound if R A is CH 3 R C is a CD 3, and, R C is R A is CH 3 is CD 3.
  • R A and R C are each preferably C 2 H 5 and C 2 D 5 , or C 2 D 5 and C 2 H 5 , respectively. That is, R A and R C are the above compounds, R A is C 2 H 5 when R C is a C 2 D 5 a, R C is C 2 H 5 when R A is C 2 D 5.
  • Formula 2 is characterized in that the N- terminal is acylated, C- terminal is a dipeptide is attached to a linker attached to the living group in the nucleophilic attack of the amine and isotopically labeled.
  • the dipeptides are characterized in that the dipeptides labeled with deuterium.
  • Figure 13 schematically shows the chemical structure of the labeling agent.
  • the compounds disclosed in the patent application Korean Patent Publication No. 2010-0009466, Korean Patent Publication No. 2010-0009479, and International Patent Publication No. WO 10/008159) were named "MBIT" and are not theoretically limited, but N The end is acylated and has a structure of dipeptides with a linker attached to the C-terminus.
  • FIG. 14 is a diagram schematically showing the binding of MBIT substances in peptides and proteins, although not limited in theory.
  • binding can also occur with primary amines of lysine side chains. Therefore, when the labeling agent is bound to one peptide or protein, two or more labeling agents may be multiplexed depending on the number of lysines included in the protein and the peptide. Even if the analyte is not necessarily a protein or peptide, as many labeling agents as the primary or secondary amines of the analyte can bind to the analyte at the maximum.
  • the present invention it is preferable to use two or more kinds of compounds represented by the formula (2) having a constant number of total deuterium contained in R A and R C , preferably two kinds in one set.
  • the pair of compounds constituting the set is called the first compound and the second compound, respectively, the first compound and the second compound preferably have the same mass regulator (R B ).
  • R B mass regulator
  • R A and R C of the first compound contains a greater number of deuterium than the other
  • R C of the first compound is R A
  • R A and R C of the first compound is CH 3
  • CD 3 respectively in the compound pair
  • R A and R C of the second compound may be mentioned pair of compounds consisting of CD 3, CH 3 .
  • the compound pair is R A and R C of the first compound each C 2 H 5, C 2 D 5 of the case, R A and R C of the second compound consisting of C 2 D 5, C 2 H 5
  • the present invention preferably contains deuterium only in one R C of the first compound and the second compound in order to quantify using y S ions.
  • each separated labeled with a first compound and a second compound of the labeled second set was analyzed tandem mass, the fragment ions produced through decomposition if the labeling agent to be decomposed so that the separated R A and R C is R A, and The difference in R C is as much as the mass of deuterium and its result is shown in the tandem mass spectrometry.
  • the relative intensities of the analytes can be quantified by comparing their relative intensities.
  • two different complementary fragment ions generally generated during tandem mass spectrometry may be used as independent quantitative signals.
  • analyte means a substance analyzed by the labeling agent according to the present invention.
  • the analyte may be a protein, carbohydrate or lipid, and may also be a peptide, nucleic acid or nucleic acid derivative, or steroid.
  • Step 2 is a step of ionizing the binder to generate fragment ions, wherein the amide bond present in the binder is broken to generate fragment ions.
  • fragment ions that can be produced while breaking the amide bonds of the conjugates of the invention
  • fragment ions comprising R A and R B and fragment ions comprising R C and analytes can be produced.
  • fragment ions including R A and R B will be referred to as 'b S ions'
  • fragment ions containing R C and analyte will be referred to as 'y S ions'. This will be described with reference to FIGS. 15 and 16.
  • FIG. 15 is a diagram showing fragment ions generated when a conjugate is decomposed during tandem mass spectrometry.
  • MBIT reagent pairs having only deuterium-labeled sites in the same molecular formula are divided into H MBIT and L MBIT by convenience.
  • Deuterium-labeled R A or R B is labeled with deuterium in H MBIT and R C. Call it L MBIT.
  • the analytes combined with H MBIT and L MBIT have the same overall weight.
  • H with deuterium
  • L without deuterium
  • the conjugate is broken into amide bonds between the two amino acids of the dipeptides during tandem mass spectrometry, including fragments (b S ) and R C containing R A and R B. It can be separated into fragment ions (y S ) containing the analyte. Fragment ions whose only part of Formula 2 is separated from the analyte are named -tag.
  • FIG. 16 illustrates tandem mass spectrometry which can be theoretically generated when tandem mass spectrometry of a peptide bound to two or more compounds of formula 2 is not limited in theory.
  • FIG. 16 when two or more amine groups, including the N-terminal and C-terminal amino acids of a peptide, are combined, the mass of all b- and y-type sequence ions that can be generated from the peptide Has a mass value less than the mass of -tag.
  • y S ions with a higher mass than -tag would appear in the mass range theoretically uninterrupted by other fragment ions derived from the peptide.
  • Step 3 is a step of quantifying fragment ions (y S ) including the analyte and R C in the fragment ions, and is a step for analyzing the analytes with fragment ions having a large mass.
  • the mass value of the y S quantitative signal is more than 1/3 of the mass value of the ion ion, y S irrespective of the low-mass cutoff, even when tandem mass spectrometry is performed using the resonance-excited collision-derived method in an ion trap mass spectrometer Ions can be detected. Therefore, unlike other conventional homologous markers using quantitative signals having a small mass value, the quadrupole ion trap mass spectrometer has a characteristic that quantitative analysis using y s quantitative signals can be performed.
  • the present invention provides a new compound comprising a hydrogen isotope, which can strongly indicate the intensity of the quantitative signal, and capable of simultaneously quantitating two or more proteins, and a composition comprising two or more such compounds, wherein the labeling agent Alternatively, the composition may be used to analyze the amino acid sequence and at the same time provide a method for quantitating the amount of protein.
  • the present invention may provide a new method of analyzing the amino acid sequence of a peptide and quantitating the amount simultaneously by utilizing a homologous labeling agent.
  • the labeling material is bound to the analyte, and then the tandem mass spectrometry is used to decompose the intermediate binding material and perform quantitative analysis using small mass fragment ions that do not contain the analyte.
  • the present invention is a quantitative analysis using a fragment ion (y S ) containing an analyte among fragment ions and having a large mass value after the binding of the labeling material is decomposed in the tandem mass spectrometry using a homopolymer labeling agent
  • y S fragment ion
  • the present invention is a quantitative analysis using a fragment ion (y S ) containing an analyte among fragment ions and having a large mass value after the binding of the labeling material is decomposed in the tandem mass spectrometry using a homopolymer labeling agent
  • y S fragment ion
  • Figure 1 shows the structure of a compound according to the invention.
  • Figure 1 (a) shows the representative structure of the compound of the present invention and the structure of the quantitative signal generated from the compound.
  • 1 (b) to 1 (d) show four structures of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1 (b) is a structure synthesized by multiple isotopes using a hydrogen isotope, wherein each X 1 -X 4 represents a position that is optionally substituted with a hydrogen isotope.
  • FIG. 2 shows representative deuterium addition and substitution reactions that can be utilized to prepare the compounds according to the present invention as homopolymer labeling agents using hydrogen isotopes.
  • Figure 3 shows the synthesis process of the compound of the present invention. It is synthesized using a haloalkane form reporter unit (R 1 -Br), a carboxylic acid form balance unit (R 2 -COOH), and an esterified amino acid.
  • R 1 -Br haloalkane form reporter unit
  • R 2 -COOH carboxylic acid form balance unit
  • the balance unit is synthesized by modifying the reporter unit.
  • the reporter and the balance unit were combined by combining two deuterium introduction methods (reduction of two deuteriums by reducing the carbonyl group of the ester bond with LiAlD 4 and introducing three deuteriums by alkylating alkyne with CD 3 I). Synthesize four kinds each.
  • the balance unit is synthesized by modifying the reporter unit.
  • FIG. 6 shows the structure of a compound according to an embodiment of the present invention. It is synthesized by using 5-balance- d n and glycine including the reporter- d n, 5-n of the n number of deuterium containing heavy hydrogen, ⁇ m tag means a tag of ⁇ mass of quantitative signal m.
  • Figure 7 shows an embodiment of a method of activating a compound according to the present invention, which shows a method of activating a compound with succinimidyl ester and binding to the peptide.
  • FIGS. 8 (e) to 8 (g) show the results of using non-kinases (tag ⁇ - ⁇ ).
  • Figure 9 shows the relative intensity of the quantitative signal (benzyl cation and iminium cation) generated in the compound of one embodiment of the present invention.
  • the intensity of the quantitative signal is expressed as a value relative to the intensity of histidine immonium ion (110 Th) generated from the model peptide.
  • FIG. 10 shows the results of tandem mass spectrometry by mixing the model peptides labeled with multiple isomers of one embodiment of the present invention at a predetermined ratio.
  • FIG. 10 (a) shows the results of a sample in which a peptide labeled with multiple isomers is mixed in a ratio of 2: 1: 2: 1 (tag ⁇ 129 : ⁇ 131 : ⁇ 132 : ⁇ 134 ), and
  • FIG. 10 (b) Shows the results of a sample mixed at a ratio of 1: 2: 1: 2 (tag ⁇ 129 : ⁇ 131 : ⁇ 132 : ⁇ 134 ).
  • Fig. 11 shows the results of measuring the amount or concentration range of peptides that can be measured using multiple isomers (tag ⁇ 129 - ⁇ 134 ).
  • Tandem mass spectrometry of FGER, VASLR, and SEIAHR in tryptic BSA (bovine serum albumin) labeled with multiple isomers showed peptides tagged tag ⁇ 129 and tag ⁇ 131 at a 3: 1 ratio.
  • the intensity of the mother ions observed at each concentration is shown in Figure 11 (a), and the ratio of the quantitative signal measured by tandem mass spectrometry is shown in Figure 11 (b).
  • Figure 12 shows the results of quantitative analysis of tryptic BSA labeled with multiple isomers in conjunction with liquid chromatography (LC) and MALDI mass spectrometer.
  • 12 (a) shows the intensity of the mother ions observed with the MALDI mass spectrometer according to the time each peptide was eluted from the LC
  • Figure 12 (b) shows the amount of quantitative signal measured in each peptide tag ⁇ 129 This is compared with the quantity of quantitative signal of. Results from six peptides (FGER, VASLR, QEPER, AWSVAR, SEIAHR and YLYEIAR) in tryptic BSA labeled with isomers.
  • Fig. 13 schematically shows the chemical structure of the labeling agent of the present invention.
  • Figure 14 schematically shows the reaction of the labeling agent of the present invention to peptides and proteins.
  • Figure 15 schematically shows the type of fragment ions that can be produced when the labeling agent bound to the amine of the analyte is decomposed during tandem mass spectrometry.
  • FIG. 16 shows tandem mass spectrometry that can be theoretically generated when tandem mass spectrometry of a peptide bound to two or more labeling agents.
  • FIG. 17 shows the results of electrospray (ESI) mass spectrometry after combining two model peptides with a labeling agent according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 shows a quadrupole ion trap of ions having a +2 charge (MH 2 2+ ) in a mother ion having a labeling agent bound to a peptide LISFYAGR having one amine at the N-terminus, according to an embodiment of the present invention. It shows the tandem mass spectrometry spectra obtained by selecting resonance within the resonance-excited collision-derived decomposition.
  • FIG. 19 shows a positive ion (MH + ) in a quadrupole ion trap of a mother ion having a labeling agent bound to a peptide LISFYAGR having one amine at the N-terminus, according to an embodiment of the present invention.
  • Resonance excitation shows the tandem mass spectrometry obtained by collision-derived decomposition.
  • FIG. 20 shows an ion having a +2 charge in a mother ion in which a labeling agent according to an embodiment of the present invention is bound to a peptide LISFYAGK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains (MH 2). 2+) a shows a tandem mass spectrum is obtained by decomposing the quadrupole ion trap to selected within 0 people this collision results.
  • FIG. 21 is a ions (MH +) having a +1 charge in a mother ion in which a labeling agent according to an embodiment of the present invention is bound to a peptide LISFYAGK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains. ) Shows the tandem mass spectrometry obtained by resonating the excitation-induced resonance with a quadrupole ion trap.
  • FIG. 22 shows a mother ion (MH 2 2+ having a charge of +2 of model peptides LISFYAGR (FIG. 10 (a)) and LISFYAGK (FIG. 10 (b)) labeled with a labeling agent according to an embodiment of the present invention.
  • LISFYAGR FIG. 10 (a)
  • LISFYAGK FIG. 10 (b)
  • FIG. 23 shows a mother ion (MH + ) having a +1 charge of the model peptides LISFYAG (FIG. 11 (a)) and LISFYAGK (FIG. 11 (b)) labeled with a labeling agent according to an embodiment of the present invention.
  • the intensity of y s quantitative signal in the quadrupole ion trap is determined by the total sum of the signal strengths of all fragment ions.
  • FIG. 11 (c) shows a mother ion having a +1 charge of the model peptide LISFYAGR labeled with a labeling agent according to an embodiment of the present invention produced by MALDI ionization and tandem mass spectrometry in a TOF / TOF apparatus.
  • S b is a view showing the intensity ratio of the quantified signal.
  • FIG. 24 (a) shows an ion having a +2 charge (MH 2 2+ ) in a mother ion in which Val-tag is bound to peptide LISFYAGK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains. Is selected from the quadrupole ion trap to show the resonance excitation collision-derived MS 2 tandem mass spectrometry generated, Figure 24 (b) shows the L y S ions generated in the MS 2 tandem mass spectrometry again in the ion trap It shows the MS 3 tandem mass spectrometry obtained by collision-derived decomposition by selecting from.
  • Figures 26 (a) and 26 (b) show H MBIT (Fig. 26 (a)) or L MBIT of Ethyl-tag in peptide YGGFLK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains.
  • Figure 26 (b)) shows the MS 2 tandem mass spectrometry generated by the resonance-excited collision-decomposed by selecting the ions (MH + ) having a +1 charge in the bound ion ion in the quadrupole ion trap
  • 26 (c) and 26 (d) are enlarged views of the range in which y S signal ion occurs in FIGS. 26 (a) and 26 (b).
  • FIG. 27 is a resonance of a quadrupole ion trap by selecting an ion having a +1 charge in a mother ion in which Ethyl-tag is bound to a peptide LISFYAGK having a total of two amines, one at the N-terminus and one at a lysine side chain.
  • the MS 2 tandem mass spectrometry generated by collision-derived decomposition is shown, showing the tandem mass spectrometry by mixing a 2: 1 ratio of a peptide bound to L MBIT of Ethyl-tag and a peptide bound to H MBIT.
  • FIG. 1 (a) Various structures or functional groups can be introduced at the R 1 , R 2 , and R 3 positions in the compound (labelling agent) represented by FIG. 1 (a).
  • the compound labeled by FIG. 1 (a).
  • Figure 1 (b) to Figure 1 (e) as an example, to synthesize a compound having four structures (tag ⁇ - ⁇ ) and confirm how the quantitative signal appears according to each structure or functional group It was.
  • Figure 1 (b) of the four structures is an example synthesized with a homologous labeling agent that can quantify multiple proteins using hydrogen isotopes.
  • X 1 to X 4 in FIG. 1 (b) show positions of substituted deuterium.
  • Tag ⁇ and ⁇ for commercially available reporter unit and balance unit among non-equivalent labeling agents include reporter unit of ⁇ , 3-iodopropyl benzene; reporter unit of ⁇ , 1-iodooctane; ⁇ The balance unit, 5-phenylpentanoic acid; and ⁇ balance unit, octanoic acid) were purchased, and the labeling agent was synthesized.
  • tag ⁇ the reporter unit constituting the labeling agent (1- (iodomethyl) -4-propylbenzene) and the balance unit (2- (4-propylphenyl) acetic acid) were synthesized according to the procedure of FIG. 5, and tag ⁇ was synthesized using them.
  • Step 1 Synthesis of 4-((trimethylsilyl) ethynyl) benzoic acid methyl ester
  • Step 2 Synthesis of (4-((trimethylsilyl) ethynyl) phenyl) methanol
  • Step 3 tert Synthesis of -butyldimethyl ((4-((trimethylsilyl) ethynyl) benzyl) oxy) silane
  • Step 4 tert Synthesis of -butyl ((4-ethynylbenzyl) oxy) dimethylsilane
  • Step 5 tert Synthesis of -butyldimethyl ((4- (prop-1-yn-1-yl) benzyl) oxy) silane
  • Step 6 tert Synthesis of -butyldimethyl ((4-propylbenzyl) oxy) silane
  • n-butylammonium fluoride (TBAF; 1.56 mL, 1.0 M tetrahydrofuran Solution, 1.56 mmol) was added slowly and stirred at 0 ° C. for 30 minutes.
  • TBAF n-butylammonium fluoride
  • 5 mL of saturated aqueous ammonium chloride solution was added to terminate the reaction, and extracted with ethyl acetate (4 times in total of 5 mL).
  • the resulting organic layer was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water.
  • the precipitate was filtered off and the resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to give 198 mg (0.838 mmol, 95%) of the title compound.
  • Step 8 Synthesis of 1- (iodomethyl) -4-propylbenzene
  • the resulting solution was distilled under reduced pressure, concentrated and dissolved in 6 mL of acetone, followed by addition of sodium iodide (NaI; 150 mg, 0.999 mmol). After stirring for 15 minutes at room temperature, the solvent is dried by distillation under reduced pressure when the reaction is complete. 10 mL of water was added thereto, followed by extraction with ethyl acetate (3 times for 5 mL each), and the resulting organic layer was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water. The precipitate was filtered off and the resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to obtain 157 mg (0.604 mmol, 90%) of the title compound (tag ⁇ reporter unit).
  • NaI sodium iodide
  • Step 12 Synthesis of Methyl 2- (N- (4-propylbenzyl) -2- (4-propylphenyl) acetamido) acetate
  • Step 13 Synthesis of 2- (N- (4-propylbenzyl) -2- (4-propylphenyl) acetamido) acetic acid
  • tag ⁇ was synthesized in the same manner as in FIG. 3, and specific synthetic methods and NMR results of the compound synthesized in each step are shown in Steps 1 to 3 below.
