KR101106355B1 - 물성이 조절된 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법 - Google Patents

물성이 조절된 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제, 가변질량 라벨링제 세트, 및 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제공한다. 여기서 RS 및 RB는 각각 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
[화학식 1]
Figure 112009037030804-pat00001
또는
Figure 112009037030804-pat00002
라벨링제, 가변질량, 동시분석, 다중정량분석, 질량분석, 단백질체, 물성조절

Description

물성이 조절된 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법 {Property-tuned variable mass labeling reagents and analytical methods for simultaneous peptide sequencing and multiplexed protein quantification using thereof}
본 발명은 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수소 동위원소를 포함하고, 물성을 조절하면서 질량을 다변화하여 서로 다른 질량값에서 정량신호를 나타낼 수 있는 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중정량 동시 분석방법에 관한 것이다.
질량분석기술은 단백질과 펩티드의 서열 및 정량 분석에 널리 이용되고 있다. 예를 들어 단백질의 정체를 규명하기 위해 단백질을 효소분해하여 생성된 조각 펩티드들을 말디 이온화법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 또는 전자 분무 이온화법(Electrospray Ionization, ESI)을 이용하여 이온화시킨 후 질량분석기를 통해 질량을 측정하여 단백질의 정체를 밝혀내기도 하고, 좀 더 정확하게는 일부 조각 펩티드들을 어미 이온으로 질량 선택하여 추가 분해를 시켜 펩티드의 서열을 규명해내는 방법을 사용하기도 한다.
질량분석기를 이용한 단백질과 펩티드의 정량분석을 위하여는 동위원소를 포함하고 있는 화학 표지물을 분석 대상 단백질 또는 펩티드에 표지하여 질량분석하는 방법이 널리 사용된다. 서로 양을 비교해야 하는 동일한 종류의 여러 시료에 동위원소 표지가 상이하게 되어 있는 동일한 화학표지물을 부착하여 질량분석을 하게 되면 동위원소의 질량차 때문에 질량분석 스펙트럼 또는 탄뎀질량분석 스펙트럼 상에서 각 시료의 질량이 다르게 나타나게 되어 그 상대적 세기를 비교함으로써 정량분석이 가능하게 된다.
상기 설명한 펩티드의 정량분석과 서열분석을 동시에 수행하기 위하여 동중체 화학변형법이 이용되고 있다. 미국 특허 공개 US 2005/0148087호 및 국제 특허 공개 WO 2005/068446호 등에서는 펩티드와 반응시켜 결합한 다음 탄뎀질량분석 과정에서 정량적인 신호가 나타나도록 동위원소로 표지된 동중체 화합물을 개시하고 있다.
그러나 상기 종래 기술들에 이용된 라벨링제들은 탄소, 질소 또는 산소 등의 동위원소를 사용하고 있어 가격이 비싸다는 문제를 가진다. 또한 정량신호가 나타나는 질량범위가 한정되어 있기 때문에 실험에서 야기되는 잡음신호에 의해 분석이 방해될 수 있다는 문제점도 가지고 있다. 이에 따라, 상대적으로 가격이 저렴한 수소 동위원소를 이용하여 아미노산 서열과 단백질의 양을 동시에 확인할 수 있는 새로운 동중체 라벨링제가 요구된다. 또한 정량신호의 질량 및 물성을 조절하여 광범위한 생체분자 분석에 유리하도록 특성이 부여된 새로운 동중체 가변질량 라벨링제 가 요구된다.
본 발명자는 대한민국 특허출원 제2008-0070272호를 통해 수소 동위원소만을 이용하고 정량신호의 질량 조절이 가능하며 디펩티드 구조를 가진 MBIT이라고 명명된 새로운 동중체 라벨링제를 제시한 바 있다. 또한 대한민국 특허 제2009-0019444호를 통해 2동중체 라벨링제의 질량조절기 역할을 하는 아미노산 잔기를 각기 다양한 물성을 지니는 천연 아미노산의 여러 잔기로 바꾸어 정량신호질량을 다변화하고, 동중체 라벨링제의 물성을 조절할 수 있음을 보였다. 천연 아미노산을 이용한 다양한 MBIT 에서는 아미노산 잔기의 다양한 물성 차이로 인해 각 MBIT 시약의 정량 신호의 세기가 최대 10배까지도 차이가 났다. 질량범위가 다변화된 가변질량 MBIT을 2개 이상 조합하여 다양한 시료를 동시에 다중 정량 분석 하기 위해서는 서로 유사 또는 균일한 정량신호세기를 가지는 MBIT 시약들을 조합하여야 정확한 결과를 기대할 수 있다. 따라서 다중 정량 동시 분석용 시약의 개발을 위해서, 유사한 정량 신호 세기를 가질 수 있도록, 동일한 물성을 갖는 여러 MBIT 시약의 개발이 요구된다.
본 발명에서는 천연 아미노산뿐만 아니라 인공 아미노산을 이용하여 동일 물성을 지니면서 정량신호질량을 다변화할 수 있는, 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석용 동중체 라벨링제를 제시하고 2종 이상의 라벨링제를 이용한 3개 이상 시료의 동시 다중 정량 분석방법을 보이고자 한다.
본 발명의 목적은, 새로운 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨로 이루어지는 가변질량 라벨링제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하고 천연 또는 인공 아미노산을 사용하여 질량을 다변화시킬 수 있는, 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하며 천연 또는 인공 아미노산을 사용하여 질량을 다변화시킬 수 있는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 라벨로 이루어지는 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하고 천연 또는 인공 아미노산의 사용으로 질량이 다변화되어 서로 다른 질량값에서 정량신호가 나타나는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 인공 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하며 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산을 사용하여 질량을 다변화시킬 수 있는, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석용 동중체 라벨로 이루어지는 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하고 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산의 사용으로 질량이 다변화되어 서로 다른 질량값에서 정량신호가 나타나지만 정량신호세기는 유사한, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하는, 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 이용하여 아미노산 서열을 분석하고 동시에 단백질의 양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수소 동위원소를 포함하며 질량이 다변화된, 둘 이상의 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 동시에 이용하여 3개 이상의 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적들은 하기 설명하는 본 발명에 의해 모두 달성될 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112009037030804-pat00003
또는
Figure 112009037030804-pat00004
여기서 RS 및 RB는 각각 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하고; RT는 질량조절기이며; Linker는 분석체와의 결합을 유도하는 반응성 링커이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "반응성 링커"는, 아민의 친핵성 공격에 리빙 그룹이 되는 활성 에스테르인 것을 의미한다. 상기 아민은 1차 아민인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 2-니트로페닐기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시에 있어서는 N-하이드록시숙신이미딜기가 링커로 사용되었다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상기 질량조절기"는, 분석체와 결합한 후 탄뎀질량분석과정에서 분해될 때, N-아실화된 아미노산 단편의 질량을 조절하여 정량 신호가 스펙트럼상에서 다른 단편들과 겹치지 않게 하기 위해서 도입되는 것을 의미하는 것으로서, RT의 종류를 바꿈으로써, 정량신호의 질량을 다양하게 변화시킬 수 있다. 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산 잔기의 측쇄 중 하나인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 질량조절기는 유사 또는 동일 물성을 지닌 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 질량조절기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 또는 옥틸 등의 직쇄 또는 가지쇄의 알킬인 것을 특징으로 한다.
상기 RS 및 RB는 중수소를 포함하여 동위원소의 질량차에 의한 정량분석을 가능하도록 하는 역할을 한다. 이에 상기 RS 및 RB는 각각 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고, RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하며, 바람직하게는 상기 RS 및 RB는 메틸 또는 하나 이상의 중수소를 포함하는 메틸인 것을 특징으로 한다. 상기 RS 및 RB는 탄소의 개수가 동일한 알킬로 이루어져 있으나, 포함된 중수소의 수가 서로 달라야 한다. 이러한 관점에서, 상기 RS와 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나 CD3 및 CH3인 것이 바람직하다. 즉, 상기 화합물에서 RS와 RB는, RS가 CH3면 RB는 CD3이고, RB가 CH3이면 RS가 CD3이다.
상기 화학식 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 아민의 친핵성 공격에 리빙그룹이 되는 링커가 부착되고 동위원소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 디펩티드는 중수소로 표지되는 디펩티드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제 두 종류 이상을 포함하는 가변질량 라벨링제 세트를 제공한다.
