JP6083595B2 - タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のN−Cα結合又はCα−C結合の特異的切断方法 - Google Patents
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Description
(1)下記の一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断する方法。
(2)上記の一般式(I)で表される化合物の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合を特異的に切断することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
(3)一般式(I)で表される化合物がマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析のマトリックスとして使用される請求項2記載の方法。
(4)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合又はCα-C結合の特異的切断試薬。
(5)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、水素ラジカル放出試薬。
(6)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス試薬。
(7)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス。
(8)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用タンパク質又はペプチドイオン化試薬。
(9)上記の一般式(I)で表される化合物を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用キット。
AHNはプロトン放出性を有するため、ペプチド、タンパク質試料の正イオン測定に適用して、成果を上げることができる(後述の実施例1)他、負イオン測定に適用したところ(後述の実施例2)、試料からプロトンを引き抜く効果も見出され、効率的に脱プロトン化分子[M-H]- を生成することができた(図22参照)。のみならず、ペプチド主鎖のN-Ca結合を切断する能力も保持しつつ、正イオンで生成するN-末端側のc-イオンからのアミノ酸配列情報を補完することのできる、C-末端側のz-イオンが観測されるようになった(図23参照)。正イオンと今回の負イオンのデータを補完的に用いることで、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列解析のための有意な情報を得ることができ、解析の精度をあげることができる。また、ペプチド主鎖のAsp(D)の部位で特異的に強く観測されるN-末端側のc11イオンを補完するC-末端側のz11イオンが観測され、負イオンでc/z対イオンが観測されたのは初めてであり、これらはアミノ酸配列解析に有用な情報である。
1.これまでの試薬の中で最もリン酸化ペプチドの解析に適し,すなわちアミノ酸配列解析に必要なシグナル数が増した。
2.これまではレーザー光照射の際に最適な結晶部位を試行錯誤で探る必要があったが,どの結晶部位からも優位なシグナルが得られるようになった。この結果,誰でも解析できるようになった。
3.リン酸化ペプチドのみならず,タンパク質からも直接に50残基以上のアミノ酸配列情報を得られるようになり,その性能はこれまで報告された試薬より優位に高い。
ペプチドは、一般に、2個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものである。タンパク質は、約20種のL-α-アミノ酸がペプチド結合により結合したポリペプチドである。ペプチドを構成するアミノ酸の数は、特に限定されるものではないが、2〜200個が適当であり、10〜50個が好ましく、15〜25個がより好ましい。ペプチドを構成するアミノ酸の数が100個よりも多いタンパク質の場合には、トリプシンなどの酵素で消化処理を行い、液体クロマトグラフィで分離・分取してから、本発明のN-Cα結合特異的切断方法に用いてもよいが、タンパク質を本発明の方法で直接切断してもよい。ペプチドを構成するアミノ酸の種類は限定されるものではなく、いかなるアミノ酸であってもよい。また、アミノ酸は、アセチル化、メチル化、リン酸化、グリコシル化などの修飾がなされていてもよい。ペプチドには、タンパク質、タンパク質以外のポリペプチド、オリゴペプチド、グリコペプチド、リポタンパク質などが含まれる。
〔実施例1〕
実験方法:質量分析装置には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法を搭載した飛行時間型(TOF)の質量分析計 AXIMA-CFR(島津製作所、京都)を使用し、レーザーには波長337nmの紫外窒素レーザーを用いた。測定はすべて正イオンモードで行った。生成したイオンの加速電圧は20kVであった。試料ペプチドには副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)のフラグメント ACTH18-35、ACTH18-35の2リン酸化体およびβ-カゼイン由来の4リン酸化ペプチドを用いた。これらペプチドはペプチド研究所(箕面、大阪)から購入したものをそのまま使用した。試料タンパク質にはHorse Apo-myoglobin、Bovine Serum Albumin(BSA)、Equine Cytochrome c、Bovine Cytochrome c はSigma Aldrich (Steinheim, Germany)から購入、Cucumber Green Mottle Mosaic Virus (CGMMV)、Tobbaco Mosaic Virus (TMV)は、つくば分子生物学研究所 野津祐三博士から提供された。