KR20100009466A - 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질정량 동시 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제, 가변질량 라벨링제 세트, 및 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제공한다. 여기서 RS 및 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00001
Figure P1020090019444
라벨링제, 가변질량, 동시분석, 정량분석, 질량분석, 단백질체

Description

가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법 {Variable mass labeling reagents and analytical methods for simultaneous peptide sequencing and protein quantitation using thereof}
본 발명은 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수소 동위원소를 포함하고, 질량을 다변화하여 서로 다른 질량값에서 정량신호를 나타낼 수 있는 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 관한 것이다.
질량분석기술은 단백질과 펩티드의 서열 및 정량 분석에 널리 이용되고 있다. 예를 들어 단백질의 정체를 규명하기 위해 단백질을 효소분해하여 생성된 조각 펩티드들을 말디 이온화법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 또는 전자 분무 이온화법(Electrospray Ionization, ESI)을 이용하여 이온화시킨 후 질량분석기를 통해 질량을 측정하여 단백질의 정체를 밝혀내기도 하고, 좀 더 정확하게는 일부 조각 펩티드들을 어미 이온으로 질량 선택하여 추가 분해를 시켜 펩티드의 서열을 규명해내는 방법을 사용하기도 한다.
질량분석기를 이용한 단백질과 펩티드의 정량분석을 위하여는 동위원소를 포함하고 있는 화학 표지물을 분석 대상 단백질 또는 펩티드에 표지하여 질량분석하는 방법이 널리 사용된다. 서로 양을 비교해야 하는 동일한 종류의 두 시료에 동위원소 표지가 상이하게 되어 있는 동일한 화학표지물을 부착하여 질량분석을 하게 되면 동위원소의 질량차 때문에 질량분석 스펙트럼 또는 탄뎀질량분석 스펙트럼 상에서 두 시료의 질량이 다르게 나타나게 되어 그 상대적 세기를 비교함으로써 정량분석이 가능하게 된다.
상기 설명한 펩티드의 정량분석과 서열분석을 동시에 수행하기 위하여 동중체 화학변형법이 이용되고 있다. 미국 특허 공개 US 2005/0148087호 및 국제 특허 공개 WO 2005/068446호 등에서는 펩티드 서열과 반응시켜 결합한 다음 탄뎀질량분석 과정에서 정량적인 신호가 나타나도록 동위원소로 표지된 동중체 화합물을 개시하고 있다.
그러나 상기 종래 기술들에 이용된 라벨링제들은 탄소, 질소 또는 산소 등의 동위원소를 사용하고 있어 가격이 비싸다는 문제를 가진다. 또한 정량신호가 나타나는 질량범위가 한정되어 있기 때문에 실험에서 야기되는 잡음신호에 의해 분석이 방해될 수 있다는 문제점도 가지고 있다. 이에 따라, 상대적으로 가격이 저렴한 수소 동위원소를 이용하여 아미노산 서열과 단백질의 양을 동시에 확인할 수 있는 새로운 동중체 라벨링제가 요구된다. 또한 정량신호의 질량 및 물성을 조절하여 광범위한 생체분자 분석에 유리하도록 할 수 있는 특성이 부여된 새로운 동중체 가변질 량 라벨링제가 요구된다.
본 발명자는 대한민국 특허출원 제2008-0070272호를 통해 수소 동위원소만을 이용하고 정량신호의 질량이 조절 가능하도록 디펩티드 구조를 띄며 MBIT이라고 명명된 새로운 동중체 라벨링제를 제시한 바 있다. 상기 특허에서는 2동중체 라벨링제의 질량조절기 역할을 하는 아미노산 잔기를 바꾸어 주는 것으로 정량신호의 질량을 조절할 수 있도록 라벨링제가 설계 제안되었다.
이에 본 발명자는 실제로 아미노산 잔기를 다변화하여 동중체 라벨링제의 정량신호질량을 다변화하고, 물성을 조절하는 실시예를 제시하여 MBIT 동중체 가변질량 라벨링제의 성능을 구현할 필요가 있다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 새로운 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨로 이루어지는 가변질량 라벨링제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하며 질량을 다변화시킬 수 있는, 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하며 질량을 다변화시킬 수 있는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨로 이루어지는 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하고 질량이 다변화되어 서로 다른 질량값에서 정량신호가 나타나는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하는, 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 이용하여 아미노산 서열 을 분석하고 동시에 단백질의 양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수소 동위원소를 포함하며 질량이 다변화된, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 동시에 이용하여 3개 이상의 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적들은 하기 설명하는 본 발명에 의해 모두 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 가변질량 라벨링제는 하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 한다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00002
여기서 RS 및 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
여기서,
상기 반응성 링커는 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 활성 에스테르 인 것을 특징으로 한다.
상기 아민은 1차 아민인 것을 특징으로 한다.
상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기 및 4-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기는 화합물의 분해시 아실기가 도입된 아미노산의 질량을 조절하도록 도입되는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기는 천연 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기는 알라닌(Ala), 세린(Ser), 히스티딘(His), 발린(Val), 글루타민(Gln), 페닐알라닌(Phe), 아르기닌(Arg), 또는 티로신(Tyr)의 측쇄인 것을 특징으로 한다.
상기 RS 및 RB는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 것을 특징으로 한다.
상기 RS와 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 한다.
상기 화학식 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 아민의 친핵성 공격에 리빙그룹이 되는 링커가 부착되고 동위원소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 디펩티드는 중수소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 가변질량 라벨링제 세트는 하기 화학식 1로 표현되는 둘 이상의 화합물을 포함하고, 여기서 각 화합물들은 RS 및 RB에서 전체 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 한다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00003
여기서 RS 및 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
여기서,
상기 반응성 링커는 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 것을 특징으로 한다.
상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기는 천연 아미노산 잔기의 측쇄로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기는 알라닌(Ala), 세린(Ser), 히스티딘(His), 발린(Val), 글루타민(Gln), 페닐알라닌(Phe), 아르기닌(Arg), 또는 티로신(Tyr)의 측쇄인 것을 특징으로 한다.
상기 RS 및 RB는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 RS 및 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 가변질량 라벨링제 세트로 표지된 동일한 분석체를 포함하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물을 포함한다.
여기서,
상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 분석체는 단백질인 것을 특징으로 한다.
상기 분석체는 핵산 또는 핵산 유도체인 것을 특징으로 한다.
상기 분석체는 탄수화물, 지질, 또는 스테로이드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 가변질량 라벨링제는 하기 화학식 2로 표현되는 것을 특징으로 한다.
화학식 2
Figure 112009013963083-PAT00004
여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 적어도 하나의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하며; RT는 질량조절기이다.
여기서,
상기 RS와 RB는 각각 CH3와 CD3이거나 또는 CD3와 CH3인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법은 본 발명에 따른 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 한다.
여기서,
상기 정량을 위한 분해법은 탄뎀질량분석법인 것을 특징으로 한다.
상기 탄뎀질량분석법은 라벨링제의 질량조절기에 따라 분석에서의 정량신호질량의 위치가 변하는 것을 특징으로 한다.