상기 가변질량 라벨링제 세트는 상기 화학식 1로 표현되는 상이한 두 화합물 의 쌍이 하나의 세트를 이루게 된다. 상기 화합물 쌍이 RS와 RB에 포함된 총 중수소의 수가 일정한 화합물 쌍이 되면, 동이원소의 질량차 때문에 스펙트럼 상에서 각 시료의 질량이 다르게 나타나게 되어 그 상대적 세기를 비교하여 정량 분석이 가능하게 된다. 이러한 관점에서, 상기 두 종류 이상의 가변질량 라벨링제 각각의 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하고, 상기 두 종류 이상의 가변질량 라벨링제는 서로 중수소의 수가 동일한 것이 바람직하다.
즉, 상기 화합물 쌍의 RS와 RB는 동일한 탄소수를 가지는 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이며, 제1화합물에서 RS에 RB보다 많은 수의 중수소를 포함하고 있다면, 제2화합물에서는 RB의 중수소 수가 RS에 비해 제1화합물의 차이만큼 많도록 구성된다. 결과적으로 제1화합물과 제2 화합물의 전체적인 질량은 동일하게 구성된다. 발명의 실시에 있어서 실제 합성되어 사용된 화합물 쌍은, 상기 RS와 RB가 각각 CH3와 CD3인 화합물과 RS와 RB가 각각 CD3와 CH3인 화합물의 쌍이다.
또한, 본 발명은 상기 가변질량 라벨링제 세트를 두 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 가변질량 라벨링제로 표지된 분석체를 포함하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물을 제공한다. 본 발명의 실시에 있어서, 상기 화합물과 분 석체의 결합은 링커가 분석체의 아민과 반응하며 리빙그룹으로 작용하여 분리되면서 이루어진다.
여기서, 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 분석체는 핵산 또는 핵산 유도체인 것을 특징으로 한다. 또는, 상기 분석체는 스테로이드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시키는 단계; 및 상기 가변질량 라벨링제 세트가 결합된 분석체를 분해하여 상기 분석체를 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법을 제공한다.
여기서, 상기 정량을 위한 분해법은 탄뎀질량분석법인 것을 특징으로 한다.
상기 탄뎀질량분석법은 라벨링제의 질량조절기에 따라 분석에서의 정량신호질량의 위치가 변하는 것을 특징으로 한다.
상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 bS 이온, aS 이온, bS-NH3 이온 및 RB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 내부조각이온으로 하는 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 메틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 114와 117 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 86과 89 Th에서 나타나며, 표지 지문이 188 Th 인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 에틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 128와 131 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 100와 103 Th에서 나타나며, 표지 지문이 202 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 프로필기인 경우, 정량신호질량(bS)이 142와 145 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 114와 117 Th에서 나타나며, 표지 지문이 216 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 부틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 156와 159 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 128과 131 Th에서 나타나며, 표지 지문이 230 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 펜틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 170와 173 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 142와 145 Th에서 나타나며, 표지 지문이 244 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 헥실기인 경우, 정량신호질량(bS)이 184와 187 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 156와 159 Th에서 나타나며, 표지 지문이 258 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 헵틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 198와 201 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 170와 173 Th에서 나타나며, 표지 지문이 272 Th인 것을 특징으로 한다.
상기 질량조절기가 직쇄 또는 가지쇄의 옥틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 212와 215 Th에서 나타나고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 184과 187 Th에서 나타나며, 표지 지문이 286 Th인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 따른 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 질량조절기에 따라 다르게 나타나는 정량신호질량을 통하여 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 원리에 대해서 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 MBIT 시약 및 기술을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 MBIT 시약의 구조이고, (b)는 MBIT 시약이 1차 아민기에 반응하여 표지되는 과정이며, (c)는 MBIT 시약 세트로 구분 표지된 펩티드를 탄뎀 질량분석한 경우 생성 가능한 조각이온들과 이들의 명칭이고, 그리고 (d)는 개략적인 탄뎀 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, 이론적으로 한정된 것은 아니지만, 본 발명에 따른 화합물 1은 N-말단이 아실화되고 C-말단에 링커가 부착된 디펩티드로, 도 1a에 표현된 것과 같은 기능으로 구분될 수 있다.
이러한 화합물들은 분석체의 1차 아민과 반응하여 도 1b에 도시된 바와 같이 분석체와 결합할 수 있게 된다. 동일한 분자식에 중수소가 표지된 부위만 다른 MBIT 시약 쌍을 편의에 의하여 HMBIT과 LMBIT으로 구분하는데, RS에 중수소가 표지된 것을 HMBIT, RB에 중수소가 표지된 것을 LMBIT으로 부른다. 이 LMBIT와 HMBIT이 결합된 분석체는 전체적인 무게는 동일하다. 그러나 탄뎀 질량분석에서 나타나는 절단 단편들 중에서 RS와 RB중 어느 한쪽만을 포함하고 있는 단편의 경우 LMBIT이 연결된 경우와 HMBIT이 연결된 경우에 대해 서로 다른 질량값을 가지게 되고, 도 1c-d에서의 bS 이온과 같이 스펙트럼상에서 다른 위치에 나타나게 된다. 이들 피크의 상대적 강도는 이들이 붙어있던 분석체의 상대적인 양으로 정량될 수 있다. 반면에 RS와 RB를 모두 포함하거나 전혀 포함하지 않는 절단 단편들의 경우 질량값이 LMBIT, HMBIT에 상관없이 일정하게 나타나게 된다. 또한 분석체가 MBIT 시약에 의해 표지된 경우 bS 이온뿐 아니라 b0 이온도 스펙트럼 상에서 발견된다. 이 b0 이온은 LMBIT, HMBIT과 상관없이 일정하게 나타나고 특정 MBIT에 의해 분석체가 표지되었다는 것을 확인할 수 있게 해 주기 때문에 표지 지문 이온(tagging signature ion)으로 이용된다.
도 2는 MBIT 기술에서 질량조절기(RT)로 직쇄 또는 가지쇄의 알킬기를 사용한 경우의 각 MBIT의 고유값을 도시한 도면이다. 2a는 MBIT 정량신호 쌍의 질량값들을, 탄뎀 질량분석할 경우 220 Da 이하의 질량값을 가지고 생성될 수 있는, 조각이온들의 분포와 함께 개략적으로 도시한 도면이다. 2b는 질량조절기로 사용된 알킬기의 탄소 수에 따른 각 MBIT의 고유한 표지지문 질량값과 정량신호 질량값을 표시한 도면이다.
질량 조절기 RT의 질량에 따라서 정량신호(XbS)의 위치가 달라지는데, 도 2에 도시된 바와 같이 메틸(C1)인 경우 114/117 Th에서, 에틸(C2)인 경우 128/131 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 프로필(C3)인 경우 142/145 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 부틸(C4)인 경우 156/159 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 펜틸(C5)인 경우 170/173 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 헥실(C6)인 경우 184/187 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 헵 틸(C7)인 경우는 198/201 Th에서, 직쇄 또는 가지쇄의 옥틸(C8)인 경우는 212/215 Th에서 나타난다. XbS에서 중성 CO가 손실된 XaS 이온은 질량조절기가 메틸인 경우 86/89 Th, 에틸인 경우는 100/103 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 프로필인 경우는 114/117 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 부틸인 경우는 128/131 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 펜틸인 경우 142/145 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 헥실인 경우 156/159 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 헵틸인 경우 170/173 Th, 그리고 직쇄 또는 가지쇄의 옥틸인 경우 184/187 Th에서 검출된다. 또한 각 MBIT의 고유 표지 지문(b0)이온은 질량조절기가 메틸인 경우 188 Th, 에틸인 경우는 202 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 프로필인 경우는 216 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 부틸인 경우는 230 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 펜틸인 경우는 244 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 헥실인 경우는 258 Th, 직쇄 또는 가지쇄의 헵틸인 경우는 272 Th, 그리고 직쇄 또는 가지쇄의 옥틸인 경우는 286 Th에서 나타난다.
본 발명은 일 측면에 있어서 하기 화학식 2로 표현되는 화합물 및 하기 화합물을 결합시킨 분석체에 관한 것이다.
