CN103228621B - 标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法 - Google Patents

标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103228621B
CN103228621B CN201180048175.4A CN201180048175A CN103228621B CN 103228621 B CN103228621 B CN 103228621B CN 201180048175 A CN201180048175 A CN 201180048175A CN 103228621 B CN103228621 B CN 103228621B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
ion
labelled reagent
phenyl
alkynes base
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201180048175.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103228621A (zh
Inventor
申承求
尹惠珠
郑庸植
李熙允
徐敏洙
徐宗喆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy Industry Foundation of POSTECH
Original Assignee
Academy Industry Foundation of POSTECH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020100081659A external-priority patent/KR101229704B1/ko
Priority claimed from KR1020100100538A external-priority patent/KR101207742B1/ko
Application filed by Academy Industry Foundation of POSTECH filed Critical Academy Industry Foundation of POSTECH
Publication of CN103228621A publication Critical patent/CN103228621A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103228621B publication Critical patent/CN103228621B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/47—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/51—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/20—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供使用氢同位素并且降低标记试剂的合成成本的同时，一次可定量多重试样的化合物。还提供利用标记试剂定量分析不同量的蛋白以及肽被测物的方法，提供将标记试剂结合于被测物后，对于通过串联质谱分析解离去掉标记试剂的一部分而剩下的包括被测物的大质量的y-型离子片段进行定量分析的新的方法。

Description

标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法
技术领域
本发明涉及标记试剂以及利用该标记试剂的氨基酸序列以及蛋白定量的同步分析方法，更具体地，涉及能够显示强定量信号的标记试剂以及利用该标记试剂的氨基酸序列以及蛋白多重定量的同步分析方法。
背景技术
质谱技术广泛应用于蛋白和肽的鉴定以及定量分析。例如，利用酶分解蛋白来生成肽，对得到的肽通过基质辅助激光解吸/电离(Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI)或电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)进行离子化，之后通过质谱分析仪准确测定质量并与基于基因序列的肽信息进行比较，由此鉴定蛋白，或更准确地，由质谱分析仪选择一部分肽并使所选肽与气体碰撞解离而生成离子片段，并基于该离子片段获取肽序列，由此鉴定蛋白。
蛋白和肽的定量分析中广泛使用将包含同位素的化学标记物标记在目标蛋白或肽并进行质谱分析的方法。对于需要定量分析的同一类多种蛋白和多肽试样，用以不同方式标记同位素的相同化学标记物进行质谱分析时，根据同位素的质量差异，在质谱图或串联质谱图中各试样显示的质量不同，由此通过比较其相对强度来进行定量分析。
为了同步进行如上所述蛋白或肽的鉴定和定量分析，利用等量异位化学标签(isobaricchemicaltagging)法。美国专利公开号US2005/0148087以及国际申请专利公开号WO2005/068446等公开了其与肽结合并进行碰撞解离时，在串联质谱图上显示定量信号的等量异位标记物。但是，这些文献提供的标记试剂使用C-13、N-15、或O-18等同位素，因此存在多种等量异位标记物的合成受到限制、价格高的问题。并且，利用已公开的等量异位标记物的标记试剂的定量分析无法适用于保罗阱(Paultrap)，线性离子阱(Lineariontrap)等四极离子阱质谱分析仪。因此，需要氢取代多样化，可利用价廉的氢同位素同步确定氨基酸序列和蛋白量的新型的等量异位标记物。
另外，四极离子阱质谱仪与其他质谱仪相比，价格低、维护管理容易、使用方便，且具有可以将离子捕获在气体中进行多次串联质谱分析的功能，因此广泛用于蛋白和肽的鉴定。因此，在蛋白研究领域中，最为广泛应用四极离子阱质谱仪。在这样的四极离子阱中，串联质谱分析通常是通过共振激发和碰撞诱导解离(ResonantExcitationCollision-InducedDissociation,RE-CID)技术来实现，但理论上并不限于此。此时，离子片段的质量与电荷之比小于母离子的质量与电荷之比的约1/3的情况下，在离子阱内未能稳定地被捕获，无法被检测，称为“低质量歧视(low-masscutoff')”效应。在已知的技术中被采用的等量异位标记物中使用质量为100～200Da左右的小的离子片段作为定量信号，因此存在在四极离子阱质谱仪由于低质量歧视效应而无法检测出定量信号离子的问题。并且，在100～200Da的质量范围内，来源于目标蛋白和肽的质量小的内部离子片段阻碍定量信号离子的可能性非常大，因此无法进行准确的定量分析。
可见，通过上述专利记载的物质，只能分析质量小的离子片段，具有无法适用于四极离子阱质谱仪的致命缺陷。因此，需要在普遍使用的四极离子阱质谱仪中也可以自由使用的等量异位标记物以及利用该标记物的分析方法的发明。并且，为了克服上述缺陷，需要定量信号以质量足够大的离子片段来显示。具有大质量的离子片段的情况下，与小质量的离子片段相比受到噪音信号影响的概率非常低，不受限于在四极离子阱质谱仪中可发生的低质量歧视效应，因此使用价值高。
另外，本发明人在韩国专利申请第2008-0070272号中公开提出了仅使用氢同位素并可调整定量信号质量、且具有二肽结构的新型等量异位标记试剂：称之为质量平衡的同位素标签((Mass-balancedisotopetag，MBIT)。此外，在韩国专利公开号第2010-0009466号，韩国专利公开号第2010-0009479号，以及PCT国际申请公开号WO10/008159中提出了通过改变质量调节基、改变等量异位标记物的物理性质以及定量信号质量的质量可变标记试剂以及标记试剂组合，作为采用该标记剂以及试剂组合的多重定量分析法提出了利用2种以上标记试剂同步定量分析3个以上试样的多重定量法即(2-plex)法。通过上述方法，可容易合成价廉的等量异位标记试剂，还可定量多重试样。但通过多重(2-plex)定量法进行多重定量时，存在作为基准的试样的消耗量多，一次分析所需的试样的总量也增加的问题。
基于上述问题，本发明人在使用氢同位素并且降低标记试剂的合成成本的同时，一次可定量多重试样的标记试剂的研究过程中，发现通过新的化学结构能够达到上述目的，从而完成了本发明。另外，针对分析多重试样时，定量信号的强度减弱、定量精确度降低的问题，通过改善现有技术，确认到串联质谱分析时，定量信号强，从而完成了本发明。另外，本发明的发明人在使用自己提出的等量异位标记物、研究能够适应于四极离子阱质谱仪的分析方法时，确认了通过具有大质量的定量信号离子来进行分析的方法，并确认到利用该方法，可在包括四极离子阱质谱仪的所有质谱仪中，对肽以及蛋白相对量进行定量的方法，从而完成了本发明。
发明概述
技术课题
本发明的目的在于提供一种化合物，其具有利用氢同位素并且降低标记试剂的合成成本的同时，一次可定量多重试样的新的化学结构。
此外，本发明的目的在于提供包含2种以上的上述化合物的组合物。
此外，本发明的目的在于提供利用上述化合物或上述组合物，同时定量分析2种以上的被测物的新的定量分析方法。
此外，本发明的目的在于提供如下方法，即利用包含氢同位素的、2种以上氨基酸序列以及蛋白的多重定量同步分析用等量异位质量可变标记试剂，通过在大于被测物质量值的质量值下检测到的定量分析信号进行定量分析的方法。
解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明提供以下述式(1)表示的化合物。
[结构式1]
式中，
R1为C1-10烷基或
R2为C1-10烷基或
R3为氨基酸残基的侧链；
R4为羟基或反应性连接基；
R5为氢、C1-4烷基或C2-4炔基；
R6为氢、C1-4烷基或C2-4炔基；
n和m分别独立地为1～4的整数；以及
上述R1和R2不包含氘，或上述R1和R2中的至少1种包含氘。
参考图1，对由上述结构式1表示的化合物的一例进行说明。如图1所示，由上述结构式1所示的化合物用于串联质谱分析时，生成显示定量信号的离子，尤其是R1 +以及R1-NH+＝CH-R3成为显示定量信号的离子。根据本发明的一实施例，可以确认R1被苄基取代时，R1 +显示强定量信号。
较好是，由上述结构式1表示的化合物的定量信号为4-(1-丙炔基)苄基阳离子。R1中包含氘时，能够显示不同的定量信号，作为一例的定量信号可为129Th(CH3C≡CC6H4CH2 +)、131Th(CH3C≡CC6H4CD2 +)、132Th(CD3C≡CC6H4CH2 +)或134Th(CD3C≡CC6H4CD2 +)。
较好是，在上述结构1中，
R1为C6-9烷基或
R2为C6-9烷基或
R5为氢、丙基或丙-1-炔基(prop-1-ynyl)；
R6为氢、丙基或丙-1-炔基；以及
n和m分别独立地为1～4的整数。
进一步较好是，在上述结构1中，
R1为辛基；R2为庚基。
另外，在上述结构式1中，较好是R1和R2的种类相同，即优选R1为C1-烷基,R2为C1-10烷基；或R1为R2为
另外，较好是，上述R1和R2如下：
分别为CH3C≡CC6H4CH2以及CD3C≡CC6H4CD2CH2；或
分别为CH3C≡CC6H4CD2以及CD3C≡CC6H4CH2CH2；或
分别为CD3C≡CC6H4CH2以及CH3C≡CC6H4CD2CH2；或
分别为CD3C≡CC6H4CD2以及CH3C≡CC6H4CH2CH2。
上述结构式1中，R3为氨基酸残基的侧链，该结构基于结构式1具有氨基酸的胺基被R1和R2取代的结构。
本发明中使用的用语“氨基酸”是指天然氨基酸或人工合成氨基酸，较好是指天然氨基酸。例如，上述氨基酸表示甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸或色氨酸。
另外，在本发明中所使用的用语“氨基酸残基的侧链”是指在氨基酸结构中除了NH2CH2COOH之外的其它结构，即NH2CH2COOH的CH2上取代的基团。例如，甘氨酸的情况下、甘氨酸残基的侧链是指氢，丝氨酸的情况下、丝氨酸残基的侧链是指羟甲基。在上述结构式1的制备过程中，可以根据氨基酸的种类，自由调节上述R3，由此能够调节定量信号。
上述结构式1中,R4为羟基或反应性连接基。
在本发明中所使用的用语“反应性连接基”是指能够使上述结构式1的化合物和被测物结合的反应基团。在本发明中，将上述结构式1的化合物用于蛋白或肽分析的情况下，较好是能够与蛋白或肽中存在的胺基或羟基反应的反应基团。作为一例，可以为琥珀酰亚胺-N-氧基、3-硫代琥珀酰亚胺-N-氧基、苯并三唑-1-基氧、五卤代苄氧基、4-硝基-苯氧基或2-硝基苯氧基，但不受限于这些。另外，R4为羟基的情况下，上述结构式1总体来说是具有羧基的化合物，因此可以使羧基成为反应性连接基取代的羰基。
上述结构式1表示的化合物中，优选化合物的例子如下：
1)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸；
2)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
3)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基)乙酸；
4)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
5)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸；
6)2-(N-(4-丙基苄基)-2-(4-丙基苯基)乙酰胺基)乙酸；
7)2-(5-苯基-N-(3-苯基丙基)戊酰胺基)乙酸；以及
8)2-(N-辛基辛酰胺基)乙酸。
另外，本发明提供包含2种以上由上述结构式1表示的化合物的组合物。
在本发明中所使用的用语“2种以上”是指包含2种以上化学结构互不相同的化合物，较好是包含2～4种化合物。进一步较好是，包含2种以上的化学结构差异仅限于氘和氢的取代与否的化合物。
较好是，上述2种以上化合物中氘数相同。化学结构互不相同但氘数相同，因此显示定量信号的离子质量发生差异，在质谱图或串联质谱图上显示的各试样的质量互不同，通过比较分析相对存在量来进行定量分析。
作为上述组合物的一例，可例举包含选自下述化合物的任意一种以上化合物的组合物。
1)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
2)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基)乙酸；
3)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；以及
4)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸。
另外，本发明提供利用由上述结构式1表示的化合物，或包含2种以上的由上述结构1表示的化合物的组合物，对被测物进行定量分析的方法。为了定量分析被测物，需要将上述化合物结合于被测物，上述化合物和被测物的结合是通过连接基与被测物的胺进行反应、并作为离去基团起作用而分离来实现。
上述被测物的特征为它是蛋白、碳水化物或脂质。另外，上述被测物的特征为它是肽。另外，上述被测物的特征为它是核酸或核酸衍生物。另外，上述被测物的特征为它是类固醇。
另外，本发明提供氨基酸序列以及蛋白的同步定量分析方法，其特征在于包括如下步骤：将包含2种以上由上述结构式1表示的化合物的组合物结合于被测物的步骤，以及解离上述被测物而定量该被测物的步骤。
以定量为目的的上述解离法较好是串联质谱分析法。提供上述定量信号质量的定量信号是R1 +或R1NH+＝CHR3的内部片段，较好是，提供上述定量信号质量的定量信号为4-(1-丙炔基)苄基阳离子。
较好是，提供上述定量信号质量的定量信号是129Th(CH3C≡CC6H4CH2 +)、131Th(CH3C≡CC6H4CD2 +)、132Th(CD3C≡CC6H4CH2 +)或134Th(CD3C≡CC6H4CD2 +)。
另外，本发明提供由上述化学式1表示的化合物的制造方法，参考图3～图5，对具体制造方法进行说明。
