CN101848886A - 质量和性质可协调的变质量标记试剂和利用该试剂进行同步肽测序和多重蛋白定量的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了变质量标记试剂、变质量标记试剂组和变质量标记试剂复组。

Description

质量和性质可协调的变质量标记试剂和利用该试剂进行同步肽测序和多重蛋白定量的分析方法
技术领域
本发明涉及变质量标记试剂(variable mass labeling reagents)和利用该变质量标记试剂进行同步肽测序和蛋白定量的分析方法，更具体地，本发明涉及包含氢同位素的变质量标记试剂和利用该变质量标记试剂进行同步肽测序和多重蛋白定量的分析方法，其中所述变质量标记试剂为在不同质量区间显示不同定量信号提供了性质和质量的可协调性(tunability)。
背景技术
质谱测定法已经广泛用于蛋白和肽的测序和定量。例如，为了鉴定蛋白，通过基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)或电喷雾离子化(ESI)使酶切产生的肽离子化，随后可以通过质谱仪对其质量进行测定从而表征所述蛋白。更准确地，将一些肽进一步切割成片段以鉴定肽序列。
为了通过质谱测定法定量蛋白和肽，已通过化学方法在目标蛋白或肽内引入多个作为标记的稳定同位素标签。将利用同位素进行差异标记的化学标签引入到待分析的相同样品中，并且可以根据所产生的质谱或串联质谱中同位素的质量差异来区分各个样品的质量，从而可以通过比较其相对强度进行蛋白质定量。
最近，已经将等量异位化学标签(isobaric chemical tagging)策略用于同步蛋白定量和测序中。US 2005/0148087和WO 2005/068446中公开了用同位素标记的等量异位试剂，其与肽结合从而在串联质谱测定法中显示定量信号。
然而，在已知方法中使用的标记试剂的问题在于其使用了昂贵的碳同位素、氮同位素和氧同位素，从而造成成本较高。此外，另一个缺点归因于有限度的信号质量窗口，使分析可能受到非预期化学噪音的干扰。因此，同步肽测序和蛋白定量需要引入低成本氢同位素的新型等量异位标记试剂。此外，还需要不仅可以为定量信号质量窗口提供可协调性，还可以为肽性质提供可协调性，从而可以广泛应用于各种生物分子的新型等量异位变质量标记试剂。
本发明人在韩国专利申请第2008-0070272号中公开提出了基于二肽的新型等量异位标记试剂：质量平衡的1H/2H-同位素标签(MBIT)，其仅使用了氢同位素并为定量信号质量窗口提供可协调性。此外，本发明人还在韩国专利申请第2009-0019444号中公开证明，利用具有不同性质的其它天然氨基酸侧链取代2-重(2-plex)等量异位标记试剂的质量可协调基团为协调信号质量窗口及其性质提供了可能。由于氨基酸侧链的化学性质不同，具有不同氨基酸侧链的各种MBIT所示的定量信号强度具有达10倍的差异。为了使MBIT试剂在同步多重定量(multiplexed quantitation)中具有更好的性能，需要组合使用两个或更多个化学性质相似但定量信号不同的MBIT试剂。因此，为了进行同步多重蛋白定量，需要具有相同性质的多种MBIT试剂，以提供相似的定量信号强度。因此，本发明人在韩国专利申请第10-2009-0054540号中公开提出了质量和性质可协调的变质量等量异位标记试剂、所述标记试剂组和用于同步定量的分析方法。
发明内容
技术问题
概而言之，本发明旨在提供用于同步肽测序和多重蛋白定量的等量异位标记试剂，其中通过使用天然或人造氨基酸为重量和性质提供了可协调性；本发明还提供了利用多个2-重等量异位标签进行同步多重蛋白定量的分析方法。
技术方案
本发明的目的是提供用于同步肽测序和蛋白定量的新型等量异位标记，其包含同位素。
本发明的另一个目的是提供用于同步肽测序和蛋白定量的等量异位标记，其包含氢同位素。
本发明的再一个目的是提供由用于同步肽测序和蛋白定量且包含氢同位素的两种或更多种等量异位标记构成的变质量标记试剂。
本发明的再一个目的是提供用于同步肽测序和蛋白定量的等量异位质量标记，其包含氢同位素并且通过使用天然或人造氨基酸提供质量可协调性。
本发明的再一个目的是提供由用于同步肽测序和蛋白定量的两种或多种等量异位标记构成的变质量标记试剂组(a set of variable masslabeling reagents)，其包含氢同位素并且通过使用天然或人造氨基酸提供质量可协调性。
本发明的再一个目的是提供由用于同步肽测序和蛋白定量的两种或多种等量异位标记构成的变质量标记试剂组，其包含氢同位素并且通过使用天然或人造氨基酸提供质量可协调性，从而在不同的质量区间显示定量信号。
本发明的再一个目的是提供由用于同步肽测序和蛋白定量的两种或多种等量异位标记构成的变质量标记试剂组，其包含氢同位素并且通过利用性质相同的天然或人造氨基酸提供质量可协调性。
本发明的再一个目的是提供由用于同步肽测序和蛋白定量的两种或多种等量异位标记构成的变质量标记试剂组，其包含氢同位素并且通过使用性质相同的天然或人造氨基酸提供质量可协调性，从而在不同的质量区间显示相似的定量信号强度。
本发明的再一个目的是提供利用包含氢同位素的等量异位变质量标记试剂组进行同步肽测序和蛋白定量的分析方法。
本发明的再一个目的是提供利用多个等量异位变质量标记试剂2-重组的组合进行同步肽测序和多重蛋白定量的分析方法，其中所述等量异位变质量标记试剂包含氢同位素并提供质量可协调性。
可以通过以下阐述实现本发明的上述目的和其它目的。
有益效果
本发明提供包含氢同位素并提供质量和性质的可协调性从而在不同质量区间显示质量信号的变质量标记试剂、变质量标记试剂组、变质量标记试剂复组(a multiplexed set of variable mass labeling reagents)、利用所述包含氢同位素的等量异位变质量标记试剂组进行同步肽测序和蛋白定量的分析方法和利用所述变质量标记试剂组进行同步肽测序和多重蛋白定量的分析方法。
附图说明
图1为显示MBIT试剂和策略的基本构思的示意图，其中(a)显示了MBIT试剂的结构，(b)显示了通过偶联MBIT试剂和伯胺进行标记的过程，(c)显示了预期通过串联质谱测定法得到的与MBIT连接的肽的片段离子，和(d)显示了串联质谱。
图2为可作为MBIT策略的质量可协调基团(RT)的氨基酸侧链类型的示意图，其中(a)显示了可作为MBIT策略的质量可协调基团(RT)的氨基酸侧链以及利用同一氨基酸时的定量信号质量对，和在肽质谱测定时串联质谱中质量范围为220Th或以下的可能片段离子的分布，和(b)显示了不与质量范围为220Th或以下的可能小质量片段发生显著干扰的8种不同的质量可协调基团(用于本发明中)。
图3为显示将烷基基团用作MBIT策略的质量可协调基团(RT)时MBIT的定量信号，其中，(a)显示了串联质谱中质量范围为220Th或以下的可能小质量片段，和(b)显示了各MBIT的内在标签标记(taggingsignature)和定量信号质量，其依赖于用作质量可协调基团的烷基基团的类型。
图4为显示利用MBIT进行蛋白相对定量和绝对定量的实验流程图，其中(a)显示了在不同条件下产生未知量的相同蛋白的相对定量实验过程，和(b)显示了未知量的经鉴定的蛋白的绝对定量实验过程。
图5为显示性质相同但信号质量不同的MBIT组的串联质谱图，并显示了利用两组或更多组MBIT对三种或更多种样品进行同步多重定量的方法。
图6为显示利用(a)固相合成法和(b)液相合成法合成MBIT试剂的方法的示意图。
图7为显示用于形成MBIT试剂的活性酯，并将形成的MBIT的活性酯与目标肽偶联的实验方法的示意图。
图8为连接8对N-乙酰化二肽MBIT试剂[Ac-Xxx-Ala，具有质量可协调基团的Xxx为(a)丙氨酸、(b)丝氨酸、(c)缬氨酸、(d)谷氨酰胺、(e)组氨酸、(f)苯丙氨酸、(g)精氨酸和(h)酪氨酸]的血管紧张素II和亮氨酸脑啡肽的肽混合物的MALDI质谱测定结果。
图9为分别与图8所述的8对不同N-乙酰化二肽MBIT试剂[Ac-Xxx-Ala，具有质量可协调基团的Xxx为(a)丙氨酸、(b)丝氨酸、(c)缬氨酸、(d)谷氨酰胺、(e)组氨酸、(f)苯丙氨酸、(g)精氨酸和(h)酪氨酸]相连的血管紧张素II([MAG(1)+H]+)的MALDI串联质谱测定结果。
图10为显示图9的定量信号质量窗口的示意图，其中还显示了肽的串联质谱测定法得到的220Th或以下的可能片段离子的分布。在N-乙酰化二肽MBIT试剂(Ac-Xxx-Ala)中，显示了具有质量可协调基团的Xxx为(a)丙氨酸、(b)丝氨酸、(c)缬氨酸、(d)谷氨酰胺、(e)组氨酸、(f)苯丙氨酸、(g)精氨酸和(h)酪氨酸时的结果。
图11是与MBIT偶联后检测的亮氨酸脑啡肽离子([MLE(1)+H]+，此处连接H+)的串联质谱测定结果的示意图。在N-乙酰化二肽MBIT试剂(Ac-Xxx-Ala)中，显示了具有质量可协调基团的Xxx为碱性氨基酸(a)组氨酸和(b)精氨酸时的结果。
图12为显示相对于所有片段离子总强度，N-乙酰化二肽MBIT试剂的质量可协调基团的定量信号(XbS，X＝H或L)强度比值和片段离子的定量信号强度(XaS或XbS-NH3)的示意图。误差线表示来自8次重复试验的标准偏差。
图13为显示通过对不同比例的连接MBIT试剂的血管紧张素II的混合物进行串联质谱测定获得的标准定量曲线图。在N-乙酰化二肽MBIT试剂(Ac-Xxx-Ala)中，显示了具有质量可协调基团的Xxx为(a)丙氨酸、(b)丝氨酸、(c)缬氨酸、(d)谷氨酰胺、(e)组氨酸、(f)苯丙氨酸、(g)精氨酸和(h)酪氨酸时的结果。误差线表示来自8次重复试验的标准偏差。