[화학식 2]
Figure 112009037030804-pat00005
또는
Figure 112009037030804-pat00006
여기서 RS 및 RB는 하나 이상의 중수소를 포함하는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이며, RT는 질량 조절기이다. 본 발명에 있어서 상기 RS 및 RB는 포함하는 중수소의 수가 상이한 동일한 알킬이다. 발명의 실시에 있어서, RS와 RB는 RS가 CH3면 RB는 CD3이고, RB가 CH3이면 RS가 CD3이다. 본 발명의 실시에 있어서 상기 질량조절기 RT는 제조상의 편의를 위해서 유사 또는 동일 물성의 천연 또는 인공 아미노산의 측쇄 그룹 중 하나에서 선택될 수 있다. 상기 화학식 2로 표현되는 화합물은 적절한 활성화 시약과의 반응을 통하여 화학식 1로 변환이 가능하다. 이에 이용되는 활성화 시약으로는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)/1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 조합, 1-벤조트리아졸(HOBt)/N,N′-디이소프로필카보이미드(DIC) 조합, (벤조트리아졸-1-일옥실)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플로로포스페이트(BOP) 등이 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시에 있어서는 NHS/EDC 조합이 이용되었다.
도 3은 동일 물성을 가지면서 다양한 질량값을 가진 MBIT 세트의 탄뎀 질량 스펙트럼에서 나타나는 특성과 2종 이상의 MBIT 세트를 사용하여 3개 이상의 시료를 동시에 다중 정량분석하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 질량조절기의 물성 조절을 통해 정량신호의 질량값은 다르면서 정량신호의 세기가 각 MBIT간에 유사하게 나타나기에 동일 물성의 여러 MBIT을 사용한 다중 정량분석이 가능해진 다. 우선, 다중 정량분석을 위해서, 서로 다른 조건 또는 환경에서 생성된 단백질 시료들을 효소분해하여 펩티드로 만든다. 첫 번째 다중 정량분석 방법은 다음과 같은 과정을 통해 이루어진다. 준비된 펩티드 중 한 가지 조건에서 수확한 펩티드를 비교 대상의 개수만큼 동일한 양으로 분취하고 각각을 서로 다른 질량신호값을 가지는 HMBIT (또는 LMBIT) 가변질량 라벨링제들로 반응시킨다. 비교하고자 하는 대상 펩티드들은 각각 서로 다른 질량신호값을 가지는 LMBIT (또는 HMBIT) 가변질량 라벨링제들로 반응시킨다. 두 번째 다중 정량 방법은 준비된 각 펩티드를 이등분한 후 각각에 다른 종류의 MBIT 시약(HMBIT(n-1)과 LMBIT(n), 또는 LMBIT(n-1)과 HMBIT(n))을 반응 시킨다. 이렇게 표지된 모든 펩티드들을 혼합하여 크로마토그래피로 분리하고, 각각의 동중체 어미이온들을 탄뎀 질량분석해서 서열분석 및 정량 분석하면, 동시에 여러 개의 시료들의 양을 정량분석할 수 있다. 첫 번째 다중 정량분석법은, 동일한 대조군을 사용하기에, 대조군과의 비교를 통해 여러 샘플 간의 상대적인 양을 바로 알 수 있다. 첫 번째 다중 정량분석법을 사용할 때 각각의 비교 대상 시료들을 표지하는 MBIT 화합물의 종류를 바꾸어서 정량분석을 반복하거나, 컨트롤을 다른 조건의 시료로 선택하면 다중 시료의 정량분석 결과를 통계적으로 다양한 조합으로 얻어낼 수 있어서 정량 결과의 정확도를 높일 수 있다. 두 번째 정량 방법은 상대적인 양의 차이가 커서 단 한 번의 비교로 상대적인 양을 알기 어려운 경우에 적용할 경우 첫 번째 방법보다 정확한 정량이 가능해진다.
본 발명은 새로운 동위원소로 수소 동위원소를 포함하고, 동일한 물성을 가지면서 질량이 다변화되어 서로 다른 질량값에서 정량신호를 나타낼 수 있는 가변질량 라벨링제, 가변질량 라벨링제 세트 및 다중 가변질량 라벨링제 세트를 제공하고, 수소 동위원소를 포함하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석용 동중체 가변질량 라벨링제 세트를 이용하여 아미노산 서열을 분석하고 동시에 단백질의 양을 정량 분석하는 방법 및 상기 가변질량 라벨링제 세트를 동시에 이용하여 3개 이상의 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열을 분석하고 동시에 양을 다중 정량 분석하는 방법을 제공하는 발명의 효과를 가진다.
이하, 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명이 후술하는 내용에 제한되는 것은 아니며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
1. 산형 MBIT 시약의 합성
산형 MBIT 시약 (XMBIT-OH, X = L or H)는 표준 고체상 합성법과 액체상 유기 합성법에 의해 합성하였다. 도 4는 (a) 고체상 합성법과 (b) 액체상 합성법을 이용하여 N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약을 합성하는 과정을 개략적 으로 나타낸 도면이다. 고체상 합성법으로는 질량조절기가 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸인 MBIT의 합성이 가능하고, 액체상 합성법으로는 질량조절기로 사용되는 아미노산 잔기가 헥실, 헵틸, 및 옥틸인 MBIT의 합성이 가능하다.
고체상 펩티드 합성 방법
물질
무수 N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 피페리딘, 염화 메틸렌(DCM, HPLC grade), 트리플로로아세트산(TFA, HPLC grade), 티오아니솔(TA), 에탄디티올(EDT,), 무수 아세트산, Fmoc-알라닌, 프로피온산, 부티르산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)에서 구입하였다. 아세트산-d3, Fmoc-알라닌-3,3,3-d3는 CDN isotope (Toronto, Canada)에서 구입하였다. 2-염화트리틸 레진은 Merck에서 구입하였다. N,N'-디이소프로필카보이미드(DIC), 1-벤조트리아졸, 그리고 N-말단이 Fmoc인 아미노산은 Advanced ChemTech에서 구입하였다.
합성 과정
1) 단계 1
Fmoc-알라닌 또는 Fmoc-알라닌-3,3,3-d3 75 mg을 수분이 완전히 제거된 DCM 용액 1 mL에 녹였다. DCM만으로는 잘 녹지 않으므로 100 μL의 DMF를 넣어서 완전 히 용해시켰다. 위에서 준비한 Fmoc 아미노산 용액과 170 μL의 DIPEA를 불꽃건조로 수분을 제거한 바이알에 담겨있는 2-염화트리틸 레진 0.1 g과 혼합하여 2~4시간동안 부드럽게 교반하였다. 레진을 펩티드 합성용 폴리프로필렌 재질의 카트리지(총 용량 5 mL)에 옮겨 담은 후 충분한 양의 DCM/메탄올/DIPEA 혼합 용액(부피비 17/2/1)으로 3회 세척하였다. 이후 충분한 양의 DCM으로 3회, DMF로 2회, 그리고 DCM으로 2회 씻은 뒤 용액을 완전히 제거하고 감압조건에서 건조시켰다.
2) 단계 2
단계 1에서 제조된 레진에 약 3 mL정도의 DMF를 넣어주고 2~3분간 충분히 흔들어주고 DMF를 제거하는 과정을 5회 반복하여 레진을 DMF에 충분히 불렸다. DMF로 묽힌 25% 피페리딘 용액(3 mL)을 레진에 넣고 5분간 교반한 후 용액을 제거하였다. 다시 25% 피페리딘 용액(3 mL)을 레진에 넣어준 후 15분간 교반하고 용액을 제거하였다. 이후 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 DMF로 3회 세척하였다.
3) 단계 3
아미노산의 잔기가 질량 조절기인 MBIT 시약을 합성하는 경우에는 다음과 같이 제조하였다.
단계 2에서 제조된 레진에, DMF에 0.6 M 농도로 녹인 Fmoc-아미노산 용액(2-아미노부틸산, 발린, 류신, 이소류신, 또는 2-아미노헵탄산), 1-벤조트리아졸 용액, 그리고 DIC 용액을 1 mL씩 넣어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 DMF로 3회 세척하였다.
아실기가 질량조절기인 MBIT 시약을 합성하는 경우에는 다음과 같이 제조하였다.
단계 2에서 제조된 알라닌-d3(또는 알라닌-d0)이 붙어 있는 레진에, DMF에 0.6 M 농도로 녹인 Fmoc-알라닌-d0 용액(또는 Fmoc-알라닌-3,3,3-d3), 1-벤조트리아졸 용액, 그리고 DIC 용액을 1 mL씩 넣어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 DMF로 3회 세척하였다.