如图3所示，由上述结构式1表示的化合物通过利用卤代烷形式的报告单元(reporterunit)和羧酸形式的平衡单元(balanceunit)以及酯化氨基酸来进行合成。
另外，包含氘的由上述结构式1表示的化合物是通过进行在报告单元和平衡单元中导入氘的反应后，利用其进行制造。导入氘的方法可通过本发明所属领域公知的方法来进行。具体的，可采用图2记载的方法。导入一个氘的方法有以下几种：在碱性重水(D2O)中，将末端炔烃的氢取代为氘的方法；以及利用硼氘化钠(NaBD4)或氘化锂铝(LiAlD4)部分还原一个羰基的方法。导入两个氘的方法有如下几种：在金属催化作用下将链烯烃还原成氘气(D2)的方法；利用LiAlD4对肽键或酯键的羰基进行还原的方法；以及利用NaOCD3在酯类化合物的α位上导入氘的方法。三个氘可通过利用碘甲烷-d3(CD3I)使仲胺或末端炔烃烷基化的方法导入。导入四个氘的方法有通过使用LiAlD4还原两个羰基的方法以及在金属催化剂下将炔烃还原为D2的方法。在这些方法中，本发明作为一个实施例组合将酯键的羰基用LiAlD4还原而导入两个氘的方法以及用CD3I使炔烃烷基化而导入三个氘的方法，合成了4重等量异位标记试剂(图1(b)，标签α)。
在本发明中，作为一例，预先合成报告单元，将合成的报告单元的一部分通过3个阶段的追加反应步骤来使其变形来合成平衡单元，参考图4，对具体的报告单元和平衡单元的制造方法进行说明。
首先，报告单元的合成方法如下：
通过采用钯催化剂和碘化亚铜(CuI)的薗头偶合反应(Sonogashiracouplingreaction)，在4-溴苯甲酸甲酯中导入被三甲基硅基(TMS)保护的炔烃。接着，将酯还原成醇。这时如果使用氢化铝锂(LiAlH4)或氘化锂铝(LiAlD4)，则各自的情况下分别产生两个氢或氘取代的化合物。
将生成的醇用叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)处理而以叔丁基二甲基硅烷(TBS)进行保护，利用碳酸钾选择性地仅去除保护炔烃的TMS，对由此生成的末端炔烃，用碘甲烷-d0(CH3I)或-d3(CD3I)导入甲基-d0或-d3。接着，利用四正丁基氟化铵(TBAF)除去TBS。
用氯代甲磺酸对生成的化合物进行处理，使用碘化钠用碘取代则能够合成报告单元。反应过程中，根据LiAlH4/LiAlD4以及CH3I/CD3I的组合能够获得共4种报告单元。使用LiAlH4和CH3I时，生成没有氘的报告-d0(reporter-d0)，使用LiAlD4和CH3I时，形成包含两个氘的报告-d2(reporter-d2)，使用LiAlH4和CD3I时，形成包含三个氘的报告-d3(reporter-d3)，使用LiAlD4和CD3I时，形成具有五个氘的报告-d5(reporter-d5)。
接下来，平衡单元(Balanceunit)的合成方法如下：
使用合成得到的报告单元的一部分，使丙二酸二乙酯烷基化。通过回流(reflux)除去丙二酸的一个羧基后，用氢氧化钠水溶液水解乙酯来合成平衡单元。在使报告单元变形为平衡单元的过程中不使用氘，因此平衡单元的氘数取决于所使用的报告单元。
根据图3所示的方法，利用如上所述制得的报告单元和平衡单元制造包含氘的由结构式1表示的化合物，此时，保持报告单元和平衡单元中所包含的氘的总数。即，如图6所示，以4重等量异位标记试剂的标签α为例，使用报告-dn的情况下，平衡单元使用包含5-n个氘的(平衡-d5-n)来合成等量异位标记物。将甘氨酸甲酯的胺用报告-dn(n＝0,2,3以及5)进行烷基化。利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，来进行合成得到的化合物与平衡-d5-n的结合反应，用氢氧化钠水溶液水解甲酯，则能够获得定量信号的质量值为129+n的新型的等量异位标记试剂的标签α129+n。通过类似的方法，如图5所示，能够制得标签β。
另外，本发明提供包括如下步骤的被测物的定量方法，将包含由下述结构式2表示的化合物的标记试剂与被测物结合的步骤(步骤1)、使上述结合物离子化而生成离子片段的步骤(步骤2)、以及定量上述离子片段中包含被测物和RC的离子片段的步骤(步骤3)。
[结构式2]
或
式中，
RA为直链或支链的C1-C18烷基、RB为质量调节基，
RC为直链或支链的C1-C18烷基，
连接基(Linker)是诱导与被测物的结合的反应性基团，
RA以及RC为相同的烷基、至少一个包含一个以上的氘。
上述步骤1是结合上述由结构式2表示的标记试剂和被测物的步骤，其目的是将被测物结合在标记试剂并用于后续的定量分析。上述结合通过标记试剂的连接基和被测物的胺基的反应来完成。结合方式已记载在韩国专利公开号第2010-0009466号，韩国专利公开号第2010-0009479号，以及国际专利公开号WO10/008159，可以通过本领域公知的胺基和连接基的结合反应来进行结合。被测物中胺基数为2以上时，可结合2个以上的上述由结构式2表示的标记试剂。
在本发明中所使用的用语“标记试剂”是指由上述结构式2表示的化合物，上述化合物与韩国专利公开号第2010-0009466号，韩国专利公开第2010-0009479号以及国际专利公开号WO10/008159的记载相同，上述专利文献作为本发明的参考而援引。
具体地，在本发明中所使用的用语“连接基”表示通过胺的亲核性攻击成为离去基团的活性酯。上述胺的特征为它是伯胺。另外，上述反应性连接基可以选自N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基、苯并三唑-1-基氧、五卤代苄基、4-硝基苯基以及2-硝基苯基。
另外，本发明中所使用的用语“上述质量调节基(RB)”是与被测物结合后，在质谱分析过程中解离时，以调节N-酰化的氨基酸片段的质量而定量信号在质谱图中不与其它片段重叠为目的导入的基团。通过改变RB的种类，能够使定量信号的质量多样化。上述质量调节基可以是类似或相同物性的天然或人工氨基酸残基的侧链之一。此外，上述质量调节基的特征在于具有类似或相同的物性。此外，上述质量调节基是C1-18的直链或支链的烷基，作为一例，可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、或辛基等的直链或支链的烷基。
上述RA和RC作为相同的烷基、它们中的至少一个包含氘，并且起到基于同位素质量差能够进行定量分析的作用。较好是，其特征在于上述RA和RC为甲基或包含一个以上氘的甲基，或者上述RA和RC分别为乙基，RA和RC中至少一个包含一个以上的氘。另外，上述RA和RC为碳数相同的烷基，但所包含的氘数不同。鉴于此，上述RA和RC较好是分别为CH3和CD3或者CD3和CH3。即，在上述化合物中，对RA和RC，RA为CH3时RC为CD3，RC为CH3时RA为CD3。或者，上述RA和RC分别为C2H5以及C2D5,或者分别为C2D5以及C2H5。即，在上述化合物中，对RA和RC，RA为C2H5时RC为C2D5，RC为C2H5时RA为C2D5。
上述结构式2的特征在于N-末端酰化，C-末端结合有基于胺的亲核性攻击成为离去基团的连接基，用同位素标记的二肽。另外，上述二肽的特征在于它是用氘标记的二肽。
参考图13-15，对上述“标记试剂”的化学结构以及分析原理进行说明。
在图13图示了标记试剂的化学结构。专利申请(韩国专利公开号第2010-0009466号，韩国专利公开号第2010-0009479以及国际专利公开号WO10/008159)中记载的化合物已命名为“MBIT”，虽未理论上限制，但具有N-末端酰化，C-末端结合有连接基的二肽结构。
图14图示了肽和蛋白中结合MBIT物质的状态，但理论上不限于此。不仅与肽以及蛋白的N-末端的伯胺结合，也可以与赖氨酸侧链的伯胺结合。因此，将一个肽或蛋白上结合标记试剂的情况下，可以根据蛋白和肽包含的赖氨酸的个数，多重结合两个以上的标记试剂。即便被测物不是蛋白或肽，也可根据被测物所具有的伯胺或仲胺的个数，标记试剂与被测物进行结合，所结合的标记试剂最多为该个数。
尤其在本发明中，较好是将RA和RC所包含的总氘数恒定的、两种以上的由上述结构式2表示的化合物作为一组来使用，进一步较好是将两种作为一组来使用。构成该组的一对化合物分别称为第一化合物和第二化合物的情况下，上述第一化合物和第二化合物较好是具有相同的质量调节基(RB)。另外，在一对化合物中，第一化合物中的RA和RC之一与另一个相比包含更多的氘时，较好是第二化合物中将第一化合物的RC设为RA，将第一化合物的RA设为RC。作为一例，可例举在一对化合物中，第一化合物的RA以及RC分别为CH3、CD3时，第二化合物的RA以及RC分别为CD3、CH3的一对化合物。或者，在一对化合物中，第一化合物的RA和RC分别为C2H5、C2D5时，第二化合物的RA以及RC分别为C2D5、C2H5的一对化合物。尤其是，在本发明中，为了利用yS离子进行定量，因此较好是仅在第一化合物和第二化合物之一的RC包含氘。
对分别使用上述标记试剂组的第一化合物和第二化合物进行区别标记的被测物进行串联质谱分析的情况下，解离标记试剂使RA和RC分离时，通过解离产生的离子片段显示相当于RA和RC的氘的质量差的差异，该结果显示在串联质谱图上。比较它们的相对强度来定量被测物的相对量。通常，在串联质谱分析过程中解离产生的互补的两个离子片段可分别独立用于定量分析信号，但不受理论限制。
本发明中所使用的用语“被测物”是指采用本发明的标记试剂进行分析的物质。上述被测物可以为蛋白，碳水化物或脂质，也可以为肽、核酸或核酸衍生物或类固醇。
上述步骤2是使上述结合物离子化而生成离子片段的步骤，通过断裂结合物中存在的酰胺键来生成离子片段的步骤。
本发明的结合物的酰胺键断裂而生成的离子片段中，能够生成包含RA和RB的离子片段以及包含RC和被测物的离子片段。在本发明中，包含RA和RB的离子片段命名为“bS离子”，包含RC和被测物的离子片段命名为“yS离子”。参考图15和图16，对此进行说明。
图15图示了在串联质谱分析中结合物解离而产生的离子片段。此时，为了便于理解，将分子式相同、只有氘标记部位不同的一对MBIT试剂，区分为HMBIT和LMBIT，RA或RB上标记氘的称为HMBIT,RC上标记氘的称为LMBIT。结合有HMBIT和LMBIT的被测物的总质量相同。
被选为同位素标记基的两个基团中，包含氘和不包含氘的基团的左上角分别添加了H(包含氘)和L(不包含氘)。如图15所示，在串联质量分析过程中，结合物中二肽的两个氨基酸之间的酰胺键断裂而分成包含RA和RB的离子片段(bS)以及包含RC和被测物的离子片段(yS)，但未受理论限制。在被测物中，仅相当于结构式2的部分分离而得的离子片段命名为-标签(-tag)。
图16图示对与2个以上的结构式2的化合物结合的肽进行串联质量分析时，理论上生成的串联质谱图，但未受理论限制。如图16所示，包括肽的N-末端以及C-末端氨基酸的2个以上的胺基与结构式2化合物结合时，可由肽生成的所有b-以及y-型序列离子的质量均具有小于-tag质量的质量值，但未受理论限制。因此，与-tag相比质量大的yS离子理论上显示在完全不受由肽衍生的其它离子片段的影响的质量范围。利用应用最广的蛋白分解酶即胰蛋白酶或LysC酶切蛋白时，能够获得在C-末端包含赖氨酸的肽，因此，在N-末端胺基和C-末端赖氨酸侧链的胺基上能够结合2个结构式2的化合物。
上述步骤3是定量上述离子片段中包含被测物和RC的离子片段(yS)的步骤，是基于具有大质量的离子片段分析被测物的步骤。
yS定量信号的质量值为母离子的质量值的1/3以上，因此在离子阱质谱仪中，利用共振激发碰撞诱导解离法进行串联质谱分析时，不受“低质量歧视(low-masscutoff')”效应的影响，能够检测yS离子。因此，不同于利用小质量值的定量信号的以往其它等量异位标记物，具有也可以在四极离子阱质谱分析仪进行利用yS定量信号的定量分析的特征。
根据采用上述分析方法的本发明的一实施例，能够确认通过利用结构式2的化合物，基于具有大质量值的yS离子片段进行定量分析。尤其是，由于利用具有与被测物本身相比更大质量的离子片段，因此在四极离子阱质谱分析仪中也能够进行定量分析，并且信号强度也增强，因此能够进行与以往的利用结构式2的化合物的分析相比更有效的分析。
发明效果
本发明能够提供包含氢同位素并且能够显示强定量信号强度，可同时对2种以上蛋白进行定量分析的新的化合物，以及包含2种以上该化合物的组合物，利用上述标记试剂或组合物测序氨基酸序列的同时定量分析蛋白量的方法。
另外，本发明能够提供利用等量异位标记试剂，测序肽的氨基酸序列的同时，定量分析含量的新的方法。以往的其它等量异位标记试剂的情况下，使标记物与被测物结合，接着通过串联质谱分析断开标记物中间的键后，利用不包含被测物的小质量的离子片段进行定量分析，与此相对，本发明具有如下特征，即利用等量异位标记试剂，在串联质谱分析过程中，断开标记物的键后，利用生成的离子片段中包含被测物且具有大质量值的离子片段(yS)来进行定量分析。因此，与以往利用小质量值的定量信号离子的分析相比，能够以最大强至5倍以上的信号强度进行定量分析，并且能够在包括四极离子阱质谱分析仪的所有质谱仪中对肽以及蛋白的相对量进行定量。
附图简要说明
图1表示本发明的化合物结构。图1(a)表示本发明的化合物的代表性结构以及由化合物产生的定量信号的结构。图1(b)～1(e)表示本发明的一实施例化合物的四种结构。图1(b)是通过氢同位素合成为等量异位标记物的结构，各X1-X4表示选择性取代为氢同位素的位置。
图2表示能够以利用氢同位素将本发明的化合物制成等量异位标记试剂为目的来适用的、具有代表性的添加以及取代氘的反应。
图3表示本发明的化合物的合成路径。利用卤代烷形式的报告单元(R1-Br)和羧酸形式的平衡单元(R2-COOH)以及酯化氨基酸来进行合成。
图4表示通过氘的添加以及取代反应，合成本发明的一实施例的化合物(标签α)所需的报告单元和平衡单元的路径。平衡单元是通过报告单元的改变来合成。通过组合两种氘的引入方法(将酯键的羰基用LiAlD4还原而导入两个氘的方法以及用CD3I使炔烃烷基化而导入三个氘的方法)分别合成四种报告单元以及平衡单元。
图5表示合成本发明的一实施例的化合物(标签β)所需的报告单元和平衡单元的合成路径。平衡单元是通过报告单元的改变来合成。
图6表示本发明的一实施例的化合物结构。是通过使用包含n个氘的报告-dn、包含5－n个氘的平衡-d5-n以及甘氨酸合成的，标签αm表示定量信号的质量值为m的标签α。
图7表示本发明化合物的活性化方法的一实施例，表示用琥珀酰亚胺酯活性化化合物并使其与肽结合的方法。
图8表示与本发明的一实施例的化合物结合的模型肽(DRVYIHPF)的串联质谱图。图8(a)～图8(d)表示使用了多重等量异位标记物(标签α129-α134)的结果，图8(e)～图8(g)表示使用非等量异位标记物(标签β-δ)的结果。
图9表示本发明的一实施例的化合物中产生的定量信号(苄基阳离子和亚胺阳离子(iminiumcation))的相对强度。定量信号强度以对于由模型肽产生的组氨酸亚胺离子(ImmoniumIon)(110Th)强度的相对值来表示。
图10表示按照一定比例将用本发明的一实施例的多重等量异位标记物进行标记的模型肽进行混合来进行串联质谱分析的结果。图10(a)表示按照2:1:2:1(标签α129:α131:α132:α134)比例混合以等量异位标记物标记的肽的试样的结果，图10(b)表示按照1:2:1:2(标签α129:α131:α132:α134)的比例混合的试样的结果。
图11表示测定了可利用多重等量异位标记物(标签α129-α134)进行测定的肽量或浓度范围的结果。其表示对于以多重等量异位标记物进行标记的trypticBSA(牛血清白蛋白，bovineserumalbumin)中的FGER,VASLR以及SEIAHR进行串联质谱分析的结果，是按照3：1的比例混合以标签α129和标签α1 31标记的肽，总蛋白量从4.2皮摩尔(picomole)稀释至13飞摩尔(femtomole)后，进行串联质谱分析的结果。各浓度下观测到的母离子的强度示于图11(a)，通过串联质谱分析测得的定量信号的比例示于图11(b)。
图12表示通过联用液相色谱仪(LC)和MALDI质谱仪定量分析以多重等量异位标记物标记的trypticBSA的结果。图12(a)表示对各肽按照LC中溶出的时间，用MALDI质谱仪观测到的母离子强度，图12(b)表示将各肽中测定的定量信号量与标签α129的定量信号量进行比较的结果。是根据以等量异位标记物标记的trypticBSA中的6种肽(FGER,VASLR,QEPER,AWSVAR,SEIAHR以及YLYEIAR)测得的结果。