  • Step 1 Synthesis of Methyl 2-((3-phenylpropyl) amino) acetate
  • Step 2 Synthesis of Methyl 2- (5-phenyl-N- (3-phenylpropyl) pentaneamido) acetate
  • Step 3 Synthesis of 2- (5-phenyl-N- (3-phenylpropyl) pentamido) acetic acid
  • tag ⁇ was synthesized in the same manner as in FIG. 3, and specific synthetic methods and NMR results of the compound synthesized in each step are shown in Steps 1 to 3 below.
  • Step 3 Synthesis of 2- (N-octyloctaneamido) acetic acid
  • Methyl 2- (N-octyloctaamido) acetate (44.7 mg, 0.136 mmol) was dissolved in 0.5 mL of methanol, and then 100 ⁇ L of 20% sodium hydroxide aqueous solution was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Upon completion of the reaction, 3 mL of ethyl acetate was added to dilute and 200 ⁇ L of 10% aqueous hydrogen chloride solution was added to neutralize the solution. Water was removed with anhydrous magnesium sulfate, and the precipitate was filtered off. The resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to obtain 36.5 mg (0.116 mmol, 86%) of the title compound.
  • Steps 1 to 7 the process of synthesizing reporter- d 5 and reporter- d 0 and the NMR results of the compounds produced in each step are shown in Steps 1 to 7 below.
  • Step 1 Synthesis of 4-((trimethylsilyl) ethynyl) benzoic acid methyl ester
  • the resulting organic layer was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water, and the precipitate was filtered. Came out.
  • the resulting solution was distilled under reduced pressure, concentrated and dissolved in 12 mL of acetone, followed by addition of sodium iodide (NaI; 280 mg, 1.87 mmol). After stirring for 1 hour at room temperature, the solvent is dried by distillation under reduced pressure when the reaction is complete. 10 mL of water was added thereto, followed by extraction with ethyl acetate (3 times for 10 mL each), and the resultant was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water. The precipitate was filtered off and the resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to obtain 279 mg (1.09 mmol, 88%) of the title compound (reporter- d 0 ).
  • diethyl 2- (4- (prop-1-yn-1-yl) benzyl) malonate- d 5 (88.5 mg, 0.302 mmol) was dissolved in 2 mL dry DMF, followed by sodium chloride (35.3 mg, 0.604 mmol) and 100 ⁇ L of water were added and stirred under reflux conditions for 2 days.
  • sodium chloride 35.3 mg, 0.604 mmol
  • 3 mL of water was added to terminate the reaction, extracted with diethyl ether (3 mL 4), and the resultant organic layer was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water.
  • the precipitate was filtered off and the resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to give 50.0 mg (0.226 mmol, 75%) of the title compound.
  • diethyl 2- (4- (prop-1-yn-1-yl) benzyl) malonate- d 0 (94.8 mg, 0.329 mmol) was dissolved in 2 mL dry DMF, followed by sodium chloride (38.5 mg, 0.658 mmol) and 200 ⁇ L of water were added and stirred for 2 days under reflux conditions.
  • sodium chloride 38.5 mg, 0.658 mmol
  • 200 ⁇ L of water were added and stirred for 2 days under reflux conditions.
  • 3 mL of water was added to terminate the reaction, followed by extraction with diethyl ether (4 times in 3 mL each), and the resultant organic layer was treated with anhydrous magnesium sulfate to remove water.
  • the precipitate was filtered off and the resulting solution was concentrated by distillation under reduced pressure and purified by column chromatography to give 50.0 mg (0.231 mmol, 70%) of the title compound.
  • the method of synthesizing the homo and multiple isomeric labeling agents and the NMR results of the compounds synthesized in each step are shown in the following steps 11 to 13. Since the method of synthesizing multiple isomers is the same, the case of the isomer labeling agent tag ⁇ 129 is described in detail, and for the other isomer labeling agents, the difference in the synthesis process is described.
  • homopolymer labeling agents tag ⁇ 131 , tag ⁇ 132 and tag ⁇ 134 were prepared as follows.
  • the binding reaction of the compound of Example 1-2 with the peptide is shown in FIG. 7.
  • the compound of Example 1-2, EDC, and N-hydroxysuccinimide (NHS) were dissolved in DMF, mixed to reach 60, 35, and 40 mM, respectively, and reacted at room temperature for 45 minutes to form a carboxylic acid terminal group of the labeling agent.
  • Peptide tryptic BSA or angiotensin II (DRVYIHPF) obtained by digesting bovine serum albumin with trypsin enzyme was dissolved in aqueous sodium bicarbonate solution (NaHCO 3 , 100 mM), and then activated labeling agent was reacted for at least 6 hours. Proceeded. Since the labeling reaction occurring in the hydroxyl group forms an ester bond to form an unstable bond and the efficiency of the reaction is low, the hydroxyl amine (80 mM) dissolved in an aqueous sodium bicarbonate solution (100 mM) is used for accurate quantification. Side reactions labeled with hydroxyl groups of the peptide were removed. The whole reaction was terminated by addition of trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Labeled angiotensin II was diluted with 50 TA solution (0.1% TFA / 50% acetonitrile / 50% H 2 O) followed by HCCA matrix solution (a-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 5 mg / mL 50 TA) and 1 The mixture was mixed with 1: 1, dried on a MALDI plate, and analyzed using a tandem time-of-flight mass spectrometer (time-of-flight / time-of-flight (TOF / TOF) mass spectrometry). Tandem mass spectrometry confirmed that the quantitative and labeling signals were observed as well as the intensity.
  • TOF / TOF tandem time-of-flight mass spectrometer
  • the labeled tryptic BSA was used to confirm the concentration or amount of analytical sample that could be measured with the homopolymer labeling agent and to verify that multiple samples could be simultaneously quantified in conjunction with liquid chromatography (LC).
  • LC liquid chromatography
  • the samples labeled with tag ⁇ 129 and tag ⁇ 131 among the multiple isomers were mixed at a ratio of 3: 1, and then diluted with 50TA. Samples of each concentration were mixed in a 1: 1 ratio of HCCA matrix solution and loaded onto a MALDI plate. The amount of peptide loaded at this time is about 4200, 1300, 420, 130, 42, and 13 femtomol per spot.
  • tryptic BSAs labeled with four different isomers were mixed at a ratio of 2: 1: 4: 8 and separated by nanoLC, and the peptide eluted from the LC was mixed with HCCA matrix solution in a MALDI plate. Loaded on and analyzed by MALDI-TOF / TOF.
  • Mass spectrometry of the model peptides associated with each labeling agent revealed that the mass values bound to one labeling agent (1406.7 for tag ⁇ 129 - ⁇ 134 , 1406.7 for tag ⁇ , 1395.7 for tag ⁇ , 1381.7 for tag ⁇ , and tag ⁇ was observed at 1341.8 Th).
  • tandem mass spectrometry was performed by selecting ions observed in the mass spectrum, and the results are shown in FIG. 8.
  • FIGS. 8 (e) to 8 (g) are tags ⁇ and tag which are non-homologs, respectively.
  • the result is a peptide labeled with ⁇ and tag ⁇ .
  • the ions generated in each labeling agent, namely the labeling signal and the quantitative signal, were observed at the designed mass values.
  • the labeling signal was observed at tag ⁇ 129 - ⁇ 134 at 361, tag ⁇ at 350, tag ⁇ at 336, and tag ⁇ at 296 Th.
  • Amount signal ⁇ tag 129 is 129, tag 131 is ⁇ 131, ⁇ 132 is tag 132, tag 134 is 134 ⁇ , ⁇ is a tag 133, tag 148 is ⁇ , and ⁇ tag has been observed in the 142 Th.
  • the intensity of the quantitative signal generated in each labeling agent is shown in FIG. 9 in comparison with the most strongly observed histidine immonium ion (110 Th) among the fragment ions of the model peptide.
  • Different types of quantitative signals were observed depending on the structure of the labeling agent.
  • the beta benzyl derivatives of tag ⁇ and tag ⁇ were quantitative signals of benzyl cation structures
  • the beta beta derivatives of tag ⁇ and tag ⁇ were non-benzyl derivatives.
  • the type of quantitative signal varies depending on the labeling agent, the quantitative signals of each labeling agent were observed more strongly than the fragment ions of the model peptide.
  • fragment ions of the model peptide fragment ions including the C-terminal group of the peptide, ie y 2 , y 3 , and y 7, were observed at the same position regardless of the labeling agent, and the N-terminal group of the peptide was observed.
  • Including fragment ions, that is, b 2 , b 3 -NH 3 , a 5 , and b 7 + H 2 O and the like were observed where the mass increased by ⁇ molecular weight of each labeling agent-H 2 O ⁇ . From the mass spectrometry and tandem mass spectrometry, it was confirmed that each labeling agent was synthesized as designed by observing the molecular weight, quantification, and labeling signal of each synthesized labeling agent as expected. It was confirmed that only labeled.
  • Figure 10 shows the results obtained by mixing model peptides labeled with multiple isomers in a proportion and tandem mass spectrometry.
  • the quantitative signals of each of the multiple isomeric labeling agents are represented by an inverted triangle.
  • FIGS. 8 (a) to 8 (d) which analyze each of the multiple isomers separately, the intensity of each quantitative signal was relatively weak and the fragment ions of the peptide were observed more strongly in the multiple quantitative analysis.
  • the ions other than the quantum signal have the same mass value so that their strength is enhanced. For this reason, like the labeling agents developed in the present invention, the stronger the quantitative signal is observed, the better the multiple quantitative analysis.
  • the amount or concentration range of peptide that can be measured using multiple isomers is shown in FIG. 11.
  • the experiments were carried out using peptides FGER, VASLR, and SEIAHR, which were relatively strongly observed in tryptic BSA labeled with isomers.
  • Peptides labeled with Tag ⁇ 129 and tag ⁇ 131 were mixed at a 3: 1 ratio and tandem mass spectrometry was performed with varying amounts of protein from 4.2 picomolar to 13 femtomol.
  • the MALDI mass spectrometer is limited in the amount of ionization by the laser, so that when the amount of the sample is small, the intensity of the mother ion is small compared to the amount of the loaded sample, but it is irrelevant to quantitative analysis through tandem mass spectrometry. It was.
  • the homologous labeling agent of the present invention had a strong quantitative signal, and was able to quantitate even a small amount of 13 peptomomol.
  • FIG. 12 shows the results of quantitative analysis in conjunction with LC and MALDI mass spectrometer.
  • 12 (a) shows the intensity of the mother ions eluted from the LC
  • Figure 12 (b) shows the amount of the quantitative signal measured at each spot compared with the quantitative signal of tag ⁇ 129 .
  • a total of six peptides FGER, VASLR, QEPER, AWSVAR, SEIAHR, and YLYEIAR
  • FGER fluorylity
  • the same peptide was measured at the same ratio of quantitative signals while eluting with LC. This means that the multilabeled peptides of the homopolymer of the present invention are simultaneously moved on the nanoLC, and thus accurate quantification is achieved only with the eluate at a specific time. In addition, as observed through the model peptide, it was confirmed that the proportion of the quantitative signal observed was not affected by the total amount of the sample.
  • the labeling agent of Chemical Formula 2 of the present invention was prepared with reference to Korean Patent Publication No. 10-2010-0009466, Korean Patent Publication No. 10-2010-0009479 and International Patent Publication No. WO 10/008159.
  • isotope coders R A and R C are methyl (CH 3 or CD 3 ) and mass regulators R B are valine, glutamine (Gln), histidine (His), phenylalanine (Phe), and arginine (Arg).
  • Labeling agents which are side chains of
  • those with side chains of valine (Val), glutamine (Gln), histidine (His), phenylalanine (Phe), and arginine (Arg) can be used as Val-tag, Gln-tag, His-tag, Phe-tag, And Arg-tag.
  • a labeling agent was prepared in which the isotopic coding groups R A and R C were ethyl (C 2 H 5 or C 2 D 5 ) and the mass regulator R B was methyl. This is named Ethyl-tag for convenience.
  • Example 2-1 The labeling agent prepared in Example 2-1 was combined with Val-, Gln-, His-, Phe-, Arg-tag and Ethyl-tag to three model peptides LISFYAGR or LISFYAGK or YGGFL.
  • two protein mixture samples were prepared in which bovine serum albumin, myoglobin, and ubiquitin protein were mixed in different amounts.
  • Mixed Sample A was prepared with bovine serum protein, myoglobin, and ubicutin at concentrations of 4 mg / mL, 2 mg / mL, and 0.2 mg / mL, respectively.
  • Mixed Sample B contained bovine serum protein, myoglobin, and ubicutin.
  • the model peptide bound with the labeling agent was desalted with ZipTip-C 18 (Millipore) and finally dissolved in a solution in which 0.5% formic acid was added and acetonitrile and water were mixed at a volume ratio of 1: 1 at each 5 M concentration. It was prepared as it is.
  • Mixed samples A and B combined with the labeling agent were mixed in a volume ratio of 1: 1, and then completely dissolved in a vacuum, and then dissolved in an aqueous solution containing 0.5% formic acid.
  • the mass spectrometer used in the quantitative analysis of the conjugate of the model peptide and MBIT described in Example 2-2 was used as Espquire HCT from Bruker or LTQ Velos from Thermo as an electrospray ionization quadrupole ion trap.
  • 100 L of sample solution was loaded into the syringe pump and then transferred to the electrospray tip at a flow rate of 1 ⁇ L / min.
  • Electrospray was at a voltage of 4 kV. Sample ions were collected and mass analyzed for up to 200 ms inside the ion trap for one spectral measurement per cycle, and up to 250 cycles were repeated for 1 minute.
  • the mass spectrometer used in the quantitative analysis of the combination of the mixed samples A, B and MBIT described in Example 2-2 uses the LTQ XL of Thermo Co., Ltd. as an electrospray ionization quadrupole ion trap connected to the liquid phase chromatography. It was. The sample solution was electrosprayed ionized through liquid phase chromatography at a flow rate of 0.3 ⁇ L / min. At this time, the electrospray was performed at a voltage of 2 kV. The mass spectrometry and tandem mass spectrometry spectra of the peptides were obtained every 0.2 seconds eluted by liquid phase chromatography.
  • FIG. 17 shows the quadrupoles by binding Val-, Gln-, His-, Phe-, and Arg-tag to the model peptides LISFYAGR (FIG. 17 (a)) and LISFYAGK (FIG. 17 (b)), followed by electrospray ionization. Mass spectrometry obtained using an ion trap mass spectrometer is shown. Peptide ions with a charge of +1 and +2, respectively, were detected.
  • the original mass of the LISFYAGR peptide is 925.5 Da, which is detected at 926.5 Th and 463.8 Th in +1 and +2 ions (MH + , MH 2 2+ ), which are detected by attaching one or two protons, respectively.
  • the labeling agent was bound to this peptide, the peptide was detected at an increased mass corresponding to the mass of one labeling substance.
  • +1 valent ions are detected at m / z 1141.6, 1170.6, 1179.6, 1189.6, and 1198.6 Th, respectively.
  • m / z at 571.3, 585.8, 590.3, 595.3, and 599.9 Th.
  • the original mass of the LISFYAGK peptide was 897.5 Da, with +1 and +2 ions (MH + , MH 2 2+ ) detected with one or two protons detected at 898.5 Th and 449.8 Th, respectively.
  • a labeling agent is bound to the peptide, the peptide is detected at an increased mass corresponding to the mass of each of two labeling substances.
  • the Val-, Gln-, His-, Phe-, and Arg-tags are combined, the +1 valent ions are detected at m / z 1328.9, 1386.9, 1404.9, 1424.9, and 1442.9 Th, respectively.
  • m / z at 654.9, 693.9, 703.0, 712.9, and 721.9 Th.
  • Tandem mass spectrometry was performed when LI-SFYAGR and LISFYAGK were combined with Val-, Gln-, His-, Phe-, and Arg-tag, respectively.
  • the peptide labeled with L MBIT and the peptide labeled with H MBIT were analyzed. The experiment was carried out by mixing at a ratio of 1: 1. The results are shown in FIGS. 18 to 21.
  • Fig. 18 is a tandem mass spectrometry obtained by resonance-excited collision-induced decomposition of ions having a +2 charge in a quadrupole ion trap of a mother ion having a labeling agent bound to peptide LISFYAGR having one amine at the N-terminus in a quadrupole ion trap. to be. Since only the N-terminus of the peptide is associated with the labeling agent, all y-type fragment ions are detected at a constant mass-to-charge ratio (m / z) regardless of the type of labeling agent. On the other hand, b-type fragment ions are detected by increasing the mass-to-charge ratio (m / z) depending on the type of lasing agent.
  • L y S and H y S ions that can be used as quantitative signals are detected at m / z 987 Th and 1000 Th, respectively, with +1 being charged.
  • y S ions are strongly detected.
  • Val-, Gln-, and Phe-tag although the signal strength is weak, it can be seen that y s quantitative signal ions are detected.
  • Figure 19 is a tandem mass spectrometry obtained by resonance-excited collision-induced decomposition of ions carrying a +1 charge in a quadrupole ion trap of a mother ion with a labeling agent bound to the peptide LISFYAGR having one amine at the N-terminus Indicates.
  • quantitative signal ions are detected, but are measured at very small signal strengths, and thus are not suitable for use in quantitative analysis.
  • FIG. 20 shows resonance excitation of a quadrupole ion trap in a quadrupole ion trap of ions having a labeling agent bound to a peptide LISFYAGK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains. Tandem mass spectrometry obtained by decomposing the derivative is shown. As shown in FIG. 8, since the labeling agent is bound to the N-terminal amine and the C-terminal lysine, respectively, the b-type and y-type fragment ions increase by a certain mass-to-charge ratio according to the type of labeling agent. Also detected can be confirmed.
  • the y S ion having a +1 charge is measured at a mass-to-charge ratio greater than -tag, and is detected in a region that is not disturbed by other sequence ions.
  • the signal strength is as strong as the other sequence ions, and the intensity ratio of [ L y S ]: [ H y S ] ions well suited to the mixing ratio of 1: 1.