4) 단계 4
단계 3에서 제조된 레진에, 25% 피페리딘 용액(3 mL)을 넣고 5분간 교반한 후 용액을 제거하였다. 다시 25% 피페리딘 용액(3 mL)을 레진에 넣어준 후 15분간 교반하고 용액을 제거하였다. 이후 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, 그리고 DMF로 3회 세척하였다.
5) 단계 5
아미노산의 잔기가 질량 조절기인 MBIT 시약을 합성하는 경우에는 다음과 같 이 제조하였다.
단계 4에서 제조된 레진에, 0.6 M 농도로 DMF에 각각 녹인 아세트산(또는 아세트산-d3), 1-벤조트리아졸 용액, 그리고 DIC 용액을 1 mL씩 넣어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 알라닌-d0가 붙어 있는 레진에는 아세트산-d3를 사용하고, 알라닌-d3인 경우는 아세트산-d0을 사용하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, DMF로 3회, 그리고 메탄올로 3회 씻어준 다음 감압 조건에서 완벽하게 말려서 바이알에 옮겼다.
아실기가 질량조절기인 MBIT 시약을 합성하는 경우에는 다음과 같이 제조하였다.
단계 4에서 제조된 레진에, 0.6 M 농도로 DMF에 각각 녹인 카복시산(프로피온산, 부티르산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 또는 노난산), 1-벤조트리아졸 용액, 그리고 DIC 용액을 1 mL씩 넣어주고 2시간 30분 동안 천천히 교반하였다. 그 후 혼합 용액을 제거하고 레진을 DMF로 3회, 메탄올로 3회, DMF로 3회, 그리고 메탄올로 3회 씻어준 다음 감압 조건에서 완벽하게 말려서 바이알에 옮겼다.
6) 단계 6
단계 5에서 제조된 레진에, TFA/벤젠/TA/증류수/EDT 혼합용액(혼합 부피비 = 16.5/1/1/1/0.5) 2 mL를 섞어주고 3시간동안 교반하였다. 레진은 전부 걸러내고, 남은 용액을 따로 모아 부피가 200 μL이하가 되도록 질소를 불어 말렸다. 그 용액에 차가운 에테르를 첨가하여 산형 MBIT 시약을 침전시켰다. 침전된 생성물은 차갑게 식힌 에테르로 3회 세척한 후 감압조건에서 완전히 건조시켰다.
상기 제조방법에 의하여 제조된 MBIT 시약을 확인하기 위해서, 각각의 MBIT 시약을 angiotensin II(1046.5 Th)에 반응을 하여 질량 분석하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이, 질량 조절기가 에틸인 경우는 1247.7 Th, 프로필인 경우는 1261.7 Th, 부틸인 경우는 1275.7 Th, 펜틸인 경우는 1289.7 Th, 헥실인 경우는 1303.7 Th, 헵틸인 경우는 1317.7 Th, 옥틸인 경우는 1331.8 Th에서 분석체가 관측되었다. 또한 각 분석체를 탄뎀질량분석을 통해서 표지지문 및 정량신호의 질량값을 확인하였다. 그 결과, 도 2b의 예상값과 같이, 표지지문과 정량신호의 질량값은 질량 조절기가 에틸인 경우 각각 202 Th (b0), 128 Th (LbS), 및 131 Th (HbS)에서, 프로필인 경우는 216 Th (b0), 142 Th (LbS), 및 145 Th (HbS)에서, 부틸인 경우는 230 Th (b0), 156 Th (LbS), 및 159 Th (HbS)에서, 펜틸인 경우는 244 Th (b0), 170 Th (LbS), 및 173 Th (HbS)에서, 헥실인 경우 각각 258 Th (b0), 184 Th (LbS), 및 187 Th (HbS)에서, 헵틸인 경우는 272 Th (b0), 198 Th (LbS), 및 201 Th (HbS)에서, 옥틸 인 경우는 286 Th (b0), 212 Th (LbS), 및 215 Th (HbS)에서 관측되었다.
액체상 유기 합성 방법
물질
2-아미노-4-펜텐산, 무수 아세트산(Ac2O-d0), Boc-l-알라닌-d0, TFA, 4-옥텐, 5-데켄, 1-헵텐, 및 그루브스 촉매(Grubbs' catalyst, 2nd genaration)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하고, 그리고 dl-알라닌-d3, 및 과중수소화된 무수 아세트산(Ac2O-d6)는 CDN Isotopes (Quebec, Canada)에서 구입하였다.
합성 과정
1) 단계 1
2-아미노-4-펜텐산(2 mmol)을 pH 9~10인 물(4 mL)에 녹이고, 무수 아세트산(4.0 mmol)을 0℃에서 투입하였다. 8M NaOH를 투입하여 pH 10 정도로 조절하고, 반응 혼합물을 4 시간 동안 0 ℃에서 교반하였다. 진한 염산 용액을 투입하여 pH 2이하로 만들어 반응을 종료하였다. 생성물은 메탄올에 녹이고, 정제하여 건조시켜 2-아세트아미도-4-펜텐산을 고체로 회수하였다.
2) 단계 2
알라닌 벤질에스터는 Boc로 보호된 알라닌에 벤질 브롬을 가하여 Boc-알라닌 벤질에스터를 만든 다음 TFA을 가하여 Boc를 제거하는 과정을 통해 만들어진다. 디옥산과 물의 혼합물(2/1, v/v)에 0.33 M로 녹여진 l-알라닌-d3(1 mmol)에 1.5 mL 의 1 M NaOH 와 디-삼차-부틸 디카보네이트(1.1 mmol)를 투입한 후 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. 디옥산을 증발시킨 후, 얼음을 사용하여 혼합물을 냉각하고 KHSO4 포화 수용액을 가하여 pH를 2~3 정도로 낮추었다. 유기 생성물은 3회에 걸쳐 10 mL의 에틸 아세테이트(EA)로 추출되고 무수 Na2SO4하에서 건조되었다. 실리카겔 크로마토그래피 정제를 통해서, Boc-dl-알라닌-d3(0.14 g, 0.74 mmol)가 얻어졌다. 0.5 mmol의 Boc-dl-알라닌-d0 또는 Boc-dl-알라닌-d3을 무수 아세톤(5 mL)에 녹이고 칼륨 카보네이트(0.75 mmol)와 브롬화 벤질(0.55 mmol)를 가하였다. 5 시간 동안 리플럭스한 후, 반응 생성물은 실온으로 냉각되고 농축된 후 클로로포름(10 mL)에 용해되었다. 유기층을 소디움 카보네이트의 포화 수용액(30 mL)으로 세척하고 Na2SO4하에서 건조한 후, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여서 Boc-알라닌-d0 벤질에스터 또는 Boc-알라닌-d3 벤질에스터를 백색 고체로 얻었다. Boc-알라닌-d0 벤질에스터 또는 Boc-알라닌-d3 벤질에스터(0.98 mmol)를 무수 DCM(10 mL)에 녹이고 8 mmol 의 TFA를 0℃에서 가하여 1 시간 동안 교반되었다. 감압하에서 용매를 제거한 후, 잔류물은 고진공하에서 건조되었다. 오일상 생성물(알라닌-d0 벤질에스터 또는 알라 닌-d3 벤질에스터)은 무수 THF(2 mL)에 보관되었다.
3) 단계 3
단계 2에서 제조된, THF(5 mL)에 녹여진 알라닌-d0 벤질에스터 또는 알라닌-d3 벤질에스터(0.55 mmol)에, BOP 시약(1.01 mmol)을 가한 후 30 분 동안 실온에서 교반하였다. DIPEA(3.36 mmol)을 0℃에서 투입하고 다시 실온에서 15 분 동안 교반한 후, 단계 1에서 제조된, 무수 THF에 녹여진 2-아세트-d3-아미도-4-펜텐산 또는 2-아세트-d0-아미도-4-펜텐산을 가한 다음 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물은 EA에 용해하였다. 유기층을 물로 세척하였다. 잔류 오일상 생성물은 플래쉬 크로마토그래피로 실리카겔에서 정제되어 벤질 2-(2-아셋아미도-4-펜텐아미도)프로파네이트를 무색 고체로 얻었다.