图14为显示通过对不同比例的连接MBIT试剂的亮氨酸脑啡肽的混合物进行串联质谱测定获得的标准定量曲线图。在N-乙酰化二肽MBIT试剂(Ac-Xxx-Ala)中，显示了具有质量可协调基团的Xxx为碱性氨基酸(a)组氨酸和(b)精氨酸时的结果。
图15为显示由N-乙酰化二肽MBIT标记的分析物的定量信号的检测极限的结果。
图16是通过利用胰蛋白酶对等量BSA(牛血清白蛋白)进行酶促水解而产生、并利用N-乙酰化二肽MBIT试剂标记且彼此混合的肽的液相色谱和串联质谱测定结果的示意图。结果显示序列为YLYEIAR的肽的定量结果。在图16中，(a)显示了8对不同的MBIT标记的YLYEIAR肽的液相色谱结果。此外，图16为显示在质量可协调基团为(b)丙氨酸、(c)丝氨酸、(d)缬氨酸、(e)谷氨酰胺、(f)组氨酸、(g)苯丙氨酸、(h)精氨酸和(i)酪氨酸侧链的情况下，由连接MBIT的YLYELAR对的色谱检测到的各组分(fraction)的MALDI串联质谱测定结果的示意图。从定量分析的结果，给出了平均值和标准偏差。
图17为与7对烷基基团MBIT试剂连接的血管紧张素II的MALDI质谱测定结果。显示了质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)乙基(C2)、(b)丙基(C3)、(c)丁基(C4)、(d)戊基(C5)、(e)己基(C6)、(f)庚基(C7)和(g)辛基(C8)的MBIT试剂的MALDI质谱。(Xn为具有质量可协调基团Cn的N-乙酰化氨基酸或N-酰基-丙氨酸)。
图18为与7对烷基基团MBIT试剂连接的血管紧张素II的MALDI串联质谱测定结果，其显示了连接HMBIT的肽和连接LMBIT的肽的混合物(混合比例为1∶1)的串联质谱测量的结果，并显示了与质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)乙基(C2)、(b)丙基(C3)、(c)丁基(C4)、(d)戊基(C5)、(e)己基(C6)、(f)庚基(C7)和(g)辛基(C8)的MBIT相连的血管紧张素II的碰撞诱发解离(CID)谱。(Xn为具有质量可协调基团Cn的N-乙酰化氨基酸或N-酰基-丙氨酸)。
图19是每种MBIT试剂的烷基质量可协调基团的定量信号强度相对于所有片段离子总强度的比值的示意图。
图20为显示各种烷基基团MBIT的定量线性比较的示意图，其中以多种混合比例将连接LMBIT的血管紧张素II和连接HMBIT的血管紧张素II混合，并利用试验比例和预期比例获得定量线性。
图21为显示烷基基团MBIT标记的分析物的定量信号的检测极限结果。将LMBIT标记的血管紧张素II和HMBIT标记的血管紧张素II以2∶1的比例混合，然后将浓度进行两倍连续稀释。进行串联质谱测定以显示定量信号质量(bS)窗口。显示质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)乙基(C2)、(b)丙基(C3)、(c)丁基(C4)、(d)戊基(C5)、(e)己基(C6)、(f)庚基(C7)和(g)辛基(C8)时定量信号的检测极限。
图22为显示通过使用烷基基团MBIT试剂对从四种不同的生理状态(physiological states)获得的血细胞凝集素(HA)-Hsc82蛋白进行定量的示意图。图22(a)中显示了HA-Hsc82蛋白的表达条件；在所述条件下表达HA-Hsc82蛋白，从细胞裂解物中纯化，通过凝胶电泳分离，然后通过SyproRuby染色使其可视化，如图22(b)所示。切下四种条件下HA-Hsc82蛋白的凝胶条带，利用胰蛋白酶酶促水解，然后如图(c)所示与烷基基团MBIT试剂结合。(Xn为具有质量可协调基团Cn的N-乙酰化氨基酸或N-酰基-丙氨酸)。
图23为显示经等量混合并通过ZipTip纯化的图22(c)的六种不同类型的分析物的质谱测定结果的示意图。各种分析物都与质量可协调基团(RT＝Cn)为己基(三角形)、庚基(正方形)和辛基(圆形)的MBIT试剂连接。在所观察的肽中，利用五种肽进行串联质谱测定。(Xn为具有质量可协调基团Cn的N-乙酰化氨基酸或N-酰基-丙氨酸)。
图24为显示使用凝胶成像系统和MALDI串联质谱测定对连接烷基基团MBIT的分析物进行定量的结果比较图。利用三对烷基基团MBIT试剂可以同时对从四种生理状态下获得的Hsc82蛋白的相对量进行定量。
图25为利用质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)己基(C6)、(b)庚基(C7)和(c)辛基(C8)的MBIT标记的五类分析物进行MALDI串联质谱测定的从头测序(de novo sequencing)结果。带下划线的氨基酸表示其序列经过验证。标有星号的氨基酸表示由MBIT标记的氨基酸。
最佳实施方式
本发明提供了下式1表示的变质量标记试剂。
式1
其中各RS和RB分别为直链或支链C1-C18烷基，RS和RB中至少一个包含一个或多个氘原子，RT为质量可协调基团，连接子为诱导与分析物反应的反应性连接子。
本文使用的术语“反应性连接子”是指活性酯，其受胺的亲核攻击而成为离去基团。所述胺为伯胺。此外，所述反应性连接子可选自N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基、苯并三唑-1-基氧基(benzotriazol-1-yloxyl)、五卤代苄基、4-硝基苯基和2-硝基苯组成的组。在本发明的实施方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺基团作为连接子。
本文使用的术语“质量可协调基团”表示与分析物结合且用于通过协调N-乙酰化氨基酸片段的质量来抑制定量信号与串联质谱中的其他片段重叠的基团。可以通过改变RT协调定量信号质量窗口。所述质量可协调基团为天然氨基酸残基或人造氨基酸残基的侧链。
所述质量可协调基团中的天然氨基酸的侧链可以为丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Tyr)的侧链。
此外，所述质量可协调基团可以是直链或支链C2-C18烷基，以及例如乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的直链或支链烷基，从而插入相似或相同的化学性质。
RS和RB含有氘原子，从而可以根据同位素的质量差异进行定量分析。因此，各RS和RB基团分别为直链或支链C1-C18烷基，并且RS和RB中至少一个含有一个或多个氘原子。优选地，RS和RB为甲基或含有一个或多个氘原子的甲基。RS和RB由具有相同数量的碳原子和不同数量的氘原子的烷基构成。在此优选各RS和RB分别为CH3和CD3，或分别为CD3和CH3。也就是说，在所述化合物中，如果RS为CH3，则RB为CD3；或者如果RB为CH3，则RS为CD3。
式1表示具有同位素和受亲核攻击成为离去基团的C-末端胺反应性连接子的N-乙酰化二肽。此外，所述二肽为氘化的二肽。
此外，本发明提供了变质量标记试剂组，其包含两种或多种式1表示的变质量标记试剂。
所述变质量标记试剂组由成对的两种不同的式1所示化合物组成。由于化合物对在RS和RB中包含特定数量的氘原子，可以通过在所得串联质谱中同位素的质量差异区分各样品的质量，进而可以通过比较其相对强度进行蛋白定量。在此优选两种变质量标记试剂中的每个RS和RB分别含有不同数量的氘原子，且所述两种变质量标记试剂含有相同数量的氘原子。
如果化合物1中RS含有的氘原子多于RB，则化合物2中的RB含有的氘原子多于RS。由此使化合物1和2的总质量彼此相同。在本发明的实施方案中，成对地合成在RS和RB中分别具有CH3和CD3的化合物和在RS和RB中分别具有CD3和CH3的化合物。
此外，本发明提供了变质量标记试剂复组，其包含两组或多组变质量标记试剂组。
此外，本发明提供了包含用变质量标记试剂标记的分析物的混合物、其盐或其水合物。在本发明的一个实施方案中，所述胺-反应性连接子的功能是作为离去基团以连接所述化合物与分析物。
因此，所述分析物可以是蛋白、碳水化合物或脂质。此外，所述分析物可以为肽。此外，所述分析物可以为核酸或其衍生物，或者所述分析物可以为类固醇。
此外，本发明提供了同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其包括以下步骤：
将分析物与所述变质量标记试剂组偶联；和
通过将连接变质量标记试剂的分析物片段化对所述分析物进行定量。
在此通过串联质谱测定进行用于定量的片段化。
串联质谱测定法的特征在于通过改变标记试剂的质量可协调基团使定量信号的质量窗口位移。
所述定量信号为选自由bS离子、aS离子、(bS-NH3)离子、yS离子和含有RB的内部片段离子(internal fragement ions)组成的组的一种或多种片段离子。
如果所述质量可协调基团为天然氨基酸的侧链，则定量信号和标签标记如下所示。
当质量可协调基团为甲基时，定量信号(bS)出现在114Th和117Th，其他定量信号(aS)出现在86Th和89Th，标签标记出现在188Th。
当质量可协调基团为丝氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在130Th和133Th，其他定量信号(aS)出现在102Th和105Th，标签标记(b0)出现在204Th。
当质量可协调基团为缬氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在142Th和145Th，其他定量信号(aS)出现在114Th和117Th，标签标记(b0)出现在216Th。
当质量可协调基团为谷氨酰胺侧链时，定量信号(bS)出现在171Th和174Th，其他定量信号(aS)出现在143Th和146Th，标签标记(b0)出现在245Th。