상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 bS 이온, aS 이온, bS-NH3 이온 및 RB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 내부조각이온으로 하는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 메틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 114와 117 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 96과 99 Da에서 나타나며, 표지 지문이 188 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 세린의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 130와 133 Da에 서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 102와 105 Da에서 나타나며, 표지 지문이 204 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 발린의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 142와 145 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 114와 117 Da에서 나타나며, 표지 지문이 216 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 글루타민의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 171와 174 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 143과 146 Da에서 나타나며, 표지 지문이 245 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 히스티딘의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 180와 183 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 152와 155 Da에서 나타나며, 표지 지문이 254 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 페닐알라닌의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 190와 193 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 162와 165 Da에서 나타나며, 표지 지문이 264 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 아르기닌의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 199와 202 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(bS-NH3)이 182와 185 Da에서 나타나며, 표지 지문이 273 Da인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 티로신의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 206와 209 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 178과 181 Da에서 나타나며, 표지 지문이 280 Da인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트는 하기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제 둘 이상을 포함하고, 여기서 각 라벨링제들은 RS와 RB에서 전체 중수소의 수가 동일한 가변질량 라벨링제 세트를 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00005
여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하며; RT는 질량조절기이고; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
또한, 본 발명에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법은 상기 다중 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물로 이루어진다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00006
여기서 RS 및/또는 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이며, RT는 질량 조절기이며, Linker는 분석체와 결합하게 해주는 관능기이다.
상기 RS 및 RB는 탄소의 개수가 동일한 알킬로 이루어져 있으나, 포함된 중수소의 수가 서로 달라야 한다. 일 예로, 상기 화합물에서 RS와 RB는, RS가 CH3면 RB는 CD3이고, RB가 CH3이면 RS가 CD3이다. 상기 화합물에서 링커는 분석체의 아민, 일반적으로는 1차 아민과 반응할 수 있는 반응성 링커이다. 보편적으로 상기 화합물의 형태를 활성 에스테르로 만들어 주는 관능기가 이용된다. 일 예로, N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기, 2-니트로페닐기 등이 있으며, 본 발명의 실시에 있어서는 N-하이드록시숙신이미딜기가 링커로 사용되었다.
상기 화합물의 질량조절기 RT는 분석체와 결합한 후 탄뎀질량분석과정에서 분해될 때, N-아실화된 아미노산 단편의 질량을 조절하여 정량 신호가 스펙트럼상에서 다른 단편들과 겹치지 않게 하기 위해서 도입된다. RT의 종류를 바꿈으로써, 정량신호의 질량을 다양하게 변화시킬 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서 상기 질량조절기 RT는 한정되지는 않지만 제조상 편의를 위해서 천연 아미노산의 측쇄 그룹 중 하나에서 선택될 수 있다. 정량신호와 다른 단편들의 겹침을 최소화하기 위하여 본 발명의 실시에 있어서 질량조절기는 알라닌, 세린, 히스티딘, 발린, 글루타민, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 티로신 등의 측쇄일 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, 하기 화학식 1로 표현되는 디펩티드 화합물의 세트이다.
화학식 1
Figure 112009013963083-PAT00007
여기서 RS 및/또는 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이며, RT는 질량조절기이며, Linker는 분석체의 1차 아민과 결합할 수 있는 반응성 링커로 되어있는 상이한 두 화합물의 쌍이 하나의 세트를 이루게 된다. 상기 화합물 쌍은 RS와 RB에 포함된 총 중수소의 수가 일정한 화합물 쌍이어야 한다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 화합물 쌍의 RS와 RB는 동일한 탄소수를 가지는 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이며, 제1 화합물에서 RS에 RB보다 많은 수의 중수소를 포함하고 있다면, 제2 화합물에서는 RB의 중수소 수가 RS에 비해 제1 화합물의 차이만큼 많도록 구성된다. 결과적으로 제1 화합물과 제2 화합물의 전체적인 질량은 동일하게 구성된다. 발명의 실시에 있어서 실제 합성되어 사용된 화합물 쌍은, 상기 RS와 RB가 각각 CH3와 CD3인 화합물과 RS와 RB가 각각 CD3와 CH3인 화합물의 쌍이다.
상기 화합물 쌍에서, 링커는 분석체의 아민, 일반적으로는 1차 아민과 반응할 수 있는 반응성 링커로, 동일한 링커가 화합물 쌍을 구성하는 각 화합물에 이용되어야 한다. 본 발명에 있어서 상기 반응성 링커는 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹으로 작동하는 활성 에스테르를 형성하는 관능기로, N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기, 2-니트로페닐기 등이 있다. 본 발명의 실시에 있어서는 N-하이드록시숙신이미딜기가 링커로 사용되었다.
본 발명에 있어서, 상기 RT는 탄뎀질량분석 스펙트럼에서 정량신호가 나타나는 구간을 조절할 수 있도록 하는 천연 또는 인공아미노산의 측쇄이며, 본 발명의 실시에는 알라닌, 세린, 히스티딘, 발린, 글루타민, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신 등의 측쇄가 이용되었다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 본 발명에 따른 상기 화합물 1이 결합된 분석체를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 분석체는 1차 아민을 포함하는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 핵산이다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 화합물과 분석체의 결합은 링커가 분석체의 아민과 반응하며 리빙그룹으로 작용하여 분리되면 서 이루어진다.
도 1은 MBIT 시약 및 기술을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 MBIT 시약의 구조이고, (b)는 MBIT 시약이 1차 아민기에 반응하여 표지되는 과정이며, (c)는 MBIT 시약 세트로 구분 표지된 펩티드를 탠덤 질량분석한 경우 생성 가능한 조각이온들과 이들의 명칭이고, 그리고 (d)는 개략적인 탠덤 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 본 발명에 따른 화합물 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 링커가 부착된 디펩티드로, 도 1a에 표현된 것과 같은 기능으로 구분될 수 있다.
이러한 화합물들은 분석체의 1차 아민과 반응하여 도 1b에 도시된 바와 같이 분석체와 결합할 수 있게 된다. 동일한 분자식에 중수소가 표지된 부위만 다른 MBIT 시약 쌍을 편의에 의하여 HMBIT과 LMBIT으로 구분하는데, RS에 중수소가 표지된 것을 HMBIT, RB에 중수소가 표지된 것을 LMBIT으로 부른다. 이 LMBIT와 HMBIT이 결합된 분석체는 전체적인 무게는 동일하다. 그러나 탄뎀 질량분석에서 나타나는 절단 단편들 중에서 RS와 RB중 어느 한쪽만을 포함하고 있는 단편의 경우 LMBIT이 연결된 경우와 HMBIT이 연결된 경우에 대해 서로 다른 질량값을 가지게 되고, 도 1c-d에서의 bS 이온과 와 같이 스펙트럼상에서 다른 위치에 나타나게 된다. 이들 피 크의 상대적 강도는 이들이 붙어있던 분석체의 상대적인 양으로 정량될 수 있다. 반면에 RS와 RB를 모두 포함하거나 전혀 포함하지 않는 절단 단편들의 경우 질량값이 LMBIT, HMBIT에 상관없이 일정하게 나타나게 된다. 또한 분석체가 MBIT 시약에 의해 표지된 경우 bS 이온뿐 아니라 b0 이온도 스펙트럼 상에서 발견된다. 이 b0 이온은 LMBIT, HMBIT과 상관없이 일정하게 나타나고 특정 MBIT에 의해 분석체가 표지되었다는 것을 확인할 수 있게 해 주기 때문에 표지 지문 이온(tagging signature ion)으로 이용된다.