マトリックスである5-amino-1-naphthol(AHN)、2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)、1,5-diaminonaphthalene (DAN)、1,5-dihydroxynaphthalene(DHN)は東京化成(東京)から購入し、再結晶することなく使用した。ペプチドおよびタンパク質試料の水溶液は、その5μLをマトリックス溶液(各マトリックスの50%アセトニトリル水溶液の飽和溶液)5μLと混合し、混合後の試料溶液1μLを試料ターゲットに塗布し、自然乾燥により試料結晶を作成した。試料結晶を塗布したターゲットを質量分析計に導入した。
異なる4種類のマトリックスDHN, AHN, DAN, DHBを用いてペプチド試料ACTH18-35の正イオンMALDI-ISDスペクトルの評価を行った(図5)。得られたISDスペクトルにはアミノ酸配列を反映するcイオンがc7〜c17まで観測され、これらISDスペクトルの質をcイオンピークのS/N値で評価した。その結果、ACTH18-35ではDANが最も高いS/N値を示し優れた結果を与えた(図4)。
1.イオンシグナルのS/N値
2.イオンシグナルのシャープネス(ピーク幅)
3.アミノ酸配列情報獲得に有用なイオンシグナルの数
4.データ獲得の容易さ(スイートスポット無し)
〔実施例2〕
実験方法:質量分析装置には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法を搭載した飛行時間型(TOF)の質量分析計 AXIMA-CFR(島津製作所、京都)を使用し、レーザーには波長337nmの紫外窒素レーザーを用いた。測定はすべて負イオンモードで行った。生成したイオンの加速電圧は20kVであった。試料ペプチドには副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)のフラグメント ACTH18-39を用いた。ペプチドはペプチド研究所(箕面、大阪)から購入したものをそのまま使用した。5-amino-1-naphthol(AHN)は東京化成(東京)から購入し、再結晶することなく使用した。ペプチド試料の水溶液は、その5μLをマトリックス溶液(アセトニトリル70%、水30%の混合溶液にDHNを飽和溶解させたもの)5μLと混合し、混合後の試料溶液1μLを試料ターゲットに塗布し、自然乾燥により試料結晶を作成した。試料結晶を塗布したターゲットを質量分析計に導入した。
AHNマトリックスを用いてペプチド試料ACTH18-39の負イオンMALDI-ISDスペクトルの評価を行った。得られた負イオンISDスペクトルにはペプチド試料からプロトンが放出して生成した脱プロトン化分子[M-H]- が高い強度で観測された(図22)。本スペクトルは、AHNマトリックスがペプチドの負イオン測定にも適することを示すものである。また、脱プロトン化分子のピークより低質量領域には、ペプチド主鎖のN-Ca結合の特異的分解に由来するN-末端側のアミノ酸配列を反映するc-イオンがc11〜c17まで観測された(図23)。本c-イオンシリーズは、ACTH18-39の11番目のグルタミン酸(E)(図22参照)からプロトンが放出されて負イオンになったために観測されたものと考えられる。さらに同じ負イオンスペクトル中には、従来、本ペプチド試料では観測できなかったC-末端側のアミノ酸配列を反映するz-イオンがz9〜z19まで観測された。Z-イオンは、図22に示すアミノ酸配列のC-末端側から数えて9番目から19番目までの配列に相当し、その生成はプロトンを放出して負イオンになりやすい酸性官能基(E, D)がC-末端側に存在していることに由来する。負イオンが感度高く観測できる本結果は、AHNマトリックスが、プロトン放出能の他にプロトン引き抜きの性質も有することを示すものである。
Claims (8)
- 5-アミノ-1-ナフトールの存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合を特異的に切断する方法。
- 5-アミノ-1-ナフトールの存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のN-Cα結合を特異的に切断することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
- 5-アミノ-1-ナフトールがマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析のマトリックスとして使用される請求項2記載の方法。
- 5-アミノ-1-ナフトールを含む、ペプチド主鎖のN-Cα結合の特異的切断試薬。
- 5-アミノ-1-ナフトールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス試薬。
- 5-アミノ-1-ナフトールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用マトリックス。
- 5-アミノ-1-ナフトールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用タンパク質又はペプチドイオン化試薬。
- 5-アミノ-1-ナフトールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析用キット。
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