图13图示了本发明的标记试剂的化学结构。
图14图示了本发明的标记试剂与肽以及蛋白结合的反应。
图15概括性表示了与被测物的胺基结合的标记试剂在串联质谱分析中被解离的情况下，能够生成的离子片段的种类。
图16表示对与2个以上标记试剂结合的肽进行串联质量分析时，理论上能够生成的串联质谱图。
图17表示结合两种模型肽与本发明的一实施例的标记试剂后，分别用电喷雾(ESI)进行质谱分析的结果。
图18表示在N-末端具有一个胺基的肽LISFYAGR与本发明的一实施例的标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子(MH2 2+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。
图19表示在N-末端具有一个胺基的肽LISFYAGR与本发明的一实施例的标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子(MH+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。
图20表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与本发明的一实施例的标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子(MH2 2+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。
图21表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与本发明的一实施例的标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子(MH+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。
图22表示在四极离子阱对本发明的一实施例的标记试剂标记的模型肽LISFYAGR(图22(a))和LISFYAGK(图22(b))的带有2个单位正电荷的母离子(MH2 2+)进行串联质谱分析时所显示的yS定量信号强度在整个离子片段信号的总强度之和中所占的比例。
图23表示在四极离子阱对本发明的一实施例的标记试剂标记的模型肽LISFYAG(图23(a))和LISFYAGK(图23(b))的带有1个单位正电荷的母离子(MH+)进行串联质谱分析时所显示的yS定量信号强度在整个离子片段信号的总强度之和中所占的比例。图23(c)表示通过MALDI离子化方法生成以本发明的一实施例的标记试剂标记的模型肽LISFYAGR的带有1个单元正电荷的母离子，并在TOF/TOF设备中进行串联质谱分析时显示的bS定量信号的强度比。
图24(a)表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与Val-标签结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子(MH2 2+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的MS2串联质谱图，图24(b)表示在离子阱内再次选择在MS2串联质谱分析中生成的LyS离子，并通过共振激发解离而得的MS3串联质谱图。
图25表示对于按照各种比例混合分别以Gln-标签的HMBIT和LMBIT标记的模型肽LISFYAGK，通过串联质谱分析所生成的LyS和HyS离子的信号强度比进行定量分析而获得的定量分析标准曲线。
图26(a)和26(b)图示N-末端和赖氨酸侧链上具有各1个胺基即共2个胺基的肽YGGFLK上结合有乙基-标签中HMBIT(图26(a))或LMBIT(图26(b))的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的母离子(MH+)并通过共振激发碰撞解离而获得的MS2串联质谱图，图26(c)和26(d)是将图26(a)和26(b)中生成yS定量信号离子的范围进行放大的图。
图27表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与乙基-标签结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子，并通过共振激发碰撞诱导解离而得的MS2串联质谱图，为图示按照2：1的比例混合与乙基-标签的LMBIT结合的肽和与HMBIT结合的肽，并进行串联质谱分析的图谱。
图28(a)为表示随着检测出的肽的液相色谱溶出时间的变化所测定的[HyS]:[LyS]比例的图。图28(b)为表示随着检测出的肽的质量与电荷之比的变化所测定的[HyS]:[LyS]比例的图。
具体实施方式
以下，参考实施例以及附图对本发明的化合物以及利用该化合物的氨基酸序列以及蛋白定量同步分析方法进行详细说明，但本发明并不受限于后述的内容，本领域技术人员在不脱离本发明的技术思想的范围内，能够以其它各种形式实施。
实施例1
以图1(a)为代表的化合物(标记试剂)中，在R1、R2以及R3位置上可以导入各种结构或功能基团。在本发明中，作为实施例，如图1(b)～图1(e)所示，合成具有4种结构的化合物(标签α-δ)，确认了基于各个结构或功能基团的定量信号的变化。
在4种结构中，图1(b)是利用氢同位素合成了对多重蛋白进行定量的等量异位标记试剂的例。图1(b)的X1～X4表示取代的氘的位置。
实施例1－1)非等量异位标记试剂的合成
按照图3所示的顺序合成标记试剂。非等量异位标记试剂中，对于能够通过商业渠道得到的报告单元和平衡单元的标签γ和δ，购买各单元(γ的报告单元、3-碘代丙苯；δ的报告单元、1-碘代辛烷；γ的平衡单元、5-苯基戊酸；以及δ的平衡单元、辛酸)合成各标记试剂，对于标签β，根据图5的路径合成构成标记试剂的报告单元(1-(碘甲基)-4-丙苯)以及平衡单元(2-(4-丙苯基)乙酸)，使用这些单元合成了标签β。
标签β的合成
首先，将报告单元的合成步骤以及各步骤中生成的化合物的核磁共振(NMR)结果示于下述步骤1～8。
步骤1:4-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯的合成
在氩气条件下，将10mL的经干燥的四氢呋喃(dryTHF)中溶解4-溴苯甲酸甲酯(500mg,2.33mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2；86.1mg,0.116mmol)、三苯基膦(PPh3；18.3mg,0.0698mmol)、三甲基硅基乙炔(TMSacetylene；493μL,3.49mmol)、三乙胺(Et3N；486μL,3.49mmol)后，在室温搅拌20分钟。该溶液中，再添加碘化亚铜(CuI；8.86mg,0.0465mmol)，室温下搅拌15小时。反应结束后，经减压蒸馏除去溶剂，再添加20mL的正戊烷，用硅藻土(Celite)片过滤而除去沉淀。减压蒸馏浓缩获得的溶液，并通过柱层析法提纯得到503mg目标化合物(2.16mmol,93％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.93(dd,2H,J＝6.8Hz,J＝1.7Hz),7.48(dd,2H,J＝6.7Hz,J＝1.8Hz),3.88(s,3H),0.22(s,9H)。
步骤2:(4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇的合成
在氩气条件下，5mL干燥THF中溶解4-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯(316mg,1.36mmol)后，冷却至0℃，缓慢加入LiAlH4(2.04mL,1.0MTHF溶液,2.04mmol)。在0℃搅拌30分钟、反应结束后，依次加入水77μL、10％的氢氧化钠水溶液154μL、水231μL，终止反应。生成白色粘性沉淀后，用氧化硅片进行过滤而除去沉淀。减压蒸馏浓缩制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到258mg目标化合物(1.26mmol,93％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.27(d,2H,J＝8.1Hz),4.66(s,2H),1.67(br,1H),0.23(s,9H)。
步骤3:叔丁基二甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THFL中溶解(4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇(258mg,1.26mmol)后，冷却至0℃，加入咪唑(103mg,1.52mmol)和溶解于干燥THF3mL中的TBSCl(228mg,1.52mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌15小时。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液10mL，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次10mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到383mg目标化合物(1.20mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.41(d,2H,J＝8.2Hz),7.23(d,2H,J＝8.1Hz),4.70(s,2H),0.90(s,9H),0.22(s,9H),0.00(s,6H)。
步骤4:叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲硅烷的合成
在氩气条件下，在4mL甲醇中溶解叔丁基甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷(383mg,2.40mmol)和碳酸钾(332mg,2.40mmol)后，在室温搅拌2小时。反应结束后，添加10mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到280mg目标化合物(1.14mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.25(d,2H,J＝8.5Hz),4.72(s,2H),3.02(s,1H),0.92(s,9H),0.01(s,6H)。
步骤5:叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲基硅烷(247mg,1.00mmol)后，冷却至-78℃，缓慢加入正丁基锂(805μL,2.49M正己酸溶液，2.00mmol)。在-78℃搅拌20分钟后，再加入碘代甲烷(313μL,5.00mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌30分钟。反应结束后，添加10mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到253mg目标化合物(0.971mmol,97％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.35(d,2H,J＝8.2Hz),7.22(d,2H,J＝8.2Hz),4.70(s,2H),2.03(s,3H),0.93(s,9H),0.07(s,6H)。
步骤6:叔丁基二甲基((4-丙基苄基)氧)硅烷的合成
20mL乙酸乙酯中溶解叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷(252mg,0.968mmol)后，在具有20巴的氢气压力的H-Cube设备上安装10％Pd/C卡盘，在室温下以每分钟0.5mL的速度使其通过。减压蒸馏所通过的溶液并进行浓缩，获得251mg目标化合物(0.949mmol,98％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.23(d,2H,J＝8.1Hz),7.12(d,2H,J＝8.1Hz),4.69(s,2H),2.26(t,2H,J＝7.4Hz),1.65-1.58(m,2H),0.94-0.85(m,12H),0.08(s,6H)。
步骤7:(4-丙基苯基)甲醇的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基二甲基((4-丙基苄基)氧)硅烷(275mg,1.04mmol)后，缓慢加入正丁基氟化胺(TBAF；1.56mL,1.0M四氢呋喃溶液,1.56mmol)，在0℃搅拌30分钟。反应结束后，添加5mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到198mg目标化合物(0.838mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.25(d,2H,J＝8.0Hz),7.18(d,2H,J＝8.0Hz),4.57(s,2H),2.97(s,1H),2.62(t,2H,J＝7.4Hz),1.74-1.62(m,2H),0.99(t,3H,J＝7.4Hz)。
步骤8:1-(碘代甲基)-4-丙基苯的合成
在氩气条件下，在3mL干燥的二氯甲烷(DCM)中，溶解(4-丙基苯基)甲醇(100mg,0.666mmol)后,冷却至0℃，加入甲磺酰氯(MsCl；62.1L,0.799mmol)和三乙胺(Et3N；140μL,0.999mmol)。在0℃搅拌30分钟后，反应结束时，添加5mL水使反应终止，对使用DCM提取(每次3mL、共3次)得到的有机层，进行无水硫酸镁处理，除去水分，滤去沉淀。减压蒸馏所得的溶液进行浓缩后，溶解在6mL丙酮，再加入碘化钠(NaI；150mg,0.999mmol)。在室温搅拌15分钟后，反应结束时减压蒸馏溶剂使其干燥。在这里添加10mL水，使用乙酸乙酯提取(每次5mL，共3次)所得的有机层，对其进行无水硫酸镁处理，除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到157mg目标化合物(标签β报告单元)(0.604mmol,90％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.27(d,2H,J＝8.1Hz),7.08(d,2H,J＝8.0Hz),4.44(s,2H),2.53(t,2H,J＝7.4Hz),1.67-1.54(m,2H),0.92(t,3H,J＝7.4Hz)
由上述合成的标签β的报告单元合成平衡单元的步骤以及各步骤中生成的化合物的NMR结果示于以下步骤9和10。
步骤9:2-(4-丙基苯基)乙腈的合成
在氩气条件下，在1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(干燥DMF)中溶解1-(碘代甲基)-4-丙基苯(73.6mg,0.283mmol)后，加入氰化钠(NaCN；27.7mg,0.566mmol)，在室温搅拌2小时。反应结束后，添加3mL水，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次3mL、共3次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到41.0mg目标化合物(0.257mmol,91％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.23-7.16(m,4H),3.69(s,2H),2.58(t,2H,J＝7.3Hz),1.69-1.57(m,2H),1.93(t,3H,J＝7.3Hz)。
步骤10:2-(4-丙基苯基)乙酸的合成