도 2는 MBIT 기술에서 질량조절기(RT)로 사용될 수 있는 아미노산 잔기의 종류를 개략적으로 도시한 도면으로, (a)는 MBIT 기술에서 정량신호질량을 조절할 수 있는 질량조절기(RT)로 사용될 수 있는 아미노산 잔기와 해당 아미노산을 이용하였을 때 나타나는 정량신호질량 쌍의 질량값을 펩티드를 탠덤 질량분석할 경우 200 Da 이하의 질량값을 가지고 생성될 수 있는 조각이온들의 분포와 함께 도시한 도면이고, (b)는 본 발명에서 이용된 8종의 질량조절기들로, 200 Da 이하의 질량값을 가지는 조각 이온들과의 간섭이 적은 질량조절기들을 도시한 도면이다.
질량 조절기 RT의 질량에 따라서 정량 피크의 위치가 달라지게 되는데, 도 2에 도시된 바와 같이 알라닌(Ala) 측쇄인 경우 114/117에서, 세린(Ser)의 측쇄인 경우 130/133에서, 히스티딘(His)의 측쇄인 경우 180/183에서, 발린(Val)의 측쇄인 경우 142/145에서, 글루타민(Gln)의 측쇄인 경우 171/174에서, 페닐알라닌(Phe)의 측쇄인 경우 190/193에서 아르기닌(Arg)의 측쇄인 경우는 199/202에서, 티로신(Tyr)의 측쇄인 경우는 206/209에서 나타나게 된다. 상기 서술한 질량조절기들의 경우 탄뎀 질량분석과정에서 생성되는 다른 조각 단편들과의 겹침이 적은 것들이다. 상기 서술한 질량조절기들 외에도 도 2에 도시된 것과 같이 트레오닌(Thr), 시스틴(Cys), 류신(Leu)/이소류신(Ile), 아스파라진(Asn), 아스파르트산(Asp), 글루타민산(Glu), 메티오닌(Met)의 경우도 질량조절기로 사용될 가능성을 가지고 있다.
본 특허의 실시에 있어서는 그림 2b에 도시된 알라닌(Ala), 세린(Ser), 발린(Val), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 아르기닌(Arg), 티로신(Tyr)의 8개의 아미노산 측쇄가 이용되었다.
본 발명은 일 측면에 있어서 하기 화학식 2로 표현되는 화합물 및 하기 화합물을 결합시킨 분석체에 관한 것이다.
화학식 2
Figure 112009013963083-PAT00008
여기서 RS 및 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이며, RT는 질량 조절기이다. 본 발명에 있어서 상기 RS 및 RB는 포함하는 중수소의 수가 상이한 동일한 알킬이다. 발명의 실시에 있어서, RS와 RB는 RS가 CH3면 RB는 CD3이고, RB가 CH3이면 RS가 CD3이다. 본 발명의 실시에 있어서 상기 질량조절기 RT는 제조상의 편의를 위해서 천연 아미노산의 측쇄 그룹 중 하나에서 선택될 수 있다. 상기 화학식 2로 표현되는 화합물은 적절한 활성화 시약과의 반응을 통하여 화학식 1로 변환이 가능하다. 이에 이용되는 활성화 시약으로는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)/N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드(EDC) 조합, 1-벤조트리아졸(HOBt)/N,N′-디이소프로필카보이미드(DIC) 조합, (벤조트리아졸-1-일옥실)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플로로포스페이트(BOP) 등이 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시에 있어서는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)/N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드(EDC) 조합이 이용되었다.
도 3은 MBIT을 이용하여 수행할 수 있는 단백질의 상대 및 절대 정량분석 과정을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 서로 다른 조건에서 생성된 양을 모르는 동일한 단백질의 상대적인 양을 비교할 때의 정량분석 과정이고, (b)는 정체를 알고 양을 모르는 단백질의 양을 절대 정량분석할 때 사용되는 정량분석 과정이며, 그리고 (c)는 3개 이상의 시료를 동시에 다중 정량분석할 때의 분석과정이다.
상기 MBIT 화합물은 도 3과 같은 방식으로 단백질의 서열 및 정량 동시분석에 활용된다. 도 3a-b에 도시된 바와 같이, MBIT 화합물을 이용하여 두 시료간의 상대적 양의 비를 정량하는 상대정량분석과 한 시료의 절대량을 구하는 절대정량분석 두 가지가 모두 가능하다. 2-plex 상대정량분석은 도 3a와 같은 과정으로 이루어진다. 양을 모르는 두 시료의 단백질들을 각각 효소분해 한다. 시료 1에서 유래된 펩티드들과 시료 2에서 유래된 펩티드들을 각각 HMBIT또는 LMBIT으로 구분표지한 후 혼합하여 크로마토그래피로 분리한 후 이를 탄뎀 질량분석 과정을 통해서 서열분석 및 동시 정량 분석한다. 상기 기술된 상대정량분석과 동일한 과정을 거치지만, 두 개의 시료 중 하나가 이미 양을 정확히 알고 있는 단백질 또는 펩티드인 것으로 실험을 진행할 경우도 3b와 같이 절대정량분석이 가능해진다.
또한 다양한 잔기를 지니는 MBIT 화합물 세트를 2종 이상 사용하면 도 3c와 같이 다중 시료 정량분석도 가능하다. 서로 다른 조건 또는 환경에서 수확한 양을 알지 못하는 여러 개의 시료로부터 유래된 단백질들을 각각 효소분해하여 생성된 펩티드들을 준비한다. 이 중 한가지 조건에서 수확한 펩티드를 비교하고자 하는 대상의 개수 만큼 동일한 양으로 분취하고 이를 컨트롤로 사용하여 각각을 서로 다른 질량신호값을 가지는 HMBIT (또는 LMBIT) 가변질량 라벨링제들로 반응시킨다. 비교하고자 하는 대상 펩티드들은 각각 서로 다른 질량신호값을 가지는 LMBIT (또는 HMBIT) 가변질량 라벨링제들로 반응시킨다. 이렇게 표지된 모든 펩티드들을 혼합하여 크로마토그래피로 분리하고, 각각의 동중체 어미이온들을 탄뎀 질량분석 해서 서열분석 및 동시 정량 분석하면, 여러 개의 시료들의 양을 동시에 다중 정량분석할 수 있다. 또한 이러한 다중 정량분석을 할 때 각각의 비교 대상 시료들을 표지하는 MBIT 화합물의 종류를 매번 바꾸어서 정량분석을 반복하거나, 컨트롤을 매번 다른 조건의 시료로 선택하면 다중 시료의 정량분석 결과를 통계적으로 다양한 조합으로 얻어낼 수 있어서 정량 결과의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명은 새로운 동위원소로 수소 동위원소를 포함하고, 질량을 다변화되어 서로 다른 질량값에서 정량신호를 나타낼 수 있는 가변질량 라벨링제, 가변질량 라벨링제 세트 및 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제공하고, 수소 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 이용하여 아미노산 서열을 분석하고 동시에 단백질의 양을 정량 분석하는 방법 및 상기 가변질량 라벨링제 세트를 동시에 이용하여 3개 이상의 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 발명의 효과를 가진다.
이하, 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명이 후술하는 내용에 제한되는 것은 아니며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
1. 산형 MBIT 시약의 합성
산형 MBIT 시약 (XMBIT-OH, X = L or H)는 표준 고체상 합성법에 의해 합성 하였다. 도 4는 N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약을 고체상 합성법을 이용하여 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 합성과정은 도 4의 합성하는 과정과 동일하게 수행하였다.
