JP2003098151A - Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックス - Google Patents
Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックスInfo
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- JP2003098151A JP2003098151A JP2001291540A JP2001291540A JP2003098151A JP 2003098151 A JP2003098151 A JP 2003098151A JP 2001291540 A JP2001291540 A JP 2001291540A JP 2001291540 A JP2001291540 A JP 2001291540A JP 2003098151 A JP2003098151 A JP 2003098151A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イ
オン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／
ＭＳ）のための新規なマトリックスを開発し、提供する
ことを目的とする。 【解決手段】本発明は、ｐ−ニトロフェノールを含む、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質
量分析法のためのマトリックスに関する。本発明は、マ
トリックスとしてｐ−ニトロフェノールを用いた、マト
リックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分
析法による質量分析法にも関する。
オン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／
ＭＳ）のための新規なマトリックスを開発し、提供する
ことを目的とする。 【解決手段】本発明は、ｐ−ニトロフェノールを含む、
マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質
量分析法のためのマトリックスに関する。本発明は、マ
トリックスとしてｐ−ニトロフェノールを用いた、マト
リックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分
析法による質量分析法にも関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マトリックス支援
レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）のための新規なマトリックスに関
する。
レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）のための新規なマトリックスに関
する。
【０００２】
【従来の技術】質量分析法（ＭＳ）は分子量を測定する
方法であり、微量の試料をイオン化し、次いで該イオン
化したイオンを質量と電荷とイオンの比に応じて分析す
る方法である。該質量分析法は、イオン化の違いによ
り、電子イオン化法（ＥＩ法）、化学イオン化法（ＣＩ
法）、高速電子衝撃法（ＦＡＢ法）、エレクトロスプレ
ーイオン化法（ＥＳＩ法）、大気圧化学イオン化法（Ａ
ＰＣＩ法）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン
化法（ＭＡＬＤＩ法）などに分類される。
方法であり、微量の試料をイオン化し、次いで該イオン
化したイオンを質量と電荷とイオンの比に応じて分析す
る方法である。該質量分析法は、イオン化の違いによ
り、電子イオン化法（ＥＩ法）、化学イオン化法（ＣＩ
法）、高速電子衝撃法（ＦＡＢ法）、エレクトロスプレ
ーイオン化法（ＥＳＩ法）、大気圧化学イオン化法（Ａ
ＰＣＩ法）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン
化法（ＭＡＬＤＩ法）などに分類される。
【０００３】質量分析法により、試料の正確な質量を決
定でき、元素構成および構造を決定することができる。
質量分析法は質量分析計を用いて分析を行ない、該質量
分析計は、通常、１）分子をイオン化する装置（イオン
源）、２）電場や磁場を利用して質量分離する装置（質
量分離装置）、３）分離されたイオンを検出する装置
（イオン検出器）および４）真空装置等から構成され
る。