4) 단계 4
DCM에, 단계 3에서 제조된 벤질 2-(2-아셋아미도-4-펜텐아미도)프로파네이트, 알켄(4-옥텐, 5-데켄, 또는 1-헵텐), 및 그루브스 촉매를 넣고 40℃에서 24시간 리플럭스하였다. 촉매와 용매를 제거한 후 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 이 반응 생성물은 20 mol% Pd(OH)2와 함께 무수 메탄올에서 혼합된 후, 실온에서 밤새 1기압의 H2 압력 하에서 교반되었다. 촉매를 필터링해서 걸러낸 후, 생성물 은 진공 하에서 농축되고 메탄올과 에테르 1:1 혼합물을 이용한 재결정이후에 산형 MBIT 시약을 얻었다.
상기 제조방법에 의하여 제조된 MBIT 시약을 확인하기 위해서, 각각의 MBIT 시약을 angiotensin II(1046.5 Th)에 반응을 하여 질량 분석하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이, 질량 조절기가 헥실인 경우는 1303.7 Th, 헵틸인 경우는 1317.7 Th, 옥틸인 경우는 1331.8 Th에서 분석체가 관측되었다. 또한 각 분석체를 탄뎀질량분석을 통해서 정량신호 및 표지지문의 질량값을 확인하였다. 그 결과, 도 2b의 예상값과 같이, 표지지문과 정량신호의 질량값은 질량 조절기가 헥실인 경우 각각 258 Th (b0), 184 Th (LbS), 및 187 Th (HbS)에서, 헵틸인 경우는 272 Th (b0), 198 Th (LbS), 및 201 Th (HbS)에서, 옥틸인 경우는 286 Th (b0), 212 Th (LbS), 및 215 Th (HbS)에서 관측되었다.
2. MBIT 시약과 분석체 펩티드와의 결합
물질
무수 아세토니트릴(ACN, HPLC grade), 무수 DMF, 하이드록실아민 하이드로클로라이드, TFA(HPLC grade), 알파-시아노-4-하이드록시시나믹산(HCCA), N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)에서 구입하였다. 1-에틸-3-(3- 디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)는 Pierce (Rockford, Il)에서 구입하였다.
MBIT 시약의 활성 에스테르 제조 및 모델 펩티드와의 반응
도 5는 MBIT 시약을 분석대상 펩티드와 반응시키기 위해 활성 에스테르를 형성하는 과정, 및 이를 통해 형성된 MBIT 활성 에스테르를 분석대상 펩티드와 반응시키는 실험방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
MBIT 시약의 숙신이미딜 에스테르를 제조하는 방법과 모델펩티드에 반응시키는 과정은 도 5에 개략적으로 도시되어 있다. DMF에 녹아 있는 XMBIT-OH (X=L or H), EDC, 및 NHS를 최종 농도가 각각 60, 35, 40 mM이 되도록 혼합하여, 실온에서 45분간 교반하였다. 이렇게 생성된 XMBIT-OSu 용액은 추가 정제과정 없이 분석체와의 반응에 바로 이용하였다.
모델 펩티드로는 angiotensin II(DRVYIHPF)를 사용하였다. angiotensin II를 0.4 mM의 농도가 되게 50 mM 소디움 바이카보네이트(NaHCO3) 버퍼에 녹였다. 이 모델 펩티드 용액의 10 μL를 상기 준비된 LMBIT-OSu 또는 HMBIT-OSu 용액 10 μL과 섞어주고 실온에서 5시간 교반하였다. 그 후 10 μL의 하이드록실아민 용액(80 mM in 100mM NaHCO3)을 넣어주고 최소 5시간 이상 교반하여 부반응을 가역시키고, 과량의 MBIT-OSu 시약을 불활성화시켰다. 이후 10% TFA를 5 μL 첨가하여 반응을 완전히 종결시켰다.
Hsc82의 트립틱 펩티드에 대한 MBIT 반응
N-말단 헤마글루틴(HA)-태그된 Hsc82 단백질은 네 가지 다른 생장 조건에서 얻어졌다. HA-Hsc82 단백질을 발현시킨 조건은 Hsc82와 같은 Hsp90 familly인 Hsp82 단백질의 존재 유무와 효모의 생장 온도 두 가지를 조합하여 도 11a에서와 같이 총 네 가지 경우로 나뉜다. norm 30은 Hsp82와 Hsc82 단백질 모두 갖고 있는 효모를 30℃에서 키운 경우이고, norm 39는 Hsp82와 Hsc82 단백질 모두 갖고 있는 효모를 이들 단백질을 과발현시키기 위해서 39℃에서 키운 경우이며, del 30은 Hsp82 단백질만 제거된 효모를 30℃에서 키운 경우이며, del 39는 Hsp82 단백질만 제거된 효모를 39℃에서 키워서 과발현시킨 경우이다. 이들 조건하에서 생성된 HA-Hsc82 단백질들은 효모에서 추출되어 안티-HA 매트릭스(clone 3F10, Roche)와 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 분리 및 정제되었다. 발현된 HA-Hsc82 단백질의 양은 Sypro Ruby stain(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 염색한 이후 VersaDoc 5000 MP 겔 이미지화 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 정량하였다.
Hsc82의 펩티드를 얻기 위해서 다음의 방법으로 트립신을 이용하여 각 시료를 효소분해 하였다. 겔로부터 단백질 밴드를 잘라낸 후 100mM NaHCO3 버퍼에 20분간 두었다. 버퍼를 제거한 후 겔을 작게 조각내고 ACN을 가하여 물을 제거하였다. 각 시료에 50mM NaHCO3 버퍼에 녹아있는 트립신 0.66 μg을 가한 후 37℃에서 20시간 반응시켰다. 증류수와 ACN의 혼합 용액을 이용해서 겔 조각으로부터 펩티드를 추출해 낸 후 각 시료별로 건조시켰다.
건조된 각 시료에 35 μL의 증류수를 가하여 녹였다. 이렇게 준비된 각 시료 용액을 4 μL씩 분취하여 HMBIT-OSu 또는 LMBIT-OSu 용액 4 μL와 혼합하여 5시간 교반하였다. 이 때 norm 39와 L C 6 -Ala를, del 30와 L C 7 -Ala를, del 39와 L C 8 -Ala를, norm 30와 H C 6 -Ala, H C 7 -Ala, 및 H C 8 -Ala를 각각 반응하였다. 그 후 4 μL의 하이드록실아민 용액(80 mM)을 넣어주고 최소 5시간 이상 교반하여 부반응을 가역시키고, 과량의 MBIT-OSu 시약을 불활성화시켰다. 이후 10% TFA를 2 μL 첨가하여 반응을 완전히 종결시켰다.
MBIT-모델펩티드의 MALDI 시료 제조
50/50/0.1 H2O/ACN/TFA용액을 사용하여 XMBIT이 연결된 모델펩티드 용액을 0.5 μM의 농도로 희석하였다. LMBIT 및 HMBIT이 연결된 모델 펩티드는 7가지의 다양한 비율로 혼합하였다. ([L]/[H] = 1/1, 2.3/1, 4/1, 6.3/1, 9/1, 12.3/1, 16/1) 7가지 혼합비로 준비된 각 시료를 매트릭스 용액(5 mg/mL HCCA in 50/50/0.1 H2O/ACN/TFA)과 부피비 1:1로 혼합하였다. 시료/매트릭스 혼합물 1 μL가 MALDI 플레이트에 로딩되었다. 한 개의 시료 스팟당 로딩된 모델 펩티드의 양은 약 250 fmol이었다.
LMBIT 및 HMBIT이 연결된 모델 펩티드를 2대 1의 비율로 섞은 후 50/50/0.1 H2O/ACN/TFA용액을 사용하여 농도를 반으로 묽히는 과정을 통해서, 펩티드의 농도가 0.5, 0.25, 0.125, 0.062, 0.031, 0.016 μM이 되는 일련의 시료를 준비하였다. 각 시료를 매트릭스 용액과 부피비 1:1로 혼합하였다. 시료/매트릭스 혼합물 1 μL가 MALDI 플레이트에 로딩되었다. 각 시료 스팟당 로딩된 모델 펩티드의 양은 약 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8 fmol이었다.