물질
무수 N,N′-디메틸포름아미드(DMF), 피페리딘, 디클로로메탄(DCM, HPLC grade), 트리플로로아세트산(TFA, HPLC grade), 티오아니솔(TA, >99.5 %), 에탄디티올(EDT,>99.5%), 무수 아세트산, N-Fmoc-알라닌은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)에서 구입하였다. 아세트산-d3, N-Fmoc-알라닌-3,3,3-d3는 CDN isotope (Toronto, Canada)에서 구입하였다. 2-염화트리틸 레진은 Merck에서 구입하였다. N,N′-디이소프로필카보이미드(DIC), 1-벤조트리아졸, 그리고 N-말단이 Fmoc으로 보호된 다른 모든 아미노산들은 Advanced ChemTech에서 구입하였다.
합성 과정
N-Fmoc-알라닌 또는 N-Fmoc-알라닌-3,3,3-d3 75 mg을 수분이 완전히 제거된 디클로로메탄 용액 1 mL에 녹였다. 디클로로메탄만으로는 잘 녹지 않으므로 100 μL의 DMF를 넣어서 완전히 용해시켰다. 위에서 준비한 N-Fmoc 아미노산 용액과 170 μL의 DIPEA를 불꽃건조로 수분을 제거한 바이알에 담겨있는 2-염화트리틸 레진 0.1 g과 혼합하여 2~4시간동안 부드럽게 교반하였다. 레진을 펩티드 합성용 폴리프로필렌 재질의 카트리지(총 용량 5 mL)에 옮겨 담은 후 충분한 양의 디클로로메탄/ 메탄올/DIPEA 혼합 용액(혼합 부피비 17/2/1)으로 3회 세척하였다. 이후 충분한 양의 디클로로메탄으로 3회, DMF로 2회 추가로 씻어준 후 디클로로메탄으로 2회 더 씻어준 뒤 레진에서 용액을 완전히 제거시키고 감압조건에서 완전히 건조시켰다.
건조된 레진에 약 3 mL정도의 DMF를 넣어주고 2-3분간 충분히 흔들어주고 DMF를 제거하는 과정을 5회 정도 반복하여 레진을 DMF에 충분히 불렸다. DMF에 섞여있는 25% 피페리딘 용액을 약 3 mL 정도 레진에 섞어주고 5분간 교반한 후 용액을 제거하였다. 그 후 다시 25% 피페리딘 용액을 3 mL 정도 레진에 다시 넣어준 후 15분간 교반하고 용액을 제거하였다. 이후 레진을 충분한 양의 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 다시 DMF로 3회 세척하였다.
이 레진에 DMF에 0.6 M 농도로 녹인 Fmoc-아미노산(알라닌, 세린, 발린, 글루타민, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 티로신 중 하나) 용액을 1 mL 넣었다. 마찬가지로 DMF에 각각 0.6 M 농도로 녹인 1-벤조트리아졸 용액, N,N′-디이소프로필카보이미드 용액을 1 mL씩 넣어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 충분한 양의 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 DMF로 다시 3회 세척하였다.
다시 DMF에 섞여있는 25% 피페리딘 용액을 약 3 mL 정도 레진에 섞어주고 5분간 교반한 후 용액을 제거하였다. 그 후 다시 25% 피페리딘 용액을 3 mL 정도 레진에 다시 넣어준 후 15분간 교반하고 용액을 제거하였다. 이후 레진을 충분한 양의 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 다시 DMF로 3회 세척하였다.
0.6 M 농도로 DMF에 각각 녹인 아세트산 또는 아세트산-d3 1 mL를 레진과 섞어주었다. 레진에 처음 반응시킨 것이 Fmoc-알라닌인 경우 아세트산-d3를 사용하고, Fmoc-알라닌-3,3,3-d3인 경우는 중수소로 표지되지 않은 아세트산을 사용하였다. 또한, 0.6M 농도로 DMF에 각각 녹인 1-벤조트리아졸 용액과 N,N′-디이소프로필카보이미드 용액을 1 mL씩 레진에 섞어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 충분한 양의 DMF로 3회, 메탄올로 3회, DMF로 3회, 그리고 다시 메탄올로 3회 씻어준 다음 감압 조건에서 완벽하게 말려서 바이알에 옮겼다.
TFA/벤젠/TA/증류수/EDT 혼합용액(혼합 부피비 = 16.5/1/1/1/0.5) 2 mL를 레진에 섞어주고 3시간동안 교반하였다. 이 과정에서 합성된 산형 MBIT 시약이 레진에서 떨어졌다. 레진은 전부 걸러내고, 남은 용액을 따로 모아 부피가 200 μL이하가 되도록 질소를 불어 말렸다. 그 용액에 차갑게 식힌 에테르를 첨가하여 흰색 가루 형태의 생성물(산형 MBIT 시약)을 침전시켰다. 침전된 생성물은 차갑게 식힌 에테르로 3.4회 세척한 후 감압조건에서 완전히 건조시켰다.
2. MBIT 시약과 분석체 펩티드와의 결합
물질
무수 아세토니트릴 (ACN, HPLC grade), 무수 N,N′-디메틸포름아미드(DMF), 하이드록실아민 하이드로클로라이드, 트리플로로아세트산(TFA, HPLC grade), 알파- 시아노-4-하이드록시시나믹산(HCCA), N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)에서 구입하였다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드(EDC)는 Pierce (Rockford, Il)에서 구입하였다. 소 혈청 단백질(BSA) 파우더는 Calbiochem에서 구입하였다.
MBIT 시약의 활성 에스테르 제조 및 모델 펩티드와의 반응
도 5는 MBIT 시약을 분석대상 펩티드와 반응시키기 위해 활성 에스테르를 형성하는 과정, 및 이를 통해 형성된 MBIT 활성 에스테르를 분석대상 펩티드와 반응시키는 실험방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
MBIT 시약의 숙신이미딜 에스테르를 제조하는 방법과 모델펩티드에 반응시키는 과정은 도 5에 개략적으로 도시되어 있다. XMBIT-OH (X=L or H), EDC, 및 NHS를 최종 농도가 각각 8.0(XMBIT-OH), 1.0(EDC), 1.25(NHS) mg/mL 이 되도록 DMF에 녹이고, 실온에서 부드럽게 45분간 교반하였다. XMBIT-OH가 과량이 사용되었기 때문에 DMF에 녹은 EDC는 모두 소모되어 EDC에 의해 분석체에 유발될 수 있는 부가반응이 억제되었다. 이렇게 생성된 XMBIT-OSu 용액은 추가 정제과정 없이 분석체와의 반응에 바로 이용하였다.
모델 펩티드 용액으로는 angiotensin II와 leucine enkephalin이 섞여있는 용액을 사용하였다. pH가 8.1로 조절된 100 mM 소듐 바이카보네이트(NaHCO3) 버퍼에 angiotensin II(DRVYIHPF)와 leucine enkephalin(YGGFL)을 각각 0.5, 0.25 mg/mL가 되게 녹였다. 이 모델 펩티드 용액의 50 μL를 상기 준비된 LMBIT-OSu 또는 HMBIT-OSu 용액 40 μL과 섞어주고 실온에서 30분간 교반하였다. 그 후 LMBIT-OSu 또는 HMBIT-OSu 용액 20 μL를 추가로 넣어주고 30분~ 2시간 동안 더 교반하였다. 그 후 20 μL의 100 mM 농도 하이드록실아민 용액을 넣어주어 최소 4시간 이상 교반하여 부반응을 가역시키고, 과량의 MBIT-OSu 시약을 불활성화시켰다. 이후 10% TFA를 20 μL 첨가하여 반응을 완전히 종결시켰다.