在1mL的30％氢氧化钠水熔中溶解2-(4-丙基苯基)乙腈(41.0mg,0.257mmol)后，回流(reflux)条件下搅拌4小时。反应结束后，添加3mL的10％氯化氢水溶液，使溶液变为酸性，对使用二乙酯提取(每次3mL、共3次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓度，并通过柱层析法提纯得到34.8mg目标化合物(标签β平衡单元)(0.195mmol,76％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.24-7.13(m,4H),3.16(s,2H),2.58(t,2H,J＝7.3Hz),1.70-1.58(m,2H),0.95(t,3H,J＝7.4Hz)。
利用如上制得的报告单元和平衡单元，通过如图3所示的步骤，进行标签β的合成，具体的合成方法以及各反应步骤中合成的化合物的NMR结果示于如下步骤11至13。步骤11:2-((4-丙基苄基)氨基)乙酸甲酯的合成
在氩气条件下，在5mL干燥DMF中溶解甘氨酸甲酯(448mg,3.57mmol)后，添加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA；777μL,4.46mmol)和1-(碘代甲基)-4-丙基苯(232mg,0.892mmol)，在室温搅拌1天。反应结束后，添加10mL水，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次10mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到152mg目标化合物(0.687mmol,77％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.20(d,2H,J＝7.9Hz),7.10(d,2H,J＝7.9Hz),3.73(s,2H),3.68(s,3H),3.38(s,2H),2.54(t,2H,J＝7.4Hz),1.94(br,1H),1.67-1.54(m,2H),0.91(t,3H,J＝7.3Hz)。
步骤12:2-(N-(4-丙基苄基)-2-(4-丙基苯基)乙酰胺基)乙酸甲酯的合成
在干燥的DCM1mL中，在氩气条件下溶解2-((4-丙基苄基)氨基)乙酸甲酯(24.5mg,0.0983mmol)和2-(4-丙基苯基)乙酸(17.5mg,0.0983mmol)后，加入EDC(56.5mg,0.295mmol)、HOBt(39.8mg,0.295mmol)以及DIPEA(84.3μL,0.491mmol)，在室温搅拌20小时。反应结束后，加入3mL的水，使其反应终止，对使用DCM提取(每次3mL，共4次)得到的有机层进行无水硫酸镁处理，除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏而浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到31.1mg目标化合物(0.0789mmol,80％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.24-7.10(m,6H),6.96-6.94(m,2H),4.55(s,2H),4.20(s,2H),3.80(s,2H),3.69(s,3H),2.57-2.51(m,4H),1.67-1.54(m,4H),1.94-1.88(m,6H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.24-7.10(m,6H),6.96-6.94(m,2H),4.62(s,2H),3.90(s,2H),3.67(s,2H),3.61(s,3H),2.57-2.51(m,4H),1.67-1.54(m,4H),1.94-1.88(m,6H)。
步骤13：2-(N-(4-丙基苄基)-2-(4-丙基苯基)乙酰胺基)乙酸的合成
在0.5mL甲醇中溶解2-(N-(4-丙基苄基)-2-(4-丙基苯基)乙酰胺基)乙酸甲酯(30.0mg,0.0786mmol)后，加入20％的氢氧化钠水溶液100μL，在室温搅拌2小时。反应结束后，加入3mL乙酸乙酯稀释后，加入200μL的10％氯化氢水溶液使其中和。用无水硫酸镁除去水分，进行减压蒸馏而浓缩滤去沉淀后得到的溶液，并通过柱层析法提纯得到26.4mg目标化合物(0.0718mmol,91％)。
主要异构体体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.24-6.88(m,8H),4.54(s,2H),3.98(s,2H),3.77(s,2H),2.55-2.47(m,4H),1.64-1.51(m,4H),0.93-0.87(m,6H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.24-6.88(m,8H),4.58(s,2H),3.83(s,2H),3.63(s,2H),2.55-2.47(m,4H),1.64-1.51(m,4H),0.93-0.87(m,6H)。
标签 γ的合成
利用购买的报告单元和平衡单元，通过如图3所示的步骤，进行标签γ的合成，具体的合成方法以及各反应步骤中合成的化合物的NMR结果示于如下步骤1至3。
步骤1：2-((3-苯基丙基)氨基)乙酸甲酯的合成
在氩气条件下，在干燥DMF3mL中溶解甘氨酸甲酯(330mg,2.63mmol)后，添加DIPEA(573μL,3.29mmol)和1-溴-3-苯基丙烷(100μL,0.658mmol)，在室温搅拌1天。反应结束后，添加5mL水，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次4mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液而进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到19.6mg目标化合物(.0946mmol,14％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.28-7.23(m,2H),7.18-7.13(m,3H),3.70(s,3H),3.39(s,2H),2.68-2.60(m,4H),1.86-1.76(m,2H)。
步骤2:2-(5-苯基-N-(3-苯基丙基)戊酰胺基)乙酸甲酯的合成
干燥好的DCM1mL中，在氩气条件下，溶解2-((3-苯基丙基)氨基)乙酸甲酯(20.0mg,0.0965mmol)和5-苯基戊酸(22.0mg,0.116mmol)后，添加EDC(55.5mg,0.289mmol)、HOBt(39.1mg,0.289mmol)以及DIPEA(82.7μL,0.482mmol)，在室温搅拌20小时。反应结束后，添加3mL水，使反应终止，对使用DCM提取(每次3mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到34.2mg目标化合物(0.0931mmol,96％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.31-7.23(m,4H),7.21-7.14(m,6H),4.01(s,2H),3.69(s,3H),3.30(t,2H,J＝7.9Hz),2.62-2.56(m,4H),2.24(t,2H,J＝6.9Hz),1.90-1.85(m,2H),1.68-1.59(m,4H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.31-7.23(m,4H),7.21-7.14(m,6H),3.95(s,2H),3.72(s,3H),3.42(t,2H,J＝7.9Hz),2.62-2.56(m,4H),2.18(t,2H,J＝6.9Hz),1.90-1.85(m,2H),1.68-1.59(m,4H)。
步骤3:2-(5-苯基-N-(3-苯基丙基)戊酰胺基)乙酸的合成
在0.5mL甲醇中溶解2-(5-苯基-N-(3-苯基丙基)戊酰胺基)乙酸甲酯(34.2mg,0.0931mmol)后，添加20％的氢氧化钠水溶液100μL，在室温搅拌2小时。反应结束后，添加3mL乙酸乙酯进行稀释，再添加10％氯化氢水溶液200μL，进行中和。利用无水硫酸镁去水分、除去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到26.2mg目标化合物(0.0741mmol,80％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.26-7.12(m,10H),3.99(s,2H),3.28(t,2H,J＝7.7Hz),2.61-2.52(m,4H),2.21(t,2H,J＝6.5Hz),1.91-1.76(m,2H),1.61-1.55(m,4H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.26-7.12(m,10H),3.91(s,2H),3.40(t,2H,J＝7.3Hz),2.61-2.52(m,4H),2.21(t,2H,J＝6.5Hz),1.91-1.76(m,2H),1.61-1.55(m,4H)。
标签δ的合成
利用购买的报告单元和平衡单元，通过如图3所示的步骤，进行标签δ的合成，具体的合成方法以及各反应步骤中合成的化合物的NMR结果示于如下步骤1至3。步骤1:2-(辛基氨基)乙酸甲酯的合成在氩气条件下，在2mL干燥DMF中溶解甘氨酸甲酯(358mg,2.85mmol)后，添加DIPEA(620μL,3.56mmol)和1-溴代辛烷(123μL,0.712mmol)，在室温搅拌1天。反应结束后，添加5mL水，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次4mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到31.6mg目标化合物(0.157mmol,22％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3)：d3.68(s,3H),3.36(s,2H),2.54(t,2H,J＝7.1Hz),1.77(s,1H),1.47-1.40(m,2H),1.24-1.22(m,10H),0.83(t,3H,J＝6.5Hz)
步骤2:2-(N-辛基辛酰胺基)乙酸甲酯的合成
在氩气条件下，在1mL干燥的DCM中溶解2-(辛基氨基)乙酸甲酯(31.6mg,0.157mmol)和正辛酸(30.0μL,0.188mmol)后，加入EDC(90.3mg,0.471mmol)、HOBt(63.6mg,0.471mmol)以及DIPEA(135μL,0.785mmol)，在室温搅拌12小时。反应结束后，加入5mL水，使反应终止，并用DCM提取(每次4mL、共4次)获得的有机层以无水硫酸镁处理而去除水分。滤去沉淀，减压蒸馏溶液进行浓缩后，通过柱层析法提纯获得44.7mg目标化合物(0.136mmol,87％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d4.00(s,2H),3.68(s,3H),3.28(t,2H,J＝7.8Hz),2.32(t,2H,J＝7.4Hz),1.64-1.43(m,4H),1.25(br,19H),0.86-0.82(m,6H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d3.98(s,2H),3.72(s,3H),3.32(t,2H,J＝7.5Hz),2.15(t,2H,J＝7.3Hz),1.64-1.43(m,4H),1.25(br,19H),0.86-0.82(m,6H)。
步骤3:2-(N-辛基辛酰胺基)乙酸的合成
在0.5mL甲醇中溶解2-(N-辛基辛酰胺基)乙酸甲酯(44.7mg,0.136mmol)后，加入100μL的20％氢氧化钠水溶液，在室温搅拌2小时。反应结束后，加入3mL乙酸乙酯进行稀释，加入200μL的10％氯化氢水溶液进行中和。用无水硫酸镁除去水分，滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，利用柱层析法提纯获得36.5mg的目标化合物(0.116mmol,86％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d4.01(s,2H),3.30(t,2H,J＝7.5Hz),2.24(t,2H,J＝7.4Hz),1.64-1.54(m,4H),1.26(br,18H),0.87-0.83(m,6H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d3.97(s,2H),3.32(t,2H,J＝7.5Hz),2.19(t,2H,J＝7.5Hz),1.64-1.54(m,4H),1.26(br,18H),0.87-0.83(m,6H)。
实施例1-2)多重等量异位标记试剂的合成
首先，在4种报告单元中，将报告-d5和报告-d0的合成步骤以及各步骤中生成的化合物的NMR结果示于以下步骤1～7。
步骤1:4-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯的合成
在氩气条件下，在10mL的干燥THF中溶解4-溴代苯甲酸甲酯(500mg,2.33mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(Pd(PPh3)2Cl2；86.1mg,0.116mmol)、三苯基膦(PPh3；18.3mg,0.0698mmol)、三甲基硅基乙炔(TMSacetylene；493μL,3.49mmol)、三乙胺(Et3N；486μL,3.49mmol)后，在室温搅拌20分钟。该溶液中，再添加碘化亚铜(CuI；8.86mg,0.0465mmol)，室温下搅拌15小时。反应结束后，经减压蒸馏除去溶剂，再添加20mL的正戊烷，用硅藻土(Celite)片过滤而除去沉淀。减压蒸馏获得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到503mg目标化合物(2.16mmol,93％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.93(dd,2H,J＝6.8Hz,J＝1.7Hz),7.48(dd,2H,J＝6.7Hz,J＝1.8Hz),3.88(s,3H),0.22(s,9H)。
步骤2
1)4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇-d2的合成
在氩气条件下，在20mL干燥THF中溶解4-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯(1.00g,5.16mmol)后、冷却至0℃，缓慢加入LiAlD4(217mg,5.16mmol)。在0℃搅拌30分钟、反应结束后，依次加入水220μL、10％的氢氧化钠水溶液440μL、水660μL，终止反应。生成白色粘性沉淀后，用氧化硅片进行过滤而除去沉淀。减压蒸馏浓缩制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到788mg目标化合物(3.82mmol,89％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.27(d,2H,J＝8.1Hz),1.67(br,1H),0.23(s,9H)。
2)(4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解4-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯(316mg,1.36mmol)后，冷却至0℃，缓慢加入LiAlH4(2.04mL,1.0MTHF溶液,2.04mmol)。在0℃搅拌30分钟、反应结束后，依次加入水77μL、10％的氢氧化钠水溶液154μL、水231μL，终止反应。生成白色粘性沉淀后，用氧化硅片进行过滤而除去沉淀。减压蒸馏浓缩制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到258mg目标化合物(1.26mmol,93％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.27(d,2H,J＝8.1Hz),4.66(s,2H),1.67(br,1H),0.23(s,9H)。