  • FIG. 21 shows resonance excitation by selecting a positive ion in a quadrupole ion trap of a mother ion in which a labeling agent is bound to a peptide LISFYAGK having a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains. Tandem mass spectrometry obtained by decomposing the derivative is shown. As in the case of +2 experiments with mother ions, it can be seen that both b-type and y-type fragment ions are detected by a certain mass-to-charge ratio depending on the type of labeling agent. However, in particular, it can be seen that the +1 valence ions selected from the experimental results show that the positive S ions of +1 valence are very strong. In addition, it can be seen that the signal intensity ratio of [ L y S ]: [ H y S ] ions is also detected almost identical to the 1: 1 mixing ratio.
  • FIG. 22 and 23 are graphs showing the ratio of the intensity of y s quantitative signal which appears when tandem mass spectrometry of a model peptide labeled with a labeling agent is included in the total sum of the signal strengths of all fragment ions.
  • FIG. 10 shows the result of selecting and decomposing a mother ion having a +2 charge after being labeled with a labeling agent and electrospray ionization. Compared to the case of LISFYAGR combined with one labeling agent, it was confirmed that the intensity of quantitative signal ion y S is more than twice stronger than that of LISFYAGK with two labeling agents coupled to the N-terminus and the C-terminus.
  • FIG. 23 (a) and 23 (b) show the results of decomposition by selecting LISFYAGR and LISFYAGK, each of which is labeled with a labeling agent and electrospray ionized to have a +1 charge.
  • FIG. 23 (c) shows the ratio of the b s quantitative signal ion when the LISFYAGR +1 labeled with a labeling agent is detected in the MALDI-TOF / TOF equipment Shown. LISFYAGK combined with two labeling agents was not detected through the MALDI ionization method.
  • Fig. 24 shows resonance by selecting in the quadrupole ion trap an ion with a +2 charge among the mother ions in which the labeling agent is bound to the peptide LISFYAGK, which has a total of two amines, one each at the N-terminus and lysine side chains.
  • the MS 3 tandem mass spectrometry obtained by collision-derived decomposition by selecting the +1 valent y S ions generated by collision-derived decomposition in an ion trap again.
  • the quantitative analysis using y S is not limited in theory, but includes lysine, which is the best performance when using a peptide capable of binding two or more labeling agents as an analyte. It can be judged that.
  • the presence of lysine at the C-terminus of the peptide has the great advantage that the +1 valent y S ion can be detected without interfering with other fragment ions.
  • FIG. 25 is a diagram illustrating a standard quantitative analysis curve obtained by performing quantitative analysis on the intensity of L y S and H y S ions generated by tandem mass spectrometry of model peptides mixed at various ratios labeled with H MBIT and L MBIT .
  • the labeling agent used in the implementation was Gln-tag, and LISFYAGK was used as the model peptide. Results were obtained for peptide ions with +1 and +2 being charged, respectively.
  • the concentration of the peptide solution labeled with the labeling agent was maintained at about 5 ⁇ M regardless of the mixing ratio. As shown in FIG. 25, it was found that the quantitative analysis using y S ions showing strong signal strength showed a measurement ratio very well matched with the actual mixing ratio.
  • the mass difference of quantitative signal ions is 3 Da, and it is possible that H y S quantitative signal ions are interfered by the natural isotope pattern of L y S quantitative signal ions. have.
  • This problem can be overcome by using an ethyl group as the isotope coders R A and R C as the mass difference between quantitative signal ions becomes 5 Da. Tandem mass spectrometry was performed by binding Ethyl-tag to the model peptide.
  • FIGS. 26 and 27 The results of tandem mass spectrometry combined with Ethyl-tag in YGGFLK are shown in FIGS. 26 and 27. Tandem mass spectrometry of the Ethyl-tag bound to LISFYAGK is shown in FIG. 28.
  • FIG. 26 shows resonance by selecting a ion having a +1 charge in a quadrupole ion trap of a mother ion in which Ethyl-tag is bound to peptide YGGFLK having a total of two amines, one in the side chain of lysine at the N-terminus. Tandem mass spectrometry obtained by collision-derived decomposition is shown. 26 (a) and 26 (b) are the results of combining H MBIT and L MBIT in Ethyl-tag, respectively.
  • FIG. 27 shows the results of tandem mass spectrometry in which the L MBIT of Ethyl-tag and the H MBIT are bound to a peptide having a LISFYAGK sequence in a ratio of 2: 1.
  • two protein mixed samples (mixed samples A and B), in which three kinds of proteins are mixed at different ratios, were prepared and analyzed using Gln-tag. It was.
  • the bovine serum protein, myoglobin, and ubicutin of mixed sample A were prepared to be 2, 4, and 0.5 times the quantity respectively compared to the bovine serum protein, myoglobin, and ubicutin of mixed sample B. This was enzymatically digested with trypsin and labeled with L MBIT and H MBIT of Gln-tag and quantitatively analyzed by liquid phase chromatography and tandem mass spectrometry.
  • FIG. 28 (a) shows the ratio of [ H y S ]: [ L y S ] measured with respect to the liquid phase chromatography elution time of the detected peptide
  • FIG. 28 (b) shows the mass versus charge of the detected peptide.
  • the figure shows the ratio [ H y S ]: [ L y S ] measured for Harvey.

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Abstract

수소 동위원소를 활용함과 동시에 라벨링제의 합성 비용은 줄이면서도 한 번에 다중의 시료를 정량할 수 있는 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 라벨링제를 이용하여 서로 양이 다른 단백질 및 펩티드 분석체를 정량분석하는 방법을 제공하는 것으로, 라벨링제를 분석체에 결합시킨 후 탄뎀질량분석을 통해 라벨링제의 일부만이 떨어져 나가고 남은, 분석체를 포함하는 큰 질량의 y-타입 조각이온을 활용하여 정량분석을 수행하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

Description

라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법
본 발명은 라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 강한 정량 신호를 나타낼 수 있는 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중정량 동시 분석방법에 관한 것이다.
단백질과 펩티드의 동정과 정량분석에는 질량분석기술이 널리 이용되고 있다. 예를 들어 단백질을 효소로 분해하여 생기는 펩티드들을 말디 이온화법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 또는 전자 분무 이온화법(Electrospray Ionization, ESI)을 이용하여 이온화시킨 후 질량분석기기로 질량을 정확히 측정하고 유전자 서열이 주는 펩티드 정보와 비교하여 단백질의 정체를 밝혀내기도 하고, 좀 더 명확하게는 일부 펩티드들을 질량분석기기로 선택하여 기체와 충돌 분해를 시켜 생기는 조각이온으로부터 펩티드의 서열을 얻어 단백질의 정체를 밝히기도 한다.
단백질과 펩티드의 정량분석에는 동위원소를 포함하고 있는 화학 표지물을 분석 대상 단백질 또는 펩티드에 표지하여 질량을 분석하는 방법이 널리 사용되고 있다. 정량적으로 비교해야 하는 동일한 종류의 여러 단백질과 펩티드 시료에 동위원소가 서로 다르게 표지되어 있는 동일한 화학 표지물을 붙여 질량분석을 하면 동위원소의 질량 차이 때문에 질량분석 스펙트럼 또는 탄뎀 질량분석 스펙트럼 상에서 각 시료의 질량이 다르게 나타나게 되어 그 상대적 존재량를 비교함으로써 정량분석이 가능하게 된다.
상기 설명한 단백질 또는 펩티드의 동정과 정량분석을 동시에 수행하기 위하여 동중체 화학표지법이 이용되고 있다. 미국특허 공개번호 US 2005/0148087 및 국제특허 공개번호 WO 2005/068446 등에는, 펩티드에 붙여 충돌 분해시키면 탄뎀 질량분석 스펙트럼에서 정량신호가 나타나도록 고안된 동중체 화학 표지물을 개시하고 있다. 그러나 상기 문헌이 제시하는 라벨링제들은 탄소-13, 질소-15, 또는 산소-18 등의 동위원소를 사용하고 있어 다양한 동중체의 합성에 한계가 있으며 가격이 비싸다는 문제를 가진다. 또한, 기존에 개시된 동중체 표지시약을 이용한 정량분석은 폴 트랩(Paul trap), 선형이온트랩(Linear ion trap) 등과 같은 사중극자 이온트랩 질량분석기에서는 활용이 불가능하다. 이에, 수소의 치환이 다양하게 가능하며 상대적으로 가격이 저렴한 수소 동위원소를 이용하여 아미노산 서열과 단백질의 양을 동시에 확인할 수 있는 새로운 동중체 라벨링제가 요구된다.
한편, 사중극자 이온트랩 질량분석기는, 타 질량분석기에 비해 가격이 저렴하고 유지관리가 용이하고 사용이 편리하며 이온을 기체상에 포집하여 여러차례 탄뎀질량분석할 수 있는 능력을 가지고 있어 단백질 및 펩티드의 정체 규명에 널리 활용되어 왔다. 이에 따라, 단백질체 연구분야에 사중극자 이온트랩 질량분석기가 가장 널리 보급되어 운영되고 있다. 이 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석은, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 일반적으로 공명여기 충돌유래분해 (Resonant Excitation Collision-Induced Dissociation, RE-CID)라는 기술로 이루어진다. 이 경우 조각 이온의 질량대 전하비가 어미이온의 질량대 전하비의 약 1/3보다 작을 경우 이온 트랩 내에서 안정하게 포집되지 않아 검출되지 않으며, 이를 'low-mass cutoff' 효과라고 한다. 기존 기술들에 이용된 동중체 라벨링제들은 질량이 100-200 Da 정도로 작은 조각 이온을 정량신호로 사용하고 있어 사중극자 이온 트랩 질량분석기에서 low-mass cutoff 효과에 의해 정량신호이온이 검출되지 않는다는 문제가 있다. 나아가, 100-200 Da의 질량영역에서는 분석체인 단백질 또는 펩티드로부터 유도될 수 있는 작은 질량을 가지는 내부조각이온들이 정량신호이온을 방해할 가능성이 매우 커서 정확한 정량분석이 불가능한 경우도 있다.
따라서, 상술한 특허에 기재된 물질로는 낮은 질량을 가지는 조각이온만이 분석이 가능하므로, 사중극자 이온 트랩 질량분석기에서 사용할 수 없다는 결정적 한계를 가지고 있다. 이에 따라, 가장 널리 보급된 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 제한없이 활용이 가능한 동중체 표지물질과 이를 활용한 분석방법의 발명이 요구된다. 또한, 상기의 한계를 극복하기 위해서는 정량신호가 충분히 큰 질량을 가지는 조각이온으로 나타날 필요가 있다. 큰 질량을 가지는 조각이온의 경우 작은 질량의 조각이온에 비해 잡음신호에 방해받을 확률이 매우 낮으며, 사중극자 이온트랩에서 발생 가능한 low-mass cutoff에 제한을 받지도 않기 때문에 매우 활용가치가 높다.
한편, 본 발명자는 대한민국특허 출원번호 제2008-0070272호를 통하여, 수소 동위원소만을 이용하고 정량신호의 질량 조절이 가능하며 디펩티드 구조를 가진 MBIT(Mass-balanced isotope tag)라고 명명된 새로운 동중체 라벨링제를 제시한 바 있다. 또한, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159를 통하여, 질량조절기를 변형하여 동중체 라벨링제의 물성 및 정량신호질량을 다변화시킨 가변질량 라벨링제 및 라벨링제 세트를 제시한 바 있으며, 이를 활용한 다중 정량분석법으로 2종 이상의 라벨링제를 이용한 3개 이상 시료의 동시 다중 정량분석법인 multi 2-plex 정량법도 제시한 바 있다. 상기의 방법으로 쉽고 저렴한 동중체 라벨링제의 합성이 가능하고 다중의 시료도 정량할 수 있으나, multi 2-plex 정량법으로 다중 정량을 할 때에는 기준이 되는 시료의 소비가 많아지고 한 번에 분석해야 하는 시료의 전체 양도 증가하는 문제가 있다.
이에 본 발명자는, 수소 동위원소를 활용함과 동시에 라벨링제의 합성 비용은 줄이면서도 한 번에 다중의 시료를 정량할 수 있는 라벨링제를 연구하던 중, 새로운 화학구조를 통하여 이러한 목적이 달성됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 다중의 시료를 분석하는 경우, 정량신호의 세기가 약해지고 정량 정확도가 줄어드는 점을 종래 기술을 개선하여 탄뎀 질량분석시에 정량신호가 강하게 발생됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명자에 의해서 제시된 동중체 라벨링제를 사용하여 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 적용할 수 있는 분석방법을 연구하던 중, 큰 질량을 가지는 정량신호이온을 통하여 분석할 수 있는 방법을 확인하였으며, 이를 활용하여 사중극자 이온트랩 질량분석기를 포함하는 모든 질량분석기에서 펩티드 및 단백질의 상대적인 양을 정량할 수 있는 방법을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 수소 동위원소를 활용함과 동시에 라벨링제의 합성 비용은 줄이면서도 한 번에 다중의 시료를 정량할 수 있는 새로운 화학구조의 화합물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 화합물 또는 상기 조성물을 이용하여 두 종류 이상의 분석체를 동시에 정량분석할 수 있는 새로운 정량분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은, 수소 동위원소를 포함하는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시분석용 동중체 가변질량 라벨링제를 이뇽하여, 분석체보다 큰 질량값에서 검출되는 정량분석 신호로 정량분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2011006225-appb-I000001
상기 식에서,
R1은 C1-10 알킬 또는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000002
이고;
R2는 C1-10 알킬 또는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000003
이고;
R3는 아미노산 잔기의 측쇄이고;
R4는 하이드록시 또는 반응성 링커이고;
R5는 수소, C1-4 알킬 또는 C2-4 알키닐이고;
R6는 수소, C1-4 알킬 또는 C2-4 알키닐이고;
n과 m은 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고; 및
상기 R1 및 R2는 중수소를 포함하지 않거나, 또는 상기 R1 및 R2 중 적어도 하나는 중수소를 포함한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 일례를 도 1을 참조하여 설명한다. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 탄뎀 질량분석에 사용될 경우, 정량 신호를 나타내는 이온이 생기게 되며, 특히 R1 + 및 R1-NH+=CH-R3가 정량 신호를 나타내는 이온이 된다. 본 발명의 일실시예에 따르면 R1에 벤질기가 치환되는 경우, R1 +가 강한 정량신호를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
바람직하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 정량신호는 4-(1-프로피닐)벤질 양이온이다. R1에 중수소가 포함됨으로서 정량신호가 다르게 나타날 수 있으며, 일례로 정량신호는 129 Th(CH3C≡CC6H4CH2 +), 131 Th(CH3C≡CC6H4CD2 +), 132 Th(CD3C≡CC6H4CH2 +) 또는 134 Th(CD3C≡CC6H4CD2 +)가 가능하다.
바람직하게는 상기 화학식 1에서,
R1은 C6-9 알킬 또는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000004
이고,
R2는 C6-9 알킬 또는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000005
이고,
R5는 수소, 프로필 또는 프로프-1-이닐(prop-1-ynyl)이고;
R6는 수소, 프로필 또는 프로프-1-이닐(prop-1-ynyl)이고; 및
n과 m은 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이다.
보다 바람직하게는 상기 화학식 1에서,
R1은 옥틸이고; R2는 헵틸이다.
또한, 상기 화학식 1에서 R1과 R2는 종류가 같은 것이 바람직하며, 즉 R1은 C1-10 알킬이고, R2는 C1-10 알킬이거나; 또는 R1은
Figure PCTKR2011006225-appb-I000006
이고, R2는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000007
인 것이 바람직하다.
또한, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는,
각각 CH3C≡CC6H4CH2 및 CD3C≡CC6H4CD2CH2이거나;
각각 CH3C≡CC6H4CD2 및 CD3C≡CC6H4CH2CH2이거나;
각각 CD3C≡CC6H4CH2 및 CH3C≡CC6H4CD2CH2이거나; 또는
각각 CD3C≡CC6H4CD2 및 CH3C≡CC6H4CH2CH2인 것이 바람직하다.
상기 화학식 1에서, R3는 아미노산의 잔기의 측쇄이며, 이는 화학식 1이 아미노산의 아민기에 R1 및 R2가 치환된 구조를 가지는 것에 기인한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신 또는 트립토판을 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산의 잔기의 측쇄"란, 아미노산의 구조 중 NH2CH2COOH를 제외한 나머지 구조, 즉 NH2CH2COOH의 CH2에 치환된 기를 의미한다. 예컨대, 글리신의 경우 글리신의 잔기의 측쇄는 수소를 의미하고, 세린의 경우 세린의 잔기의 측쇄는 하이드록시메틸을 의미한다. 상기 화학식 1의 제조과정에서, 상기 R3를 아미노산의 종류에 따라 자유롭게 조절이 가능하며, 이에 따라 정량신호의 조절 또한 가능하다.
상기 화학식 1에서, R4는 하이드록시 또는 반응성 링커이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "반응성 링커"란, 상기 화학식 1의 화합물과 분석체가 결합될 수 있도록 하는 반응기를 의미한다. 본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물을 단백질 또는 펩티드의 분석에 사용하는 경우, 단백질 또는 펩티드에 존재하는 아민기 또는 하이드록시기와 반응할 수 있는 반응기가 바람직하다. 일례로, 숙신이미드-N-옥시, 3-설포숙신이미드-N-옥시, 벤조트리아졸-1-일옥시, 펜타할로벤질옥시, 4-니트로페녹시 또는 2-니트로페녹시일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, R4가 하이드록시인 경우에는 상기 화학식 1이 전체적으로 카르복시기를 가진 화합물이므로, 카르복시기를 반응성 링커가 치환된 카보닐기로 만들 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중 바람직한 화합물의 예는 하기와 같다:
1) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산;
2) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)페닐)프로판아미도-3,3-d 2)아세트 산;
3) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질-1,1-d 2)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)페닐)프로판아미도)아세트 산;
4) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도-3,3-d 2)아세트 산;
5) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)벤질-1,1-d 2)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산;
6) 2-(N-(4-프로필벤질)-2-(4-프로필페닐)아세트아미도)아세트 산;
7) 2-(5-페닐-N-(3-페닐프로필)펜탄아미도)아세트 산; 및
8) 2-(N-옥틸옥탄아미도)아세트 산.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "두 종류 이상"이란, 서로의 화학구조가 동일하지 않은 화합물이 두 종류 이상 포함된 것을 의미하며, 바람직하게는 2 내지 4 종류의 화합물을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 중수소와 수소의 치환여부에 대해서만 화학구조가 동일하지 않은 화합물을 두 종류 이상 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 두 종류 이상의 화합물은 서로 중수소의 수가 동일한 것이 바람직하다. 서로의 화학구조가 동일하지 않으면서도, 서로 중수소의 수는 동일하기 때문에, 정량신호를 나타내는 이온의 질량 차이가 생기므로 질량분석 스펙트럼 또는 탄뎀 질량분석 스펙트럼 상에서 각 시료의 질량이 다르게 나타나게 되어 그 상대적 존재량을 비교 분석하여 정량분석이 가능하다.