BSA의 트립틱 펩티드에 대한 MBIT 반응
pH 8.1의 100 mM 소듐 바이카보네이트 버퍼에 용해된 BSA(0.6 mg/mL)는 0.1% 아세트산에 용해된 개질된 트립신(0.1 μg/μL)과 60:1의 무게비로 혼합되어 38℃에서 12시간 동안 배양하였다. 얻어진 트립틱 펩티드 용액을 16 μL씩 분취하여 HMBIT-OSu 또는 LMBIT-OSu 용액 14 μL와 혼합하여 30분간 교반하였다. 이후 추가로 HMBIT-OSu 또는 LMBIT-OSu 용액 6 μL를 넣어주고 30분~2시간 동안 더 교반하였다. 그리고 나서 10 μL의 100 mM 하이드록실아민을 넣어주고 최소 4시간동안 교반하여 부반응을 가역시키고 남아있는 XMBIT-OSu를 제거하였다. 반응은 10 μL의 10% TFA를 넣어주어 완전히 종결시켰다.
MBIT-모델펩티드의 MALDI 시료 제조
XMBIT이 연결된 모델펩티드 용액은 말디 질량분석을 위해 0.1% TFA용액에 500배 희석하였다. LMBIT 및 HMBIT이 연결된 모델 펩티드는 7가지의 다양한 비율로 혼합하였다. ([L]/[H] = 1/1, 2.3/1, 4/1, 6.3/1, 9/1, 12.3/1, 16/1) 7가지 혼합비로 준비된 각 시료는 매트릭스용액(5 mg/mL HCCA in 50/50/0.1 H2O/ACN/TFA)과 부피비 1:1로 혼합하였다. 시료/매트릭스 혼합물 1 μL가 MALDI 플레이트에 로딩되었다. 한 개의 시료 스팟당 로딩된 모델 펩티드의 양은, angiotensin II와 leucine enkephalin이 각각 약 250 fmol씩이었다.
MBIT으로 연결된 BSA 트립틱 펩티드의 LC-MALDI 시료 제조
HMBIT 또는 LMBIT으로 연결된 BSA 트립틱 펩티드를 1:1 비율로 혼합하여 그 중 일 분취량(6.4 μL)를 PepMap column (포어 크기 100 Å 입자 직경 3 mm, 내경 75 mm, 길이 150 mm)을 장착한 역상 나노액체상크로마토그래피 (Reverse-Phase Nano-Liquid Chromatography, RP-nano-LC) 분리기 (LC-packings사, Sunnyvale, CA)에 주입되었다. LC는 유속 ~0.3 mL/분으로 60분 동안 작동되었으며 2-용매 구배를 사용하여 작동하였다. 부피비로 H2O/ACN/TFA = 95/5/0.1인 용매 A와 H2O/ACN/TFA = 20/80/0.1인 용매 B가 2-용매 구배에 이용되었다. [용매 A]/[용매 B] 구배는 100/0 에서 시작하여, 0~40분 사이에 40/60으로 변하고, 40~41분 사이에 10/90으로 변하였으며, 41~47분 사이까지 10/90으로 유지되었다. 47분이 되는 시점에서 100/0으로 급격히 떨어져서 47~60분 동안 100/0의 비율이 유지되었다. 용출되는 시료는 매 25초마다 HCCA가 도포되어있는 단일 MALDI 스폿에 Probot microfraction collector를 이용하여 모아졌다. 60분 동안 총 144개의 MALDI 스폿에 LC용출되어 나오는 시료가 분취되어 도포되었다.
MALDI-MS 및 MS/MS
상기 방법들을 통해서 MALDI 타겟에 도포된 시료들을 분석하기 위하여 4700 Proteomic Analyzer (Applied Biosystems사, Foster City, CA)가 양이온 모드로 질량 대 전하비 범위 500-2500 Th에서 사용되었다. 각 도포된 스폿에 대하여 Time-of-Flight(TOF) 스펙트럼이 1000개의 반복 레이저 샷에 대한 결과를 축적하여 얻어졌다.
XMBIT으로 연결된 모델펩티드의 이온들은 질량조절기 RT의 종류에 따라 서로 다른 질량 대 전하비 위치에서 검출이 되었으며, 각각의 XMBIT으로 연결된 펩티드들은 탠덤 질량분석을 위한 어미이온으로 선택되었다. XMBIT으로 연결된 BSA 트립틱 펩티드의 경우 다양한 서열의 펩티드들이 다양한 용출시간에서 검출되는 것을 확인하였다. 그 중 YLYEIAR의 서열을 가지는 펩티드(질량 927.5 Da)가 XMBIT에 의해 반 응이 진행된 것들을 각 8종의 서로 다른 질량조절기를 가지는 MBIT 시약들에 대해서 각각 탄뎀 질량분석을 위한 어미이온으로 선택하였다.
탄뎀 질량분석을 위해 각 선택된 충돌-유래 분해(Collision-Induced Dissociation, CID)를 1.3×10-6 torr의 대기압 하에서 수행하였다. 이 CID 스펙트럼은 2000회의 반복 레이저 샷에 대한 결과를 축적하여 얻어졌다. CID 스펙트럼은 ABI-4700 Proteomic Analyzer에 함께 제공되어 있는 DataExplorer 프로그램을 이용하여 베이스라인이 보정되었다. 베이스라인 보정 후, LbS, HbS 이온의 세기를 측정하여 상대적인 양의 비를 결정하였다.
3. MBIT을 이용한 실제 실험 결과
도 6은 angiotensin II와 leucine enkephalin이 섞여있는 펩티드 혼합물을 8종의 MBIT 시약쌍으로 반응을 보낸 후 각각을 말디 질량분석한 결과를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 2b에 도시된 8개의 서로 다른 질량조절기 RT를 가지는 8종의 MBIT 시약 쌍 각각을 모델펩티드와 반응하여 MALDI-TOF 질량분석한 결과를 도 6a 내지 6h에 나타내었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 도의 [MXX(n)+H]+ 에서의 XX는 펩티드의 종류를 나타내고(ag = angiotensin II, le = leucine enkephalin), n은 펩티드에 연결된 MBIT 시약의 개수를 나타낸다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (a) 알라닌, (b) 세린, (c) 발린, (d) 글루타민, (e) 히스티딘, (f) 페닐알라닌, (g) 아르기닌, 그리고 (h) 티로신인 경우를 각각 도시하였다.
Leucine enkephalin은 질량조절기(RT)가 염기성을 띄는 경우에만 H+가 붙은 상태로 검출되었다. MBIT에 연결된 angiotensin II ([Mag(1)+H]+)는 질량조절기 RT의 종류와 무관하게 모두 MALDI 질량분석을 통해 검출되었다. Angiotensin II의 티로신 측쇄에 부반응이 추가로 진행되었다고 생각되는 [Mag(2)+H]+ 도 발견되었으나 [Mag(1)+H]+에 비하여 세기가 약하였다. 반응이 진행되지 않은 angiotensin II([Mag(0)+H]+)는 도 6e에서 나타나듯이 히스티딘의 측쇄가 질량조절기 RT로 사용된 경우(Ac-HA MBIT)에만 비교적 크게 나타났다. 이는 Ac-HA MBIT의 합성 및 분리정제 과정을 최적화하여 시약의 순도를 높이기만 해결되는 문제이다. 이 Ac-HA MBIT을 제외한 나머지 MBIT을 펩티드에 연결하는 반응은 도 6의 신호세기 비율로 추정하였을 때 완결에 가깝게 진행되었다.