步骤3
1)叔丁基二甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷-d2的合成
在氩气条件下，在15mL干燥THF中溶解(4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇-d2(600mg,2.94mmol)后，冷却至0℃，加入咪唑(240mg,3.52mmol)和溶解于干燥5mLTHF中的叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl；531mg,3.52mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌15小时。反应结束后，添加20mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次20mL、共3次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到895mg目标化合物(2.79mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.41(d,2H,J＝8.2Hz),7.23(d,2H,J＝8.1Hz),0.90(s,9H),0.22(s,9H),0.00(s,6H)。
2)叔丁基二甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷-d0的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解(4-((三甲基硅基)乙炔基)苯基)甲醇(258mg,1.26mmol)后，冷却至0℃，加入咪唑(103mg,1.52mmol)和溶解于干燥3mLTHF中的TBSCl(228mg,1.52mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌15小时。反应结束后，添加10mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次10mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到383mg目标化合物(1.20mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.41(d,2H,J＝8.2Hz),7.23(d,2H,J＝8.1Hz),4.70(s,2H),0.90(s,9H),0.22(s,9H),0.00(s,6H)。
步骤4
1)叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲硅烷-d2的合成
在氩气条件下，在12mL甲醇中溶解叔丁基甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷-d2(1.16g,3.62mmol)和碳酸钾(1.00g,7.24mmol)后，在室温搅拌2小时。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液15mL，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次10mL、共3次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到858mg目标化合物(3.45mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.25(d,2H,J＝8.5Hz),3.02(s,1H),0.92(s,9H),0.01(s,6H)。
2)叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲硅烷-d0的合成
在氩气条件下，在4mL甲醇中溶解叔丁基甲基((4-((三甲基硅基)乙炔基)苄基)氧)硅烷(383mg,2.40mmol)和碳酸钾(332mg,2.40mmol)后，在室温搅拌2小时。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液10mL，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到280mg目标化合物(1.14mmol,95％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.44(d,2H,J＝8.2Hz),7.25(d,2H,J＝8.5Hz),4.72(s,2H),3.02(s,1H),0.92(s,9H),0.01(s,6H)。
步骤5
1)叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷-d5的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲基硅烷-d2(263mg,1.06mmol)后，冷却至-78℃，缓慢加入正丁基锂(851μL,2.49M正己酸溶液,2.12mmol)。在-78℃搅拌20分钟后，再加入碘代甲烷-d3(331μL,5.30mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌30分钟。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液5mL，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共3次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到280mg目标化合物(1.05mmol,99％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.35(d,2H,J＝8.2Hz),7.22(d,2H,J＝8.2Hz),0.93(s,9H),0.07(s,6H)。
2)叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷-d0的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基((4-乙炔基苄基)氧)二甲基硅烷(247mg,1.00mmol)后，冷却至-78℃，缓慢加入正丁基锂(805μL,2.49M正己酸溶液,2.00mmol)。在-78℃搅拌20分钟后，再加入碘代甲烷-d0(313μL,5.00mmol)。接着，升温至室温后，在室温搅拌30分钟。反应结束后，添加饱和氯化铵水溶液10mL，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到253mg目标化合物(0.971mmol,97％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.35(d,2H,J＝8.2Hz),7.22(d,2H,J＝8.2Hz),4.70(s,2H),2.03(s,3H),0.93(s,9H),0.07(s,6H)。
步骤6
1)(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)甲醇-d5的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷-d5(280mg,1.05mmol)后，缓慢加入正丁基氟化胺(TBAF；1.58mL,1.0M四氢呋喃溶液,1.58mmol)，在室温搅拌30分钟。反应结束后，添加5mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到198mg目标化合物(0.838mmol,88％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.33(d,2H,J＝8.2Hz),7.20(d,2H,J＝8.1Hz)。
2)(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)甲醇-d0的合成
在氩气条件下，在5mL干燥THF中溶解叔丁基二甲基((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氧)硅烷-d0(326mg,1.25mmol)后，缓慢加入正丁基氟化胺(TBAF；1.88mL,1.0M四氢呋喃溶液,1.88mmol)，在0℃搅拌30分钟。反应结束后，添加5mL饱和氯化铵水溶液，使反应终止，对使用乙酸乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到182mg目标化合物(1.24mmol,99％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.33(d,2H,J＝8.2Hz),7.20(d,2H,J＝8.1Hz),4.56(s,2H),2.44(br,1H),2.01(s,3H)。
步骤7
1)1-(碘代甲基)-4-(丙-1-炔-1-基)苯-d5的合成
在氩气条件下，在干燥好的5mL二氯甲烷(DCM)中，溶解(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)甲醇-d5(140mg,0.926mmol)后,冷却至0℃，加入甲磺酰氯(MsCl；86.3μL,1.11mmol)和三乙胺(Et3N；194L,1.39mmol)。在0℃搅拌30分钟后，反应结束时，添加5mL水使反应终止，对使用DCM提取(每次5mL、共3次)得到的有机层，进行无水硫酸镁处理，除去水分，滤去沉淀。减压蒸馏所得的溶液进行浓缩后，溶解在10mL丙酮，再加入碘化钠(NaI；207mg,1.39mmol)。在室温搅拌1小时后，反应结束时减压蒸馏溶剂使其干燥。在这里添加10mL水，使用乙酸乙酯提取(每次10mL，共3次)所得的有机层，对其进行无水硫酸镁处理，除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到220mg目标化合物(报告-d5)(0.843mmol,91％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.30-7.27(m,2H)。
2)1-(碘代甲基)-4-(丙-1-炔-1-基)苯-d0的合成
在氩气条件下，在干燥好的4mLDCM中溶解(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)甲醇-d0(182mg,1.24mmol)后，冷却至0℃，加入甲磺酰氯(MsCl；116μL,1.49mmol)和三乙胺(Et3N；260μL,1.87mmol)。在0℃搅拌30分钟后，反应结束时，添加5mL水使反应终止，对使用DCM提取(每次5mL、共3次)得到的有机层，进行无水硫酸镁处理，除去水分，滤去沉淀。减压蒸馏所得的溶液进行浓缩后，溶解在12mL丙酮，再加入碘化钠(NaI；280mg,1.87mmol)。在室温搅拌1小时后，反应结束时减压蒸馏溶剂使其干燥。在这里添加10mL水，使用乙酸乙酯提取(每次10mL，共3次)所得的有机层，对其进行无水硫酸镁处理，除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到279mg目标化合物(报告-d0)(1.09mmol,88％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.30-7.27(m,2H),4.42(s,2H),2.02(s,3H)。
利用如上合成的报告单元，合成平衡-d5和平衡-d0的步骤和各步骤中生成的化合物的NMR结果示于以下步骤8～10。
步骤8
1)2-(4-(丙-1-炔1-基)苄基)丙二酸二乙酯-d5的合成
在氩气条件下，在2mL干燥DMF溶解1-(碘代甲基)-4-(丙-1-炔-1-基)苯-d5(0.392mmol)和氢化钠(NaH；19.8mg,60％矿物油混合物,0.473mmol)后，冷却至0℃，加入二乙基丙二酸(89.8μL,0.592mmol)。接着，升温至室温，在室温搅拌3小时。反应结束后，加入饱和氯化铵水溶液5mL，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次3mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到88.5mg目标化合物(0.302mmol,77％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.28-7.23(m,2H),7.11-7.07(m,2H),4.17-4.06(m,4H),3.57(s,1H),1.21-1.14(m,3H)。
2)2-(4-(丙-1-炔1-基)苄基)丙二酸二乙酯-d0的合成
在氩气条件下，在3mL干燥DMF溶解1-(碘代甲基)-4-(丙-1-炔-1-基)苯-d0(98.0mg,0.383mmol)和氢化钠(NaH；18.4mg,60％矿物油混合物,0.459mmol)后，冷却至0℃，加入二乙基丙二酸(87.2μL,0.574mmol)。接着，升温至室温，在室温搅拌3小时。反应结束后，加入饱和氯化铵水溶液5mL，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次3mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。除去沉淀，减压蒸馏浓缩制得的溶液，并通过柱层析法提纯得到94.8mg目标化合物(0.329mmol,86％)。
步骤9
1)3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d5乙酯的合成
在氩气条件下，在2mL干燥DMF中溶解2-(4-(丙-1-炔-1-基)苄基)丙二酸二乙酯-d5(88.5mg,0.302mmol)后，加入氯化钠(35.3mg,0.604mmol)和100μL水，在回流(reflux)条件下搅拌2天。反应结束后，加入3mL水使反应终止，对利用二乙酯提取(3mL4)得到的有机层进行无水硫酸镁处理而除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得50.0mg目标化合物(0.226mmol,75％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.28(d,2H,J＝8.1Hz),7.08(d,2H,J＝8.1Hz),4.08(q,2H,J＝7.2Hz),2.56(s,2H),1.19(t,3H,J＝7.2Hz)。
2)3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d0乙酯的合成
在氩气条件下，在2mL干燥DMF中溶解2-(4-(丙-1-炔-1-基)苄基)丙二酸二乙酯-d0(94.8mg,0.329mmol)后，加入氯化钠(38.5mg,0.658mmol)和200μL水，在回流(reflux)条件下搅拌2天。反应结束后，加入3mL水，使反应终止，对利用二乙酯提取(每次3mL，共4次)得到的有机层进行无水硫酸镁处理，除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得50.0mg目标化合物(0.231mmol,70％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.28(d,2H,J＝8.1Hz),7.08(d,2H,J＝8.1Hz),4.08(q,2H,J＝7.2Hz),2.89(t,2H,J＝7.6Hz),2.56(t,2H,J＝8.0Hz),2.00(s,3H),1.19(t,3H,J＝7.2Hz)。