상기 조성물의 일례로는, 하기 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 들 수 있다:
1) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)페닐)프로판아미도-3,3-d 2)아세트 산;
2) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질-1,1-d 2)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)페닐)프로판아미도)아세트 산;
3) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도-3,3-d 2)아세트 산; 및
4) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3)벤질-1,1-d 2)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물을 이용하여 분석체를 정량분석하는 방법을 제공한다. 분석체를 정량분석 하기 위해서는 상기 화합물을 분석체에 결합시켜야 하며, 상기 화합물과 분석체의 결합은 링커가 분석체의 아민과 반응하며 리빙그룹으로 작용하여 분리되면서 이루어진다.
상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분석체는 핵산 또는 핵산 유도체인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분석체는 스테로이드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물을 분석체에 결합시키는 단계; 및 상기 분석체를 분해하여 상기 분석체를 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법을 제공한다.
상기 정량을 위한 분해법은 탄뎀 질량분석법인 것이 바람직하다. 상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 R1 + 또는 R1NH+=CHR3의 내부조각이며, 바람직한 양태로서, 상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 4-(1-프로피닐)벤질 양이온이다.
바람직하게는, 상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 129 Th(CH3C≡CC6H4CH2 +), 131 Th(CH3C≡CC6H4CD2 +), 132 Th(CD3C≡CC6H4CH2 +) 또는 134 Th(CD3C≡CC6H4CD2 +)이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하며, 구체적인 제조방법을 도 3 내지 도 5를 참조하여 설명한다.
도 3에 기재된 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 할로알칸 형태의 reporter unit과 카복시산 형태의 balance unit 및 에스테르화된 아미노산을 사용하여 합성된다.
또한, 중수소를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, reporter unit과 balance unit에 중수소를 도입하는 반응을 진행한 후 이를 이용하여 제조할 수 있다. 중수소를 도입하는 방법은 본 발명이 속하는 분야에 알려진 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 도 2에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 하나의 중수소를 도입하는 방법에는 염기성의 중수(D2O)에서 말단 알킨의 수소를 중수소로 치환하는 방법과 하나의 카보닐기를 중수소화붕소나트륨(NaBD4) 또는 중수소화알루미늄리튬(LiAlD4)으로 부분적으로 환원시키는 방법이 있다. 두 개의 중수소를 도입하는 방법에는 알켄을 금속 촉매 하에서 중수소 기체(D2)로 환원하는 방법과 펩티드 결합이나 에스테르 결합의 카보닐기를 LiAlD4로 환원하는 방법과 메톡사이드나트륨(NaOCD3)를 사용하여 에스테르 화합물의 알파 위치에 중수소를 도입하는 방법이 있다. 세 개의 중수소는 요오드화메탄-d 3 (CD3I)를 사용하여 2차 아민이나 말단 알킨을 알킬화 시키는 방법으로 도입할 수 있다. 네 개의 중수소를 도입하는 방법에는 두 개의 카보닐기를 LiAlD4를 사용하여 환원하는 방법과 알킨을 금속 촉매 하에서 D2로 환원하는 방법이 있다. 이들 방법 중에서 본 발명에서는, 일 실시예로, 에스테르 결합의 카보닐기를 LiAlD4로 환원시켜서 2개의 중수소를 도입하는 방법과 알킨을 CD3I로 알킬화하여 3개의 중수소를 도입하는 방법을 조합하여 4중의 동중체 라벨링제(도 1(b), tag a)를 합성하였다.
본 발명에서는, 일례로 reporter unit을 먼저 합성하고, 합성된 reporter unit의 일부를 3 단계의 추가 반응으로 변형하여 balance unit을 합성하였으며, 구체적인 Reporter unit 및 balance unit의 제조방법은 도 4를 참조하여 설명한다.
먼저, Reporter unit의 합성 방법은 다음과 같다.
팔라듐 촉매와 요오드화제일구리를 사용한 소노가시라 결합법(Sonogashira coupling)을 통해서 4-브로모벤조산 메틸 에스테르에 트리메틸실릴(TMS)로 보호된 알킨을 도입한다. 이어서 에스테르를 알코올로 환원시킨다. 이 때 수소화알루미늄리튬(LiAlH4) 또는 중수소화알루미늄리튬(LiAlD4)을 사용하면 각각의 경우에 수소 또는 중수소가 두 개씩 치환된 화합물이 생성된다.
생성된 알코올을 염화 tert-부틸디메틸실란(TBSCl)으로 처리하여 tert-부틸디메틸실란(TBS)으로 보호하고, 탄산칼륨을 이용하여 알킨을 보호하고 있는 TMS만 선택적으로 제거한다. 이렇게 생성된 말단 알킨에 요오드화메탄-d 0 (CH3I) 또는 -d 3 (CD3I)를 사용하여 메틸-d 0 또는 -d 3 를 도입한다. 이어서 불화 테트라-n-부틸암모늄(TBAF)을 사용하여 TBS를 제거한다.
생성된 화합물에 염화 메탄술폰산을 처리하고 요오드화나트륨을 사용하여 요오드로 치환하면 reporter unit이 합성된다. 반응 중간에 LiAlH4/LiAlD4와 CH3I/CD3I의 조합에 따라서 총 네 종류의 reporter unit이 얻어진다. LiAlH4과 CH3I를 사용하면 중수소가 없는 reporter-d 0 가 생성되고, LiAlD4와 CH3I를 사용하면 두 개의 중수소가 포함된 reporter-d 2 가 생성되며, LiAlH4와 CD3I를 사용하면 세 개의 중수소가 포함된 reporter-d 3 가 생성되며, LiAlD4와 CD3I를 사용하면 다섯 개의 중수소가 포함된 reporter-d 5 가 생성된다.
다음으로, Balance unit의 합성 방법은 다음과 같다.
합성된 reporter unit의 일부를 사용하여 말론산 디에틸을 알킬화한다. 환류(reflux)를 통하여 말론산의 카르복실기 하나를 제거한 후, 수산화나트륨 수용액으로 에틸 에스테르를 가수분해하여 balance unit을 합성한다. Reporter unit을 balance unit으로 변형하는 과정에는 중수소를 사용하지 않으므로, balance unit의 중수소의 수는 사용한 reporter unit에 의해서 결정된다.
상기와 같이 제조된 reporter unit과 balance unit을 이용하여 중수소를 포함하는 화학식 1로 표시되는 화합물을 도 3에 기재된 방법으로 제조할 수 있으며, 이 때 reporter unit과 balance unit에 포함된 중수소의 전체 수를 유지한다. 즉, 도 6과 같이 4중 동중체 라벨링제 tag α를 예로 들면, reporter-d n 을 사용한 경우에는 balance unit은 5-n개의 중수소가 포함된 것(balance-d 5-n )을 사용하여 동중체를 합성한다. 글리신 메틸 에스테르의 아민을 reporter-d n (n = 0, 2, 3, 및 5)으로 알킬화 한다. 합성된 화합물과 balance-d 5-n 을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)를 사용하여 결합 반응을 진행하고, 수산화나트륨 수용액으로 메틸 에스테르를 가수분해하면 정량신호의 질량값이 129+n인 산형의 동중체 라벨링제 tag α129+n가 얻어진다. 또한 상기와 유사한 방법으로 도 5와 같이, tag β를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 라벨링제를 분석체와 결합하는 단계(단계 1); 상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계(단계 2); 및 상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온을 정량하는 단계(단계 3)을 포함하는 분석체의 정량방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2011006225-appb-I000008
또는
Figure PCTKR2011006225-appb-I000009
상기 식에서,
RA는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RB는 질량조절기이고,
RC는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
Linker는 분석체와 결합을 유도하는 반응성 링커이고,
RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함한다.
상기 단계 1은, 상기 화학식 2로 표시되는 라벨링제를 분석체와 결합시키는 단계로서, 분석체에 라벨링제를 결합시켜 이후 정량분석에 이용하기 위한 단계이다. 상기 결합은 라벨링제의 Linker와 분석체의 아민기가 반응하여 결합되는 것이다. 결합 방법은 대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159에 기재된 바와 같으며, 당업계에 알려진 아민기와 Linker의 결합 반응으로 결합시킬 수 있다. 분석체에 여러개의 아민기가 2이상인 경우에는 상기 화학식 2로 표시되는 라벨링제가 2이상 결합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "라벨링제"란, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미하며, 상기 화합물은 대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479호, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159에 기재된 바와 같으며, 상기 특허문헌은 본 발명의 참조로서 포함된다.
구체적으로, 본 발명에서 사용되는 용어 "Linker"는, 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 활성 에스테르인 것을 의미한다. 상기 아민은 1차 아민인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "상기 질량조절기(RB)"는, 분석체와 결합한 후 질량분석과정에서 분해될 때, N-아실화된 아미노산 단편의 질량을 조절하여 정량 신호가 스펙트럼상에서 다른 단편들과 겹치지 않게 하기 위해서 도입되는 것을 의미한다. RB의 종류를 바꿈으로써, 정량신호의 질량을 다양하게 변화시킬 수 있다. 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나일 수 있다. 또한, 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성을 지닌 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 질량조절기는 C1-18의 직쇄 또는 가지쇄의 알킬일 수 있으며, 일례로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 또는 옥틸 등의 직쇄 또는 가지쇄의 알킬일 수 있다.
상기 RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 중수소를 포함하며, 동위원소의 질량차에 의한 정량분석을 가능하도록 하는 역할을 한다. 바람직하게는, 상기 RA 및 RC는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸이거나, 또는 상기 RA 및 RC는 각각 에틸이고, RA 및 RC 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 RA 및 RC는 탄소의 개수가 동일한 알킬로 이루어져 있으나, 포함된 중수소의 수가 서로 달라야 한다. 이러한 관점에서, 상기 RA와 RC는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 것이 바람직하다. 즉, 상기 화합물에서 RA와 RC는, RA가 CH3이면 RC는 CD3이고, RC가 CH3이면 RA가 CD3이다. 또는, 상기 RA 및 RC는, 각각 C2H5 및 C2D5이거나, 또는 각각 C2D5 및 C2H5인 것이 바람직하다. 즉, 상기 화합물에서 RA와 RC는, RA가 C2H5이면 RC는 C2D5이고, RC가 C2H5이면 RA가 C2D5이다.
상기 화학식 2는 N-말단이 아실화되고 C-말단에 아민의 친핵성 공격에 리빙그룹이 되는 링커가 부착되고 동위원소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 디펩티드는 중수소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 "라벨링제"의 화학구조 및 분석원리를 도 13 내지 도 15를 참조하여 설명한다.
도 13은 라벨링제의 화학구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 특허출원(대한민국특허 공개번호 제2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제2010-0009479, 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159)에서 개시된 화합물을 "MBIT"로 명명하였고, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, N-말단이 아실화되고 C-말단에 링커가 부착된 디펩티드의 구조를 지닌다.
도 14는, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 펩티드 및 단백질에서 MBIT물질이 결합하는 모습을 도식적으로 나타낸 그림이다. 펩티드 및 단백질의 N-말단의 1차 아민 뿐 아니라, 리신 측쇄의 1차 아민과도 결합이 일어날 수 있다. 그러므로 하나의 펩티드 또는 단백질에 라벨링제를 결합시킬 때, 단백질 및 펩티드가 포함하는 리신의 개수에 따라 2개 이상의 라벨링제가 다중 결합될 수 있다. 분석체가 꼭 단백질이나 펩티드가 아니더라도, 분석체가 가지고 있는 1차 또는 2차 아민의 개수만큼의 라벨링제가 최대로 분석체와 결합할 수 있다.
특히 본 발명은, RA 및 RC에 포함된 총 중수소의 수가 일정한 상기 화학식 2로 표현되는 화합물을 두 종류 이상, 바람직하게는 두 종류를 하나의 세트로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세트를 구성하는 화합물 쌍을 각각 제1화합물과 제2화합물이라고 할 때, 상기 제1화합물과 제2화합물은 동일한 질량조절기(RB)를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 화합물 쌍에서, 제1화합물의 RA 및 RC 중 하나가 다른 하나에 비해 많은 수의 중수소를 포함하고 있다면, 제2화합물에서는 제1화합물의 RC를 RA로 가지고, 제1화합물의 RA를 RC로 가지는 것이 바람직하다. 일례로, 화합물 쌍에서 제1화합물의 RA 및 RC가 각각 CH3, CD3인 경우, 제2화합물의 RA 및 RC는 CD3, CH3로 구성되는 화합물의 쌍을 들 수 있다. 또는, 화합물 쌍에서 제1화합물의 RA 및 RC가 각각 C2H5, C2D5인 경우, 제2화합물의 RA 및 RC는 C2D5, C2H5로 구성되는 화합물의 쌍을 들 수 있다. 특히, 본 발명은 yS 이온을 이용하여 정량하기 위하여, 제1화합물과 제2화합물 중 하나의 RC에만 중수소를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 라벨링제 세트의 제1화합물과 제2화합물로 각각 구분 표지된 분석체를 탄뎀질량분석하였을 때, RA 및 RC가 분리되도록 라벨링제가 분해될 경우 분해를 통해 생성된 조각이온은 RA 및 RC에서 차이가 나는 중수소의 질량만큼의 차이를 보이며 이의 결과가 탄뎀질량분석 스펙트럼에 나타나게 된다. 이들의 상대적인 세기를 비교하여 분석체의 상대적인 양을 정량할 수 있다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 일반적으로 탄뎀질량분석 과정에서 분리되어 생성되는 서로 다른 상보적인 두 개의 조각이온이 각각 독립적인 정량분석신호로 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "분석체"는, 본 발명에 따른 라벨링제에 의하여 분석되는 물질을 의미한다. 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질일 수 있으며, 또한 펩티드, 핵산 또는 핵산 유도체, 또는 스테로이드일 수 있다.
상기 단계 2는, 상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계로서, 결합체에 존재하는 아미드 결합이 깨지면서 조각이온을 생성시키는 단계이다.
본 발명의 결합체의 아미드 결합이 깨지면서 생성될 수 있는 조각이온 중에서, RA 및 RB를 포함하는 조각이온 및 RC와 분석체를 포함하는 조각이온이 생성될 수 있다. 본 발명에서 RA 및 RB를 포함하는 조각이온을 'bS 이온'으로 명명하고, RC와 분석체를 포함하는 조각이온을 'yS 이온'이라 명명하기로 한다. 이를 도 15 및 도 16를 참조하여 설명한다.
도 15는, 결합체가 탄뎀질량분석 과정에서 분해되었을 때 생성되는 조각이온들을 도시한 그림이다. 이 때 동일한 분자식에 중수소가 표지된 부위만 다른 MBIT 시약 쌍을 편의에 의하여 HMBIT과 LMBIT으로 구분하는데, RA 또는 RB에 중수소가 표지된 것을 HMBIT, RC에 중수소가 표지된 것을 LMBIT으로 부른다. HMBIT과 LMBIT이 결합된 분석체는 전체적인 무게는 동일하다.
동위원소 암호화기로 선택된 두 개 중에 중수소를 포함하는 것과 그렇지 않은 것의 좌측 상단에 각각 H(중수소 포함)와 L(중수소 미포함)을 첨자로 표기하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 결합체는 탄뎀질량분석 과정에서 디펩티드의 두 아미노산 사이의 아미드 결합이 깨지면서 RA와 RB를 포함하는 조각이온(bS)과 RC와 분석체를 포함하는 조각이온(yS)으로 분리될 수 있다. 분석체에서 화학식 2에 해당하는 부분만 떨어져 나간 조각 이온을 -tag이라 명명한다.
도 16은, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 2개 이상의 화학식 2의 화합물과 결합한 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 이론적으로 생성될 수 있는 탄뎀질량분석 스펙트럼을 도시하고 있다. 도 16에 도시된 바와 같이, 펩티드의 N-말단 및 C-말단의 아미노산을 포함하여 2개 이상의 아민기와 화학식 2의 화합물이 결합한 경우, 펩티드로부터 생성 가능한 모든 b- 및 y-타입 서열 이온들의 질량은 -tag의 질량보다 작은 질량값을 가지게 된다. 따라서, -tag보다 질량이 큰 yS이온은 이론적으로 펩티드로부터 유도되는 다른 조각 이온들의 방해를 전혀 받지 않는 질량범위에서 나타나게 된다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 가장 널리 활용되고 있는 단백질 분해 효소인 트립신 또는 LysC를 이용하여 단백질을 효소분해하게 되면 C-말단에 리신을 포함하고 있는 펩티드를 얻을 수 있기 때문에, N-말단의 아민기와 C-말단 리신 측쇄의 아민기에 2개의 화학식 2의 화합물을 결합시킬 수 있다.
상기 단계 3은, 상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온(yS)을 정량하는 단계로서, 큰 질량을 가지는 조각이온으로 분석체를 분석하기 위한 단계이다.
yS 정량신호의 질량값은 어미이온의 질량값의 1/3 이상이기 때문에, 이온트랩 질량분석기에서 공명여기 충돌유래 분해법을 이용하여 탄뎀질량분석을 하는 경우에도 low-mass cutoff와 무관하게 yS이온의 검출이 가능하다. 따라서, 작은 질량값을 가지는 정량신호를 활용하는 기존의 다른 동중체 표지와는 달리, 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 yS 정량신호를 활용한 정량분석을 수행할 수 있다는 특징이 있다.