Leucine enkephalin은 angiotensin II와는 달리 펩티드 서열에 염기성을 띄는 아미노산이 존재하지 않아서 MALDI 이온화 수율이 떨어진다. 그래서 일반적으로 MALDI 질량분석 스펙트럼상에서 잘 검출이 되지 않는다. 그러나 도 6e와 6f에서 처럼 염기성을 띄는 질량조절기 RT를 가지는 Ac-HA와 Ac-RA MBIT이 leucine enkephalin에 연결되었을 때에는 강한 신호세기로 MALDI 질량분석을 통해 검출이 되었다. 이를 통해 염기성 질량조절기를 가진 MBIT 시약은 기존 MALDI 질량분석을 통해 잘 검출되지 않던 펩티드의 이온화 수율을 증대시켜 검출이 가능하게 해 주는 부가적인 기능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
도 7은 8종의 MBIT 시약 쌍으로 각각 MBIT 반응이 진행된 angiotensin II 이온([MAG(1)+H]+)의 말디 탠덤 질량분석 결과를 나타낸 도면으로, 각 MBIT 시약 쌍에 대하여 HMBIT으로 반응한 펩티드와 LMBIT으로 반응한 펩티드를 1대 1의 혼합비로 섞어서 탠덤 질량분석한 결과이다. 서로 다른 아미노산 잔기를 가지는 MBIT 시약이 연결된 각각의 angiotensin II 이온의 CID 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 7a에서 h까지 각각 Ac-AA, Ac-SA, Ac-VA, Ac-QA, Ac-HA, Ac-FA, Ac-RA, 그리고 Ac-YA의 MBIT이 연결된 angiotensin II의 CID 스펙트럼이다. 각 종류의 MBIT 시약에 대해서 [L]/[H] 혼합비가 1/1인 시료들의 CID 스펙트럼을 도시하였다. N-말단의 1차 아민에 MBIT 시약이 연결되기 때문에 C-말단을 포함하고 있는 조각단편인 y-타입 이온들은 MBIT 시약의 종류와 무관하게 동일한 질량 대 전하비 값을 가지고 검출되었다. 반면에 N-말단을 포함하고 있는 조각단편인 a- 또는 b-타입 이온들은 질량조절기의 종류에 따라 서로 다른 위치에서 검출되었다. 도 7g의 Ac-RA MBIT이 연결된 경우를 제외하면 나머지 7종의 MBIT은 대체로 CID 스펙트럼에서의 조각이온 분포가 유사하였다. Ac-RA MBIT의 아르기닌 측쇄의 강한 염기성이 조각이온 분포에 변화를 미친다는 것을 알 수 있었다. 정량 신호로 사용되는 XbS 이온쌍(X = L or H)은 MBIT의 종류에 따라 서로 다른 질량 대 전하비 값에서 나타났다. Ac-AA MBIT의 경우는 114, 117 Th, Ac-SA MBIT은 130, 133 Th, Ac-VA MBIT의 경우는 142, 145 Th, Ac-QA MBIT의 경우는 171, 174 Th, Ac-HA MBIT의 경우는 180, 183 Th, Ac-FA MBIT의 경우는 190, 193 Th, Ac-RA MBIT의 경우는 199, 202 Th, 그리고 Ac-YA MBIT의 경우는 206, 209 Th에서 각각 정량신호 이온쌍이 나타났다. XbS 이온쌍은 CID과정에서 유래된 잉여 에너지에 의해 추가로 분해가 일어날 수 있다. 도 7에서 보여주는 바와 같이, Ac-RA MBIT으로 연결된 경우는 아르기닌 측쇄에서의 중성 NH3 손실이 크기 때문에 XbS-NH3의 신호가 182, 185 Th에서 추가적으로 관측되고, 나머지 7종의 MBIT의 경우에는 XbS에서 중성 CO 손실에 해당하는 28 Da의 질량이 감소한 XaS 이온이 Ac-AA MBIT의 경우 96, 99 Th, Ac-SA MBIT의 경우 102, 105 Th, Ac-VA MBIT의 경우 114, 117 Th, Ac-QA MBIT의 경우 143, 146 Th, Ac-HA MBIT의 경우 152, 155 Th, Ac-FA MBIT의 경우 162, 165 Th, Ac-YA MBIT의 경우 178, 181 Th에서 추가로 검출되었다. 또한 각 MBIT에 따라 표지 지문의 역할을 하는 b0 이온이 관측되었다. 표지 여부가 확실하지 않은 어미 이온을 탄뎀 질량분석 했을 때, 특정 질량을 가지는 표지 지문 이온이 관측되면, 해당 어미이온은 MBIT에 의해 표지되었음을 확실히 알 수 있다. 표지 지문 이온인 b0는 Ac-AA MBIT의 경우는 188 Th, Ac-SA MBIT은 204 Th, Ac-VA MBIT의 경우는 216 Th, Ac-QA MBIT의 경우는 245 Th, Ac-HA MBIT의 경우는 254 Th, Ac-FA MBIT의 경우는 264 Th, Ac-RA MBIT의 경우는 273 Th, 그리고 Ac-YA MBIT의 경우는 280 Th에서 나타난다.
도 8은 정량 신호쌍 XbS가 나타나는 위치를 각 MBIT의 종류별로 확대하여 나타낸 도면이다. 도 8에 도시된 바와 같이, [L]/[H] 혼합비 1/1에 거의 들어맞는 [LbS]/[HbS] 신호세기 비를 보이고 있다. Ac-AA MBIT을 이용한 경우 XbS쌍이 나타나는 114, 117 Th 근처에 펩티드로부터 유래된 것으로 추정되는 정체불명의 잡음신호가 크게 검출되었다. Ac-SA의 경우는 정량신호의 세기가 상대적으로 약하며 1/1의 혼합비와 잘 맞지 않는 신호세기 비를 보였다. 그러나 나머지 6종의 MBIT을 이용한 경우, 인근에 잡음신호도 거의 보이지 않으며 혼합비와 거의 유사한 정량신호세기비가 관찰되었다.
도 9는 MBIT으로 연결된 leucine enkephalin의 CID 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 9a는 Ac-HA가 연결되어 검출된 leucine enkephalin의 결과이고, 도 9b는 Ac-RA가 연결되어 검출된 결과이다. 상기 기술된 MBIT으로 연결된 angiotensin II의 CID 결과와 마찬가지로, y-타입 이온들의 위치는 MBIT의 종류와 무관하게 일정하게 유지되나, a-, b- 타입 이온들의 위치는 질량조절기의 질량 차이에 의해 차이 를 보여주었다. 또한 Ac-RA로 연결된 leucine enkephalin의 경우 N-말단 방면에 아르기닌 측쇄가 존재하기 때문에 a- 및 b-타입 이온들에서 중성 NH3 손실이 많이 발견되었다. 또한 Ac-HA와 Ac-RA가 연결된 leucine enkephalin의 경우 각각 조각이온의 분포에 대한 큰 차이를 보여주었다. 이는 연결된 MBIT의 종류에 따라 분석체 펩티드의 물리 화학적 성질을 다양하게 조절할 수 있다는 것을 말해주며, 질량조절기 RT가 정량신호질량 변화뿐 아니라 분석체의 2물성도 조절할 수 있음을 암시하는 것이다.