步骤10
1)3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d5(平衡-d5)的合成
在0.5mL甲醇中溶解3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d5乙酯(43.0mg,0.194mmol)后，加入100μL的20％氢氧化钠水溶液，在室温搅拌2小时。反应结束后，加入3mL乙酸乙酯进行稀释，加入200μL的10％氯化氢水溶液进行中和。利用无水硫酸镁除去水分，滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得32.2mg目标化合物(平衡-d5)(0.167mmol,86％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.30(d,2H,J＝8.1Hz),7.10(d,2H,J＝8.1Hz),2.64(s,2H)。
2)3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d0(平衡-d0)的合成
在0.5mL甲醇中溶解3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d0乙酯(50.0mg,0.231mmol)后，加入100μL的20％氢氧化钠水溶液，在室温搅拌2小时。反应结束后，加入3mL乙酸乙酯进行稀释，加入200μL的10％氯化氢水溶液进行中和。利用无水硫酸镁除去水分，滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得37.3mg目标化合物(平衡-d0)(0.198mmol,86％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.30(d,2H,J＝8.1Hz),7.10(d,2H,J＝8.1Hz),2.91(t,2H,J＝7.6Hz),2.64(t,2H,J＝8.0Hz),2.02(s,3H)。
利用如上制得的报告单元和平衡单元的等量异位标记物以及多重等量异位标记试剂的合成方法以及各步骤中合成的化合物的NMR结果示于下述步骤11～13。多重等量异位标记物的合成方法相同，因此详细记载等量异位标记试剂的标签α129的情况，对其他等量异位标记试剂，仅记载了合成过程中的区别。
步骤11
2-((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氨基)乙酸甲酯-d0的合成
在氩气条件下，在2mL干燥DMF中溶解甘氨酸甲酯(169mg,1.34mmol)后，添加DIPEA(292μL,1.68mmol)和1-(碘代甲基)-4-(丙-1-炔-1-基)苯-d0(报告-d0；232mg,0.892mmol)，在室温搅拌1天。反应结束后，添加5mL水，使反应终止，对使用二乙酯提取(每次5mL、共4次)得到的有机层用无水硫酸镁处理除去水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液而进行浓缩，并通过柱层析法提纯得到58.6mg目标化合物(0.270mmol,80％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.30(d.2H,J＝8.2Hz),7.19(d,2H,J＝8.2Hz),3.72(s,2H),3.67(s,3H),3.35(s,2H),2.20(br,1H),1.99(s,3H)。
步骤12
2-(N-(4-(丙-1-炔-1-基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酰胺基)乙酸甲酯-d5的合成
在氩气条件下，在1mL干燥的DCM中溶解2-((4-(丙-1-炔-1-基)苄基)氨基)乙酸甲酯-d0(18.3mg,0.0845mmol)和3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酸-d5(平衡-d5；13.6mg,0.0704mmol)后，加入EDC(40.5mg,0.211mmol)、HOBt(28.5mg,0.211mmol)以及DIPEA(60.3μL,0.352mmol)，在室温搅拌20小时。反应结束后，加入3mL水，使反应结束，对利用DCM提取(每次3mL，共4次)得到的有机层用无水硫酸镁进行处理，去除水分。滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得25.0mg目标化合物(0.0759mmol,91％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.33-7.24(m,4H),7.11-6.96(m,4H),4.51(s,2H),4.00(s,2H),3.64(s,3H),2.65(s,2H),2.02(s,3H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.33-7.24(m,4H),7.11-6.96(m,4H),4.58(s,2H),3.81(s,2H),3.60(s,3H),2.52(s,2H),2.02(s,3H)。
步骤13
2-(N-(4-(丙-1-炔-1-基)苄基-3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酰胺基)乙酸-d5的合成
在0.5mL甲醇中溶解2-(N-(4-(丙-1-炔-1-基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔-1-基)苯基)丙酰胺基)乙酸甲酯-d5(25.0mg,0.0637mmol)后，加入100μL的20％氢氧化钠水溶液，在室温搅拌2小时。反应结束后，加入3mL乙酸乙酯进行稀释，加入200μL的10％氯化氢水溶液进行中和。利用无水硫酸镁除去水分，滤去沉淀，减压蒸馏制得的溶液进行浓缩，通过柱层析法提纯获得21.0mg等量异位标记试剂标签α129(0.0554mmol,87％)。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d77.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),4.47(s,2H),3.97(s,2H),2.62(s,2H),2.02(s,3H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),4.56(s,2H),3.79(s,2H),2.53(s,2H),2.00(s,3H)。
与上述步骤11～13类似的方法，如下制造等量异位标记试剂标签α131,标签α132以及标签α134。
等量异位标记试剂α131
与等量异位标记试剂标签α129相同的步骤进行合成，但在合成过程中，步骤11中使用报告-d2，在步骤12中使用平衡-d3进行合成。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),3.97(s,2H),2.90(t,2H,J＝7.9Hz),2.64(t,2H,J＝8.0Hz),2.02(s,3H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),3.79(s,2H),2.93(t,2H,J＝7.9Hz),2.55(t,2H,J＝8.0Hz),2.00(s,3H)。
等量异位标记试剂α132
与等量异位标记试剂标签α129相同的步骤进行合成，但在合成过程中，步骤11中使用报告-d3，在步骤12中使用平衡-d2进行合成。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),4.47(s,2H),3.97(s,2H),2.62(s,2H),2.02(s,3H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),4.56(s,2H),3.79(s,2H),2.53(s,2H),2.00(s,3H)。
等量异位标记试剂α134
与等量异位标记试剂标签α129相同的步骤进行合成，但在合成过程中，步骤11中使用报告-d5，在步骤12中使用平衡-d0进行合成。
主要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),3.97(s,2H),2.90(t,2H,J＝7.9Hz),2.64(t,2H,J＝8.0Hz),2.02(s,3H)。次要异构体:1HNMR(300MHz,CDCl3):d7.32-7.23(m,4H),7.09-7.94(m,4H),3.79(s,2H),2.93(t,2H,J＝7.9Hz),2.55(t,2H,J＝8.0Hz),2.00(s,3H)。
利用如上制得的化合物，用于如下所述的定量分析实验。
实施例 1-3) 定量分析实验
步骤1:标记试剂和被测物的结合
实施例1-2的化合物和肽的结合反应示于图7。实施例1-2的化合物和EDC以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于DMF，按照各自的浓度达到60、35以及40mM进行混合，在室温使其反应45分钟，使得标记试剂的羧酸末端基活性化成琥珀酰亚胺酯。
将用胰蛋白酶对牛血清白蛋白进行酶切获得的肽(trypticBSA)或血管紧张素II(DRVYIHPF)溶解于碳酸氢钠水溶液(NaHCO3,100mM)后，加入活性化的标记试剂，使其反应6小时以上。在羟基上发生的标记反应中形成酯键，即形成不稳定的键，反应效率也低，因此为了准确的定量，利用溶解于碳酸氢钠水溶液(100mM)的羟胺(80mM)消除标记在肽的羟基的副反应。整个反应通过加入三氟乙酸(TFA)进行终止。
步骤2：MALDI以及LC-MALDI定量分析
用50TA溶液(0.1％TFA/50％乙腈/50％H2O)稀释标记的血管紧张素II后，按照1:1的比例与HCCA基质溶液(a-氰基-4-羟基肉桂酸,5mg/mL50TA)进行混合，放至MALDI板进行干燥后，利用串联飞行时间质谱仪(time-of-flight/time-of-flight(TOF/TOF)massspectrometry)进行分析。通过串联质谱分析，确认了是否可以观察到设计好的定量信号以及标记信号，并且其强度为多少。
确认了能够利用经标记的trypticBSA，以等量异位标记试剂进行测定的分析试样的浓度或量的范围，确认了是否可以并用液相色谱仪(LC)同时定量分析多重试样。为了确认能够用等量异位标记试剂来测定试样的浓度范围，以3:1的比例混合被多重标记试剂中的标签α129和标签α131标记的试样，重复用50TA进行稀释的步骤。按照1:1比例混合各浓度的试样和HCCA基质溶液，加样在MALDI板。此时，加样的肽量在每样滴中约为4200,1300,420,130,42以及13飞摩尔。为了测试与LC并用的多重定量分析，按照2:1:4:8的比例混合了以四种等量异位标记试剂标记的trypticBSA，通过纳升液相色谱(nanoLC)进行分离，将从LC溶出的肽与HCCA基质溶液加样在MALDI板，采用MALDI-TOF/TOF进行分析。
实验结果
1)利用模型肽的标记试剂的鉴定
定量分析与各标记试剂结合的模型肽(血管紧张素II,DRVYIHPF)的结果，在与一个标记试剂结合的质量值(标签α129-α134为1406.7,标签β为1395.7,标签γ为1381.7,以及标签δ为1341.8Th)观察到离子。为了更加准确地鉴定，选择在质谱上观察到的离子，进行串联质谱分析，其结果示于图8。
图8(a)～图8(d)为以多重等量异位标记试剂(标签α129-α134)标记的肽的结果，图8(e)～图(g)是分别以非等量异位标记试剂标签β、标签γ以及标签δ标记的肽的结果。在设计好的质量值观察到了各标记试剂中生成的离子，即标记信号以及定量信号。标记信号中，标签α129-α134在361,标签β在350,标签γ在36,以及标签δ在296Th观察到。定量信号中，标签α129在129,标签α131在131,标签α132在132,标签α134在134,标签β在133,标签γ在148,以及标签δ在142Th观察到。
在各标记试剂中生成的定量信号强度与在模型肽的离子片段中所观察到的最强的组氨酸亚胺离子(IminiumIon)(110Th)进行比较，其结果示于图9。根据标记试剂的不同结构，观测到不同类型的定量信号。即，报告单元为苄基衍生物的标签α和标签β中，观测到苄基阳离子结构的定量信号，不是苄基衍生物的标签γ和标签δ中，观测到亚胺阳离子结构的定量信号。
根据不同标记试剂定量定量信号的类型不同，但观测到的各标记试剂的定量信号的强度远强于模型肽离子片段。在模型肽的离子片段中，包含肽的C-末端基的离子片段，即y2,y3,以及y7不受标记试剂的影响，在相同位置上观测到，包含肽的N-末端基的离子片段，即b2,b3-NH3,a5,以及b7+H2O等在质量增加{各标记试剂的分子量-H2O}的地方观察到。在质谱分析以及串联质谱分析结果中，确认到经合成的所有各标记试剂的分子量和定量以及标记信号按照预料的结果显示，由此可以确认各标记试剂按照设计那样合成，由肽的离子片段确认标记试剂仅标记在N-末端基。
对按照一定比例混合多重等量异位标记试剂标记的模型肽，进行串联质谱分析的结果示于图10。混合的比例(摩尔比)为标签α129:α131:α132:α134＝2:1:2:1时示于图10(a)，1:2:1:2时示于图10(b)，用倒三角表示各多重等量异位标记试剂的定量信号。与分别分析多重等量异位标记试剂的图8(a)～图8(d)相比，进行多重定量分析的情况下，各定量信号强度相对变弱，观测到的肽的离子片段信号变得更强。如此，使用总分子量相同但定量信号的质量值不同的多重等量异位标记试剂时，与定量信号不同，由于其他离子的质量值相同，因此相互重叠其信号强度增强。基于这样的理由，如本发明中开发的标记试剂，观测到的定量信号越强，越有利于多重定量分析。
2)利用trypticBSA的多重等量异位标记试剂的性能鉴定
能够利用多重等量异位标记试剂测得的肽的量或浓度范围示于图11。为了较好反应BSA的绝对量，以等量异位标记试剂标记的trypticBSA中，观测到较强信号的肽即FGER,VASLR,以及SEIAHR进行试验。按照3:1的比例混合以标签α129和标签α131标记的肽，一边将总蛋白量从4.2皮摩尔改变至13飞摩尔一边进行串联质谱分析。MALDI质谱分析仪中被激光离子化的量有限，因此与试样的量少的情况相比，量多的情况下，测定到加样的试样的量相比母离子的强度较小，但确认到不会影响到采用串联质谱分析的定量分析。另外，本发明的等量异位标记试剂的定量信号强，因此能够定量分析如13飞摩尔的少量的试样。
另外，将并用LC和MALDI质谱分析仪的定量分析结果示于图12。图12(a)表示LC中溶出的母离子的强度，图12(b)表示在各样滴中测得的定量信号量与标签α129的定量信号的对照。通过串联质谱分析定量了共6种肽(FGER,VASLR,QEPER,AWSVAR,SEIAHR以及YLYEIAR)。与肽种类无关，根据各等量异位标记试剂按照一定比例(标签α129:α131:α132:α134＝1:0.51:1.96:3.81)测得。另外，在相同肽的情况下，从LC溶出时以相同的定量信号的比例测得。这表示用本发明的等量异位标记试剂多重标记的肽在纳升LC(nanoLC)同步移动，并且仅靠特定时机的溶出液也能进行准确的定量。另外，如模型肽中所观测，确认到观测得到的定量信号的比例不受试样总量的影响。
实施例2
实施例2-1)标记试剂的制造
参考韩国专利公开号第10-2010-0009466号，韩国专利公开号第10-2010-0009479号以及国际专利公开号WO10/008159号，制造本发明的结构式2的标记试剂。