定でき、元素構成および構造を決定することができる。
質量分析法は質量分析計を用いて分析を行ない、該質量
分析計は、通常、１）分子をイオン化する装置（イオン
源）、２）電場や磁場を利用して質量分離する装置（質
量分離装置）、３）分離されたイオンを検出する装置
（イオン検出器）および４）真空装置等から構成され
る。
【０００４】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳとは、特定の波
長のレーザーエネルギーを吸収し、イオン化の補助をす
るマトリックスと呼ばれる物質と試料とを適量比で混合
させたものを分析試料とし、その分析試料をレーザーに
よりイオン化させるＭＡＬＤＩ法と、電場によって与え
られた初期エネルギーが物質の質量によって異なるた
め、真空中を飛行して検出器にイオンが到達するのに要
する時間が異なるのを利用して質量分離を行うＴＯＦ装
置とを組み合わせた質量分析法である。
長のレーザーエネルギーを吸収し、イオン化の補助をす
るマトリックスと呼ばれる物質と試料とを適量比で混合
させたものを分析試料とし、その分析試料をレーザーに
よりイオン化させるＭＡＬＤＩ法と、電場によって与え
られた初期エネルギーが物質の質量によって異なるた
め、真空中を飛行して検出器にイオンが到達するのに要
する時間が異なるのを利用して質量分離を行うＴＯＦ装
置とを組み合わせた質量分析法である。
【０００５】該ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより、理論
的には数百ダルトンの低分子量の試料から数万ダルトン
の高分子量の試料の質量分析が可能である。しかしなが
ら、分析する試料の純度、およびそのイオン化のされ易
さなどの問題が存在するために高分子量の試料の質量分
析は困難である。更に、高分子量の物質では同位体を有
する元素の数が多いために各同位体イオンのピーク強度
は増大し、かつ同位体イオンのピークの本数も増加する
ために、質量分析を行なうことはより困難である。
的には数百ダルトンの低分子量の試料から数万ダルトン
の高分子量の試料の質量分析が可能である。しかしなが
ら、分析する試料の純度、およびそのイオン化のされ易
さなどの問題が存在するために高分子量の試料の質量分
析は困難である。更に、高分子量の物質では同位体を有
する元素の数が多いために各同位体イオンのピーク強度
は増大し、かつ同位体イオンのピークの本数も増加する
ために、質量分析を行なうことはより困難である。
【０００６】ＭＡＬＤＩ法では、被験試料にパルスレー
ザーを照射して試料をイオン化する。レーザーとしては
様々な波長（ＵＶ ２６６、３３７、３５５ｎｍ；ＩＲ
２．７９、２．９４および１０．６μｍ）およびパル
ス寿命（０．５〜２００ｎｓ）を有するものが使用され
ており、例えば、波長３３７ｎｍの窒素レーザー、波長
２６６ｎｍのＮｄ−ＹＡＧレーザーを含むが、３３７ｎ
ｍの窒素レーザーが使用されることが多い。
ザーを照射して試料をイオン化する。レーザーとしては
様々な波長（ＵＶ ２６６、３３７、３５５ｎｍ；ＩＲ
２．７９、２．９４および１０．６μｍ）およびパル
ス寿命（０．５〜２００ｎｓ）を有するものが使用され
ており、例えば、波長３３７ｎｍの窒素レーザー、波長
２６６ｎｍのＮｄ−ＹＡＧレーザーを含むが、３３７ｎ
ｍの窒素レーザーが使用されることが多い。
【０００７】マトリックスは、使用するレーザーおよび
被験試料の化学的性質によって選択されるが、被験試料
が十分にイオン化されるためには試料とマトリックスと
の化学的性質が重要であるので使用可能なマトリックス
は限定される。３３７ｎｍの窒素レーザーによるＭＡＬ
ＤＩ法において、従来のマトリックスとしては、被験物
質がポリペプチドおよびタンパク質の場合には桂皮酸誘
導体（例えば、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂
皮酸（シナピン酸、ＳＡと略す）、α−シアノ−４−ヒ
ドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡと略す）、トランス−４−ヒ
ドロキシ−３−メトキシ桂皮酸（フェルラ酸、ＦＡと略
す）を含む））が知られており、被験物質が糖類の場合
には、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ、また
はゲンチシン酸（ＧＡと略す））が知られている。一
方、被験物質が核酸の場合については、３−ヒドロキシ
ピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）（G．R．Parrらによる