MBIT 시약 종류에 따른 각 정량신호의 세기는 전체 조각이온의 세기의 총합에 대한 비율로 계산되어 도 10에 도시하였다. 정확한 정량분석을 위해서는 우선적으로 정량신호가 되는 XbS이온의 세기가 강해야 하고, 또한 정량신호이온이 추가로 분해가 잘 일어나지 않아야 한다. 질량조절기가 글루타민, 히스티딘의 측쇄인 경우 정량신호질량의 세기가 가장 강하게 나타났으며, 정량신호질량 대비 추가 분해 이온의 세기가 상대적으로 약했다. 히스티딘의 측쇄가 질량조절기인 경우 XbS 이온의 세기가 가장 강하게 나타나서 알라닌의 측쇄가 사용된 경우의 5배 이상 정량신호가 증폭되었음을 알 수 있었다. 글루타민의 측쇄가 사용된 경우는 XbS에서 추가 분해가 일어나서 생성되는 XaS 이온의 세기가 상대적으로 가장 약하게 나타났다. 이와 같은 결과를 통해서 다양한 질량조절기 중 히스티딘 혹은 글루타민의 측쇄가 MBIT을 이 용한 펩티드 및 단백질의 정량 분석에 있어서 가장 우수한 성능을 보여줌을 알 수 있었다.
도 11은 LMBIT이 연결된 angiotensin II와 HMBIT이 연결된 angiotensin II를 상기에 서술한 다양한 혼합비로 섞어서 정량분석하여, 각 혼합비와 측정을 통해 얻어진 비의 선형성을 비교한 도면이다. Ac-SA MBIT을 제외한 나머지 7종의 MBIT은 angiotensin II의 정량분석에서 혼합비와 잘 맞는 측정비를 나타내고 있음을 알 수 있었다. 특히 글루타민, 히스티딘의 측쇄가 질량조절기로 사용된 Ac-QA MBIT과 Ac-HA MBIT의 경우 각 측정 값의 표준편차도 가장 작게 나타나며 (측정치의 20%이내), 선형성도 가장 우수하게 나타났다. 이는 상기 서술한 바와 같이 Ac-QA와 Ac-HA MBIT의 경우 정량신호의 세기가 강하게 나타나기 때문인 것으로 생각되며, 이 결과를 통해서 Ac-QA와 Ac-HA가 펩티드 및 단백질 정량분석에 가장 좋은 성능을 발휘하는 MBIT이란 것을 확인할 수 있었다. Ac-SA을 이용한 결과에서는 혼합비와 실험으로 얻어진 측정비가 전혀 일치하지 않으며 아무런 선형성도 보이지 않음을 알 수 있었다. 이는 Ac-SA가 연결된 angiotensin II의 CID에서 정량신호의 세기가 다른 MBIT을 이용한 경우에 비해 작을 뿐 아니라, 정량신호가 나타나는 위치인 130, 133 Th에 예상치 못한 잡음신호가 나타나기 때문이라고 생각된다. 이 잡음신호는 MBIT으로 표지되지 않은 angiotensin II 에서도 나타나는 잡음신호이다.
도 12는 leucine enkephalin의 정량분석 선형성을 확인하는 그림으로, 실제로 검출된 Ac-HA MBIT이 연결된 경우와 Ac-RA MBIT이 연결된 경우에 대한 결과이 다. 도 11의 angiotensin II 결과와 마찬가지로 혼합비와 실험으로 측정한 비가 좋은 선형성을 가지며 잘 맞는다는 것을 확인할 수 있었다. 단백질의 정량 및 서열분석을 위해서 액체상 크로마토그래피의 활용이 보편적이기 때문에, MBIT이 실제 분석체의 정량 및 서열 분석을 바르게 하기 위해서는 HMBIT으로 연결된 펩티드와 LMBIT으로 연결된 동일한 펩티드가 크로마토그래피상에서 동일한 시간에서 용출되어 나와야 한다.
도 13은 MBIT으로 표지된 분석체의 정량분석 측정한계를 확인한 결과이다. LMBIT-과 HMBIT-으로 각각 표지된 angiotensin II를 3:1의 비율로 혼합한 후 탄뎀 질량분석한 결과 중 정량신호질량(bS)이 나오는 영역을 확대한 그림이다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (a) 발린, (b) 글루타민, (c) 히스티딘, (d) 페닐알라닌, (e) 아르기닌, 그리고 (f) 티로신인 경우가 도시되었다. 한 개의 말디 스폿에 250 fmol의 시료가 도포된 경우에서 시작하여 농도를 2배씩 지속적으로 묽혀서 나타나는 정량 신호의 신호대 잡음비를 관찰하였다.
도 14는 동일한 양의 소 혈청 단백질을 트립신으로 효소분해하여 생성된 펩티드를 MBIT 시약 쌍으로 구분 표지한 후 혼합하여 액체상 크로마토그래피 및 탄뎀 질량분석으로 정량분석한 결과를 나타낸 도면이다. YLYEIAR의 서열을 가지는 펩티드의 결과를 도시하였다. (a) 8종의 MBIT쌍으로 표지된 YLYEIAR 펩티드가 분리되어 나오는 액체상 크로마토그래피 결과. (b)~(i) 각 MBIT쌍으로 표지된 YLYEIAR가 크로마토그래피에서 검출되는 각각의 분취(fraction)를 말디 탄뎀 질량분석으로 정량분석한 결과. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (b) 알라닌, (c) 세린, (d) 발린, (e) 글루타민, (f) 히스티딘, (g) 페닐알라닌, (h) 아르기닌, 그리고 (i) 티로신인 경우가 각각 도시되었다. 정량분석하여 얻어진 상대적 양의 평균과 표준편차가 수치로 각각 표시되었다.
도 1은 MBIT 시약 및 기술을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 MBIT 시약의 구조이고, (b)는 MBIT 시약이 1차 아민기에 반응하여 표지되는 과정이며, (c)는 MBIT 시약 세트로 구분 표지된 펩티드를 탠덤 질량분석한 경우 생성 가능한 조각이온들과 이들의 명칭이고, 그리고 (d)는 개략적인 탠덤 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 MBIT 기술에서 질량조절기(RT)로 사용될 수 있는 아미노산 잔기의 종류를 개략적으로 도시한 도면으로, (a)는 MBIT 기술에서 정량신호질량을 조절할 수 있는 질량조절기(RT)로 사용될 수 있는 아미노산 잔기와 해당 아미노산을 이용하였을 때 나타나는 정량신호질량 쌍의 질량값을 펩티드를 탠덤 질량분석할 경우 200 Da 이하의 질량값을 가지고 생성될 수 있는 조각이온들의 분포와 함께 도시한 도면이고, (b)는 본 발명에서 이용된 8종의 질량조절기들로, 200 Da 이하의 질량값을 가지는 조각 이온들과의 간섭이 적은 질량조절기들을 도시한 도면이다.
도 3은 MBIT을 이용하여 수행할 수 있는 단백질의 상대 및 절대 정량분석 과정을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 서로 다른 조건에서 생성된 양을 모르는 동일한 단백질의 상대적인 양을 비교할 때의 정량분석 과정이고, (b)는 정체를 알고 양을 모르는 단백질의 양을 절대 정량분석할 때 사용되는 정량분석 과정이며, 그리고 (c)는 3개 이상의 시료를 동시에 다중 정량분석할 때의 분석과정이다.