MBIT으로 연결된 Hsc82 트립틱 펩티드의 LC-MALDI 시료 제조
MBIT으로 연결된 Hsc82 트립틱 펩티드 시료 6종류를 각각 3 μL씩 덜어내어 혼합하고 그 중 일 분취량(6.4 μL)를 PepMap column(포어 크기 100 Å 입자 직경 3 mm, 내경 75 mm, 길이 150 mm)을 장착한 역상 나노액체상크로마토그래피 (Reverse-Phase Nano-Liquid Chromatography, RP-nano-LC) 분리기(LC-packings사, Sunnyvale, CA)에 주입되었다. LC는 유속 0.3 μL/분으로 60분 동안 작동되었으며 2-용매 구배를 사용하여 작동하였다. 부피비로 H2O/ACN/TFA = 95/5/0.1인 용매 A와 ACN/TFA = 100/0.1인 용매 B가 2-용매 구배에 이용되었다. [용매 A]/[용매 B] 구배는 100/0에서 시작하여, 0~20분 사이에 30/70으로 변하고, 20~40분 사이에 0/100으로 변하였으며, 40~45분 사이까지 0/100으로 유지되었다. 45분이 되는 시점에서 100/0으로 급격히 떨어져서 45~60분 동안 100/0의 비율이 유지되었다. 용출되는 시료는 매트릭스 용액과 함께 매 25초마다 단일 MALDI 스폿에 Probot microfraction collector를 이용하여 모아졌다. 60분 동안 총 144개의 MALDI 스폿에 LC용출되어 나오는 시료가 분취되어 도포되었다.
MALDI-MS 및 MS/MS
상기 방법들을 통해서 MALDI 타겟에 도포된 시료들을 분석하기 위하여 4700 Proteomic Analyzer (Applied Biosystems사, Foster City, CA)가 양이온 모드로 질량 대 전하비 범위 800-2500 Th에서 사용되었다. 각 도포된 스폿에 대하여 Time-of-Flight(TOF) 스펙트럼이 1000 개의 반복 레이저 샷에 대한 결과를 축적하여 얻어졌다.
XMBIT으로 연결된 모델펩티드의 이온들은 질량조절기 RT의 종류에 따라 서로 다른 질량 대 전하비 위치에서 검출이 되었으며, 각각의 XMBIT으로 연결된 펩티드들은 탄뎀 질량분석을 위한 어미이온으로 선택되었다. XMBIT으로 연결된 Hsc82 트립틱 펩티드의 경우에는 다양한 서열의 펩티드들이 다양한 용출시간에서 검출되는 것을 확인하였다. 각 MBIT 시약 별로 MBIT으로 표지된 펩티드 중 5개를 탄뎀 질량분석을 위한 어미이온으로 선택하였다.
탄뎀 질량분석을 위해 각 선택된 충돌-유래 분해(Collision-Induced Dissociation, CID)를 1.3 × 10-6 torr의 대기압 하에서 수행하였다. 이 CID 스펙트럼은 2000 회의 반복 레이저 샷에 대한 결과를 축적하여 얻어졌다. CID 스펙트럼 은 ABI-4700 Proteomics Analyzer에 함께 제공되어 있는 Data Explorer 프로그램을 이용하여 베이스라인이 보정되었다. 베이스라인 보정 후, LbS, HbS 이온(또는 LaS, HaS 이온)의 세기를 측정하여 상대적인 양의 비를 결정하였다. 각 CID 스펙트럼은 PEAKS 4.5(Bioinformatics Solutions Inc., Canada)를 이용하여 MBIT 라벨링을 고정 변형으로 설정한 상태에서 de novo 서열분석이 이루어졌다.
3. MBIT을 이용한 실제 실험 결과
도 6은 angiotensin II에 7종의 MBIT 시약 쌍으로 반응을 보낸 후 각각을 말디 질량분석한 결과를 개략적으로 나타낸 도면이다. 서로 다른 질량조절기 RT를 가지는 7종의 MBIT 시약 쌍 각각을 모델펩티드와 반응하여 MALDI-TOF 질량분석한 결과이다. MBIT 시약에서 질량조절기가 (a) 에틸, (b) 프로필, (c) 부틸, (d) 펜틸, (e) 헥실, (f) 헵틸, 그리고 (g) 옥틸인 경우를 각각 도시하였다. 각 결과에서 반응이 진행되지 않은 펩티드나 MBIT가 둘 이상 붙은 펩티드 없이, angiotensin II에 MBIT이 하나만 붙은 반응 결과물만이 존재하므로, 반응이 잘 진행되었음을 알 수 있다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 7은 7종의 MBIT 시약 쌍으로 각각 반응이 진행된 angiotensin II 이온의 말디 탄뎀 질량분석 결과를 나타낸 도면으로, 각 MBIT 시약 쌍에 대하여 HMBIT으로 반응한 펩티드와 LMBIT으로 반응한 펩티드를 1대 1의 혼합비로 섞어서 탄뎀 질량분석한 결과이다. 도 7a에서 7g까지 질량 조절기가 각각 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 그리고 옥틸인 MBIT이 연결된 angiotensin II의 CID 스펙트럼이다. 각 종류의 MBIT 시약에 대해서 [L]/[H] 혼합비가 1/1인 시료들의 CID 스펙트럼을 도시하였다. N-말단의 1차 아민에 MBIT 시약이 연결되기 때문에 C-말단을 포함하고 있는 조각단편인 y-타입 이온들은 MBIT 시약의 종류와 무관하게 동일한 질량 대 전하비 값을 가지고 검출되었다. 반면에 N-말단을 포함하고 있는 조각단편인 a- 또는 b-타입 이온들은 질량조절기의 종류에 따라 서로 다른 위치에서 검출되었다. 모든 경우에 대체로 CID 스펙트럼에서의 조각이온 분포가 유사하였다. 이로부터 각 질량조절기의 길이 차이가 조각이온 분포에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 정량 신호로 사용되는 XbS 이온쌍(X = L or H)은 MBIT의 종류에 따라 서로 다른 질량 대 전하비 값에서 나타났다. 질량조절기가 에틸인 경우는 128, 131 Th, 프로필인 경우는 142, 145 Th, 부틸인 경우는 156, 159 Th, 펜틸인 경우는 170, 173 Th, 헥실인 경우는 184, 187 Th, 헵틸인 경우는 198, 201 Th, 그리고 옥틸인 경우는 212, 215 Th에서 각각 정량신호 이온쌍이 나타났다. XbS 이온쌍은 CID과정에서 유래된 잉여 에너지에 의해 추가로 분해가 일어날 수 있다. 도 7에서 보여주는 바와 같이, XbS에서 중성 CO 손실에 해당하는 28 Da의 질량이 감소한 XaS 이온이 질량조절기가 에틸인 경우는 100, 103 Th, 프로필인 경우는 114, 117 Th, 부틸인 경우는 128, 131 Th, 펜틸인 경우 142, 145 Th, 헥실인 경우 156, 159 Th, 헵틸인 경우 170, 173 Th, 그리고 옥틸인 경우 184, 187 Th에서 추가로 검출되었다. 또한 각 MBIT에 따라 표지 지문의 역할을 하는 b0 이온이 관측되었다. 표지 여부가 확실하지 않은 어미 이온을 탄뎀 질량분석 했을 때, 특정 질량을 가지는 표지 지문 이온이 관측되면, 해당 어미이온은 표지지문에 해당하는 MBIT에 의해 표지되었음을 확실히 알 수 있다. 표지 지문 이온인 b0는 질량조절기가 에틸인 경우는 202 Th, 프로필인 경우는 216 Th, 부틸인 경우는 230 Th, 펜틸인 경우는 244 Th, 헥실인 경우는 258 Th, 헵틸인 경우는 272 Th, 그리고 옥틸인 경우는 286 Th에서 나타난다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 8은 MBIT 시약 종류에 따른 각 정량신호의 세기를 전체 조각이온의 세기의 총합에 대한 비율로 계산하여 도시한 것이다. XbS의 상대적 크기는 질량조절기가 프로필에서 옥틸인 경우는 3.8%정도로 균일하고 메틸과 에틸인 경우에는 각각 1.9%와 2.7%로 다른 MBIT에 비해 작게 나타나며, XaS 이온의 세기는 질량조절기의 길이가 길수록 강하게 나타난다.