当质量可协调基团为组氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在180Th和183Th，其他定量信号(aS)出现在152Th和155Th，标签标记(b0)出现在254Th。
当质量可协调基团为苯丙氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在190Th和193Th，其他定量信号(aS)出现在162Th和165Th，标签标记(b0)出现在264Th。
当质量可协调基团为精氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在199Th和202Th，其他定量信号(bS-NH3)出现在182Th和185Th，标签标记(b0)出现在273Th。
当质量可协调基团为酪氨酸侧链时，定量信号(bS)出现在206Th和209Th，其他定量信号(aS)出现在178Th和181Th，标签标记(b0)出现在280Th。
如果所述质量可协调基团为人造氨基酸的侧链，则定量信号和标签标记如下所示。
当质量可协调基团为乙基时，定量信号(bS)出现在128Th和131Th，其他定量信号(aS)出现在100Th和103Th，标签标记(b0)出现在202Th。
当质量可协调基团为直链或支链丙基时，定量信号(bS)出现在142Th和145Th，其他定量信号(aS)出现在114Th和117Th，标签标记(b0)出现在216Th。
当质量可协调基团为直链或支链丁基时，定量信号(bS)出现在156Th和159Th，其他定量信号(aS)出现在128Th和131Th，标签标记(b0)出现在230Th。
当质量可协调基团为直链或支链戊基时，定量信号(bS)出现在170Th和173Th，其他定量信号(aS)出现在142Th和145Th，标签标记(b0)出现在244Th。
当质量可协调基团为直链或支链己基时，定量信号(bS)出现在184Th和187Th，其他定量信号(aS)出现在156Th和159Th，标签标记(b0)出现在258Th。
当质量可协调基团为直链或支链庚基时，定量信号(bS)出现在198Th和201Th，其他定量信号(aS)出现在170Th和173Th，标签标记(b0)出现在272Th。
当质量可协调基团为直链或支链辛基时，定量信号(bS)出现在212Th和215Th，其他定量信号(aS)出现在184Th和187Th，标签标记(b0)出现在286Th。
此外，本发明还提供了用于同步肽测序和蛋白定量的方法，其特征在于将所述变质量标记试剂复组与不同分析物连接，然后对所述分析物进行片段化和定量。
此外，本发明还提供了用于多重蛋白定量的分析方法，其中，在偶联分析物和本发明变质量标记试剂复组的定量过程中，通过依赖于质量可协调基团的差异定量信号质量对一种样品和其他不同样品进行单独定量。
下文将参考附图对本发明进行详细阐述。
图1为显示MBIT试剂和策略的基本构思的示意图，其中(a)显示了MBIT试剂的结构，(b)显示了通过偶联MBIT试剂和伯胺进行标记的过程，(c)显示了预期通过串联质谱测定法得到的与MBIT连接的肽的片段离子，和(d)显示了串联质谱。
如图1所示，本发明的化合物1在理论上并不限于具有C-末端胺反应性连接子的N-乙酰化二肽，其功能如图1(a)所述。
如图1(b)所示，所述化合物能够通过与目标肽的伯胺结合(conjugation)而与所述分析物结合。在MBIT对中，除了氘化部分外，各MBIT具有相同的结构式，并方便地表示为HMBIT和LMBIT(H：重；L：轻)，其中，HMBIT具有氘化的Rs，LMBIT具有氘化的RB。连接LMBIT的分析物和HMBIT的分析物的总质量彼此相同。然而，在串联质谱的片段中，如图1(c-d)所示的bS离子，仅包含RS或RB之一的片段具有彼此不同的信号质量(取决于LMBIT和HMBIT)，并且出现在不同的谱区。可以将峰的相对强度定量为连接MBIT的分析物的相对量。相反，包含RS和RB两者或完全不包含RS和RB的片段具有恒定的信号质量，其与LMBIT和HBMIT无关，并且在谱中检测到了b0离子和bS离子。b0离子恒定地出现在谱中，其与LMBIT和HMBIT无关，且作为用于MBIT结合的标签标记。
图2为可作为MBIT策略的质量可协调基团(RT)的氨基酸侧链类型的示意图，其中，(a)显示了可作为MBIT策略的质量可协调基团(RT)的氨基酸侧链以及利用相同氨基酸时的定量信号质量对，和在肽质谱测定时串联质谱中质量范围为220Th或以下的可能片段离子的分布，和(b)显示了8个不同的质量可协调基团(用于本发明中)，其不与质量范围为220Th或以下的可能小质量片段发生显著干扰。
如图2所示，通过改变质量可协调基团(RT)使定量峰位移，而丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)侧链分别在114/117Th、130/133Th、180/183Th、142/145Th、171/174Th、190/193Th、199/202Th和206/209Th产生信号。上述质量可协调基团与串联质谱测定中产生的其他片段离子稍为重叠。除了图2所示的上述质量可协调基团外，也可以将苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)或蛋氨酸(Met)用作质量可协调基团。如图2b所示，在本发明的实施方案中，使用了八种不同的氨基酸侧链：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)的侧链。
图3为显示将烷基基团用作MBIT策略的质量可协调基团(RT)时的MBIT的定量信号，其中，(a)显示了串联质谱中质量范围为220Th或以下的可能小质量片段，和(b)显示了各MBIT的内在标签标记质量和定量信号质量，其依赖于用作质量可协调基团的烷基基团的类型。
通过改变质量可协调基团(RT)使定量信号(bS)位移，且如图3所示甲基(C1)、乙基(C2)、直链或支链丙基(C3)、直链或支链丁基(C4)、直链或支链戊基(C5)、直链或支链己基(C6)、直链或支链庚基(C7)和直链或支链辛基(C8)分别在114/117Th、128/131Th、142/145Th、156/159Th、170/173Th、184/187Th、198/201Th和212/215Th产生信号。当所述质量可协调基团为甲基、乙基、直链或支链丙基、直链或支链丁基、直链或支链戊基、直链或支链己基、直链或支链庚基和直链或支链辛基时，分别在86/89Th、100/103Th、114/117Th、128/131Th、142/145Th、156/159Th、170/173Th和184/187Th检测到由bS的中性CO损失(neutral CO-loss)推导出的其aS离子。当所述质量可协调基团为甲基、乙基、直链或支链丙基、直链或支链丁基、直链或支链戊基、直链或支链己基、直链或支链庚基和直链或支链辛基时，各MBIT的内在标签标记(b0)分别出现在188Th、202Th、216Th、230Th、244Th、258Th、272Th和286Th。
在本发明的一个方面，本发明涉及下式2表示的化合物和连接所述化合物的分析物。
[式2]
Figure G2009800004315D00131
其中，RS和RB为具有一个或多个氘原子的直链或支链C1-C18烷基，RT为质量可协调基团。在本发明中，RS和RB为具有相同数量的碳原子和不同数量的氘原子的烷基。在本发明的实施方案中，如果RS为CH3，则RB为CD3，或者如果RB为CH3，则RS为CD3。在本发明的实施方案中，为了方便起见，所述质量可协调基团RT可以选自由具有相同或相似性质的天然或人造氨基酸侧链组成的组。利用恰当的活化试剂可以将式2所示的化合物转化为式1的化合物。活化试剂的实例可以包括N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的组合、1-苯并三唑(HOBt)/N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的组合、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷(BOP)，而本发明的实施方案使用了NHS/EDC的组合。
图4为显示利用MBIT进行蛋白相对定量和绝对定量的试验流程图，其中(a)显示了在不同条件下产生未知量的相同蛋白的相对定量实验过程，和(b)显示了未知量的经鉴定的蛋白的绝对定量试验过程。
如图4所述，所述MBIT化合物用于同步肽测序和蛋白定量。如图4(a)和4(b)所述，所述MBIT化合物可用于蛋白的相对定量和绝对定量。
按照图4(a)所述的过程进行2重相对定量。分别对两个样品的蛋白(未知量)进行酶切。分别用HMBIT和LMBIT对样品1的肽和样品2的肽进行标记。随后，将其混合并通过色谱分离，接着通过串联质谱测定进行同步肽测序和蛋白定量。
如图4(b)所示，当使用已知量的肽或蛋白进行上述相对定量的过程时，可以实现绝对定量。
图5为显示性质相同但信号质量不同的MBIT组的串联质谱图，并显示了利用两组或更多组MBIT对三种或更多种样品进行同步多重定量的方法。
通过协调质量可协调基团的性质，MBIT组显示不同的定量信号质量和相似的定量信号强度，从而可以进行多重定量。
为了多重定量，首先将在不同条件和环境下产生的蛋白样品进行酶切以制备肽。第一种多重定量按照如下进行。在所制备的肽中，以与比较样品相同的数量制备在一种条件下获得的一种经降解肽的等分试样，并且各等分试样分别与具有不同信号质量的HMBIT(或LMBIT)变质量标记试剂连接。所述比较肽与具有不同信号质量的LMBIT(或HMBIT)变质量标记试剂连接。