首先，制造同位素的标记基RA和RC为甲基(CH3或CD3)，质量调节基RB为缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg)侧链的标记试剂。方便起见，将质量调节基为缬氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)和精氨酸(Arg)侧链的标记试剂分别命名为Val-标签、Gln-标签、His-标签、Phe-标签以及Arg-标签。另外，制造同位素标记基RA和RC为乙基(C2H5或C2D5)，质量调节基RB为甲基的标记试剂。方便起见，将其命名为乙基-标签。
实施例2-2)结合物的制造
对上述实施例2-1中制得的标记试剂，与3种模型肽LISFYAGR或LISFYAGK或YGGFL结合了Val-、Gln-、His-、Phe-、Arg-标签以及乙基-标签。另外，准备将牛血清白蛋白(bovineserumalbumin)、肌球素(myoglobin)以及泛素(ubiquitin)蛋白以不同的量混合的2种蛋白混合试样。混合试样A中，牛血清白蛋白、肌球素以及泛素的浓度分别为4mg/mL、2mg/mL以及0.2mg/mL。混合式样B中，牛血清白蛋白、肌球素以及泛素的浓度分别为2mg/mL,0.5mg/mL以及0.4mg/mL。将混合试样A和B分别用胰蛋白酶进行酶切后，混合试样A与LMBIT、混合试样B与HMBIT进行结合。此时，将Gln-标签作为MBIT的标记。将MBIT结合于肽试样的方法参考韩国公开号第10-2010-0009466号、韩国专利公开号第10-2010-0009479号以及国际专利公开号WO10/008159。
对与标记试剂结合的模型肽，用ZipTip-C18(密理博(Millipore)公司)除去盐之后，按照最终以分别为5M浓度、乙腈和水体积比1:1混合并添加有0.5％的甲酸的溶液中溶解的状态准备。对与标记试剂结合的混合试样A和B，按照1:1的体积比混合后、在真空完全去除溶剂并在添加0.5％的甲酸的溶液中溶解的状态准备。
实施例2-3)的定量分析
利用上述实施例2-2的结合物，进行如下所述的定量分析。
实施记载在上述实施例2-2的模型肽和MBIT的结合物的定量分析时，所使用的质谱分析仪使用了作为电喷雾离子化四极离子阱设备的布鲁克(Bruker)公司的EsquireHCT产品或赛默飞(Thermo)公司的LTQVelos。将100L的试样溶液加样在注射泵(syringepump)后，以1μL/分钟的流速输送至电喷雾端。以4kV电压实施电子喷雾。为了一个周期中测定一个谱图，试样离子在离子阱内部被捕获最多200ms并进行质量分析，每1分钟实施最多250周期的重复测定。
记载在上述实施例2-2的混合试样A以及B与MBIT的结合物的定量分析中使用的质谱仪使用了作为与液相色谱连接的电喷雾离子化四极离子阱设备的赛默飞(Thermo)公司的LTQXL。试样溶液以0.3μL/分钟的流速通过液相色谱仪并由电喷雾进行离子化。此时，电喷雾以2kV电压实施。获得了从液相色谱中每0.2秒之隔溶出的肽的质谱分析以及串联质谱分析图谱。
1)分别将Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签结合于LISFYAGR和LISFYAGK时的质量分析结果
分别将Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签结合于LISFYAGR和LISFYAGK时，进行了定量分析，其结果示于图17。
图17表示结合模型肽LISFYAGR(图17(a))以及LISFYAGK(图17(b))与Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签后，将其分别通过电喷雾离子化，并利用四极离子阱质谱仪获得的质谱图。分别检测到带有1、2个单元正电荷的肽离子。
LISFYAGR肽的原本质量为925.5Da，带着1个或2个质子检测出的+1价、+2价离子(MH+,MH2 2+)分别在926.5Th、463.8Th检测到。该肽与标记试剂结合时，在增加相当于1个标记物质量的质量处检测到肽。结合Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签时，+1价离子分别在m/z1141.6,1170.6,1179.6,1189.6以及1198.6Th检测到，+2价离子分别在m/z571.3,585.8,590.3,595.3以及599.9Th检测到。
LISFYAGK肽的原本质量为897.5Da，带着1个或2个质子检测出的+1价、+2价离子(MH+,MH2 2+)分别在898.5Th、449.8Th检测到。该肽与标记试剂结合时，在增加相当于2个标记物质量的质量处检测到肽。结合Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签时，+1价离子分别在m/z1328.9,1386.9,1404.9,1424.9以及1442.9Th检测到，+2价离子分别在m/z654.9,693.9,703.0,712.9以及721.9Th检测到。
通过上述结果，可以确认具有1个胺的LISFYAGR结合有一个标记试剂，具有2个胺的LISFYAGK结合有2个标记试剂。
2)在LISFYAGR以及LISFYAGK分别结合Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签时的串联质谱分析结果
实施在LISFYAGR以及LISFYAGK分别结合Val-,Gln-,His-,Phe-以及Arg-标签时的串联质谱分析，此时，按照1:1的比例混合以LMBIT标记的肽和以HMBIT标记的肽并实施实验。其结果示于图18～图21。
图18表示在N-末端具有一个胺基的肽LISFYAGR与标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。仅在肽的N-末端结合有标记试剂，因此y-型离子片段均不受标记试剂种类的影响、而在一定的质量与电荷之比(m/z)被检测。相反，b-型离子片段在质量与电荷之比(m/z)根据标记试剂的种类而增加的情况下被检测。
可作为定量信号使用的LyS,HyS离子以带有+1价电荷的状态分别在m/z987Th以及1000Th被检测。对具有强碱性的His-以及Arg-标签，能够检测出强的yS离子。对Val-、Gln-以及Phe-标签，虽然信号强度弱，但可以确认检测出yS定量信号离子。
图19表示在N－末端具有一个胺基的肽LISFYAGR与标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。此时，虽然能够检测到定量信号离子，但信号强度非常小，由此可知不适于定量分析。
图20表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子(MH2 2+)，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。如图20所示，N-末端的胺基和C-末端的赖氨酸的胺基上分别结合有标记试剂，因此能够确认根据标记试剂的种类、b-型以及y-型离子片段均以增加一定质量与电荷之比的状态被检测出。尤其是，可知带有+1价电荷的yS离子在比-标签(-tag)大的质量与电荷之比被检测出，在完全不受其他序列离子的区域内被检出。并且，信号强度也强、相当于其他序列离子的强度，显示了适合于1:1的混合比的[LyS]:[HyS]离子强度比。
Val-,Phe-标签的情况下，检测出带有+2价的yS离子，这也显示出适合于1:1的混合比的离子强度比。相反地，具有弱碱性的Gln-标签和具有强碱性的His-,Arg-标签的情况下，未检测到+2价的yS离子，而检测到强度相应增加的+1价的yS离子。理论上不限于此，但是+2价的yS离子可能会受到+1价的其他序列离子的影响，因此可判断+1价yS离子更加有利于用作定量分析信号。
图21表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子，经共振激发碰撞诱导解离而得的串联质谱图。与利用+2价母离子进行试验的情况下相同，根据标记试剂的种类、b-型以及y-型离子片段均以增加一定质量与电荷之比的状态被检测出。但特定地，选择+1母离子进行试验的结果中，发现+1价的yS定量信号非常强。并且，可知检测到的[LyS]:[HyS]离子信号强度比与1:1的混合比几乎一致。
3)yS定量信号强度的测定
图22和图23表示串联质谱分析以标记试剂标记的模型肽时显示的yS定量信号强度在整个离子片段的信号强度中所占比例。图22表示选择被标记试剂标记并经电喷雾离子化后带有+2价电荷的母离子、并将其解离的结果。可知与结合有1个标记试剂的LISFYAGR的情况相比，在N-末端和C-末端结合有共2个标记试剂的LISFYAGK情况下，定量信号离子yS的强度呈现为两倍以上。
图23(a)和23(b)表示分别选择以标记试剂标记并电喷雾离子化而带有+1价电荷的LISFYAGR以及LISFYAGK，进行解离的结果。为了与已有的使用bS离子的情况相比，图23(c)中图示了在MALDI-TOF/TOF设备检测出以标记试剂标记的LISFYAGR+1价母离子时的bS定量信号离子的比例。结合有2个标记试剂的LISFYAGK通过MALDI离子化方法未检测出。由此结果可知，解离N-末端的胺基和C-末端的赖氨酸胺基上结合有2个标记试剂的LISFYAGK时产生的yS离子的相对强度，与以往的使用bS的情况相比，能够获得强5倍以上的定量信号强度。
根据上述结果可知，虽然理论上不限于此，但在N-末端甚至在赖氨酸的侧链上结合有标记试剂，即结合有2个以上的标记试剂时，能够获得非常强的yS定量信号。另外，可知在N-末端的胺基和C-末端的赖氨酸上结合有2个标记试剂的情况下，+1价yS离子在完全不受其他序列离子影响的质量与电荷之比、以非常强的信号强度被检测，能够在不受噪音信号影响的情况下进行非常准确且具有再现性的定量分析。使用质量值大的yS，与以往的使用质量值小的定量信号离子的情况相比，能够以强至5倍以上的定量信号强度进行定量分析。
4)在离子阱内再次选择yS离子，再次碰撞激发解离而得的MS3串联质谱图的分析
图24表示在N-末端和赖氨酸侧链上各具有一个胺基即共两个胺基的肽LISFYAGK与标记试剂结合的母离子中，在四极离子阱内选择带有2个单位正电荷的离子，经共振激发碰撞诱导解离而得的+1价yS离子，在离子阱内再次选择该离子，再次进行碰撞激发解离而得到的MS3串联质谱图。
图示了选择与Val-标签结合的LISFYAGK的LyS离子进行试验的结果。如果N-末端的标记试剂解离而产生yS离子时，在MS3图谱中，bn离子均应当减少144Th来显示，如果结合于赖氨酸侧链的标记试剂中产生yS离子时，在MS3图谱中，yn离子均应当减少144Th来显示。MS3图谱中以减少144Th状态显示的bn以及yn离子片段分别命名为bn'、yn'。如可以由图24(b)确认，包含N-末端的b-型离子片段维持相同位置，但包含C-末端的y-型离子片段均在减少144Th的位置检测为yn'。几乎未检测到bn'。由结果可以确认通过串联质谱分析显示的强的yS定量信号并非来自肽中结合在N-末端的标记试剂，而是来自与赖氨酸侧链的胺基结合的标记试剂。
考虑上述图18～图24的结果，可以判断利用yS的定量分析在将包括赖氨酸因此能够与2个以上的标记试剂结合的肽作为被测物时可以显示出最好的性能，但理论上不限于此。尤其是，具有在肽的C-末端具有赖氨酸时、+1价yS离子在不受其他离子片段影响的情况下可以被检测的优点，但理论上不限于此。
5)定量标准曲线分析
图25表示对于按照各种比例混合分别以HMBIT和LMBIT标记的模型肽，通过串联质谱分析所生成的LyS和HyS离子的信号强度进行定量分析而获得的定量分析标准曲线。实施时所使用的标记试剂为Gln-标签，模型肽为LISFYAGK。分别对带有+1价、+2价电荷的肽离子进行实施而获得结果。以标记试剂标记的肽溶液的浓度在不受混合比的影响下维持在约为5μM。由图25可知，采用显示强的信号强度的yS离子的定量分析给出非常符合实际混合比的测定比。尤其是，选择+1价母离子时，如上所述yS的信号强度特异性地显示强信号，因此直到1:64的混合比均能获得良好的定量分析结果。选择+2价母离子进行定量分析的情况下，也可以直到1:36的混合比均能够显示非常好的线性。考虑到以往采用具有小质量值的bS定量信号时1:16的混合比达到定量极限，在采用yS时，改善了约达到最多4倍的定量极限。
6)将乙基-标签(Ethyl-tag)结合于YGGFLK以及LISFYAGK时的串联质谱分析结果
作为同位素标记基的RA以及RC使用甲基的情况下，定量信号的质量差为3Da，因此HyS定量信号可能受到LyS定量信号离子的天然同位素的影响。此时，作为同位素标记基的RA以及RC使用乙基的情况下，定量信号离子的质量差达到5Da充分大，由此可以克服上述问题。因此，在模型肽上结合乙基-标签来进行了串联质谱分析。
乙基-标签结合于YGGFLK时的串联质谱分析结果示于图26和图27。将乙基-标签结合于LISFYAGK的串联质谱分析结果示于图28。
图26表示N-末端和赖氨酸侧链上具有各1个胺基即共2个胺基的肽YGGFLK上结合有乙基-标签的母离子中，在四极离子阱内选择带有1个单位正电荷的离子并通过共振激发碰撞解离而获得的串联质谱图。其中，图26(a)和26(b)为分别结合乙基-标签中HMBIT和LMBIT时的结果。以乙基-标签的HMBIT标记的情况下，质量与电荷之比986.5下检测到+1价的LyS离子，以LMBIT标记的情况下，991.5下检测到+1价的HyS离子。图26(c)和26(d)是扩大了检测到yS离子的区域的图，LyS和HyS离子的质量差为5Da，因此能够确认不会因天然同位素分布而相互受到影响。
图27表示按照2:1的比例混合将具有LISFYAGK序列的肽与乙基-标签的LMBIT结合的肽以及与HMBIT结合的肽，并进行串联质谱分析的结果。选择在质量与电荷之比1332.6下检测到的带有+1价电荷的离子进行串联分析，其结果，+1价的LyS以及HyS离子在质量与电荷之比1200.6以及1205.6下按照[HyS]:[LyS]＝2:1的比例检测出，成功地再现了LMBIT和HMBIT混合比。
7)采用Gln-标签对蛋白混合试样进行定量分析的结果
为了用MBIT的yS离子定量分析实际蛋白，准备3种蛋白以不同的比例混合的2组蛋白混合试样(混合试样A和B)、并利用Gln-标签进行分析。按照与混合试样B的牛血清白蛋白、肌球素以及泛素的量相比，混合试样A的牛血清白蛋白、肌球素以及泛素的量分别达到2倍、4倍以及0.5倍的条件进行准备。使用胰蛋白酶酶切这些试样、并用Gln-标签的LMBIT以及HMBIT进行标记、通过液相色谱和串联质谱分析进行定量分析的结果示于图28。
图28(a)为表示随着检测出的肽的液相色谱溶出时间的变化所测定的[HyS]:[LyS]比例的图。图28(b)为表示随着检测出的肽的质量与电荷之比的变化所测定的[HyS]:[LyS]比例的图。由此确认来源于牛血清白蛋白的肽的情况下获得了[HyS]:[LyS]＝2.01±0.06的结果，肌球素的情况下获得了[HyS]:[LyS]＝4.13±0.11的结果，泛素的情况下获得了[HyS]:[LyS]＝0.49±0.02的结果。这是对于混合试样A和B中的各蛋白的比例，在5％的误差范围内成功进行定量分析的实例。

Claims (10)

1.由下述结构式1表示的化合物，其特征在于，
式中，
R1为C1-10烷基或
R2为C1-10烷基或
R3为选自下组的氨基酸残基的侧链：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸和色氨酸；
R4为羟基、琥珀酰亚胺-N-氧基、3-硫代琥珀酰亚胺-N-氧基、苯并三唑-1-基氧、五卤代苄氧基、4-硝基-苯氧基或2-硝基苯氧基；
R5为C1-4烷基或C2-4炔基；
R6为C1-4烷基或C2-4炔基；
n和m分别独立地为1～4的整数；
上述R1和R2不包含氘，或上述R1和R2中的至少1个包含氘；并且
所述氨基酸残基的侧链是氨基酸结构中NH2CH2COOH的CH2上取代的基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
R1为C6-9烷基或
R2为C6-9烷基或
R5为丙基或丙-1-炔基；
R6为丙基或丙-1-炔基；以及
n和m分别独立地为1～4的整数。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1为辛基；R2为庚基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