Rapid Communications in Mass Spectrometry，６，３
６９−３７２（１９９２））および、無機酸または有機
酸のアンモニウム塩とヒドロキシ置換フェノンとの組み
合わせ（チバガイギー・アクチエンゲゼルシャフトによ
る特開平６−３２２２７４号、１９９４年１１月２２日
公開）が提案されているが、その例は少ない。
被験試料の化学的性質によって選択されるが、被験試料
が十分にイオン化されるためには試料とマトリックスと
の化学的性質が重要であるので使用可能なマトリックス
は限定される。３３７ｎｍの窒素レーザーによるＭＡＬ
ＤＩ法において、従来のマトリックスとしては、被験物
質がポリペプチドおよびタンパク質の場合には桂皮酸誘
導体（例えば、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂
皮酸（シナピン酸、ＳＡと略す）、α−シアノ−４−ヒ
ドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡと略す）、トランス−４−ヒ
ドロキシ−３−メトキシ桂皮酸（フェルラ酸、ＦＡと略
す）を含む））が知られており、被験物質が糖類の場合
には、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ、また
はゲンチシン酸（ＧＡと略す））が知られている。一
方、被験物質が核酸の場合については、３−ヒドロキシ
ピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）（G．R．Parrらによる
Rapid Communications in Mass Spectrometry，６，３
６９−３７２（１９９２））および、無機酸または有機
酸のアンモニウム塩とヒドロキシ置換フェノンとの組み
合わせ（チバガイギー・アクチエンゲゼルシャフトによ
る特開平６−３２２２７４号、１９９４年１１月２２日
公開）が提案されているが、その例は少ない。
【０００８】被験物質が核酸である場合の問題点は、試
料に混在するアルカリ金属イオン（Ｎａ＋およびＫ＋を
含む）とその核酸とが親和性を有するので多数の付加体
が形成することによって多数の質量ピークが観察される
ために、分析前に被験試料を十分に精製することが必要
とされることである。分子量の大きな核酸の場合では、
更に分解能が低いことにより幅広いピークが観察される
ために、正確な質量分析を行なうのがより困難である。
従って、従来のマトリックスの場合には、比較的大きな
長鎖ＤＮＡ（塩基数が２００以上）の分析は困難であ
り、且つ分解能の面においても塩基数が５０以上のＤＮ
Ａについては良好な結果が得られなかった。従って、核
酸関連物質、特に長鎖ＤＮＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｍ
Ｓのための新規なマトリックスを開発することが望まれ
ている。
料に混在するアルカリ金属イオン（Ｎａ＋およびＫ＋を
含む）とその核酸とが親和性を有するので多数の付加体
が形成することによって多数の質量ピークが観察される
ために、分析前に被験試料を十分に精製することが必要
とされることである。分子量の大きな核酸の場合では、
更に分解能が低いことにより幅広いピークが観察される
ために、正確な質量分析を行なうのがより困難である。
従って、従来のマトリックスの場合には、比較的大きな
長鎖ＤＮＡ（塩基数が２００以上）の分析は困難であ
り、且つ分解能の面においても塩基数が５０以上のＤＮ
Ａについては良好な結果が得られなかった。従って、核
酸関連物質、特に長鎖ＤＮＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｍ
Ｓのための新規なマトリックスを開発することが望まれ
ている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、マトリック
ス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）のための新規なマトリッ
クスを開発し、提供することを目的とする。
ス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）のための新規なマトリッ
クスを開発し、提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、ｐ−ニトロフ
ェノールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン
化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｍ
Ｓ）のためのマトリックスに関する。本発明は、マトリ
ックスとしてｐ−ニトロフェノールを用いた、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法
による質量分析法にも関する。
ェノールを含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン
化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｍ
Ｓ）のためのマトリックスに関する。本発明は、マトリ
ックスとしてｐ−ニトロフェノールを用いた、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法
による質量分析法にも関する。
【００１１】
【発明の実施の態様】以下、本発明を詳細に記載する。
本明細書における用語「マトリックス」とはそれ自体が
イオン化されやすい、被験試料のイオン化を促進する物
質を意味する。被験物質はマトリックスを介してイオン
化を達成することができる。
本明細書における用語「マトリックス」とはそれ自体が
イオン化されやすい、被験試料のイオン化を促進する物
質を意味する。被験物質はマトリックスを介してイオン
化を達成することができる。
【００１２】本発明において、マトリックスとして、３
３７ｎｍの吸収を有し、且つ置換基としてニトロ基を有
する化合物を用いる。好ましくは、ｐ−ニトロフェノー
ルである。ニトロフェノールにはｐ−ニトロフェノール
の位置異性体であるｏ−およびｍ−体が存在し得るが、
それらは３３７ｎｍの吸収を有しないために本発明の実
施には適さない。
３７ｎｍの吸収を有し、且つ置換基としてニトロ基を有
する化合物を用いる。好ましくは、ｐ−ニトロフェノー
ルである。ニトロフェノールにはｐ−ニトロフェノール
の位置異性体であるｏ−およびｍ−体が存在し得るが、
それらは３３７ｎｍの吸収を有しないために本発明の実
施には適さない。
【００１３】本願の発明における分析物は、低分子量物
質、ポリペプチドおよび核酸関連物質を含むが、核酸関
連物質が好ましい。その核酸関連物質としては比較的に
低分子量のプライマーから高分子量の長鎖ＤＮＡを含
む。その核酸関連物質の例としては、約５００ｍｅｒま
での合成およびＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドを含み、
約５０ｍｅｒまでの合成およびＰＣＲ増幅オリゴヌクレ
オチドが特に好ましい。
質、ポリペプチドおよび核酸関連物質を含むが、核酸関
連物質が好ましい。その核酸関連物質としては比較的に
低分子量のプライマーから高分子量の長鎖ＤＮＡを含
む。その核酸関連物質の例としては、約５００ｍｅｒま
での合成およびＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドを含み、
約５０ｍｅｒまでの合成およびＰＣＲ増幅オリゴヌクレ
オチドが特に好ましい。
【００１４】本発明では、予め調製した被験試料溶液お
よび予め調製したマトリックス溶液を混合し、その混合
溶液を乾燥することによって溶媒を蒸発し、分析試料で
ある混晶を調製する。
よび予め調製したマトリックス溶液を混合し、その混合
溶液を乾燥することによって溶媒を蒸発し、分析試料で
ある混晶を調製する。
【００１５】上に記載の被験試料溶液とマトリックス溶
液との混合溶液は、十分なイオン化を達成するために均
一であることが望ましい。本発明におけるマトリックス
自体は水に難溶であり、有機溶媒に可溶であるために、
水溶液である被験試料溶液と、水と有機溶媒の混合溶媒
からなるマトリックス溶液とを混合することが好まし
い。
液との混合溶液は、十分なイオン化を達成するために均
一であることが望ましい。本発明におけるマトリックス
自体は水に難溶であり、有機溶媒に可溶であるために、
水溶液である被験試料溶液と、水と有機溶媒の混合溶媒
からなるマトリックス溶液とを混合することが好まし
い。
【００１６】被験試料溶液の調製では、脱塩処理を行な
ってもよい。例えば、上に記載の核酸関連物質の試料を
脱塩装置（例えば、精製スピンカラム（キアゲン社
製））を用いて脱塩処理を行なうことができる。
ってもよい。例えば、上に記載の核酸関連物質の試料を
脱塩装置（例えば、精製スピンカラム（キアゲン社