第二种多重定量按照如下进行。将所制备的各种肽分为两个等分试样，并与HMBIT(n-1)和LMBIT(n)或LMBIT(n-1)和HMBIT(n)混合。将所有标记肽混合并通过色谱分离。分析各标记肽的等量异位母离子，从而通过串联质谱测定进行测序和定量，由此进行多重定量。
对于第一种多重定量方法，可以通过分析结果的统计组合提高结果的准确性，而分析结果的统计组合是通过对每个比较样品使用各种MBIT进行重复分析或通过在不同条件下选择作为对照的样品而获得的。在由于相对量差异较大而不易于通过一次试验分析相对量的情况下，第二种多重定量方法优于第一种方法。
实施方式
下文将参考实施例和附图对本发明的变质量标记试剂和利用所述变质量标记试剂进行同步肽测序和蛋白定量的分析方法进行详细描述。然而，本发明不应被解释为仅限于本文所列的实施例，此外对所述实施例所作的各种改进和变化并不偏离本发明的范围和精神，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
单独进行以下试验，其中所述质量可协调基团为丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Tyr)侧链，所述质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)。
质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)的MBIT具有二肽结构，通常表示为HXn-Ala或LXn-Ala(H：重，L：轻)。
1.酸式MBIT的合成
通过标准的固相肽合成法或液相有机合成法合成酸式MBIT试剂(XMBIT-OH，X＝L或H)。标准的固相肽合成法可用于制备所有类型的MBIT，其中所述质量可协调基团为氨基酸侧链，相应的质量可协调基团为天然氨基酸的侧链，例如丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)，或者所述质量可协调基团为N-酰基基团或氨基酸侧链，相应的质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)。所述液相有机合成法可用于制备酸式MBIT试剂，其中所述质量可协调基团为氨基酸侧链，相应的质量可协调基团为己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)。
图6为显示利用(a)固相合成法和(b)液相合成法合成N-乙酰化二肽MBIT试剂的方法的示意图。
(a)固相肽合成
材料
无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、哌啶、二氯甲烷(DCM，HPLC级)、三氟乙酸(TFA，HPLC级)、苯甲硫醚(TA，＞99.5％)、乙二硫醇(EDT，＞99.5％)、无水乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和N-Fmoc-丙氨酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。乙酸-d3和N-Fmoc-丙氨酸-3，3，3-d3购自CDN isotope(加拿大多伦多)。2-氯三苯甲基树脂购自Merck。N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-苯并三唑和其他N-Fmoc保护的氨基酸购自AdvancedChemTech(Louisville，KY)。
合成
1)步骤1
将N-Fmoc-丙氨酸或N-Fmoc-丙氨酸-3，3，3-d3(75mg)溶解到脱水的DCM溶液(1mL)中，并通过加入DMF(100μL)使其完全溶解。将所制备的N-Fmoc氨基酸溶液和DIPEA(170μL)与经加热干燥的小瓶中所含的2-氯三苯甲基树脂(0.1g)混合，并将混合物温和搅拌2-4小时。将树脂加入到适合用于肽合成的聚丙烯筒(总体积为5mL)，并利用DCM/甲醇/DIPEA(17/2/1，v/v/v)的混合溶液清洗三次。此后，用DCM清洗树脂三次，并利用DMF清洗两次。随后，再用DCM清洗树脂两次，从其中除去溶液，在减压下将其完全干燥。
2)步骤2
向步骤1制备的干燥树脂中加入约3mL DMF，并搅拌2-3分钟。重复5次除去DMF的过程，并将树脂充分浸在DMF中。向树脂中加入含25％哌啶的DMF溶液(约3mL)，并搅拌5分钟以除去溶液。接着，再次向树脂中加入25％的哌啶溶液(约3mL)，并搅拌15分钟以除去溶液。随后，用DMF清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，并用DMF清洗三次。
3)步骤3
质量可协调基团为氨基酸侧链的MBIT试剂的合成如下所示。
向步骤2制备的树脂中加入含N-Fmoc-氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸中的一种)的DMF溶液(0.6M，1mL)。分别向其中加入1mL含0.6M 1-苯并三唑和DIC的DMF溶液，并搅拌2小时30分钟。除去混合溶液后，用DMF充分清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，并用DMF清洗三次。
质量可协调基团为酰基的MBIT试剂的合成如下所示。
向步骤2制备的结合丙氨酸-d3(或丙氨酸-d0)的树脂中分别加入1mL含0.6M N-Fmoc-丙氨酸-d0(或N-Fmoc-丙氨酸-3，3，3-d3)、1-苯并三唑和DIC的DMF溶液，并缓慢搅拌2小时30分钟。除去混合溶液后，用DMF充分清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，并用DMF清洗三次。
4)步骤4
向步骤3制备的树脂中加入约3mL含25％哌啶的DMF溶液，并搅拌5分钟。除去溶液后，向树脂中加入含25％哌啶的DMF溶液(3mL)，并搅拌15分钟。随后，用DMF充分清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，并用DMF清洗三次。
5)步骤5
质量可协调基团为氨基酸侧链的MBIT试剂的合成如下所示。
向步骤4制备的树脂中加入含乙酸-d0或乙酸-d3的DMF溶液(0.6M，1mL)。如果用N-Fmoc-丙氨酸-d0处理树脂，则使用乙酸-d3。如果用N-Fmoc-丙氨酸-3，3，3-d3处理树脂，则使用乙酸-d0。此外，向树脂中分别加入1mL含0.6M 1-苯并三唑和DIC的DMF溶液，并缓慢搅拌2小时30分钟。除去混合溶液后，用DMF充分清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，用DMF清洗三次，并用甲醇清洗三次。随后，在减压下完全干燥树脂，并将其转移到小瓶中。
质量可协调基团为N-酰基的MBIT试剂的合成如下所示。
此外，向步骤4制备的树脂中分别加入1mL含0.6M羧酸(丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸或壬酸)、1-苯并三唑和DIC的DMF溶液，并缓慢搅拌2小时30分钟。除去混合溶液后，用DMF充分清洗树脂三次，用甲醇清洗三次，用DMF清洗三次，并用甲醇清洗三次。随后，在减压下完全干燥树脂，并将其转移到小瓶中。
6)步骤6
向步骤5制备的树脂中加入TFA/苯/TA/蒸馏水/EDT(16.5/1/1/I/0.5，v/v/v/v)的混合溶液(2mL)，并搅拌3小时。在该过程中，将合成的酸式MBIT试剂从树脂上切下。过滤取出树脂，收集剩余的溶液并通过氮气将其干燥至体积为200μL或更小。向所述溶液中加入冷醚以沉淀出白色粉末(酸式MBIT试剂)。利用冷醚清洗所述沉淀产物三或四次，并在减压下将其完全干燥。
(b)液相有机合成
材料
2-氨基-4-戊烯酸、无水乙酸(Ac2O-d0)、Boc-1-丙氨酸-d0、TFA、4-辛烯、5-癸烯、1-庚烯和Grubbs′s催化剂(第二代)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，全氘化无水乙酸(Ac2O-d6)购自CDN Isotopes(加拿大魁北克)。
合成
1)步骤1
将2-氨基-4-戊烯酸(2mmol)溶于水(pH 9-10，4mL)，并在0℃向其中加入无水乙酸-d0或无水乙酸-d3(4.0mmol)。向其中加入8M NaOH，将其pH调整至10。在0℃搅拌溶液4小时。向该溶液中加入浓盐酸溶液，以将pH调整至2或更低。将所产生的物质溶解在甲醇中，纯化并干燥以回收固体的2-乙酰氨基-4-戊烯酸。
2)步骤2
向N-Boc保护的丙氨酸中加入苄基溴以产生N-Boc-丙氨酸苄酯，然后通过加入TFA以除去Boc，从而制备丙氨酸苄酯。向0.33M含l-丙氨酸-d3(1mmol)的二氧杂环己烷和水(2/1，v/v)混合溶液中加入1.5mL 1MNaOH和二叔丁基碳酸氢酯(1.1mmol)，然后在室温下搅拌6小时。在二氧杂环己烷挥发后，利用冰冷却混合物，并向所述混合物中加入饱和的KHSO4溶液，从而将pH调整至2-3。利用10mL乙酸乙酯(EA)萃取有机产物三次，并用无水Na2SO4干燥。通过硅胶色谱纯化产物，从而产生N-Boc-dl-丙氨酸-d3(0.14g，0.74mmol)。将0.5mmol N-Boc-dl-丙氨酸-d0或N-Boc-dl-丙氨酸-d3溶解在无水丙酮(5mL)中，并向其中加入碳酸钾(0.75mmol)和苄基溴(0.55mmol)。回流5小时后，将反应产物冷却至室温，浓缩，然后溶解在氯仿(10mL)中。利用浓缩的碳酸钠水溶液(30mL)清洗有机层，并用Na2SO4干燥，随后进行硅胶色谱从而产生白色固体N-Boc-dl-丙氨酸-d0苄酯或N-Boc-dl-丙氨酸-d3苄酯。将N-Boc-dl-丙氨酸-d0苄酯或N-Boc-dl-丙氨酸-d3苄酯(0.98mmol)溶解在DCM(10mL)中，在0℃向其中加入8mmol TFA，并搅拌1小时。减压除去溶剂，并在高真空下干燥残留物。将油产物(丙氨酸-d0苄酯或丙氨酸-d3苄酯)保存在无水THF(2mL)中。