상기 분석방법에 따른 본 발명의 일실시예에 따르면, 화학식 2의 화합물을 이용하여 큰 질량값을 가지는 yS 조각이온으로 정량분석이 가능하다는 것을 확인할 수 있다. 특히, 분석체 자체보다 큰 질량을 가지는 조각이온을 활용하기 때문에, 사중극자 이온트랩 질량분석기에서도 정량분석이 가능하며, 또한 신호의 세기도 증폭되는바, 기존에 화학식 2의 화합물을 이용한 분석보다 보다 효과적인 분석이 가능하다.
본 발명은 수소 동위원소를 포함하면서, 정량신호의 세기를 강하게 나타낼 수 있고, 둘 이상의 단백질을 동시에 정량분석할 수 있는 새로운 화합물, 및 상기 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 라벨링제 또는 조성물을 이용하여 아미노산 서열을 분석하고 동시에 단백질의 양을 정량분석하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 동중체 라벨링제를 활용하여, 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 정량분석하는 새로운 방법을 제공할 수 있다. 기존의 다른 동중체 표지시약의 경우 표지물질을 분석체와 결합시킨 다음 탄뎀질량분석으로 표지물질 중간의 결합을 분해시킨 후 분석체를 포함하지 않는 작은 질량의 조각이온을 활용하여 정량분석을 수행하는 것인 반면, 본 발명은 동중체 라벨링제를 활용하여 표지물질의 결합이 탄뎀질량분석 과정에서 분해된 후 조각이온들 중 분석체를 포함하고 큰 질량값을 가지는 조각이온(yS)을 활용하여 정량분석을 수행할 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라, 기존의 작은 질량값을 가지는 정량신호이온을 활용하는 경우에 비하여 최대 5배 이상 강한 신호세기로 정량분석이 가능하며, 사중극자 이온트랩 질량분석기를 포함하는 모든 질량분석기에서 펩티드 및 단백질의 상대적인 양을 정량할 수 있다.
도 1은, 본 발명에 따른 화합물의 구조를 나타낸다. 도 1(a)는 본 발명의 화합물의 대표 구조 및 화합물에서 생성되는 정량신호의 구조를 나타낸다. 도 1(b) 내지 1(d)는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 네 가지 구조를 나타낸 것이다. 도 1(b)는 수소 동위원소를 이용하여 다중 동중체로 합성된 구조이며, 여기서 각각의 X1-X4는 선택적으로 수소 동위원소로 치환되는 위치를 나타낸다.
도 2는, 본 발명에 따른 화합물을, 수소 동위원소를 사용하여 동중체 라벨링제로 제조하기 위하여, 활용가능한 대표적인 중수소 첨가 및 치환 반응을 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 화합물의 합성 과정을 나타낸 것이다. 할로알칸 형태의 reporter unit(R1-Br)과 카복시산 형태의 balance unit(R2-COOH) 및 에스테르화된 아미노산을 사용하여 합성된다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른 화합물(tag α)의 합성에 필요한 reporter unit과 balance unit을 중수소 첨가 및 치환 반응을 사용하여 합성하는 과정을 나타낸 것이다. Balance unit은 reporter unit의 변형을 통해 합성한다. 두 가지의 중수소 도입 방법(에스테르 결합의 카보닐기를 LiAlD4로 환원시켜서 2개의 중수소를 도입하는 방법과 알킨을 CD3I로 알킬화하여 3 개의 중수소를 도입하는 방법)을 조합해서 reporter 및 balance unit을 각각 네 종류씩 합성한다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른 화합물(tag β)의 합성에 필요한 reporter unit과 balance unit을 합성하는 과정을 나타낸 것이다. Balance unit은 reporter unit의 변형을 통해 합성한다.
도 6은, 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 구조를 나타낸 것이다. n개의 중수소를 포함한 reporter-d n , 5-n개의 중수소를 포함한 balance-d 5-n 및 글리신을 사용하여 합성한 것으로, tag αm은 정량신호의 질량값이 m인 tag α를 의미한다.
도 7은, 본 발명에 따른 화합물의 활성화 방법의 일실시예를 나타낸 것으로, 화합물을 숙신이미딜 에스테르로 활성화하고 펩티드에 결합하는 방법을 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일실시예의 화합물과 결합된 모델 펩티드(DRVYIHPF)의 탄뎀 질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 8(a) 내지 8(d)는 다중 동중체(tag α129-α134)를 사용한 결과이며, 도 8(e) 내지 8(g)는 비동중체(tag β-δ)를 사용한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일실시예의 화합물에서 생성되는 정량신호(벤질 양이온과 이미늄 양이온)의 상대적 세기를 나타낸 것이다. 정량신호의 세기는 모델 펩티드로부터 생성된 히스티딘 임모늄 이온(110 Th)의 세기에 대하여 상대적인 값으로 표시하였다.
도 10은, 본 발명의 일실시예의 다중 동중체로 표지된 모델 펩티드들를 일정 비율로 섞어서 탄뎀 질량분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 10(a)는 다중 동중체로 표지된 펩티드를 2:1:2:1(tag α129:α131:α132:α134)의 비율로 섞은 시료의 결과를 나타낸 것이고, 도 10(b)는 1:2:1:2(tag α129:α131:α132:α134)의 비율로 섞은 시료의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은, 다중 동중체(tag α129-α134)를 이용해서 측정할 수 있는 펩티드의 양 또는 농도 범위를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 다중 동중체로 표지된 tryptic BSA(소 혈청 알부민, bovine serum albumin) 중에서 FGER, VASLR 및 SEIAHR을 탄뎀 질량분석한 결과를 나타낸 것으로, tag α129와 tag α131로 표지된 펩티드들을 3:1의 비율로 섞고 전체 단백질의 양을 4.2 피코몰에서 13 펨토몰까지 변화시킨 다음, 탄뎀 질량분석한 결과이다. 각 농도에서 관측되는 어미 이온의 세기를 도 11(a)에 나타내었고, 탄뎀 질량분석으로 측정된 정량신호의 비율은 도 11(b)에 나타내었다.
도 12는, 액체 크로마토그래피(LC)와 MALDI 질량분석기를 연동하여 다중 동중체로 표지된 tryptic BSA를 정량분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 12(a)는 각 펩티드들이 LC에서 용출된 시간에 따라 MALDI 질량분석기로 관측된 어미 이온의 세기를 나타낸 것이며, 도 12(b)는 각 펩티드들에서 측정된 정량신호의 양을 tag α129의 정량신호의 양과 비교해서 나타낸 것이다. 동중체로 표지된 tryptic BSA 중에서 6 가지의 펩티드(FGER, VASLR, QEPER, AWSVAR, SEIAHR 및 YLYEIAR)로부터 얻은 결과이다.
도 13은, 본 발명의 라벨링제의 화학구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 14는, 본 발명의 라벨링제가 펩티드 및 단백질에 결합하는 반응을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 15는, 분석체의 아민과 결합한 라벨링제가 탄뎀질량분석 과정에서 분해되었을 때 생성될 수 있는 조각이온들의 종류를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 16은, 2개 이상의 라벨링제와 결합한 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 이론적으로 생성될 수 있는 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 17은, 모델 펩티드 2종과 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제를 결합시킨 후 각각을 전자분무(ESI) 질량분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 19는, N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 20은, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 21은, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 22는, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR(도 10(a))과 LISFYAGK(도 10(b))의 +2가 전하를 띠는 어미이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다.
도 23은, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드LISFYAG(도 11(a))과 LISFYAGK(도 11(b))의 +1가 전하를 띠는 어미이온(MH+)을 사중극자 이온트랩에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 것이다. 도 11(c)는, 본 발명의 일실시예에 따른 라벨링제로 표지된 모델 펩티드 LISFYAGR의 +1가 전하를 띠는 어미이온을 MALDI 이온화법으로 생성하여 TOF/TOF 장비에서 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 bS 정량신호의 세기비를 나타낸 도면이다.
도 24(a)는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 Val-tag이 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온(MH2 2+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 MS2 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 24(b)는 MS2 탄뎀질량분석에서 생성된 LyS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 25는, Gln-tag의 HMBIT과 LMBIT으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 모델펩티드 LISFYAGK를 탄뎀질량분석하여 생성된 LyS 및 HyS이온의 신호 세기비로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 것이다.
도 26(a)와 26(b)는, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 YGGFLK에 Ethyl-tag 중 HMBIT(도 26(a)) 또는 LMBIT(도 26(b))이 결합된 어미이온 중 +1전하를 띄는 이온(MH+)을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 MS2 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 26(c)와 26(d)는 도 26(a)와 26(b)에서 yS 정량신호이온이 나오는 범위를 확대하여 도시한 도면이다.
도 27은, N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 Ethyl-tag이 결합된 어미이온 중 +1전하를 띄는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 MS2 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것으로, Ethyl-tag의 LMBIT에 결합된 펩티드와 HMBIT에 결합된 펩티드를 2:1의 비율로 혼합하여 탄뎀질량분석한 스펙트럼을 도시한 도면이다.
이하, 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 화합물과, 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명이 후술하는 내용에 제한되는 것은 아니며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
실시예 1
도 1(a)로 대표되는 화합물(라벨링제)에서 R1, R2, 및 R3 위치에 다양한 구조 또는 작용기를 도입할 수 있다. 본 발명에서는, 실시예로 도 1(b) 내지 도 1(e)에 나타난 바와 같이, 네 가지 구조를 갖는 화합물(tag α-δ)을 합성하고 각 구조 또는 작용기에 따라서 정량신호가 어떻게 나타나는지 확인하였다.
네 가지 구조 중에서 도 1(b)는 수소 동위원소를 이용하여 다중의 단백질을 정량할 수 있는 동중체 라벨링제로 합성한 예이다. 도 1(b)의 X1 내지 X4는 치환된 중수소의 위치를 나타낸다.
실시예 1-1) 비동중체 라벨링제의 합성
라벨링제는 도 3에 기재된 바와 같은 순서로 합성하였다. 비동중체 라벨링제 중에서 reporter unit과 balance unit을 상업적으로 구할 수 있는 tag γ와 δ의 경우는 각 unit(γ의 reporter unit, 3-아이오도프로필 벤젠; δ의 reporter unit, 1-아이오도옥탄; γ의 balance unit, 5-페닐펜탄산; 및 δ의 balance unit, 옥탄산)을 구입하여 각 라벨링제 합성을 진행하였으며, tag β의 경우는 라벨링제를 구성하는 reporter unit(1-(아이오도메틸)-4-프로필벤젠)과 balance unit(2-(4-프로필페닐)아세트산)은 도 5의 과정으로 합성하고 이들을 사용하여 tag β를 합성하였다.
tag β의 합성
먼저, reporter unit을 합성한 과정 및 각 단계에서 생성된 화합물들의 핵자기공명(NMR) 결과들을 하기 단계 1 내지 8에 나타내었다.
단계 1 : 4-((트리메틸실릴)에티닐)벤조산 메틸 에스테르의 합성
아르곤 조건 하에서 10 mL의 잘 건조된 테트라히드로퓨란(dry THF)에 4-브로모벤조산 메틸 에스테르(500 mg, 2.33 mmol), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐디클로라이드(Pd(PPh3)2Cl2; 86.1 mg, 0.116 mmol), 트리페닐포스핀(PPh3; 18.3 mg, 0.0698 mmol), 트리메틸실릴아세틸렌(TMS acetylene; 493 μL, 3.49 mmol), 트리에틸아민(Et3N; 486 μL, 3.49 mmol)을 녹인 후, 20분 동안 실온에서 교반하였다. 여기에 다시 요오드화제일구리(CuI; 8.86 mg, 0.0465 mmol)를 가하고 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 용매를 감압 증류로 제거한 후, n-펜탄 20 mL를 넣어주고 셀라이트(Celite) 패드로 필터하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하여 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 503 mg(2.16 mmol, 93%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H).
단계 2 : (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 4-((트리메틸실릴)에티닐)벤조산 메틸 에스테르(316 mg, 1.36 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 LiAlH4(2.04 mL, 1.0 M THF 용액, 2.04 mmol)를 천천히 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면, 차례로 물 77 μL, 10% 수산화나트륨 수용액 154 μL, 물 231 μL를 가하여 반응을 종결시켰다. 흰색 점성 침전이 생성되면 실리카 패드로 필터하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 258 mg(1.26 mmol, 93%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H).
단계 3 : tert -부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올(258 mg, 1.26 mmol)을 녹인 후, 0℃로 냉각하고 이미다졸(103 mg, 1.52 mmol)과 dry THF 3 mL에 녹인 TBSCl(228 mg, 1.52 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 15시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(10 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 383 mg(1.20 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 4 : tert -부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란의 합성
아르곤 조건 하에서 메탄올 4 mL에 tert-부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란(383 mg, 2.40 mmol)과 탄산칼륨(332 mg, 2.40 mmol)을 녹인 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 280 mg(1.14 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H).
단계 5 : tert -부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란(247 mg, 1.00 mmol)을 녹인 후, -78℃로 냉각하고 n-부틸리튬(805 μL, 2.49 M n-헥산 용액, 2.00 mmol)을 천천히 가하였다. 20분 동안 -78℃에서 교반한 후 여기에 다시 요오드화메탄(313 μL, 5.00 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축시켜 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 253 mg(0.971 mmol, 97%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
단계 6 : tert -부틸디메틸((4-프로필벤질)옥시)실란의 합성
에틸 아세테이트 20 mL에 tert-부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란(252 mg, 0.968 mmol)을 녹인 후, 20 bar의 수소 압력을 가지는 H-Cube 장비에 10% Pd/C 카트리지를 장착하고 실온에서 분당 0.5 mL의 속도로 통과시켰다. 통과된 용액을 감압 증류로 농축시켜 목적화합물을 251 mg(0.949 mmol, 98%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.12 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.69 (s, 2H), 2.26 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.65-1.58 (m, 2H), 0.94-0.85 (m, 12H), 0.08 (s, 6H).
단계 7 : (4-프로필페닐)메탄올의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸디메틸((4-프로필벤질)옥시)실란(275 mg, 1.04 mmol)을 녹인 후, 불화-n-부틸암모늄(TBAF; 1.56 mL, 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액, 1.56 mmol)을 천천히 가하고 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 198 mg(0.838 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.25 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.57 (s, 2H), 2.97 (s, 1H), 2.62 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.74-1.62 (m, 2H), 0.99 (t, 3H, J = 7.4 Hz).
단계 8 : 1-(아이오도메틸)-4-프로필벤젠의 합성
잘 건조된 디클로로메탄(DCM) 3 mL에 아르곤 조건 하에서 (4-프로필페닐)메탄올(100 mg, 0.666 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 염화 메탄술폰산(MsCl; 62.1 L, 0.799 mmol)과 트리에틸아민(Et3N; 140 μL, 0.999 mmol)을 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(3 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하고 침전물을 걸러내었다. 얻어진 용액을 감압 증류하여 농축하고 이를 다시 아세톤 6 mL에 녹인 후, 요오드화나트륨(NaI; 150 mg, 0.999 mmol)을 가하였다. 15분 동안 실온에서 교반한 후 반응이 완결되면 용매를 감압증류로 건조시킨다. 여기에 물 10 mL를 가하고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(tag β reporter unit)을 157 mg(0.604 mmol, 90%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.44 (s, 2H), 2.53 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.92 (t, 3H, J = 7.4 Hz)
상기에서 합성된 tag β의reporter unit으로부터 balance unit을 합성하는 과정 및 각 단계에서 생성된 화합물들의 NMR 결과들을 하기 단계 9와 10에 나타내었다.
단계 9 : 2-(4-프로필페닐)아세토나이트릴의 합성
아르곤 조건 하에서 잘 건조된 N,N-디메틸포름아미드(dry DMF) 1 mL에 1-(아이오도메틸)-4-프로필벤젠(73.6 mg, 0.283 mmol)을 녹인 후, 시안화나트륨(NaCN; 27.7 mg, 0.566 mmol)을 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하여(3 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 41.0 mg(0.257 mmol, 91%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.23-7.16 (m, 4H), 3.69 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.69-1.57 (m, 2H), 1.93 (t, 3H, J = 7.3 Hz).
단계 10 : 2-(4-프로필페닐)아세트 산의 합성
30% 수산화나트륨 수용액 1 mL에 2-(4-프로필페닐)아세토나이트릴(41.0 mg, 0.257 mmol)를 녹인 후 4시간 동안 환류(reflux) 조건 하에서 교반하였다. 반응이 완결되면 10% 염화수소 수용액 3 mL를 가하여 용액을 산성화시키고, 디에틸 에테르로 추출하여(3 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(tag β의 balance unit)을 34.8 mg(0.195 mmol, 76%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.13 (m, 4H), 3.16 (s, 2H), 2.58 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.70-1.58 (m, 2H), 0.95 (t, 3H, J = 7.4 Hz).
상기에서 제조된 reporter unit과 balance unit을 이용하여, 도 3과 같은 과정으로 tag β의 합성을 진행하였으며, 구체적인 합성 방법 및 각 단계에서 합성된 화합물의 NMR 결과들을 하기 단계 11 내지 13에 나타내었다.
단계 11 : 메틸 2-((4-프로필벤질)아미노)아세테이트의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 5 mL에 글리신 메틸 에스테르(448 mg, 3.57 mmol)를 녹인 후, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA; 777 μL, 4.46 mmol)과 1-(아이오도메틸)-4-프로필벤젠(232 mg, 0.892 mmol)를 가하고 1일 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(10 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 152 mg(0.687 mmol, 77%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.20 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.73 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.38 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.94 (br, 1H), 1.67-1.54 (m, 2H), 0.91 (t, 3H, J = 7.3 Hz).
단계 12 : 메틸 2-(N-(4-프로필벤질)-2-(4-프로필페닐)아세트아미도)아세테이트의 합성
잘 건조된 DCM 1 mL에 아르곤 조건 하에서 메틸 2-((4-프로필벤질)아미노)아세테이트(24.5 mg, 0.0983 mmol)와 2-(4-프로필페닐)아세트 산(17.5 mg, 0.0983 mmol)를 녹인 후, EDC(56.5 mg, 0.295 mmol), HOBt(39.8 mg, 0.295 mmol) 및 DIPEA(84.3 μL, 0.491 mmol)를 가하고 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 31.1 mg(0.0789 mmol, 80%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-7.10 (m, 6H), 6.96-6.94 (m, 2H), 4.62 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.61 (s, 3H), 2.57-2.51 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.94-1.88 (m, 6H).