R1为C1-10烷基，R2为C1-10烷基；或
R1为R2为
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
上述R1和R2分别为CH3-C≡C-C6H4-CH2以及CD3-C≡C-C6H4-CD2-CH2；或
分别为CH3-C≡C-C6H4-CD2以及CD3-C≡C-C6H4-CH2-CH2；或
分别为CD3-C≡C-C6H4-CH2以及CH3-C≡C-C6H4-CD2-CH2；或
分别为CD3-C≡C-C6H4-CD2以及CH3-C≡C-C6H4-CH2-CH2。
6.2-(5-苯基-N-(3-苯基丙基)戊酰胺基)乙酸的化合物。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，上述化合物为选自
1)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸；
2)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
3)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基)乙酸；
4)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
5)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸；
6)2-(N-(4-丙基苄基)-2-(4-丙基苯基)乙酰胺基)乙酸；以及
7)2-(N-辛基辛酰胺基)乙酸的任一种化合物。
8.一种组合物，其特征在于，包含2种以上权利要求1～7中任一项所述的化合物。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，上述2种以上的化合物中氘数彼此相同。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，该组合物包含选自下述化合物的任一种以上化合物，
1)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；
2)2-(N-(4-(丙-1-炔基)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苯基)丙酰胺基)乙酸；
3)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基-3,3-d2)乙酸；以及
4)2-(N-(4-(丙-1-炔基-3,3,3-d3)苄基-1,1-d2)-3-(4-(丙-1-炔基)苯基)丙酰胺基)乙酸。
CN201180048175.4A 2010-08-23 2011-08-23 标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法 Expired - Fee Related CN103228621B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100081659A KR101229704B1 (ko) 2010-08-23 2010-08-23 동중체로 표지된 단백질 및 펩티드를 큰 질량의 ｙ－타입 이온을 이용하여 정량분석하는 방법
KR10-2010-0081659 2010-08-23
KR1020100100538A KR101207742B1 (ko) 2010-10-14 2010-10-14 라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법
KR10-2010-0100538 2010-10-14
PCT/KR2011/006225 WO2012026743A2 (ko) 2010-08-23 2011-08-23 라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103228621A CN103228621A (zh) 2013-07-31
CN103228621B true CN103228621B (zh) 2016-06-15

Family

ID=45723924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180048175.4A Expired - Fee Related CN103228621B (zh) 2010-08-23 2011-08-23 标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8809012B2 (zh)
EP (1) EP2610243A4 (zh)
JP (1) JP5683706B2 (zh)
CN (1) CN103228621B (zh)
WO (1) WO2012026743A2 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150038435A1 (en) * 2012-03-01 2015-02-05 Novo Nordisk A/S N-terminally modified oligopeptides and uses thereof
WO2014066284A1 (en) * 2012-10-22 2014-05-01 President And Fellows Of Harvard College Accurate and interference-free multiplexed quantitative proteomics using mass spectrometry
JP2016004032A (ja) * 2014-06-19 2016-01-12 国立大学法人弘前大学 ペプチドのアミノ酸配列の解析方法
WO2017210427A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 President And Fellows Of Harvard College Techniques for high throughput targeted proteomic analysis and related systems and methods
CN114436765B (zh) * 2021-12-24 2023-03-31 中南大学 一种苄位氘代的α，α-二氘苄碘、二氘苄胺、二氘药物分子及其合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1081681A (zh) * 1992-03-31 1994-02-09 第一制药株式会社 氨基糖衍生物
WO1995009634A1 (en) * 1993-10-07 1995-04-13 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Electrophilic peptide analogs as inhibitors of trypsin-like enzymes
WO2010008159A3 (en) * 2008-07-18 2010-04-15 Postech Academy-Industry Foundation Mass- and property-tuned variable mass labeling reagents and analytical methods for simultaneous peptide sequencing and multiplexed protein quantification using thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL328271A1 (en) 1996-01-23 1999-01-18 Rapigene Inc Methods of and compositions for determining sequences of nucleic acid molecules
WO2003078962A2 (en) 2002-03-11 2003-09-25 President And Fellows Of Harvard College Detection and quantification of modified proteins
US20050148771A1 (en) 2004-01-05 2005-07-07 Applera Corporation. Active esters of N-substituted piperazine acetic acids, including isotopically enriched versions thereof
US20050148087A1 (en) 2004-01-05 2005-07-07 Applera Corporation Isobarically labeled analytes and fragment ions derived therefrom
KR20080070272A (ko) 2007-01-26 2008-07-30 유코미디어 주식회사 위치정보의 선택적 이용 기능이 구비된 무선단말과 이를위한 프로그램 기록매체

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1081681A (zh) * 1992-03-31 1994-02-09 第一制药株式会社 氨基糖衍生物
WO1995009634A1 (en) * 1993-10-07 1995-04-13 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Electrophilic peptide analogs as inhibitors of trypsin-like enzymes
WO2010008159A3 (en) * 2008-07-18 2010-04-15 Postech Academy-Industry Foundation Mass- and property-tuned variable mass labeling reagents and analytical methods for simultaneous peptide sequencing and multiplexed protein quantification using thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
(N-ACYL-N-ALKYL)GLYCYL BOROLYSINE ANALOGS : A NEW CLASS OF POTENT THROMBIN INHIBITORS;Robert A. Galemmo等;《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》;19961231;第6卷(第24期);第2915页Scheme 1和第2916页表1 *
Tetramic acids and derivatives by telluride-triggered Dieckmann cyclizations;Donald C. Dittmer等;《Issue in Honor of Prof. Franklin A. Davis ARKIVOC》;20091209(第vi期);第76页化合物4b *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103228621A (zh) 2013-07-31
EP2610243A2 (en) 2013-07-03
EP2610243A4 (en) 2014-04-02
WO2012026743A3 (ko) 2012-08-23
WO2012026743A2 (ko) 2012-03-01
JP5683706B2 (ja) 2015-03-11
US20130183704A1 (en) 2013-07-18
JP2013536433A (ja) 2013-09-19
US8809012B2 (en) 2014-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103228621B (zh) 标记试剂以及利用其的多肽和蛋白的测序及定量方法
CN104987326B (zh) 反应性质量标记物的集合
CA2775118C (en) Mass labels
Lu et al. Ionic reagent for controlling the gas-phase fragmentation reactions of cross-linked peptides
Waliczek et al. Peptides labeled with pyridinium salts for sensitive detection and sequencing by electrospray tandem mass spectrometry
US8486712B2 (en) Deuterium isobaric tag reagents for quantitative analysis
CA2480836A1 (en) Method for characterising analytes
KR101106355B1 (ko) 물성이 조절된 가변질량 라벨링제와 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법
Hoffmanns et al. Use of the Sonogashira coupling reaction for the “two-step” labeling of phenylalanine peptide side chains with organometallic compounds
US20030228700A1 (en) Labeling reagent and methods of use
Massonnet et al. Combined use of ion mobility and collision-induced dissociation to investigate the opening of disulfide bridges by electron-transfer dissociation in peptides bearing two disulfide bonds
US8309359B2 (en) Isobaric tags for analyte detection and quantification
CN107848956A (zh) 用于样品制备尤其是用于质谱分析的方式和方法
JP7197570B2 (ja) 質量分析のためのスルホキシドベースの試薬
EP1916526A1 (en) Method for diagnostic and therapeutic target discovery by combining isotopic and isobaric labels
Hannon et al. Synthesis and characterisation of water-soluble poly (aryl ether) dendrimers for encapsulation of biomimetic active site analogues
KR101207742B1 (ko) 라벨링제 및 이를 이용한 아미노산 서열 및 단백질 다중 정량 동시 분석방법
CN101535316A (zh) 芳基硼酸在蛋白质标记中的应用
WO2005012914A2 (en) Method for characterising polypeptides by maldi-tof mas spectrometry
CN110330509B (zh) 一种桉叶硫醚的合成工艺

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160615

Termination date: 20180823