도 4는 N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약을 고체상 합성법을 이 용하여 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 MBIT 시약을 분석대상 펩티드와 반응시키기 위해 활성 에스테르를 형성하는 과정, 및 이를 통해 형성된 MBIT 활성 에스테르를 분석대상 펩티드와 반응시키는 실험방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 angiotensin II와 leucine enkephalin이 섞여있는 펩티드 혼합물을 8종의 MBIT 시약쌍으로 반응을 보낸 후 각각을 말디 질량분석한 결과를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 8종의 MBIT 시약 쌍으로 각각 MBIT 반응이 진행된 angiotensin II 이온([MAG(1)+H]+)의 말디 탠덤 질량분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 도 7에서 정량신호질량이 나타나는 질량영역을 확대하여 나타낸 도면으로, 펩티드를 탠덤 질량분석할 경우 200 Da 이하에서 생성될 수 있는 조각이온들의 분포와 함께 도시하였다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (a) 알라닌, (b) 세린, (c) 발린, (d) 글루타민, (e) 히스티딘, (f) 페닐알라닌, (g) 아르기닌, 그리고 (h) 티로신인 경우가 각각 도시되었다.
도 9는 MBIT 반응이 진행되고 H+가 붙은 형태로 검출된 leucine enkephaline 이온([MLE(1)+H]+)의 탠덤 질량분석 결과 스펙트럼이다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 염기성을 띄는 (a) 히스티딘, 그리고 (b) 아르기닌인 경우가 검출되어 도시되었다.
도 10은 MBIT 시약의 질량조절기 종류에 따른 정량신호(XbS, X=H or L)의 세기와 정량신호로부터 유도되는 추가 분해 이온들(XaS 또는 XbS-NH3)의 세기가 전체 조각이온들의 신호세기의 총 합에서 차지하는 비율을 나타낸 도면이다. 오차막대는 8회의 반복 실험을 통해 나타난 표준편차를 의미한다.
도 11은 MBIT 시약으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 angiotensin II를 탠덤 질량분석으로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 도면이다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (a) 알라닌, (b) 세린, (c) 발린, (d) 글루타민, (e) 히스티딘, (f) 페닐알라닌, (g) 아르기닌, 그리고 (h) 티로신인 경우가 각각 도시되었다. 오차막대는 8회의 반복 실험을 통해 나타난 표준편차를 의미한다.
도 12는 MBIT 시약으로 구분 표지하여 다양한 비율로 섞은 leucine enkephalin을 탠덤 질량분석으로 정량분석을 수행하여 얻은 표준정량분석커브를 나타낸 도면이다. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 염기성을 띄는 (a) 히스티딘, 그리고 (b) 아르기닌인 경우가 도시되었다.
도 13은 동일한 양의 소 혈청 단백질을 트립신으로 효소분해하여 생성된 펩티드를 MBIT 시약 쌍으로 구분 표지한 후 혼합하여 액체상 크로마토그래피 및 탠덤 질량분석으로 정량분석한 결과를 나타낸 도면이다. YLYEIAR의 서열을 가지는 펩티드의 결과를 도시하였다. (a) 8종의 MBIT쌍으로 표지된 YLYEIAR 펩티드가 분리되어 나오는 액체상 크로마토그래피 결과. (b)~(i) 각 MBIT쌍으로 표지된 YLYEIAR가 크로마토그래피에서 검출되는 각각의 분취(fraction)를 말디 탠덤 질량분석으로 정량분석한 결과. N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약(Ac-Xxx-Ala)에서 질량조절기를 포함한 Xxx가 (b) 알라닌, (c) 세린, (d) 발린, (e) 글루타민, (f) 히스티딘, (g) 페닐알라닌, (h) 아르기닌, 그리고 (i) 티로신인 경우가 각각 도시되었다. 정량분석하여 얻어진 상대적 양의 평균과 표준편차가 수치로 각각 표시되었다.

Claims (47)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
    화학식 1
    Figure 112009013963083-PAT00009
    (여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커임)
  2. 제1항에 있어서, 상기 반응성 링커는 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 활성 에스테르인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아민은 1차 아민인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기 및 4-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 질량조절기는 화합물의 분해시 아실기가 도입된 아미노산의 질량을 조절하도록 도입되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 질량조절기는 천연 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 질량조절기는 알라닌(Ala), 세린(Ser), 히스티딘(His), 발린(Val), 글루타민(Gln), 페닐알라닌(Phe), 아르기닌(Arg), 또는 티로신(Tyr)의 측쇄인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RS와 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 아민의 친핵성 공격에 리빙그룹이 되는 링커가 부착되고 동위원소로 표지되는 디펩티드인 것 을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  11. 제10항에 있어서 상기 디펩티드는 중수소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  12. 하기 화학식 1로 표현되는 둘 이상의 화합물을 포함하고, 여기서 각 화합물들은 RS 및 RB에서 전체 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
    화학식 1
    Figure 112009013963083-PAT00010
    (여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커임)
  13. 제12항에 있어서, 상기 반응성 링커는 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  15. 제12항에 있어서, 상기 질량조절기는 천연 아미노산 잔기의 측쇄로 이루어지는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 질량조절기는 알라닌(Ala), 세린(Ser), 히스티딘(His), 발린(Val), 글루타민(Gln), 페닐알라닌(Phe), 아르기닌(Arg), 또는 티로신(Tyr)의 측쇄인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  17. 제12항에 있어서, 상기 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 RS와 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 화합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  19. 제12항 내지 제18항에 따른 가변질량 라벨링제 세트로 표지된 동일한 분석체를 포함하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 분석체는 단백질인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 분석체는 핵산 또는 핵산 유도체인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 분석체는 탄수화물, 지질, 또는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  24. 하기 화학식 2로 표현되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
    화학식 2
    Figure 112009013963083-PAT00011
    (여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 적어도 하나의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하며; RT는 질량조절기임)
  25. 제24항에 있어서, 상기 RS와 RB는 각각 CH3와 CD3이거나 또는 CD3와 CH3인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  26. 제12항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 따른 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 정량을 위한 분해법은 탄뎀질량분석법인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 탄뎀질량분석법은 라벨링제의 질량조절기에 따라 분석에서의 정량신호질량의 위치가 변하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 bS 이온, aS 이온, bS-NH3 이온 및 RB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 내부조각이온으로 하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 메틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 114와 117 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 96과 99 Da에서 나타나며, 표지 지문이 188 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 세린의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 130와 133 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 102와 105 Da에서 나타나며, 표지 지문이 204 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  32. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 발린의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 142와 145 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 114와 117 Da에서 나타나며, 표지 지문이 216 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 글루타민의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 171와 174 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 143과 146 Da에서 나타나며, 표지 지문이 245 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  34. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 히스티딘의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 180와 183 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 152와 155 Da에서 나타나며, 표지 지문이 254 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 페닐알라닌의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 190와 193 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 162와 165 Da에서 나타나며, 표지 지문이 264 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 아르기닌의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 199와 202 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(bS-NH3)이 182와 185 Da에서 나타나며, 표지 지문이 273 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  37. 제28항에 있어서, 상기 질량조절기가 티로신의 측쇄인 경우, 정량신호질량(bS)이 206와 209 Da에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 178과 181 Da에서 나타나며, 표지 지문이 280 Da인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  38. 하기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제 둘 이상을 포함하고, 여기서 각 라벨링제들은 RS와 RB에서 전체 중수소의 수가 동일한 가변질량 라벨링제 세트를 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 가변질량 라벨링제 세트.
    화학식 1
    Figure 112009013963083-PAT00012
    (여기서 RS 또는 RB, 또는 RS 및 RB 모두는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; 상기 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하며; RT는 질량조절기이고; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커임)
  39. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단 백질 정량 동시 분석방법.
  40. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제30항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법.
  41. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제31항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법.
  42. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제32항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법.
  43. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제33항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정 량하는 분석방법.
  44. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제34항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법.
  45. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제35항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석법.
  46. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제36항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법.
  47. 제38항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제19항에 따른 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제37항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정 량하는 분석방법.
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