도 9는 LMBIT이 연결된 angiotensin II와 HMBIT이 연결된 angiotensin II를 상기에 서술한 다양한 혼합비로 섞어서 정량분석하여, 각 혼합비와 측정을 통해 얻 어진 비의 선형성을 비교한 도면이다. 질량 조절기가 각각 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸인 MBIT의 정량 신호인 XaS(하얀 원)와 XbS(검은원)를 이용한 정량 분석 결과는 도 9a-9g에 도시하였다. 점선은 XaS를 이용한 실험 결과의 추세선이고, 실선은 XbS를 이용한 실험 결과의 추세선이다. 본 발명에 사용된 모든 MBIT이 angiotensin II의 정량분석에서 있어서, 혼합비와 잘 맞는 측정비를 나타내고 있음을 알 수 있었다. XaS를 이용한 정량 분석에서도 XbS와 같은 정도의 선형성을 보인다. 이는 XbS뿐만 아니라 XaS도 정량에 이용할 수 있음을 보여준다.
도 10은 MBIT으로 표지된 분석체의 정량분석 측정한계를 확인한 결과이다. LMBIT-과 HMBIT-으로 각각 표지된 angiotensin II를 2 대 1의 비율로 혼합한 후 농도를 2배씩 지속적으로 묽힌 시료들을 탄뎀 질량분석한 결과 중 정량신호질량(XbS)이 나오는 영역을 확대한 도면이다. 질량조절기가 (a) 에틸, (b) 부틸, (c) 펜틸, (d) 헥실, (e) 헵틸, 그리고 (f) 옥틸인 경우를 도시하였다. 한 개의 말디 스폿에 250 fmol의 시료가 도포된 경우에서 시작하여 농도를 2배씩 지속적으로 묽혀서 나타나는 정량 신호의 신호대 잡음비를 관찰하였다. 모든 경우에 약 5 fmol 정도의 시료를 측정할 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명에 사용한 기기의 측정한계에 해당하는 값으로 더 좋은 장비를 사용한다면 MBIT 시약의 측정한계는 더 낮아질 것으로 기대된다.
도 11은 네 가지 다른 생장 조건에서 얻어진 HA-Hsc82 단백질의 양과 정량분석을 위해 각각의 시료에 사용한 MBIT 시약을 표시한 도면이다. HA-Hsc82 단백질을 발현시킨 조건을 도 11a에 나타내었다. norm 30은 Hsp82와 Hsc82 단백질 모두 갖고 있는 효모를 30℃에서 키운 경우이고, norm 39는 Hsp82와 Hsc82 단백질 모두 갖고 있는 효모를 39℃에서 키운 경우이며, del 30은 Hsp82 단백질만 제거된 효모를 30℃에서 키운 경우이며, del 39는 Hsp82 단백질만 제거된 효모를 39℃에서 키운 경우이다. 이들 조건하에서 생성된 HA-Hsc82 단백질을 효모에서 추출 및 정제하여 전기영동한 이후 Sypro Ruby stain으로 염색한 결과를 도 11b에 도시하였다. 겔 이미지화 시스템으로 단백질의 양을 측정한 결과 norm 30은 3.49 μg, norm 39는 5.74 μg, del 30은 2.93 μg, 그리고 del 39는 4.90 μg이었다. 네 가지 조건의 HA-Hsc82 단백질들의 겔 밴드를 잘라내어 트립신으로 효소분해한 후 MBIT 시약에 반응하였는데, 각 단백질 그룹에 반응한 MBIT 시약을 도 11c에 도시하였다. 이때 norm 39와 L C 6 -Ala를, del 30과 L C 7 -Ala를, del 39와 L C 8 -Ala를, norm 30과 H C 6 -Ala, H C 7 -Ala, 및 H C 8 -Ala를 각각 반응하였다(C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.) 각각의 LMBIT와 HMBIT을 1 대 1로 섞어서 정량분석했을 때 예상되는 비율은 질량조절기가 헥실인 경우는 1.64이고, 헵틸인 경우는 0.84이며, 옥틸인 경우는 1.40이다. (norm 30 : norm 39 : del 30 : del 39 = 1 : 1.64 : 0.84 : 1.40)
도 12는 도 11c의 6종류의 분석체를 동일량 혼합하고 ZipTip으로 정제한 후 질량분석한 결과를 나타낸 도면이다. 각 분석체에는 질량조절기가 헥실(삼각형), 헵틸(사각형), 그리고 옥틸(원)인 MBIT 시약이 부착되어 있다. 질량스펙트럼 상에서 동일 분석체는 각각에 표지된 MBIT의 질량 차이(14 Da)만큼씩 분리되어 나타난다. 관측된 펩티드 중 다섯 가지의 펩티드(VLEIR, EIFLR, LLDAPAAIR, QLETEPDLFIR, GVVDSEDLPLNLSR)가 탄뎀 질량분석에 사용되었다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 13은 겔 이미지화 시스템으로 정량한 결과와 MBIT쌍으로 표지된 분석체를 말디 탄뎀 질량분석으로 정량한 결과를 비교 도시한 도면이다. 질량조절기가 헥실인 MBIT으로 얻은 결과들(norm 39 / norm 30)의 평균은 1.65로 겔 이미지화 시스템으로 정량한 결과에 비해 0.8% 크게 관측 되었고, 헵틸인 MBIT으로 얻은 결과들(del 30 / norm 30)은 0.85로 1.1%의 차이를 보였으며, 옥틸인 MBIT으로 얻은 결과들(del 39 / norm 30)은 1.46로 4.05%의 차이를 보였다. 겔 이미지화 시스템으로 정량한 결과와 유사한 결과를 보임을 알 수 있다. 이로부터 3쌍의 MBIT 시약을 이용하여 4 가지 생장 조건에서 얻어진 Hsc82 단백질의 상대적인 양을 동시에 알 수 있다. (norm 30 : norm 39 : del 30 : del 39 = 1 : 1.65 : 0.85 : 1.46)
도 14는 질량조절기가 헥실, 헵틸, 그리고 옥틸인 MBIT쌍으로 표지된 5 종류의 분석체의 말디 탄뎀 질량분석한 결과로부터 아미노산 서열 분석(de novo sequencing)한 결과를 나타낸다. 아미노산 코드에 그어진 밑줄은 그 아미노산의 서열분석이 정확하게 되었음을 의미한다. 아미노산 코드 다음에 이어지는 별표는 그 아미노산에 MBIT이 표지되었음을 나타낸다. 류신과 이소류신은 동일한 원소구성을 가지기 때문에 모두 류신으로만 표기하였다.
도 1은 MBIT 시약 및 기술을 개략적으로 나타낸 도면으로, (a)는 MBIT 시약의 구조이고, (b)는 MBIT 시약이 1차 아민기에 반응하여 표지되는 과정이며, (c)는 MBIT 시약 세트로 구분 표지된 펩티드를 탄뎀 질량분석한 경우 생성 가능한 조각이온들과 이들의 명칭이고, 그리고 (d)는 개략적인 탄뎀 질량분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 MBIT 기술에서 질량조절기(RT)로 알킬기를 사용한 경우의 각 MBIT의 고유값을 도시한 도면이다. 2a는 MBIT 정량신호 쌍의 질량값들을, 탄뎀 질량분석할 경우 220 Da 이하의 질량값을 가지고 생성될 수 있는, 조각이온들의 분포와 함께 개략적으로 도시한 도면이다. 2b는 질량조절기로 사용된 알킬기의 종류에 따른 각 MBIT의 고유한 표지지문 질량값과 정량신호 질량값을 표시한 도면이다.
도 3은 동일 물성을 가지면서 다양한 질량값을 가진 MBIT 세트의 탄뎀 질량 스펙트럼에서 나타나는 특성과 이들 MBIT 세트를 2종 이상 사용하여 3개 이상의 시료를 동시에 다중 정량분석하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 N-말단이 아실화된 디펩티드 구조의 MBIT 시약을 (a) 고체상 합성법과 (b) 액체상 유기 합성법을 이용하여 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 고체상 합성법으로는 질량조절기가 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸인 MBIT의 합성이 가능하고, 액체상 합성법으로는 질량조절기로 사용되는 아미노산 잔기가 헥실, 헵틸, 및 옥틸인 MBIT의 합성이 가능하다.