3)步骤3
向步骤2制备的含丙氨酸-d0苄酯或丙氨酸-d3苄酯(0.55mmol)的THF(5mL)中加入BOP试剂(1.01mmol)，并在室温下搅拌30分钟。在0℃向其中加入DIPEA(3.36mmol)，并在室温下搅拌15分钟。随后，向其中加入步骤1制备的含2-乙酰-d3-氨基-4-戊烯酸或2-乙酰-d0-氨基-4-戊烯酸的无水THF，并在室温下搅拌过夜。在溶剂挥发后，将残留物溶解在EA中。用水清洗有机层。通过快速硅胶色谱纯化剩余的油状产物，从而产生无色固体2-(2-乙酰氨基-4-戊烯氨基)丙酸苄酯。
4)步骤4
向DCM中加入步骤3制备的2-(2-乙酰氨基-4-戊烯氨基)丙酸苄酯、烯烃(4-辛烯、5-癸烯或1-庚烯)和Grubbs′s催化剂，并在40℃回流24小时。除去催化剂和溶剂后，通过硅胶色谱纯化产物。将反应产物与含20mol％Pd(OH)2的无水甲醇混合，然后在1atm H2压力下室温搅拌过夜。过滤除去催化剂后，在真空下浓缩产物，随后利用甲醇和醚(1∶1，v/v)的混合溶液进行重结晶，从而产生酸式MBIT试剂。
2.将MBIT试剂和目标肽偶联
材料
无水乙腈(ACN，HPLC级)、无水DMF、盐酸羟胺、三氟乙酸(TFA，HPLC级)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自Pierce(Rockford，Il)。牛血清白蛋白(BSA)购自Calbiochem(SanDiego，CA)。
制备MBIT试剂的活性酯并与模型肽偶联
图7为显示用于形成MBIT试剂的活性酯，并将形成的MBIT的活性酯与目标肽偶联的试验方法的示意图。
图7显示了制备MBIT试剂的琥珀酰亚胺酯(OSu)并将其与模型肽偶联的方法。将XMBIT-OH(X＝L或H)、EDC和NHS溶解在DMF中直至终浓度分别为60mM、35mM和40mM，并在室温下搅拌45分钟。所制备的XMBIT-OSu溶液直接用于偶联分析物，而无需其他的纯化。
将血管紧张素II(DRVYIHPF)或亮氨酸脑啡肽(YGGFL)用作模型肽。当利用质量可协调基团为天然氨基酸侧链(例如，丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Try))的N-乙酰化二肽MBIT试剂进行试验时，使用血管紧张素II和亮氨酸脑啡肽(摩尔比例为1∶1)的模型肽混合物。当利用质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)的MBIT试剂进行试验时，仅使用血管紧张素II作为模型肽。
将所述模型肽或肽混合物溶解在50mM碳酸氢钠(NaHCO3)缓冲液中直至浓度为0.4mM。将10μL模型肽溶液与所制备的10μL LMBIT-OSu或HMBIT-OSu溶液混合，并在室温下搅拌5小时。然后，向其中加入10μL羟胺溶液(含80mM羟胺的100mM NaHCO3溶液)，并搅拌5小时或更长从而逆转副反应并使过量的MBIT-OSu试剂失活。利用5μl 10％TFA终止反应。
MBIT与BSA的胰蛋白酶切肽(Tryptic Peptides)的结合
利用质量可协调基团为天然氨基酸的侧链(例如丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Tyr))的MBIT试剂进行与BSA的胰蛋白酶切肽的结合。
将溶于100mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.1)的BSA(0.6mg/mL)与溶于0.1％乙酸的修饰胰蛋白酶(0.1μg/μL)以60∶1的质量比混合，并在38℃温育12小时。将经胰蛋白酶切的肽分成两个16μL的等分试样，并与HMBIT-OSu或LMBIT-OSu溶液(14μL)混合，并搅拌30分钟。此外，加入6μL HMBIT-OSu或LMBIT-Osu溶液，并搅拌30分钟至2小时。随后，加入10μL 100mM羟胺，并搅拌4小时或更长以逆转副反应。除去残留的XMBIT-Osu。利用10μl 10％TFA终止反应。
MBIT与Hsc82p的胰蛋白酶切肽的结合
利用质量可协调基团(RT＝Cn)为己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)的MBIT试剂与Hsc82的胰蛋白酶切肽进行结合。
从四种生理状态获得N-末端带有血管紧张素(HA)标记的Hsc82蛋白。如图22(a)所示，根据与Hsc82共存的Hsp82蛋白(该蛋白是Hsp90家族的一员)和酵母生长温度的组合，将HA-Hsc82蛋白的表达条件分为四组。Norm 30表示将具有Hsp82和Hsc82蛋白的酵母在30℃下培养，norm 39表示将具有Hsp82和Hsc82蛋白的酵母在39℃下培养以进行热诱导，del 30表示将缺乏Hsp82蛋白的酵母在30℃下培养，del 39表示将缺乏Hsp82蛋白的酵母在39℃下培养以进行热诱导。从细胞裂解液中分离在所述条件下表达的HA-Hsc82蛋白，利用抗-HA基质(克隆3F10，Roche)纯化，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离。通过Sypro Ruby染色(Molecular Probes，Eugene，OR)使表达的HA-Hsc82蛋白可视化，并利用VersaDoc 5000MP凝胶成像系统(Bio-Rad，Hercules，CA)进行定量。
为了获得Hsc82肽，利用胰蛋白酶对各个样品进行如下所述的酶切。从凝胶中切出蛋白条带并在100mM NaHCO3缓冲液中温育20分钟。除去缓冲液后，将凝胶切成小块，并向其中加入ACN以除去水。向各个样品中加入含0.66μg胰蛋白酶的50mM NaHCO3缓冲液，并在37℃温育20小时。通过利用蒸馏水和ACN的混合溶液使凝胶块膨胀，从而提取胰蛋白酶切肽，并将其干燥。
向各干燥样品中加入蒸馏水(35μL)。将各样品溶液的等分试样(4μL)与HMBIT-OSu或LMBIT-OSu溶液(4μL)混合，并搅拌5小时。此时，norm 39和LX6-Ala；del 30和LX7-Ala；del 39和LX8-Ala；norm 30和HX6-Ala；HX7-Ala和HX8-Ala相互反应。随后，加入羟胺溶液(80mM，4μL)，并搅拌5小时或更长以逆转副反应并使过量MBIT-OSu试剂失活。利用2μl 10％TFA终止反应。
MBIT-模型肽的MALDI样品的制备
在0.1％的TFA中将连接XMBIT的模型肽溶液稀释500倍，以进行MALDI分析。以七种不同的比例([L]/[H]＝1/1、2.3/1、4/1、6.3/1、9/1、12.3/1、16/1)混合LMBIT和HMBIT-模型肽。以1∶1的体积比例将各个样品与基质溶液(含5mg/mL HCCA的50/50/0.1H2O/ACN/TFA)混合。将样品/基质混合物(1μL)上样至MALDI靶标板上。每点(spot)中模型肽、血管紧张素II和亮氨酸脑啡肽的总量为250fmol。
与连接MBIT的BSA和Hsc82p的胰蛋白酶切肽的LC-MALDI样品制备
以1∶1的比例将连接HMBIT或LMBIT的胰蛋白酶切肽混合，并将等分试样(6.4μL)注射到装配有PepMap柱(100-孔，3-m粒径，75-m i.d.，长150-mm)的反相纳米液相色谱(RP-nano-LC)系统(LC Packings，Sunnyvale，CA)中。利用两个溶剂梯度(H2O/ACN/TFA＝95/5/0.1(溶剂A)和ACN/TFA＝100/0.1(溶剂B))以0.3μL/分钟的流速运行液相色谱(LC)60分钟。[A]/[B]梯度在起始时为100/0，在第0-20分钟变为30/70，在第20-40分钟变为0/100，并在第40-45分钟保持0/100，然后在第45分钟迅速降低并在第45-60分钟保持在100/0。利用Probot微组分收集器(Dionex，Sunnyvale，CA)每25秒在带有基质溶液的单个MALDI点上收集洗脱的肽。在60分钟内将样品洗脱到总数为144的MALDI点上。
MALDI-MS和MS/MS
为了分析涂到MALDI靶标的样品，在500-2500Th质量范围使用阳性模式的4700蛋白质组学分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在每个MALDI点，通过累积1000个单激光发射谱获得飞行时间(TOF)质谱。
根据质量可协调基团RT检测不同m/z值下连接XMBIT的模型肽离子，并选择连接XMBIT的模型肽作为用于串联质谱测定的母离子。在不同的洗脱时间检测连接XMBIT的BSA的胰蛋白酶切肽。
对于串联质谱测定，在1.3×10-6托空气下进行CID。通过加和2000个单激光发射谱获得CID谱。利用ABI-4700Data Explore软件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)校正CID质谱的基线。校正基线后，将LbS和HbS离子的高度用于相对定量。利用PEAKS 4.5(Bioinformatics Solutions Inc.，加拿大)分析各CID谱，以进行从头测序。
3.MBIT的试验结果
(a)包括丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Tyr)的天然氨基酸残基的质量可协调基团。