단계 13 : 2-(N-(4-프로필벤질)-2-(4-프로필페닐)아세트아미도)아세트 산의 합성
메탄올 0.5 mL에 메틸 2-(N-(4-프로필벤질)-2-(4-프로필페닐)아세트아미도)아세테이트(30.0 mg, 0.0786 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 26.4 mg(0.0718 mmol, 91%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.54 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.77 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.24-6.88 (m, 8H), 4.58 (s, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.63 (s, 2H), 2.55-2.47 (m, 4H), 1.64-1.51 (m, 4H), 0.93-0.87 (m, 6H).
tag γ의 합성
구입한 reporter 및 balance unit을 사용하여, 도 3과 같은 과정으로 tag γ의 합성을 진행하였으며, 구체적인 합성 방법 및 각 단계에서 합성된 화합물의 NMR 결과들을 하기 단계 1 내지 3에 나타내었다.
단계 1 : 메틸 2-((3-페닐프로필)아미노)아세테이트의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 3 mL에 글리신 메틸 에스테르(330 mg, 2.63 mmol)를 녹인 후, DIPEA(573 μL, 3.29 mmol)과 1-브로모-3-페닐프로판(100 μL, 0.658 mmol)를 가하고 1일 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(4 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 19.6 mg(0.0946 mmol, 14%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.18-7.13 (m, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.39 (s, 2H), 2.68-2.60 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 2H).
단계 2 : 메틸 2-(5-페닐-N-(3-페닐프로필)펜탄아미도)아세테이트의 합성
잘 건조된 DCM 1 mL에 아르곤 조건 하에서 메틸 2-((3-페닐프로필)아미노)아세테이트(20.0 mg, 0.0965 mmol)와 5-페닐발레르 산(22.0 mg, 0.116 mmol)를 녹인 후, EDC(55.5 mg, 0.289 mmol), HOBt(39.1 mg, 0.289 mmol) 및 DIPEA(82.7 μL, 0.482 mmol)를 가하고 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 34.2 mg(0.0931 mmol, 96%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 4.01 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.30 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.24 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.31-7.23 (m, 4H), 7.21-7.14 (m, 6H), 3.95 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.42 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.62-2.56 (m, 4H), 2.18 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 1.90-1.85 (m, 2H), 1.68-1.59 (m, 4H).
단계 3 : 2-(5-페닐-N-(3-페닐프로필)펜타아미도)아세트 산의 합성
메탄올 0.5 mL에 메틸 2-(5-페닐-N-(3-페닐프로필)펜탄아미도)아세테이트(34.2 mg, 0.0931 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 26.2 mg(0.0741 mmol, 80%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.99 (s, 2H), 3.28 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.26-7.12 (m, 10H), 3.91 (s, 2H), 3.40 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.61-2.52 (m, 4H), 2.21 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.61-1.55 (m, 4H).
tag δ의 합성
구입한 reporter 및 balance unit을 사용하여, 도 3과 같은 과정으로 tag δ의 합성을 진행하였으며, 구체적인 합성 방법 및 각 단계에서 합성된 화합물의 NMR 결과들을 하기 단계 1 내지 3에 나타내었다
단계 1 : 메틸 2-(옥틸아미노)아세테이트의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 2 mL에 글리신 메틸 에스테르(358 mg, 2.85 mmol)를 녹인 후, DIPEA(620 μL, 3.56 mmol)과 1-브로모옥탄(123 μL, 0.712 mmol)를 가하고 1일 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(4 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 31.6 mg(0.157 mmol, 22%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.68 (s, 3H), 3.36 (s, 2H), 2.54 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 1.77 (s, 1H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.24-1.22 (m, 10H), 0.83 (t, 3H, J = 6.5 Hz)
단계 2 : 메틸 2-(N-옥틸옥타아미도)아세테이트의 합성
잘 건조된 DCM 1 mL에 아르곤 조건 하에서 메틸 2-(옥틸아미노)아세테이트(31.6 mg, 0.157 mmol)와 n-옥탄산(30.0 μL, 0.188 mmol)를 녹인 후, EDC(90.3 mg, 0.471 mmol), HOBt(63.6 mg, 0.471 mmol) 및 DIPEA(135 μL, 0.785 mmol)를 가하고 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(4 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 44.7 mg(0.136 mmol, 87%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.00 (s, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.28 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 2.32 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.98 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.15 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.64-1.43 (m, 4H), 1.25 (br, 19H), 0.86-0.82 (m, 6H).
단계 3 : 2-(N-옥틸옥탄아미도)아세트 산의 합성
메탄올 0.5 mL에 메틸 2-(N-옥틸옥타아미도)아세테이트(44.7 mg, 0.136 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 36.5 mg(0.116 mmol, 86%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 4.01 (s, 2H), 3.30 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 3.97 (s, 2H), 3.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.19 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.26 (br, 18H), 0.87-0.83 (m, 6H).
실시예 1-2) 다중 동중체 라벨링제의 합성
먼저, 네 종류의 reporter unit 중에서 reporter-d 5 와 reporter-d 0 를 합성한 과정 및 각 단계에서 생성된 화합물들의 NMR 결과들을 하기 단계 1 내지 7에 나타내었다.
단계 1 : 4-((트리메틸실릴)에티닐)벤조산 메틸 에스테르의 합성
아르곤 조건 하에서 10 mL의 dry THF에 4-브로모벤조산 메틸 에스테르(500 mg, 2.33 mmol), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐디클로라이드(Pd(PPh3)2Cl2; 86.1 mg, 0.116 mmol), 트리페닐포스핀(PPh3; 18.3 mg, 0.0698 mmol), 트리메틸실릴아세틸렌(TMS acetylene; 493 μL, 3.49 mmol), 트리에틸아민(Et3N; 486 μL, 3.49 mmol)을 녹인 후, 20분 동안 실온에서 교반하였다. 여기에 다시 요오드화제일구리(CuI; 8.86 mg, 0.0465 mmol)를 가하고 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 용매를 감압 증류로 제거한 후, n-펜탄 20 mL를 넣어주고 셀라이트(Celite) 패드로 필터하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하여 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 503 mg(2.16 mmol, 93%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.93 (dd, 2H, J = 6.8 Hz, J = 1.7 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 6.7 Hz, J = 1.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 0.22 (s, 9H).
단계 2
1) (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올-d 2 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 20 mL에 4-((트리에틸실릴)에티닐)벤조산 메틸 에스테르(1.00 g, 5.16 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 LiAlD4(217 mg, 5.16 mmol)를 천천히 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면, 물 220 μL, 10% 수산화나트륨 수용액 440 μL, 및 물 660 μL을 차례로 가하여 반응을 종결시켰다. 흰색 점성 침전이 생성되면 실리카 패드로 필터하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 788 mg(3.82 mmol, 89%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H).
2) (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 4-((트리메틸실릴)에티닐)벤조산 메틸 에스테르(316 mg, 1.36 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 LiAlH4(2.04 mL, 1.0 M THF 용액, 2.04 mmol)를 천천히 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면, 차례로 물 77 μL, 10% 수산화나트륨 수용액 154 μL, 물 231 μL를 가하여 반응을 종결시켰다. 흰색 점성 침전이 생성되면 실리카 패드로 필터하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 258 mg(1.26 mmol, 93%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.27 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.66 (s, 2H), 1.67 (br, 1H), 0.23 (s, 9H).
단계 3
1) tert-부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란-d 2 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 15 mL에 (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올-d 2 (600 mg, 2.94 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 이미다졸(240 mg, 3.52 mmol)과 dry THF 5 mL에 녹인 염화 tert-부틸디메틸실란(TBSCl; 531 mg, 3.52 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 15시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 20 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(20 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 895 mg(2.79 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
2) tert-부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 (4-((트리메틸실릴)에티닐)페닐)메탄올(258 mg, 1.26 mmol)을 녹인 후, 0℃로 냉각하고 이미다졸(103 mg, 1.52 mmol)과 dry THF 3 mL에 녹인 TBSCl(228 mg, 1.52 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 15시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(10 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 383 mg(1.20 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.41 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.70 (s, 2H), 0.90 (s, 9H), 0.22 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 4
1) tert-부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란-d 2 의 합성
아르곤 조건 하에서 메탄올 12 mL에 tert-부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란-d 2 (1.16 g, 3.62 mmol)와 탄산칼륨(1.00 g, 7.24 mmol)을 녹인 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 15 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(10 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 858 mg(3.45 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H).
2) tert-부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 메탄올 4 mL에 tert-부틸디메틸((4-((트리메틸실릴)에티닐)벤질)옥시)실란(383 mg, 2.40 mmol)과 탄산칼륨(332 mg, 2.40 mmol)을 녹인 후, 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 280 mg(1.14 mmol, 95%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.44 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.72 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.01 (s, 6H).
단계 5
1) tert-부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란-d 5 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란-d 2 (263 mg, 1.06 mmol)를 녹인 후, -78℃로 냉각하고 n-부틸리튬(851 μL, 2.49 M n-헥산 용액, 2.12 mmol)을 천천히 가하였다. 20분 동안 -78℃에서 교반한 후 여기에 다시 요오드화메탄-d 3 (331 μL, 5.30 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하고(5 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 280 mg(1.05 mmol, 99%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
2) tert-부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸((4-에티닐벤질)옥시)디메틸실란(247 mg, 1.00 mmol)을 녹인 후, -78℃로 냉각하고 n-부틸리튬(805 μL, 2.49 M n-헥산 용액, 2.00 mmol)을 천천히 가하였다. 20분 동안 -78℃에서 교반한 후 여기에 다시 요오드화메탄-d 0 (313 μL, 5.00 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 10 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축시켜 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 253 mg(0.971 mmol, 97%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.35 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 4.70 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
단계 6
1) (4-(프로프-1-인-1-일)페닐)메탄올-d 5 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란-d 5 (280 mg, 1.05 mmol)을 녹인 후, 불화-n-부틸암모늄(TBAF; 1.58 mL, 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액, 1.58 mmol)을 천천히 가하고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 198 mg(0.838 mmol, 88%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz).
2) (4-(프로프-1-인-1-일)페닐)메탄올-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry THF 5 mL에 tert-부틸디메틸((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)옥시)실란-d 0 (326 mg, 1.25 mmol)을 녹인 후, 불화-n-부틸암모늄(TBAF; 1.88 mL, 1.0 M 테트라히드로퓨란 용액, 1.88 mmol)을 천천히 가하고 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 에틸 아세테이트로 추출하여(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 182 mg(1.24 mmol, 99%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.56 (s, 2H), 2.44 (br, 1H), 2.01 (s, 3H).
단계 7
1) 1-(아이오도메틸)-4-(프로프-1-인-1-일)벤젠-d 5 의 합성
잘 건조된 DCM 5 mL에 아르곤 조건 하에서(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)메탄올-d 5 (140 mg, 0.926 mmol)를 녹인 후, 0로 냉각하고 염화 메탄술폰산(MsCl; 86.3 μL, 1.11 mmol)과 트리에틸아민(Et3N; 194 L, 1.39 mmol)을 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(5 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하고 침전물을 걸러내었다. 얻어진 용액을 감압 증류하여 농축하고 이를 다시 아세톤 10 mL에 녹인 후, 요오드화나트륨(NaI; 207 mg, 1.39 mmol)을 가하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후 반응이 완결되면 용매를 감압증류로 건조시킨다. 여기에 물 10 mL를 가하고 에틸 아세테이트로 추출하여(10 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(reporter-d 5 )을 220 mg(0.843 mmol, 91%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H).
2) 1-(아이오도메틸)-4-(프로프-1-인-1-일)벤젠-d 0 의 합성
잘 건조된 DCM 4 mL에 아르곤 조건 하에서(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)메탄올-d 0 (182 mg, 1.24 mmol)를 녹인 후, 0℃로 냉각하고 염화 메탄술폰산(MsCl; 116 μL, 1.49 mmol)과 트리에틸아민(Et3N; 260 μL, 1.87 mmol)을 가하였다. 30분 동안 0℃에서 교반한 후 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(5 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하고 침전물을 걸러내었다. 얻어진 용액을 감압 증류하여 농축하고 이를 다시 아세톤 12 mL에 녹인 후, 요오드화나트륨(NaI; 280 mg, 1.87 mmol)을 가하였다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후 반응이 완결되면 용매를 감압증류로 건조시킨다. 여기에 물 10 mL를 가하고 에틸 아세테이트로 추출하여(10 mL씩 총 3회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(reporter-d 0 )을 279 mg(1.09 mmol, 88%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30-7.27 (m, 2H), 4.42 (s, 2H), 2.02 (s, 3H).
상기에서 합성된 reporter unit으로부터 balance-d 5 와 balance-d 0 를 합성하는 과정 및 각 단계에서 생성된 화합물들의 NMR 결과들을 하기 단계 8 내지 10에 나타내었다.
단계 8
1) 디에틸 2-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)말로네이트-d 5 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 2 mL에 1-(아이오도메틸)-4-(프로프-1-인-1-일)벤젠-d 5 (0.392 mmol)와 수소화나트륨(NaH; 19.8 mg, 60% 미네랄오일 혼합물, 0.473 mmol)을 녹인 후, 0℃로 냉각하고 디에틸 말론산(89.8 μL, 0.592 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하여(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 88.5 mg(0.302 mmol, 77%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28-7.23 (m, 2H), 7.11-7.07 (m, 2H), 4.17-4.06 (m, 4H), 3.57 (s, 1H), 1.21-1.14 (m, 3H).
2) 디에틸 2-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)말로네이트-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 3 mL에 1-(아이오도메틸)-4-(프로프-1-인-1-일)벤젠-d 0 (98.0 mg, 0.383 mmol)와 수소화나트륨(NaH; 18.4 mg, 60% 미네랄오일 혼합물, 0.459 mmol)을 녹인 후, 0℃로 냉각하고 디에틸 말론산(87.2 μL, 0.574 mmol)을 가하였다. 이후 실온으로 온도를 높여주고 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 포화 염화암모늄 수용액 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하여(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 94.8 mg(0.329 mmol, 86%) 얻었다.
단계 9
1) 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온-d 5 에틸 에스테르의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 2 mL에 디에틸 2-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)말로네이트-d 5 (88.5 mg, 0.302 mmol)를 녹인 후, 염화나트륨(35.3 mg, 0.604 mmol)과 물 100 μL를 가하고 2일 동안 환류(reflux) 조건 하에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(3 mL 4) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 50.0 mg(0.226 mmol, 75%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.56 (s, 2H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz).
2) 에틸 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온-d 0 에틸 에스테르의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 2 mL에 디에틸 2-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)말로네이트-d 0 (94.8 mg, 0.329 mmol)를 녹인 후, 염화나트륨(38.5 mg, 0.658 mmol)과 물 200 μL를 가하고 2일 동안 환류(reflux) 조건 하에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 50.0 mg(0.231 mmol, 70%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.28 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.89 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H), 1.19 (t, 3H, J = 7.2 Hz).
단계 10
1) 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온산-d 5 (balance-d 5 )의 합성
메탄올 0.5 mL에 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온-d 5 에틸 에스테르(43.0 mg, 0.194 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(balance-d 5 )을 32.2 mg(0.167 mmol, 86%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.64 (s, 2H).
2) 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온산-d 0 (balance-d 0 )의 합성
메탄올 0.5 mL에 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로피온-d 0 에틸 에스테르(50.0 mg, 0.231 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물(balance-d 0 )을 37.3 mg(0.198 mmol, 86%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H).
상기에서 제조된 reporter unit과 balance unit을 이용하여, 동중체 및 다중 동중체 라벨링제의 합성 방법 및 각 단계에서 합성된 화합물의 NMR 결과들을 하기 단계 11 내지 13에 나타내었다. 다중 동중체들의 합성 방법은 동일하므로 동중체 라벨링제 tag α129의 경우를 상세히 기술하고, 다른 동중체 라벨링제들의 경우는 합성과정의 차이점을 기술하였다.
단계 11
메틸 2-((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)아미노)아세테이트-d 0 의 합성
아르곤 조건 하에서 dry DMF 2 mL에 글리신 메틸 에스테르(169 mg, 1.34 mmol)를 녹인 후, DIPEA(292 μL, 1.68 mmol)과 1-(아이오도메틸)-4-(프로프-1-인-1-일)벤젠-d 0 (reporter-d 0 ; 232 mg, 0.892 mmol)를 가하고 1일 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 5 mL를 가하여 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출하고(5 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 58.6 mg(0.270 mmol, 80%) 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.30 (d. 2H, J = 8.2 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 3.72 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.35 (s, 2H), 2.20 (br, 1H), 1.99 (s, 3H).
단계 12
메틸 2-(N-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)-3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로판아미도)아세테이트-d 5 의 합성
잘 건조된 DCM 1 mL에 아르곤 조건 하에서 메틸 2-((4-(프로프-1-인-1-일)벤질)아미노)아세테이트-d 0 (18.3 mg, 0.0845 mmol)와 3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로판 산-d 5 (balance-d 5 ; 13.6 mg, 0.0704 mmol)를 녹인 후, EDC(40.5 mg, 0.211 mmol), HOBt(28.5 mg, 0.211 mmol) 및 DIPEA(60.3 μL, 0.352 mmol)를 가하고 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 물 3 mL를 가하여 반응을 종결시키고 DCM으로 추출하여(3 mL씩 총 4회) 얻어진 유기층에 무수 황산마그네슘을 처리하여 수분을 제거하였다. 침전물을 걸러내고 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 목적화합물을 25.0 mg(0.0759 mmol, 91%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.51 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.65 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.33-7.24 (m, 4H), 7.11-6.96 (m, 4H), 4.58 (s, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.60 (s, 3H), 2.52 (s, 2H), 2.02 (s, 3H).