도 5는 MBIT 시약을 분석대상 펩티드와 반응시키기 위해 활성 에스테르를 형성하는 과정, 및 이를 통해 형성된 MBIT 활성 에스테르를 분석대상 펩티드와 반응시키는 실험방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 angiotensin II에 7종의 MBIT 시약쌍으로 반응을 보낸 후 각각을 말디 질량분석한 결과를 개략적으로 나타낸 도면이다. MBIT 시약에서 질량조절기가 (a) 에틸, (b) 프로필, (c) 부틸, (d) 펜틸, (e) 헥실, (f) 헵틸, 그리고 (g) 옥틸인 경우를 각각 도시하였다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 7은 7종의 MBIT 시약 쌍으로 각각 MBIT 반응이 진행된 angiotensin II 이온의 말디 탄뎀 질량분석 결과를 나타낸 도면으로, 각 MBIT 시약 쌍에 대하여 HMBIT으로 반응한 펩티드와 LMBIT으로 반응한 펩티드를 1대 1의 혼합비로 섞어서 탄뎀 질량분석한 결과이다. 질량조절기가 (a) 에틸, (b) 프로필, (c) 부틸, (d) 펜틸, (e) 헥실, (f) 헵틸, 그리고 (g) 옥틸인 MBIT이 연결된 angiotensin II의 CID 스펙트럼이다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 8은 MBIT 시약 종류에 따른 각 정량신호의 세기를 전체 조각이온의 세기의 총합에 대한 비율로 계산하여 도시한 것이다.
도 9는 LMBIT이 연결된 angiotensin II와 HMBIT이 연결된 angiotensin II를 다양한 혼합비로 섞어서 정량분석하여, 각 혼합비와 측정을 통해 얻어진 비의 선형 성을 비교한 도면이다.
도 10은 MBIT으로 표지된 분석체의 정량분석 측정한계를 확인한 결과이다. LMBIT-과 HMBIT-으로 각각 표지된 angiotensin II를 2 대 1의 비율로 혼합한 후 농도를 2배씩 지속적으로 묽힌 시료들을 탄뎀 질량분석한 결과 중 정량신호질량(bS)이 나오는 영역을 확대한 도면이다. MBIT 시약에서 질량조절기가 (a) 에틸, (b) 부틸, (c) 펜틸, (d) 헥실, (e) 헵틸, 그리고 (f) 옥틸인 경우를 각각 도시하였다.
도 11은 네 가지 다른 생장 조건에서 얻어진 HA-Hsc82 단백질의 양과 정량분석을 위해 각각의 시료에 사용한 MBIT 시약을 표시한 도면이다. HA-Hsc82 단백질을 발현시킨 조건을 도 11a에 나타내었고, 이들 조건하에서 생성된 HA-Hsc82 단백질을 효모에서 추출 및 정제하여 전기영동한 이후 Sypro Ruby stain으로 염색한 결과를 도 11b에 도시하였다. 네 가지 조건의 HA-Hsc82 단백질들의 겔 밴드를 잘라내어 트립신으로 효소분해한 후 MBIT 시약에 반응하였는데, 각 단백질 그룹에 반응한 MBIT 시약을 도 11c에 도시하였다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 12는 도 11c의 6종류의 분석체를 동일량 혼합하고 ZipTip으로 정제한 후 질량분석한 결과를 나타낸 도면이다. 각 분석체에는 질량조절기가 헥실(삼각형), 헵틸(사각형), 그리고 옥틸(원)인 MBIT 시약이 부착되어 있다. 다섯 가지의 펩티드가 탄뎀 질량분석에 사용되었다. 여기서 C n 은 질량조절기가 CnN-아실화된 아미노산을 뜻한다.
도 13은 겔 이미지화 시스템으로 정량한 결과와 MBIT쌍으로 표지된 분석체를 말디 탄뎀 질량분석으로 정량한 결과를 비교 도시한 도면이다. 이로부터 3쌍의 MBIT 시약을 이용하여 4 가지 생장 조건에서 얻어진 Hsc82 단백질의 상대적인 양을 동시에 알 수 있다.
도 14는 질량조절기가 (a)헥실, (b)헵틸, 그리고 (c)옥틸인 MBIT쌍으로 표지된 5 종류의 펩티드의 말디 탄뎀 질량분석한 결과로부터 아미노산 서열 분석(de novo sequencing)한 결과를 나타낸다. 아미노산 코드에 그어진 밑줄은 그 아미노산의 서열분석이 정확하게 되었음을 의미한다. 아미노산 코드 다음에 이어지는 별표는 그 아미노산에 MBIT이 표지되었음을 나타낸다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제:
    [화학식 1]
    Figure 112011028151205-pat00007
    또는
    Figure 112011028151205-pat00008
    여기서,
    RS 및 RB는 각각 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하고,
    RT는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
    Linker는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 하이드록시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RS 및 RB는 각각 메틸이고; RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 RS 및 RB는 각각 CH3 및 CD3이거나, 또는 각각 CD3 및 CH3인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 RT는 직쇄 또는 가지쇄의 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 또는 옥틸인 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제.
  6. 삭제
  7. 제1항의 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제 두 종류 이상을 포함하는 가변질량 라벨링제 세트.
  8. 제7항의 가변질량 라벨링제 세트에 있어서,
    상기 두 종류 이상의 가변질량 라벨링제 각각의 RS와 RB에 포함된 중수소 수가 상이하고,
    상기 두 종류 이상의 가변질량 라벨링제는 서로 중수소의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 가변질량 라벨링제 세트.
  9. 제7항의 가변질량 라벨링제 세트를 두 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 가변질량 라벨링제 세트.
  10. 제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 가변질량 라벨링제로 표지된 분석체를 포함하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분석체는 단백질, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 분석체는 펩티드인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 분석체는 핵산 또는 핵산 유도체인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 분석체는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 혼합물, 그의 염 또는 그의 수화물.
  15. 제7항 또는 제8항의 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시키는 단계; 및
    상기 가변질량 라벨링제 세트가 결합된 분석체를 분해하여 상기 분석체를 정량하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 정량을 위한 분해법은 탄뎀질량분석법인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 탄뎀질량분석법은 라벨링제의 RT에 따라 정량신호질량을 주는 정량신호의 위치가 변하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 정량신호질량을 주는 정량신호는 bS 이온, aS 이온, 및 RB 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 내부조각이온에 의한 것을 특징으로 하는 분석방법.
  19. 제15항에 있어서,
    1) 상기 RT가 메틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 114와 117 Th에서 나타나 고, 또 다른 정량신호질량(aS)이 86과 89 Th에서 나타나며, 표지 지문이 188 Th이고,
    2) 상기 RT가 에틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 128와 131 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 100와 103 Th에서 나타나며, 표지 지문이 202 Th이고
    3) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 프로필기인 경우, 정량신호질량(bS)이 142와 145 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 114와 117 Th에서 나타나며, 표지 지문이 216 Th이고,
    4) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 부틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 156와 159 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 128과 131 Th에서 나타나며, 표지 지문이 230 Th이고,
    5) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 펜틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 170와 173 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 142와 145 Th에서 나타나며, 표지 지문이 244 Th이고,
    6) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 헥실기인 경우, 정량신호질량(bS)이 184와 187 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 156와 159 Th에서 나타나며, 표지 지문이 258 Th이고,
    7) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 헵틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 198와 201 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 170와 173 Th에서 나타나며, 표지 지문이 272 Th이고, 또는
    8) 상기 RT가 직쇄 또는 가지쇄의 옥틸기인 경우, 정량신호질량(bS)이 212와 215 Th에서 나타나고, 또다른 정량신호질량(aS)이 184과 187 Th에서 나타나며, 표지 지문이 286 Th
    인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  20. 제9항에 따른 다중 가변질량 라벨링제 세트를 따른 분석체에 결합시키고 분해하여 해당 분석체를 정량하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 및 단백질 정량 동시 분석방법.
  21. 하기 화학식 1로 표현되는 가변질량 라벨링제를 두 종류 이상을 포함하는 가변질량 라벨링제 세트를 두 종류 이상 포함하는 다중 가변질량 라벨링제 세트를 분석체에 결합시켜 정량하는 과정에서 정해진 한 종류의 시료와 나머지 각기 다른 시료의 비율을 제19항에 해당하는 방법으로 각각 따로 정량하여 전체 시료들 사이의 양을 다중 정량하는 분석방법:
    [화학식 1]
    Figure 112011028151205-pat00023
    또는
    Figure 112011028151205-pat00024
    여기서,
    RS 및 RB는 각각 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고; RS 및 RB 중 적어도 하나는 하나 이상의 중수소를 포함하고,
    RT는 직쇄 또는 가지쇄의 C1-C18 알킬이고,
    Linker는 N-하이드록시숙신이미딜기, N-하이드록시설포숙신이미딜기, 벤조트리아졸-1-일옥실기, 펜타할로벤질기, 4-니트로페닐기 및 하이드록시기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
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