-N-乙酰化二肽MBIT的确定
为了确定N-乙酰化二肽MBIT，利用各种MBIT试剂标记血管紧张素II(1045.5Da)，从而测定[MAG(1)+H]+离子的信号质量(图8)，并进行串联质谱测定(图9)。连接LMBIT的血管紧张素II和HMBIT的血管紧张素II在同一质量出现。当质量可协调基团为丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸的侧链时，分别在1233.6Th、1249.6Th、1261.7Th、1290.7Th、1299.7Th、1309.7Th、1318.7Th和1325.7Th检测[MAG(1)+H]+离子。当质量可协调基团为丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸的侧链时，标签标记和定量信号质量分别出现在188Th(b0)、114Th(LbS)和117Th(HbS)，204Th(b0)、130Th(LbS)和133Th(HbS)，216Th(b0)、142Th(LbS)和145Th(HbS)，245Th(b0)、171Th(LbS)和174Th(HbS)，254Th(b0)、180Th(LbS)和183Th(HbS)，264Th(b0)、190Th(LbS)和193Th(HbS)，273Th(b0)、199Th(LbS)和202Th(HbS)，以及280Th(b0)、206Th(LbS)和209Th(HbS)。结果表明，可以利用天然氨基酸侧链便利地合成N-乙酰化二肽MBIT试剂。
-连接N-乙酰化二肽MBIT的模型肽的串联质谱测定
图8为连接8对N-乙酰化二肽MBIT试剂的血管紧张素II和亮氨酸脑啡肽的肽混合物的MALDI质谱测定的结果，其中，图8(a-h)显示了连接具有图2(b)所示的八种质量可协调基团RT的八对MBIT试剂的模型肽的MALDI-TOF质谱。如图8所示，[MXX(n)+H]+中的XX代表肽的类型(AG＝血管紧张素II，LE＝亮氨酸脑啡肽)，n代表与肽连接的MBIT试剂的数量。在N-乙酰化二肽MBIT试剂(N-乙酰基-Xxx-Ala或Ac-XA)中，显示具有质量可协调基团的Xxx(或X)为(a)丙氨酸、(b)丝氨酸、(c)缬氨酸、(d)谷氨酰胺(e)组氨酸、(f)苯丙氨酸、(g)精氨酸和(h)酪氨酸时的各MALDI-TOF谱。当质量可协调基团为丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸时，分别在1233.6Th、1249.6Th、1261.7Th、1290.7Th、1299.7Th、1309.7Th、1318.7Th和1325.7Th检测对应于血管紧张素II的[MAG(1)+H]+离子。此外，当质量可协调基团为组氨酸或精氨酸时，分别在809.5Th和828.5Th检测到对应于亮氨酸脑啡肽的[MLE(1)+H]+离子。通过将各MBIT试剂与模型肽偶联而提高的质量值与理论上预期由各MBIT试剂提高的质量值相同，这表明成功地合成了各MBIT试剂。
仅在用具有碱性质量可协调基团(RT)的MBIT标记后，才能检测到亮氨酸脑啡肽。不论质量可协调基团RT的类型，在MALDI谱中检测到所有连接MBIT的血管紧张素II([MAG(1)+H]+)。检测到表明在血管紧张素II的酪氨酸侧链发生副反应的[MAG(2)+H]+，但强度弱于[MAG(1)+H]+。如图8(e)所示，仅当质量可协调基团RT为组氨酸侧链(Ac-HAMBIT)时，才能检测到大量未反应血管紧张素II([MAG(0)+H]+)，这简单地可以通过改进Ac-HAMBIT的合成和纯化过程中的试剂纯度来避免。根据图8显示的相对强度，推测除了Ac-HAMBIT之外，其他MBIT与肽的偶联进行完全。
与血管紧张素II不同，亮氨酸脑啡肽在其肽序列中没有碱性氨基酸，因此不易于在MALDI质谱中检测。然而，如图8(e)和(g)所示，当具有碱性质量可协调基团RT的Ac-HA和Ac-RA MBIT与亮氨酸脑啡肽相连时，在MALDI质谱中检测到强的信号，这表明具有碱性质量可协调基团的MBIT试剂提高了在已知MALDI质谱中不易检测的肽的电离产量，从而可以在MALDI质谱中对其进行检测。
图9为分别与8对不同的N-乙酰化二肽MBIT试剂相连的血管紧张素II([MAG(1)+H]+)的MALDI串联质谱测定结果，其中对于每对MBIT试剂，以1∶1的混合比例将连接HMBIT的肽和连接LMBIT的肽混合以进行串联质谱测定。在图9(a-h)中，显示了连接具有不同氨基酸残基的MBIT试剂的血管紧张素II的CID谱，其中各个CID谱分别显示了与Ac-AA、Ac-SA、Ac-VA、Ac-QA、Ac-HA、Ac-FA、Ac-RA或Ac-YA MBIT连接的血管紧张素II，各MBIT试剂均具有1/1的[L]/[H]比。由于MBIT试剂与N-末端伯胺相连，不论MBIT试剂的类型，在相同的m/z值检测到y型片段离子。相反，根据质量可协调基团的类型，在不同的m/z值检测到a型或b型片段。除了图9(g)中的Ac-RA MBIT外，其他七种不同的MBIT在CID谱中显示相似的片段离子分布。可以看出，Ac-RA MBIT具有影响片段离子分布的强碱性精氨酸侧链。根据MBIT的类型，在不同的m/z值出现标签标记(b0)和定量信号质量XbS离子对(X＝L或H)。Ac-AA MBIT、Ac-SA MBIT、Ac-VAMBIT、Ac-QA MBIT、Ac-HA MBIT、Ac-FA MBIT、Ac-RA MBIT和Ac-YAMBIT分别在188Th(b0)、114Th(LbS)、117Th(HbS)；204Th(b0)、130Th(LbS)、133Th(HbS)；216Th(b0)、142Th(LbS)、145Th(HbS)；245Th(b0)、171Th(LbS)、174Th(HbS)；254Th(b0)、180Th(LbS)、183Th(HbS)；在264Th(b0)、190Th(LbS)、193Th(HbS)；273Th(b0)、199Th(LbS)、202Th(HbS)；和280Th(b0)、206Th(LbS)、209Th(HbS)显示标签标记离子和定量信号离子对，这与图2(b)中的预测值相符，说明成功地合成了N-乙酰化的二肽MBIT试剂。
XbS离子对可能会被在CID过程中的剩余能量进一步解离。如图9所示，在182Th、185Th检测到由Ac-RA MBIT的精氨酸侧链的中性NH3-损失而来的XbS-NH3。在其他七种不同的MBIT中，Ac-AA MBIT、Ac-SAMBIT、Ac-VA MBIT、Ac-QA MBIT、Ac-HA MBIT、Ac-FA MBIT和Ac-YAMBIT分别在在86Th(LaS)和89Th(HaS)；102Th(LaS)和105Th(HaS)；114Th(LaS)和117Th(HaS)；143Th(LaS)和146Th(HaS)；152Th(LaS)和155Th(HaS)；162Th(LaS)和165Th(HaS)；和178Th(LaS)和181Th(HaS)显示由XbS的中性CO-损失而来的XaS离子(28Da损失)。
图10为显示各类型MBIT的定量信号XbS的示意图。如图10所示，发现[LbS]/[HbS]比几乎等于比值为1/1的[L]/[H]比。Ac-AA MBIT显示未知化学噪音，推断其来自肽，其接近于显示XbS对的114Th和117Th。Ac-SAMBIT显示相对弱的信号，并且其信号强度比不等于1/1的比值。然而，其他六种不同的MBIT几乎没有出现化学噪音，且其信号强度比值几乎等于1/1。
图11为连接MBIT的亮氨酸脑啡肽离子的CID谱的结果，其中(a)为连接Ac-HA的亮氨酸脑啡肽的结果，(b)为连接Ac-RA的亮氨酸脑啡肽的结果。与上述连接MBIT的血管紧张素II的CID结果相似，不论MBIT试剂的类型，在相同区间检测到y型离子；但根据质量可协调基团的类型，在不同区间检测到a型或b型离子。此外，由于连接Ac-RA的亮氨酸脑啡肽具有N-末端精氨酸侧链，在a型和b型离子中检测到中性NH3-损失。连接Ac-HA的亮氨酸脑啡肽和Ac-RA的亮氨酸脑啡肽分别在片段离子分布中显示出巨大的差异，这表明可以根据MBIT的类型协调目标肽的物理和化学性质，并且质量可协调基团RT为分析物的定量信号质量和性质提供了可协调性。
图12为显示各MBIT试剂的定量信号强度与所有片段离子的总强度的比值。为了准确定量，定量信号XbS离子强度应该强，并且不应发生定量信号离子的额外解离。相对于定量信号质量，质量可协调基团为谷氨酰胺或组氨酸侧链的MBIT试剂显示最强的定量信号，而其他片段离子的强度较弱。由于其XbS离子强度最强，质量可协调基团为组氨酸侧链时的定量信号比丙氨酸侧链时扩增5倍或更多。当质量可协调基团为谷氨酰胺侧链时，由XbS的额外解离产生的XaS离子显示最弱的强度。这些结果表明，质量可协调基团为组氨酸或谷氨酰胺侧链的MBIT在肽和蛋白的定量分析中表现最佳。
图13为显示各种MBIT的定量线性的示意图，其中，以如上所述的多种混合比例将连接LMBIT的血管紧张素II和连接HMBIT的血管紧张素II混合，并使用试验比例和预期比例从而获得定量线性。发现除了Ac-SAMBIT外，七种不同的MBIT在血管紧张素II的定量分析中显示优异的线性。具体而言，质量可协调基团为谷氨酰胺侧链的Ac-QAMBIT和质量可协调基团为组氨酸侧链的Ac-HAMBIT在所观察的比例中显示最小的标准偏差(测量值的20％以内)和优异的线性，这是由于Ac-QA MBIT和Ac-HAMBIT的强定量信号强度而获得的。所述结果表明，Ac-QA MBIT和Ac-HA MBIT在肽和蛋白的定量分析中显示的性能最佳。Ac-SA MBIT显示的性能差且不具线性，这是因为与Ac-SAMBIT相连的血管紧张素II在CID中的定量信号强度弱于其他MBIT，并且在130Th和133Th检测到未预料到的化学噪音。所述化学噪音与在没有MBIT标记的血管紧张素II中检测到的相同。