단계 13
2-(N-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질-3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로판아미도)아세트 산-d 5 의 합성
메탄올 0.5 mL에 메틸 2-(N-(4-(프로프-1-인-1-일)벤질)-3-(4-(프로프-1-인-1-일)페닐)프로판아미도)아세테이트-d 5 (25.0 mg, 0.0637 mmol)를 녹인 후, 20% 수산화나트륨 수용액 100 μL를 가하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트 3 mL를 가하여 묽히고 10% 염화수소 수용액 200 μL를 가하여 용액을 중화시켰다. 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 침전물은 걸러내어 얻어진 용액을 감압 증류로 농축하고 관 크로마토그래피로 정제하여 동중체 라벨링제 tag α129를 21.0 mg(0.0554 mmol, 87%) 얻었다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 77.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H).
상기 단계 11 내지 13과 유사한 방법으로 하기와 같이 동중체 라벨링제 tag α131, tag α132 및 tag α134를 제조하였다.
동중체 라벨링제 α131
동중체 라벨링제 tag α129와 동일한 과정으로 합성하되, 합성 과정 중에서 단계 11에는 reporter-d 2 를 사용하고 단계 12에는 balance-d 3 를 사용하여 합성하였다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H).
동중체 라벨링제 α132
동중체 라벨링제 α129와 동일한 과정으로 합성하되, 합성 과정 중에서 단계 11에는 reporter-d 3 를 사용하고 단계 12에는 balance-d 2 를 사용하여 합성하였다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.47 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 4.56 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.00 (s, 3H).
동중체 라벨링제 α134
동중체 라벨링제 α129와 동일한 과정으로 합성하되, 합성 과정 중에서 단계 11에는 reporter-d 5 를 사용하고 단계 12에는 balance-d 0 를 사용하여 합성하였다.
Major isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 2.90 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.64 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.02 (s, 3H). Minor isomer: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.32-7.23 (m, 4H), 7.09-7.94 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 2.93 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 2.00 (s, 3H).
상기 제조된 화합물을 이용하여 하기와 같이 정략분석 실험에 사용하였다.
실시예 1-3) 정량분석 실험
단계 1: 라벨링제와 분석체의 결합
실시예 1-2의 화합물과 펩티드의 결합 반응을 도 7에 나타내었다. 실시예 1-2의 화합물과 EDC와 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 DMF에 녹이고 각각의 농도가 60, 35 및 40 mM이 되도록 섞어서 실온에서 45분간 반응시켜 라벨링제의 카복시산 말단기를 숙신이미딜 에스테르로 활성화시켰다.
소 혈청 알부민을 트립신 효소로 분해하여 얻은 펩티드(tryptic BSA) 또는 앤지오텐신 II(DRVYIHPF)를 탄산수소나트륨 수용액(NaHCO3, 100 mM)에 녹인 다음, 활성화된 라벨링제를 넣고 6시간 이상 반응을 진행시켰다. 히드록실기에 일어나는 표지 반응은 에스테르 결합을 형성하여 불안정한 결합을 형성하며 반응의 효율도 낮기 때문에, 정확한 정량을 위해서, 탄산수소나트륨 수용액(100 mM)에 녹인 히드록실 아민(80 mM)를 사용해서 펩티드의 히드록실기에 표지된 부반응을 제거하였다. 전체 반응은 트리플루오로아세트산(TFA)을 가하여 종결시켰다.
단계 2: MALDI 및 LC-MALDI 질량 분석
표지된 앤지오텐신 II는 50 TA 용액(0.1% TFA/50% acetonitrile/50% H2O)으로 묽힌 다음 HCCA 매트릭스 용액(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 5 mg/mL 50 TA)과 1:1로 섞어서 MALDI plate에 올리고 건조한 다음, 탄뎀 비행시간형 질량분석기(time-of-flight/time-of-flight(TOF/TOF) mass spectrometry)를 사용하여 분석하였다. 탄뎀 질량분석을 통해서 설계한대로 정량신호 및 표지신호가 관측되는지 또한 그 세기가 어느 정도인지 확인하였다.
표지된 tryptic BSA를 사용해서 동중체 라벨링제로 측정 가능한 분석 시료의 농도 혹은 양의 범위를 확인하고 액체 크로마토그래피(LC)와 연동해서 다중의 시료를 동시에 정량분석할 수 있는지 확인하였다. 동중체 라벨링제로 측정 가능한 시료의 농도 범위를 확인하기 위해서, 다중 동중체 중 tag α129와 tag α131로 표지된 시료를 3:1의 비율로 섞은 다음 50TA를 사용하여 묽히는 과정 반복하였다. 각 농도의 시료를 HCCA 매트릭스 용액 1:1의 비율로 섞어서 MALDI plate에 로딩하였다. 이때 로딩된 펩티드의 양은 스팟당 약 4200, 1300, 420, 130, 42, 및 13 펨토몰이다. LC와 연동한 다중 정량분석을 테스트하기 위해서는 네 종류의 동중체로 표지된 tryptic BSA를 2:1:4:8의 비율로 섞고 nanoLC로 분리하였으며, LC에서 용출되는 펩티드를 HCCA 매트릭스 용액과 함께 MALDI plate에 로딩하여 MALDI-TOF/TOF로 분석하였다.
실험 결과
1) 모델 펩티드를 이용한 라벨링제의 검증
각 라벨링제와 결합된 모델 펩티드(angiotensin II, DRVYIHPF)들을 질량 분석한 결과, 하나의 라벨링제와 결합한 질량값(tag α129-α134는 1406.7, tag β는 1395.7, tag γ는 1381.7, 및 tag δ는 1341.8 Th)에서 이온이 관측되었다. 더 정확한 검증을 위해서, 질량 스펙트럼에서 관측된 이온을 선택하여 탄뎀 질량분석을 진행하였으며 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8(a) 내지 도 8(d)는 다중 동중체(tag α129-α134)로 표지된 펩티드의 결과이며, 도 8(e) 내지 도 8(g)는 각각 비동중체인 tag β, tag γ, 및 tag δ로 표지된 펩티드의 결과이다. 각 라벨링제에서 생성되는 이온들, 즉 표지신호와 정량신호는 설계된 질량값들에서 관측되었다. 표지신호는 tag α129-α134는 361, tag β는 350, tag γ는 336, 및 tag δ는 296 Th에서 관측되었다. 정량신호는 tag α129는 129, tag α131은 131, tag α132는 132, tag α134는 134, tag β는 133, tag γ는 148, 및 tag δ는 142 Th에서 관측되었다.
각 라벨링제에서 생성되는 정량신호의 세기를 모델 펩티드의 조각 이온 중 가장 강하게 관측되는 히스티딘 임모늄 이온(110 Th)과 비교하여 도 9에 나타내었다. 라벨링제의 구조에 따라 다른 타입의 정량신호가 관측되었다. 즉 reporter unit이 벤질 유도체인 tag α와 tag β는 벤질 양이온 구조의 정량신호가 관측되었고, 벤질 유도체가 아닌 tag γ와 tag δ는 이미늄 양이온 구조의 정량신호가 관측되었다. 비록 라벨링제에 따라 정량신호의 타입은 다르더라도, 각 라벨링제의 정량신호들은 모델 펩티드의 조각 이온에 비하여 훨씬 강하게 관측되었다. 모델 펩티드의 조각 이온들을 보면, 펩티드의 C-말단기를 포함하는 조각이온들, 즉 y2, y3, 및 y7은 라벨링제에 무관하게 같은 위치에서 관측되었으며, 펩티드의 N-말단기를 포함하는 조각 이온들, 즉 b2, b3-NH3, a5, 및 b7+H2O 등은 {각 라벨링제의 분자량 - H2O} 만큼 질량이 증가한 곳에서 관측되었다. 질량분석 및 탄뎀 질량분석 결과에서 합성된 모든 각 라벨링제의 분자량과 정량 및 표지신호가 예상한대로 관측되는 것을 통해서 각 라벨링제가 설계대로 합성되었음을 확인하였으며, 펩티드의 조각 이온들로부터 라벨링제가 N-말단기에만 표지되었음을 확인하였다.
다중 동중체로 표지된 모델 펩티드들를 일정 비율로 섞고 탄뎀 질량분석한 결과를 도 10에 나타내었다. 섞은 비율(몰 비)이 tag α129 : α131 : α132 : α134 = 2:1:2:1인 경우는 도 10(a)에 도시하였으며, 1:2:1:2인 경우는 도 10(b)에 도시하였으며, 각 다중 동중체 라벨링제의 정량신호들은 역삼각형으로 표시하였다. 다중 동중체 각각을 따로 분석한 도 8(a) 내지 도 8(d)에 비해서, 다중 정량분석을 하는 경우에는 각각의 정량신호의 세기는 상대적으로 약해지고 펩티드의 조각 이온들은 더 강하게 관측되었다. 이와 같이 전체 분자량은 동일하고 정량신호의 질량값만 상이한 다중 동중체를 사용할 경우에는 정량신호와는 달리 그 이외의 이온들은 질량 값이 동일하기 때문에 중첩되어 그 세기가 강화된다. 이와 같은 이유로, 본 발명으로 개발된 라벨링제들과 같이, 정량신호가 강하게 관측될수록 다중 정량분석에 유리하다.
2) tryptic BSA를 이용한 다중 동중체의 성능 검증
다중 동중체를 이용해서 측정할 수 있는 펩티드의 양 또는 농도 범위를 도 11에 도시하였다. BSA의 절대 양을 잘 반영할 수 있도록, 동중체로 표지된 tryptic BSA중에서 비교적 강하게 관측된 펩티드인 FGER, VASLR, 및 SEIAHR을 이용하여 실험을 진행하였다. Tag α129와 tag α131으로 표지된 펩티드들을 3:1의 비율 섞고 전체 단백질의 양을 4.2 피코몰에서 13 펨토몰까지 변화해가면서 탄뎀 질량분석하였다. MALDI 질량분석기는 레이저에 의해서 이온화되는 양이 제한되어 시료의 양이 적을 때 비해서 양이 많은 경우에는 로딩된 시료양 대비 어미 이온의 세기가 작게 측정되지만, 탄뎀 질량분석을 통한 정량분석에는 무관함을 확인하였다. 또한 본 발명의 동중체 라벨링제는 정량신호가 강해서, 13 펩토몰의 적은 양의 시료도 정량분석할 수 있었다.
또한, LC와 MALDI 질량분석기를 연동한 정량분석 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12(a)는 LC에서 용출된 어미 이온들의 세기를 나타내며, 도 12(b)는 각 스팟에서 측정된 정량신호의 양을 tag α129의 정량신호와 비교해서 나타낸 것이다. 총 6 종류의 펩티드(FGER, VASLR, QEPER, AWSVAR, SEIAHR, 및 YLYEIAR)를 탄뎀 질량분석으로 정량하였다. 펩티드의 종류와는 무관하게, 각 동중체 라벨링제에 따라 일정한 비율(tag α129 : α131 : α132 : α134 = 1 : 0.51 : 1.96 : 3.81)로 측정되었다. 또한, 동일 펩티드의 경우에는 LC에서 용출되는 동안 동일한 정량신호들의 비율로 측정되었다. 이는 본 발명의 동중체로 다중 표지된 펩티드들이 nanoLC 상에서 동시에 이동하고 있으며, 따라서 특정 시점의 용출액만으로도 정확한 정량이 이루어짐을 의미한다. 또한, 모델 펩티드를 통해서 관측했듯이, 관측되는 정량신호의 비율이 시료의 전체 양에는 영향을 받지 않음을 확인하였다.
실시예 2
실시예 2-1) 라벨링제의 제조
대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009479호 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159호를 참조하여, 본 발명의 화학식 2의 라벨링제를 제조하였다.
우선 동위원소 암호화기인 RA와 RC가 메틸(CH3 또는 CD3)이고 질량조절기인 RB가 발린(Val), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 및 아르기닌(Arg)의 측쇄인 라벨링제들을 만들었다. 질량조절기가 발린(Val), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 및 아르기닌(Arg)의 측쇄인 것들을 편의상 각각 Val-tag, Gln-tag, His-tag, Phe-tag, 및 Arg-tag으로 명명하였다. 또한 동위원소 암호화기인 RA와 RC가 에틸(C2H5 또는 C2D5)이고 질량조절기인 RB가 메틸인 라벨링제를 만들었다. 이는 편의상 Ethyl-tag으로 명명하였다.
실시예 2-2) 결합체의 제조
상기 실시예 2-1에서 제조된 라벨링제를, 3종의 모델 펩티드 LISFYAGR 또는 LISFYAGK 또는 YGGFL에 Val-, Gln-, His-, Phe-, Arg-tag 및 Ethyl-tag을 결합시켰다. 또한, 소 혈청 단백질 (bovine serum albumin), 미오글로빈 (myoglobin), 및 유비큐틴 (ubiquitin) 단백질을 서로 다른 양으로 혼합한 두 개의 단백질 혼합물 시료를 준비하였다. 혼합시료 A에는 소 혈청 단백질, 미오글로빈, 및 유비큐틴이 각각 4 mg/mL, 2 mg/mL, 및 0.2 mg/mL의 농도로 준비되었고, 혼합시료 B에는 소 혈청 단백질, 미오글로빈, 및 유비큐틴이 각각 2 mg/mL, 0.5 mg/mL, 및 0.4 mg/mL의 농도로 준비되었다. 혼합시료 A와 B를 각각 트립신으로 효소분해한 뒤 혼합시료 A에는 LMBIT을, 혼합시료 B에는 HMBIT을 결합시켰다. 이 때 Gln-tag을 MBIT 표지로 사용하였다. 펩티드 시료에 MBIT을 결합하는 방법은 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009466호, 대한민국특허 공개번호 제10-2010-0009479호 및 국제특허 공개번호 WO 10/008159호를 참조하였다.
라벨링제로 결합된 모델 펩티드는 ZipTip-C18(Millipore사)으로 염을 제거한 후 최종적으로 각 5 M 농도로 아세토니트릴과 물이 부피비 1:1로 혼합되어 있고 0.5%의 포름산이 첨가된 용액에 녹아있는 상태로 준비하였다. 라벨링제로 결합된 혼합시료 A와 B는 1:1의 부피비로 혼합된 후 진공에서 완전히 용매를 제거한 다음 0.5%의 포름산이 첨가된 수용액에 녹아있는 상태로 준비되었다.
실시예 2-3) 정량분석
상기 실시예 2-2의 결합체를 이용하여, 하기와 같이 정량분석을 실시하였다.
상기 실시예 2-2에 기술된 모델 펩티드와 MBIT의 결합체의 정량분석 실시에 활용된 질량분석기는 전자분무 이온화 사중극자 이온트랩 장비로 Bruker사의 Esquire HCT제품 또는 Thermo 사의 LTQ Velos를 사용하였다. 시료 용액 100 L가 syringe pump에 로딩된 후 1 μL/min의 유속으로 전자분무 팁으로 운반되었다. 전자분무는 4 kV의 전압으로 이루어졌다. 한 주기에 하나의 스펙트럼 측정을 위하여 이온 트랩 내부에 최대 200 ms 동안 시료 이온이 포집되어 질량분석되었으며, 1분동안 최대 250주기의 반복측정이 이루어졌다.
상기 실시예 2-2에 기술된 혼합시료 A 및 B와 MBIT의 결합체의 정량분석 실시에 활용된 질량분석기는 액체상크로마토그래피와 연결되어 있는 전자분무 이온화 사중극자 이온트랩 장비로 Thermo사의 LTQ XL을 사용하였다. 시료 용액은 0.3 μL/min의 유속으로 액체상크로마토그래피를 통과하여 전자분무 이온화되었다. 이 때 전자분무는 2 kV의 전압으로 이루어졌다. 액체상크로마토그래피에서 용출되어 나오는 매 0.2초마다 펩티드의 질량분석 및 탄뎀질량분석 스펙트럼을 얻었다.
1) LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 질량분석 결과
LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우에 대하여 정량분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17은 모델 펩티드 LISFYAGR(도 17(a)) 및 LISFYAGK(도 17(b))에 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 후 이를 전자분무 이온화 하여 사중극자 이온트랩 질량분석기를 이용하여 얻은 질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 각각 +1, +2의 전하를 띠는 펩티드 이온이 검출되었다.
LISFYAGR 펩티드의 원래 질량은 925.5 Da으로, 양성자가 1개 또는 2개 붙어서 검출되는 +1가, +2가 이온(MH+, MH2 2+)이 926.5 Th, 463.8 Th에서 각각 검출된다. 이 펩티드에 라벨링제를 결합시킨 경우 각 표지물질 1개의 질량에 해당하는 만큼 증가한 질량에서 펩티드가 검출되었다. Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우 각각 +1가 이온은 m/z 1141.6, 1170.6, 1179.6, 1189.6, 및 1198.6 Th에서 검출되고 있으며, +2가 이온은 m/z 571.3, 585.8, 590.3, 595.3, 및 599.9 Th에서 검출되고 있다.
LISFYAGK 펩티드의 원래 질량은 897.5 Da으로, 양성자가 1개 또는 2개 붙어서 검출되는 +1가, +2가 이온(MH+, MH2 2+)이 898.5 Th, 449.8 Th에서 각각 검출되었다. 상기 펩티드에 라벨링제를 결합시킨 경우 각 표지물질 2개의 질량에 해당하는 만큼 증가한 질량에서 펩티드가 검출된다. Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우 각각 +1가 이온은 m/z 1328.9, 1386.9, 1404.9, 1424.9, 및 1442.9 Th에서 검출되고 있으며, +2가 이온은 m/z 654.9, 693.9, 703.0, 712.9, 및 721.9 Th에서 검출되고 있다.
상기의 결과를 통하여, 1개의 아민을 가지고 있는 LISFYAGR에는 1개의 라벨링제가, 2개의 아민을 지니는 LISFYAGK에는 2개의 라벨링제가 결합되었다는 것을 확인할 수 있다.
2) LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 탄뎀질량분석 결과
LISFYAGR 및 LISFYAGK에 각각 Val-, Gln-, His-, Phe-, 및 Arg-tag을 결합시킨 경우의 탄뎀질량분석을 실시하였으며, 이 때 LMBIT으로 표지된 펩티드와 HMBIT으로 표지된 펩티드를 1:1의 비율로 혼합하여 실험하였다. 그 결과를 도 18 내지 도 21에 나타내었다.