製））を用いて脱塩処理を行なうことができる。
【００１７】また、試料のＰＣＲ増幅量が少ない場合に
は、濃縮するために一旦エタノールを用いて処理するこ
とによってその被験試料を沈降させ、次いでその沈殿物
に水（５０μＬ以下が好ましい）を加えて試料を再溶解
させる。
は、濃縮するために一旦エタノールを用いて処理するこ
とによってその被験試料を沈降させ、次いでその沈殿物
に水（５０μＬ以下が好ましい）を加えて試料を再溶解
させる。
【００１８】マトリックス溶液は、水と有機溶媒との混
合溶媒を用いて調製する。その有機溶媒は、水と混和性
であり、且つ乾燥させることによって容易に蒸発させる
ことができる低沸点の揮発性の溶媒である。例えば、ア
ルコール性有機溶媒（特に、メタノール、エタノールが
好ましい）、アセトニトリル、アセトンを含む。場合に
より、ある緩衝液を一定の割合でそれらの混合溶液に加
えることができる。その緩衝液としては、当該分野で知
られている緩衝液を含み、例えば有機酸または無機酸の
アンモニウム塩（例えば、０．１Ｍ クエン酸ジアンモ
ニウム水溶液）を含む。該緩衝液を、水：有機溶媒：緩
衝液を１：１：２の割合で混合することができる。ま
た、マトリックス溶液の濃度は、ｐ−ニトロフェノール
の濃度が０．１〜１．０Ｍとなるように調製することが
好ましい。具体的には、ｐ−ニトロフェノール（５．５
６ｍｇ〜５５．６ｍｇ）を水（１００μＬ）、メタノー
ル（１００μＬ）、０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム
水溶液（２００μＬ）に溶解することによって調製する
ことができる。
合溶媒を用いて調製する。その有機溶媒は、水と混和性
であり、且つ乾燥させることによって容易に蒸発させる
ことができる低沸点の揮発性の溶媒である。例えば、ア
ルコール性有機溶媒（特に、メタノール、エタノールが
好ましい）、アセトニトリル、アセトンを含む。場合に
より、ある緩衝液を一定の割合でそれらの混合溶液に加
えることができる。その緩衝液としては、当該分野で知
られている緩衝液を含み、例えば有機酸または無機酸の
アンモニウム塩（例えば、０．１Ｍ クエン酸ジアンモ
ニウム水溶液）を含む。該緩衝液を、水：有機溶媒：緩
衝液を１：１：２の割合で混合することができる。ま
た、マトリックス溶液の濃度は、ｐ−ニトロフェノール
の濃度が０．１〜１．０Ｍとなるように調製することが
好ましい。具体的には、ｐ−ニトロフェノール（５．５
６ｍｇ〜５５．６ｍｇ）を水（１００μＬ）、メタノー
ル（１００μＬ）、０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム
水溶液（２００μＬ）に溶解することによって調製する
ことができる。
【００１９】次いで、上記の被験試料溶液とマトリック
ス溶液とを混合し、その得られた溶液を乾燥することに
よって溶媒を蒸発させ、分析試料の混晶を調製する。具
体的には、先ず上記の被験試料溶液とマトリックス溶液
とを一定の割合で混合する。該割合は、約１：１〜約
１：約５０の範囲が可能であり、１：１、１：４、１：
９および１：１９が好ましく、１：９および１：１９が
特に好ましい。次いで、得られたその混合溶液の少量
（例えば、１μＬ）をサンプルプレート上に添加した
後、大気圧下または真空中で乾燥させて徐々に溶媒を蒸
発させて、目的の分析試料の混晶を得る。
ス溶液とを混合し、その得られた溶液を乾燥することに
よって溶媒を蒸発させ、分析試料の混晶を調製する。具
体的には、先ず上記の被験試料溶液とマトリックス溶液
とを一定の割合で混合する。該割合は、約１：１〜約
１：約５０の範囲が可能であり、１：１、１：４、１：
９および１：１９が好ましく、１：９および１：１９が
特に好ましい。次いで、得られたその混合溶液の少量
（例えば、１μＬ）をサンプルプレート上に添加した
後、大気圧下または真空中で乾燥させて徐々に溶媒を蒸
発させて、目的の分析試料の混晶を得る。
【００２０】或いは、サンプルプレート上で直接的に試
料溶液とマトリックス溶液とを混合させて、混晶を得る
こともできる。すなわち、上記の試料溶液およびマトリ
ックス溶液とを一定の割合で（該割合は、約１：１〜約
１：５０の範囲が可能であり、１：１、１：２、１：
４、１：９および１：１９が好ましく、１：１および
１：２が特に好ましい）混合させた後、大気圧下または
真空中で乾燥することによって徐々に蒸発させて混晶を
得ることができる。
料溶液とマトリックス溶液とを混合させて、混晶を得る
こともできる。すなわち、上記の試料溶液およびマトリ