图14为显示由连接Ac-HA MBIT的亮氨酸脑啡肽或Ac-RAMBIT的亮氨酸脑啡肽获得的亮氨酸脑啡肽的定量线性图。与图13中血管紧张素II的结果相同，试验比例和期望比例具有良好的定量线性。
图15为N-乙酰化二肽MBIT标记的分析物的定量信号的检测极限的结果。以3∶1的比例将LMBIT-标记的血管紧张素II和HMBIT-标记的血管紧张素II混合，然后进行串联质谱测定以显示定量信号质量(bS)窗口。显示了N-乙酰化二肽MBIT试剂(Ac-Xxx-Ala)中具有质量可协调基团的Xxx为(a)缬氨酸、(b)谷氨酰胺、(c)组氨酸、(d)苯丙氨酸、(e)精氨酸和(f)酪氨酸时的定量信号的检测极限。
将250fmol样品上样至MALDI点，进行两倍连续稀释以观察定量信噪比。发现检测极限达到约4-8fmol。所述检测极限与MALDI质谱测定法的检测极限相对应。因此，可以预期通过使用较好的设备可以提高MBIT试剂的检测极限。
图16为显示了利用胰蛋白酶对等量的BSA(牛血清白蛋白)进行酶促水解产生、并利用N-乙酰化二肽MBIT试剂标记并彼此混合的肽的液相色谱和串联质谱测定结果的示意图。结果显示序列为YLYEIAR的肽的定量。在图16中，(a)显示利用八对不同MBIT标记的YLYEIAR肽的液相色谱的结果。此外，图16为显示质量可协调基团为(b)丙氨酸，(c)丝氨酸，(d)缬氨酸，(e)谷氨酰胺，(f)组氨酸，(g)苯丙氨酸，(h)精氨酸和(i)酪氨酸侧链的情况下，由连接MBIT的YLYELAR对的色谱检测到的各组分的MALDI串联质谱测定的结果图。对于定量分析的结果，给出了平均值和标准偏差。由于液相色谱通常用于蛋白定量和测序，在色谱中连接HMBIT和LMBIT的肽应在相同时间洗脱，以有利于MBIT在蛋白定量和测序中获得的性能。发现连接HMBIT和连接LMBIT的肽的各组分具有恒定的混合比例，这表明这些肽在色谱中的洗脱时间相同。
(b)质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)
-烷基基团MBIT的确定
为了确定烷基基团MBIT，利用各MBIT试剂标记血管紧张素II(1045.5Da)，从而测定[MAG(1)+H]+离子的信号质量(图17)，并进行串联质谱测定(图18)。连接LMBIT的血管紧张素II和HMBIT的血管紧张素II在同一质量出现。当质量可协调基团为乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基时，分别在1247.7Th、1261.7Th、1275.7Th、1289.7Th、1303.7Th、1317.7Th和1331.8Th检测到[MAG(1)+H]+离子。当质量可协调基团为乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基时，标签标记和定量信号质量分别出现在202Th(b0)、128Th(LbS)和131Th(HbS)；216Th(b0)、142Th(LbS)和145Th(HbS)；230Th(b0)、156Th(LbS)和159Th(HbS)；244Th(b0)、170Th(LbS)和173Th(HbS)；258Th(b0)、184Th(LbS)和187Th(HbS)；272Th(b0)、198Th(LbS)和201Th(HbS)；286Th(b0)、212Th(LbS)和215Th(HbS)。结果表明可以便利地合成质量可协调基团为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)或辛基(C8)的烷基基团MBIT试剂。
-连接烷基基团MBIT的模型肽的串联质谱测定
为了确定烷基基团MBIt试剂与肽的反应性，将血管紧张素II(1045.5Da)与各MBIT试剂连接，以进行质谱测定。图17为与七对烷基基团MBIT试剂相连的血管紧张素II的MALDI-质谱测定结果。显示了质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)乙基(C2)、(b)丙基(C3)、(c)丁基(C4)、(d)戊基(C5)、(e)己基(C6)、(f)庚基(C7)和(g)辛基(C8)的MBIT试剂的MALDI质谱。如图17所示，当质量可协调基团为乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基时，分别在1247.7Th、1261.7Th、1275.7Th、1289.7Th、1303.7Th、1317.7Th和1331.8Th检测到信号。另外，还通过串联质谱测定分析了各个分析物的标签标记和定量信号质量。没有观察到未反应的肽或与两种或更多种MBIT连接的肽，观察到仅与一种MBIT连接的血管紧张素II，这表明偶联成功。
此外，为了确定相应MBIT试剂的定量信号质量，对与七种不同的MBIT试剂偶联的血管紧张素II离子进行MALDI串联质谱测定。图18显示了连接HMBIT的肽和连接LMBIT的肽的混合物(混合比例为1∶1)的串联质谱测定的结果。图18(a-g)显示了与质量可协调基团(RT＝Cn)分别为乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)和辛基(C8)的MBIT相连的血管紧张素II的CID谱。如根据图3(b)所示的值的预期，当质量可协调基团为乙基时，标签标记和定量信号质量出现在202Th(b0)、128Th(LbS)和131Th(HbS)；当质量可协调基团为丙基时，标签标记和定量信号质量出现在216Th(b0)、142Th(LbS)和145Th(HbS)；当质量可协调基团为丁基时，标签标记和定量信号质量出现在230Th(b0)、156Th(LbS)和159Th(HbS)；当质量可协调基团为戊基时，标签标记和定量信号质量出现在244Th(b0)、170Th(LbS)和173Th(HbS)；当质量可协调基团为己基时，标签标记和定量信号质量出现在258Th(b0)、184Th(LbS)和187Th(HbS)，当质量可协调基团为庚基时，标签标记和定量信号质量出现在272Th(b0)、198Th(LbS)和201Th(HbS)；当质量可协调基团为辛基时，标签标记和定量信号质量出现在286Th(b0)、212Th(LbS)和215Th(HbS)。由于MBIT试剂与N-末端伯胺相连，在相同的m/z值检测到具有C-末端的y型片段离子，其与MBIT试剂的类型无关。此外，所有MBIT在CID谱中显示相似的片段离子分布。可以看出，各质量可协调基团的长度差异不影响片段离子分布。所述结果表明成功合成了烷基基团MBIT试剂并成功地与模型肽进行了偶联。
图19为显示各种MBIT试剂的烷基质量可协调基团的定量信号强度相对于所有片段离子总强度的比值的示意图。当质量可协调基团为丙基至辛基时，XbS的相对强度为3.8％。当质量可协调基团为甲基和乙基时，XbS的相对强度分别为1.9％和2.7％，这低于其他MBIT的XbS的相对强度。质量可协调基团的长度越长，XaS的强度越强。
图20为显示各种烷基基团MBIT的定量线性比较的示意图，其中以多种混合比例将连接LMBIT的血管紧张素II和连接HMBIT的血管紧张素II混合，并使用试验比例和预期比例从而获得定量线性。
图20(a-g)显示当质量可协调基团为乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基时，MBIT定量信号、XaS(白圈)和XbS(黑圈)的定量分析结果。虚线代表利用XaS的试验结果，实线代表利用XbS的试验结果。发现本发明使用的所有MBIT都在血管紧张素II的定量分析中显示出优异的线性。利用XaS的定量分析显示与XbS相似的优异线性，这表明XaS和XbS都可以用于定量分析。
图21为显示标记烷基MBIT的分析物的定量信号的检测极限的结果。LMBIT-标记的血管紧张素II和HMBIT-标记的血管紧张素II以2∶1的比例混合，然后将浓度进行两倍连续稀释。进行串联质谱测定以显示定量信号质量(bS)窗口。显示当质量可协调基团(RT＝Cn)为(a)乙基(C2)、(b)丁基(C4)、(c)、戊基(C5)、(d)己基(C6)、(e)庚基(C7)和(f)辛基(C8)时的定量信号的检测极限。
将250fmol样品上样至MALDI点，进行两倍连续稀释以观察定量信噪比。发现所有样品的检测极限都为约5fmol。所述检测极限与MALDI质谱测定法的检测极限相对应。因此，可以预期通过使用较好的设备可以提高MBIT试剂的检测极限。
图22为显示从四种不同的生理状态获得的HA-Hsc82蛋白的定量以及各样品中使用的MBIT试剂的示意图。HA-Hsc82蛋白的表达条件示于图22(a)中。Norm 30表示将具有Hsp82和Hsc82蛋白的酵母在30℃下培养，norm 39表示将具有Hsp82和Hsc82蛋白的酵母在39℃下培养，del 30表示将缺乏Hsp82蛋白的酵母在30℃下培养，del 39表示将缺乏Hsp82蛋白的酵母在39℃下培养。从细胞裂解液中纯化在所述条件下表达的HA-Hsc82蛋白，随后通过凝胶电泳分离。如图(b)所示，通过Sypro Ruby染色使表达的HA-Hsc82可视化。根据利用凝胶成像系统的定量结果，norm 30为3.49μg，norm 39为5.74μg，del 30为2.93μg，del 39为4.90μg。从凝胶上切下在四种不同条件下表达的HA-Hsc82蛋白的蛋白条带。在胰蛋白酶切后，如图22(c)所示，将肽与MBIT试剂偶联。此时，norm 39和LX6-Ala相互反应，del 30和LX7-Ala相互反应，del 39和LX8-Ala相互反应，norm 30和HX6-Ala相互反应，HX7-Ala和HX8-Ala相互反应(Xn为质量可协调基团为Cn的N-乙酰化氨基酸或N-酰基-丙氨酸)。对LMBIT和HMBIT的1∶1混合物进行定量。当质量可协调基团为己基、庚基和辛基时，预期比例分别为1.64、0.84和1.40(norm 30∶norm 39∶del 30∶del 39＝1∶1.64∶0.84∶1.40)。