도 18은 N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼이다. 펩티드의 N-말단에만 라벨링제와 결합되었기 때문에 y-타입 조각 이온들은 모두 라벨링제의 종류와 무관하게 일정한 질량대 전하비(m/z)에서 검출되고 있다. 반면에 b-타입의 조각이온들은 라젤링제의 종류에 따라 질량대 전하비(m/z)가 증가하여 검출이 되고 있다.
정량신호로 활용될 수 있는 LyS, HyS이온은 +1가 전하를 띤 채로 m/z 987 Th과 1000 Th에서 각각 검출되고 있다. 강한 염기성을 지니는 His- 및 Arg-tag의 경우는 yS이온이 강하게 검출되고 있다. Val-, Gln-, 및 Phe-tag의 경우에도 신호세기가 약하기는 하지만 yS 정량신호이온이 검출되고 있음을 알 수 있다.
도 19는 N-말단에 1개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGR에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 이 경우, 정량신호이온이 검출은 되나, 매우 작은 신호세기로 측정이 되고 있어 정량분석에 활용하기에 적합하지 않음을 알 수 있다.
도 20은 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 도 8에 나타난 바와 같이, N-말단의 아민과 C-말단 리신의 아민에 각각 라벨링제가 결합하였기 때문에 라벨링제의 종류에 따라 b-타입 및 y-타입 조각이온들이 모두 일정 질량대 전하비 만큼 증가하여 검출되는 것도 확인할 수 있다. 특히, +1가 전하를 띠는 yS이온은 -tag보다 큰 질량 대 전하비에서 측정이 되며, 다른 서열이온들에 전혀 방해받지 않은 영역에서 검출이 되고 있음을 알 수 있다. 또한 신호세기도 다른 서열이온들 만큼 강하게 나타나고 있으며, 1:1의 혼합비에 잘 맞는 [LyS]:[HyS]이온의 세기비를 나타내었다.
Val-, Phe-tag의 경우 +2가를 띠는 yS이온도 검출되고 있으며, 이 또한 1:1의 혼합비에 잘 맞는 이온 세기비를 나타내었다. 반면, 약하게 염기성을 띠는 Gln-tag과 강한 염기성을 띠는 His-, Arg-tag의 경우는 +2가의 yS이온이 거의 검출되지 않았으며, 그만큼 +1가의 yS이온이 강하게 검출되었다. 이론적으로 한정된 것은 아니지만, +2가의 yS이온은 +1가의 다른 서열이온들에 의해 방해받을 수 있기 때문에 +1가의 yS이온을 정량분석 신호로 활용하는 것이 훨씬 유리한 것으로 판단된다.
도 21은 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +1전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. +2가 어미이온으로 실험한 경우와 마찬가지로, 라벨링제의 종류에 따라 b-타입 및 y-타입 조각이온들이 모두 일정 질량대 전하비 만큼 증가하여 검출되는 것을 확인할 수 있다. 그러나 특징적으로, +1가 어미이온을 선택하여 실험한 결과에서는 +1가의 yS정량신호이온이 매우 강하게 나타난다는 것을 확인할 수 있다. 또한 [LyS]:[HyS]이온의 신호 세기 비 역시 1:1 혼합비와 거의 일치하게 검출이 되고 있음을 알 수 있다.
3) yS 정량신호의 세기 측정
도 22와 도 23은 라벨링제로 표지된 모델 펩티드를 탄뎀질량분석하였을 때 나타나는 yS 정량신호의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 도면이다. 도 10은 라벨링제로 표지되어 전자분무 이온화 된 후 +2가 전하를 띠는 어미이온을 선택하여 분해한 결과를 도시하고 있다. 한 개의 라벨링제가 결합된 LISFYAGR의 경우에 비하여, 2개의 라벨링제가 N-말단과 C-말단에 결합된 LISFYAGK의 경우 정량신호이온 yS의 세기가 두 배 이상 강하게 나오는 것을 확인할 수 있었다.
도 23(a)와 23(b)는 라벨링제로 표지되어 전자분무 이온화되어 +1가 전하를 띠는 LISFYAGR과 LISFYAGK를 각각 선택하여 분해한 결과를 나타낸 것이다. 기존의 bS이온을 활용하는 경우와 비교하기 위하여, 도 23(c)에는 라벨링제로 표지된 LISFYAGR +1가 어미이온을 MALDI-TOF/TOF 장비에서 검출했을 때의 bS 정량신호이온의 비율을 도시하였다. 두 개의 라벨링제가 결합한 LISFYAGK는 MALDI이온화 방법을 통해서는 검출되지 않았다. 그 결과 N-말단의 아민과 C-말단 리신의 아민에 두 개의 라벨링제가 결합된 LISFYAGK을 분해하여 생성되는 yS이온의 상대적인 세기가 기존의 bS를 활용하는 경우에 비해 5배 이상 강한 정량신호세기를 얻을 수 있다는 것을 확일할 수 있었다.
상기 결과를 바탕으로, 이론적으로 한정된 것은 아니나, N-말단에 추가하여 리신의 측쇄까지 라벨링제가 결합하여 총 2개 이상의 라벨링제가 결합한 경우 매우 강한 yS 정량신호를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, N-말단의 아민과 C-말단의 리신에 라벨링제가 2개 결합한 경우, +1가의 yS이온은 다른 서열이온들의 방해를 전혀 받지 않는 질량 대 전하비에서 매우 강한 신호세기로 검출이 되어 잡음신호의 방해 없이 매우 정확하고 재현성 있는 정량분석을 가능하게 해 준다는 것을 알 수 있었다. 큰 질량값을 가지는 yS를 이용하게 되면, 기존의 작은 질량값을 가지는 정량신호이온을 활용하는 경우에 비하여 최대 5배 이상 강한 신호세기로 정량분석이 가능하게 된다.
4) yS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼 분석
도 24는 N-말단과 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 LISFYAGK에 라벨링제가 결합된 어미이온 중 +2가 전하를 띠는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 생성된 +1가의 yS이온을 다시 이온트랩 내에서 선택하여 다시 충돌유래 분해하여 얻은 MS3 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
Val-tag과 결합된 LISFYAGK의 LyS 이온을 선택하여 실험한 결과를 도시하였다. 만일 N-말단의 라벨링제가 분해되어 yS 이온이 생성되었다면, MS3 스펙트럼에서 bn 이온들이 모두 144 Th씩 감소하여 나타나야 하고, 리신 측쇄에 결합한 라벨링제에서 yS 이온이 생성되었다고 하면 MS3 스펙트럼에서는 yn 이온들이 모두 144 Th씩 감소하여 나타나야 한다. MS3 스펙트럼에서 144 Th 감소해서 나타나는 bn 및 yn 조각이온들을 각각 bn', yn' 으로 명명한다. 도 24(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, N-말단을 포함하는 b-타입 조각이온들의 위치는 동일하게 유지되는데, C-말단을 포함하는 y-타입 조각이온들의 위치는 전부 144 Th만큼 감소하여 yn'으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다. bn'은 거의 검출되지 않았다. 결과적으로, 탄뎀질량분석을 통해 강하게 나타나는 yS정량신호는 펩티드의 N-말단에 붙은 라벨링제가 아닌 리신 측쇄의 아민기와 결합한 라벨링제로부터 유래된다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 18 내지 도 24의 결과를 고려할 때, yS를 활용하는 정량분석은 이론적으로 한정되는 것은 아니나, 리신을 포함하고 있어 두 개 이상의 라벨링제가 결합할 수 있는 펩티드를 분석체로 할 때 가장 좋은 성능을 보인다고 판단할 수 있다. 특히, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 펩티드의 C-말단에 리신이 있는 경우 +1가의 yS이온이 다른 조각이온의 방해를 전혀 받지 않고 검출 될 수 있다는 큰 장점을 지닌다.
5) 표준 정량커브 분석
도 25는 HMBIT과 LMBIT으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 모델펩티드를 탄뎀질량분석하여 생성된 LyS 및 HyS이온의 세기로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 도면이다. 실시에 활용된 라벨링제는 Gln-tag이며 모델펩티드로는 LISFYAGK가 활용되었다. +1가, +2가 전하를 띠는 펩티드 이온에 대하여 각각 실시 결과를 얻었다. 라벨링제로 표지된 펩티드 용액의 농도는 혼합비와 상관없이 약 5 μM로 유지되었다. 도 25에 나타난 바와 같이, 강한 신호세기를 보이는 yS이온을 활용한 정량분석은 실제 혼합비와 아주 잘 맞는 측정비를 보이고 있음을 알 수 있었다. 특히 +1가 어미이온을 선택한 경우 yS의 신호세기가 상기 서술한 바와 같이 특이적으로 강하게 나타나기 때문에 1:64의 혼합비에 이르기까지 매우 좋은 정량분석 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다. +2가 어미이온을 선택하여 정량분석하는 경우도 1:36의 혼합비까지 매우 우수한 선형성을 보인다. 기존의 작은 질량을 가지는 bS 정량신호를 활용한 경우에는 1:16의 혼합비 정도가 정량한계였음을 생각해 보면, yS를 도입하면서 최대 약 4배 정도 정량한계가 개선되었다.
6) YGGFLK 및 LISFYAGK에 Ethyl-tag을 결합시킨 경우의 탄뎀질량분석 결과
동위원소 암호화기인 RA 및 RC로 메틸기를 활용하는 경우 정량신호이온의 질량차이가 3 Da으로, LyS 정량신호이온의 자연동위원소패턴에 의하여 HyS 정량신호이온이 간섭받을 가능성이 있다. 이러한 문제는 동위원소 암호화기인 RA 및 RC로 에틸기를 사용하게 되면 정량신호이온의 질량차이가 5 Da으로 충분히 커지게 되어 극복이 가능하다. 이를 실시하기 위하여 모델펩티드에 Ethyl-tag을 결합하여 탄뎀질량분석하였다.
YGGFLK에 Ethyl-tag을 결합하여 탄뎀질량분석한 결과를 도 26 및 27에 도시하였다. LISFYAGK에 Ethyl-tag을 결합하여 탄뎀질량분석한 결과는 도 28에 도시하였다.
도 26은 N-말단에 리신의 측쇄에 각각 1개씩 총 2개의 아민을 가지고 있는 펩티드 YGGFLK에 Ethyl-tag이 결합된 어미이온 중 +1전하를 띄는 이온을 사중극자 이온트랩 내에서 선택하여 공명여기 충돌유래 분해하여 얻은 탄뎀질량분석 스펙트럼을 나타낸다. 이 중 도 26(a)와 26(b)는 Ethyl-tag 중 각각 HMBIT과 LMBIT이 결합된 경우의 결과이다. Ethyl-tag의 HMBIT으로 표지된 경우 질량 대 전하비 986.5에서 +1가의 LyS 이온이 검출되고 LMBIT으로 표지된 경우 991.5에서 +1가의 HyS이온이 검출되었다. 도 26(c)와 26(d)는 yS 이온이 검출되는 영역을 확대한 도면으로, LyS와 HyS이온의 질량이 5 Da 차이가 나므로 자연동위원소분포에 의해 서로 간섭받지 않는 것을 확인알 수 있다.
도 27은 LISFYAGK의 서열을 가지는 펩티드에 Ethyl-tag의 LMBIT을 결합시킨 것과 HMBIT을 결합시킨 것을 2:1의 비율로 혼합하여 탄뎀질량분석한 결과이다. 질량 대 전하비 1332.6에서 검출되는 +1가 전하를 띄는 이온을 선택하여 탄뎀질량분석한 결과, 질량 대 전하비 1200.6과 1205.6에서 +1가의 LyS 및 HyS 이온이 [HyS]:[LyS] = 2:1 의 비율로 LMBIT과 HMBIT의 혼합비를 성공적으로 재현하며 검출되었다.
7) 단백질 혼합시료를 Gln-tag으로 정량분석한 결과
실제 단백질을 MBIT의 yS이온으로 정량분석한 실시를 하기 위하여 세 종류의 단백질이 서로 다른 비율로 혼합되어 있는 두 개의 단백질 혼합시료(혼합시료 A와 B)를 준비하여 Gln-tag을 이용하여 분석하였다. 혼합시료 A의 소 혈청 단백질, 미오글로빈, 및 유비큐틴은 혼합시료 B의 소 혈청 단백질, 미오글로빈, 및 유비큐틴에 비하여 양적으로 각각 2배, 4배, 및 0.5배가 되도록 준비하였다. 이를 트립신으로 효소분해하고 Gln-tag의 LMBIT 및 HMBIT으로 표지하여 액체상크로마토그래피와 탄뎀질량분석을 통해 정량분석한 결과가 도 28에 도시되었다.
도 28(a)는 검출된 펩티드의 액체상크로마토그래피 용출 시간에 대하여 측정된 [HyS]:[LyS] 비율을 도시한 도면이고, 도 28(b)는 검출된 펩티드의 질량 대 전하비에 대하여 측정된 [HyS]:[LyS] 비율을 도시한 도면이다. 소 혈청 단백질로부터 유래된 것으로 규명된 펩티드의 경우 [HyS]:[LyS] = 2.01 0.06의 결과를 얻었고, 미오글로빈의 경우는 [HyS]:[LyS] = 4.13 ± 0.11, 유비큐틴의 경우는 [HyS]:[LyS] = 0.49 ± 0.02의 결과를 얻을 수 있었다. 이는 혼합시료 A와 B에서의 각 단백질의 비율을 5% 오차범위 이내로 성공적으로 정량분석한 실시이다.

Claims (27)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000010
    상기 식에서,
    R1은 C1-10 알킬 또는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000011
    이고;
    R2는 C1-10 알킬 또는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000012
    이고;
    R3는 아미노산 잔기의 측쇄이고;
    R4는 하이드록시 또는 반응성 링커이고;
    R5는 수소, C1-4 알킬 또는 C2-4 알키닐이고;
    R6는 수소, C1-4 알킬 또는 C2-4 알키닐이고;
    n과 m은 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고; 및
    상기 R1 및 R2는 중수소를 포함하지 않거나, 또는 상기 R1 및 R2 중 적어도 하나는 중수소를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 C6-9 알킬 또는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000013
    이고,
    R2는 C6-9 알킬 또는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000014
    이고,
    R5는 수소, 프로필 또는 프로프-1-이닐(prop-1-ynyl)이고;
    R6는 수소, 프로필 또는 프로프-1-이닐(prop-1-ynyl)이고; 및
    n과 m은 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서,
    R1은 옥틸이고; 및
    R2는 헵틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R1은 C1-10 알킬이고, R2는 C1-10 알킬이거나; 또는
    R1은
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000015
    이고, R2는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000016
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2는 각각 CH3―C≡C―C6H4―CH2 및 CD3―C≡C―C6H4―CD2―CH2이거나;
    각각 CH3―C≡C―C6H4―CD2 및 CD3―C≡C―C6H4―CH2―CH2이거나;
    각각 CD3―C≡C―C6H4―CH2 및 CH3―C≡C―C6H4―CD2―CH2이거나; 또는
    각각 CD3―C≡C―C6H4―CD2 및 CH3―C≡C―C6H4―CH2―CH2인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    R3는 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신 및 트립토판으로 구성되는 어느 하나의 아미노산 잔기의 측쇄인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    R4는 하이드록시, 숙신이미드-N-옥시, 3-설포숙신이미드-N-옥시, 벤조트리아졸-1-일옥시, 펜타할로벤질옥시, 4-니트로페녹시 또는 2-니트로페녹시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    1) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산;
    2) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )페닐)프로판아미도-3,3-d 2 )아세트 산;
    3) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질-1,1-d 2 )-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )페닐)프로판아미도)아세트 산;
    4) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도-3,3-d 2 )아세트 산;
    5) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )벤질-1,1-d 2 )-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산;
    6) 2-(N-(4-프로필벤질)-2-(4-프로필페닐)아세트아미도)아세트 산;
    7) 2-(5-페닐-N-(3-페닐프로필)펜탄아미도)아세트 산; 및
    8) 2-(N-옥틸옥탄아미도)아세트 산
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물을 두 종류 이상 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 두 종류 이상의 화합물은 서로 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은
    1) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )페닐)프로판아미도-3,3-d2)아세트 산;
    2) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐)벤질-1,1-d 2 )-3-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )페닐)프로판아미도)아세트 산;
    3) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )벤질)-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도-3,3-d 2 )아세트 산; 및
    4) 2-(N-(4-(프로프-1-이닐-3,3,3-d 3 )벤질-1,1-d 2 )-3-(4-(프로프-1-이닐)페닐)프로판아미도)아세트 산
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 라벨링제를 분석체와 결합시키는 단계;
    상기 결합체를 이온화하여 조각이온을 생성시키는 단계;
    상기 조각이온 중 분석체와 RC를 포함하는 조각이온을 정량하는 단계를 포함하는 분석체의 정량방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000017
    또는
    Figure PCTKR2011006225-appb-I000018
    상기 식에서,
    RA는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RB는 질량조절기이고,
    RC는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
    Linker는 분석체와 결합을 유도하는 반응성 링커이고,
    RA 및 RC는 동일한 알킬로 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함한다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 RA 및 RC는 각각 메틸이고, RA 및 RC 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 RA 및 RC는 각각 에틸이고, RA 및 RC 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 RA 및 RC는, 각각 CH3 및 CD3이거나, 또는 각각 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 RA 및 RC는, 각각 C2H5 및 C2D5이거나, 또는 각각 C2D5 및 C2H5인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 RB는 천연 또는 인공 아미노산 잔기의 측쇄인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 RB는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-18 알킬인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 Linker는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 라벨링제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 두 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 두 종류 이상의 화합물 각각의 RA 및 RC에 포함된 중수소의 수가 상이하고, 상기 두 종류 이상의 화합물은 서로 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 정량방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나의 화합물의 RA 및 RC가 각각 CH3 및 CD3이고, 상기 다른 하나의 화합물의 RA 및 RC는 각각 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 하나의 화합물의 RA 및 RC가 각각 C2H5 및 C2D5이고, 상기 다른 하나의 화합물의 RA 및 RC는 각각 C2D5 및 C2H5인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  24. 제12항에 있어서, 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 분석체는 핵산, 핵산 유도체 또는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 정량방법.
  27. 제12항에 있어서, 상기 정량방법은 사중극자 이온트랩 질량분석기를 이용하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
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