图23为显示经等量混合并通过ZipTip纯化的图22(c)的六种不类分析物的质谱测定结果的示意图。各种分析物都与质量可协调基团(RT＝Cn)为己基(三角形)、庚基(正方形)和辛基(圆形)的MBIT试剂连接。在质谱中，根据MBIT的质量差异(14Da)分离相同的分析物。在所观察的肽中，利用五种肽进行串联质谱测定(VLEIR、EIFLR、LLDAPAAIR、QLETEPDLFIR、GVVDSEDLPLNLSR)。
图24为显示使用凝胶成像系统与MALDI串联质谱测定对连接烷基基团MBIT的分析物进行定量的结果比较图。质量可协调基团为己基的烷基基团MBIT的结果(norm 39/norm 30)产生的平均值为1.65，这比凝胶成像系统的平均值高0.8％。利用质量可协调基团为庚基的烷基基团MBIT的结果(del 30/norm 30)产生的平均值为0.85，这比凝胶成像系统的平均值高1.1％。此外，质量可协调基团为辛基的烷基基团MBIT的结果(del 39/norm 30)产生的平均值为1.46，这比凝胶成像系统的平均值高4.0％。可以看出，这些结果与凝胶成像系统的结果相似。可以利用三对烷基基团MBIT试剂同时对从四种生理状态下获得的Hsc82蛋白的相对量进行定量(norm 30∶norm 39∶del 30∶del 39＝1∶1.65∶0.85∶1.46)。
图25是利用质量可协调基团为己基、庚基和辛基的MBIT标记的五类分析物的MALDI串联质谱测定的从头测序结果。带下划线的氨基酸表示其序列经过验证。标有星号标记的氨基酸表示由MBIT标记的氨基酸。由于具有相同的组成，异亮氨酸也被表示为亮氨酸。

Claims (23)

1.下式1表示的变质量标记试剂：
Figure F2009800004315C00011
式1
其中，RS和RB分别为直链或支链C1-C18烷基；RS和RB中至少一个包含一个或多个氘原子；RT为天然或人造氨基酸的侧链；连接子为受胺的亲核攻击而成为离去基团的活性酯或羟基。
2.如权利要求1所述的变质量标记试剂，其中所述RS和RB分别为甲基，且RS和RB中至少一个包含一个或多个氘原子。
3.如权利要求2所述的变质量标记试剂，其中RS和RB分别为CH3和CD3，或分别为CD3和CH3。
4.如权利要求1所述的变质量标记试剂，其中所述RT为丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Gln)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)或酪氨酸(Tyr)的侧链。
5.如权利要求1所述的变质量标记试剂，其中所述RT为直链或支链的C2-C18烷基。
6.如权利要求5所述的变质量标记试剂，其中所述RT为直链或支链的乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基。
7.如权利要求1所述的变质量标记试剂，其中所述连接子选自由N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基、苯并三唑-1-基氧基、五卤代苄基和4-硝基苯基组成的组。
8.变质量标记试剂组，其包含两个或更多个权利要求1所述的式1表示的变质量标记试剂。
9.如权利要求8所述的变质量标记试剂组，其中所述两个或更多个变质量标记试剂中的RS和RB分别包含不同数量的氘原子，且所述两个或多个变质量标记试剂包含相同数量的氘原子。
10.变质量标记试剂复组，其包含两组或更多组权利要求8所述的变质量标记试剂组。
11.包含用权利要求1-10所述的变质量标记试剂标记的分析物的混合物、其盐或其水合物。
12.如权利要求11所述的混合物、其盐或其水合物，其中所述分析物为蛋白、碳水化合物或脂质。
13.如权利要求11所述的混合物、其盐或其水合物，其中所述分析物为肽。
14.如权利要求11所述的混合物、其盐或其水合物，其中所述分析物为核酸或其衍生物。
15.如权利要求11所述的混合物、其盐或其水合物，其中所述分析物为类固醇。
16.用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其包含以下步骤：
将分析物与权利要求8或9所述的变质量标记试剂组偶联；和
通过将连接变质量标记试剂的分析物片段化对所述分析物进行定量。
17.如权利要求16所述的用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中通过串联质谱测定法进行所述用于定量的片段化。
18.如权利要求17所述的用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中通过改变串联质谱测定中标记试剂的RT使定量信号质量窗口发生位移。
19.如权利要求18所述的用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中所述定量信号为选自由bS离子、aS离子，ys离子和包含RB的内部片段离子组成的组中的一种或多种内部片段离子。
20.如权利要求16所述的用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中，
1)当RT为甲基时，定量信号质量(bS)出现在114Th和117Th，其他定量信号质量(aS)出现在86Th和89Th，标签标记(b0)出现在188Th；
2)当RT为丝氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在130Th和133Th，其他定量信号质量(aS)出现在102Th和105Th，标签标记(b0)出现在204Th；
3)当RT为缬氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在142Th和145Th，其他定量信号质量(aS)出现在114Th和117Th，标签标记(b0)出现在216Th；
4)当RT为谷氨酰胺侧链时，定量信号质量(bS)出现在171Th和174Th，其他定量信号质量(aS)出现在143Th和146Th，标签标记(b0)出现在245Th；
5)当RT为组氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在180Th和183Th，其他定量信号质量(aS)出现在152Th和155Th，标签标记(b0)出现在254Th；
6)当RT为苯丙氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在190Th和193Th，其他定量信号质量(aS)出现在162Th和165Th，标签标记(b0)出现在264Th；
7)当RT为精氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在199Th和202Th，其他定量信号质量(bS-NH3)出现在182Th和185Th，标签标记(b0)出现在273Th；或者
8)当RT为酪氨酸侧链时，定量信号质量(bS)出现在206Th和209Th，其他定量信号质量(aS)出现在178Th和181Th，标签标记(b0)出现在280Th。
21.如权利要求16所述的用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中，
1)当RT为乙基时，定量信号质量(bS)出现在128Th和131Th，其他定量信号质量(aS)出现在100Th和103Th，标签标记出现在202Th；
2)当RT为直链或支链丙基时，定量信号质量(bS)出现在142Th和145Th，其他定量信号质量(aS)出现在114Th和117Th，标签标记(b0)出现在216Th；
3)当RT为直链或支链丁基时，定量信号质量(bS)出现在156Th和159Th，其他定量信号质量(aS)出现在128Th和131Th，标签标记(b0)出现在230Th；
4)当RT为直链或支链戊基时，定量信号质量(bS)出现在170Th和173Th，其他定量信号质量(aS)出现在142Th和145Th，标签标记(b0)出现在244Th；
5)当RT为直链或支链己基时，定量信号质量(bS)出现在184Th和187Th，其他定量信号质量(aS)出现在156Th和159Th，标签标记(b0)出现在258Th；
6)当RT为直链或支链庚基时，定量信号质量(bS)出现在198Th和201Th，其他定量信号质量(aS)出现在170Th和173Th，标签标记(b0)出现在272Th；或
7)当RT为直链或支链辛基时，定量信号质量(bS)出现在212Th和215Th，其他定量信号质量(aS)出现在184Th和187Th，标签标记(b0)出现在286Th。
22.用于同步肽测序和蛋白定量的分析方法，其中将权利要求10所述的变质量标记试剂复组与分析物连接，并片段化，从而对所述分析物进行定量。
23.用于多重定量的分析方法，其中在偶联所述分析物和权利要求10所述的变质量标记试剂复组的定量过程中，通过权利要求20或21所述的方法分别定量一种样品与其他不同样品的比例。
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