ックス溶液とを一定の割合で（該割合は、約１：１〜約
１：５０の範囲が可能であり、１：１、１：２、１：
４、１：９および１：１９が好ましく、１：１および
１：２が特に好ましい）混合させた後、大気圧下または
真空中で乾燥することによって徐々に蒸発させて混晶を
得ることができる。
【００２１】次いで、上で得られた混晶について質量分
析を行なう。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析
法は当業者にとって周知である（例えば、上記のG．R．
ParrらによるRapid Communications in Mass Spectrome
try，６，３６９−３７２（１９９２）を参照）。具体
的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレ
ートに、上記の通り得られた混晶を挿入する。次いで、
３３７ｎｍ波長のレーザーを照射することによって、マ
トリックスを励起させる。得られたピーク［Ｍ−Ｈ］−
について、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて解析する。質
量値の決定は、該装置に付属の解析ソフト上でワンボタ
ン一括入力によって達成する。
析を行なう。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析
法は当業者にとって周知である（例えば、上記のG．R．
ParrらによるRapid Communications in Mass Spectrome
try，６，３６９−３７２（１９９２）を参照）。具体
的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレ
ートに、上記の通り得られた混晶を挿入する。次いで、
３３７ｎｍ波長のレーザーを照射することによって、マ
トリックスを励起させる。得られたピーク［Ｍ−Ｈ］−
について、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて解析する。質
量値の決定は、該装置に付属の解析ソフト上でワンボタ
ン一括入力によって達成する。
【００２２】試料の分析前に、予め試料分析時と同じ条
件で標準物質を用いて質量校正を行なう。具体的には、
上記同一プレート上にシナピン酸をマトリックスとして
用いて混晶を形成させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法に
より解析後、その質量値を解析ソフトに登録している値
と比較して質量校正を行なう。分析試料が低分子量物質
の場合には、標準物質としてシナピン酸（ＭＷ＝２２
４．２２）およびウシインスリン（ＭＷ＝５７３３．５
９）を用いて２点補正を行なうことにより、質量校正を
行なう。一方で、分析試料が高分子物質の場合には、標
準物質としてシナピン酸およびウシ血清アルブミン（Ｍ
Ｗ＝６６４３０）を用いて２点補正を行なうことによ
り、質量校正を行なう。
件で標準物質を用いて質量校正を行なう。具体的には、
上記同一プレート上にシナピン酸をマトリックスとして
用いて混晶を形成させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法に
より解析後、その質量値を解析ソフトに登録している値
と比較して質量校正を行なう。分析試料が低分子量物質
の場合には、標準物質としてシナピン酸（ＭＷ＝２２
４．２２）およびウシインスリン（ＭＷ＝５７３３．５
９）を用いて２点補正を行なうことにより、質量校正を
行なう。一方で、分析試料が高分子物質の場合には、標
準物質としてシナピン酸およびウシ血清アルブミン（Ｍ
Ｗ＝６６４３０）を用いて２点補正を行なうことによ
り、質量校正を行なう。
【００２３】
【実施例】以下に、本発明を実施例をもって説明する
が、本発明はこれら実施例によって限定されるものでは
ないことは無論である。本発明における質量分析計は、
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ計（Voyager-DE PRO（Applie
d Biosystems社製）を使用した。
が、本発明はこれら実施例によって限定されるものでは
ないことは無論である。本発明における質量分析計は、
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ計（Voyager-DE PRO（Applie
d Biosystems社製）を使用した。
【００２４】実施例１．被験試料がλＤＮＡの５００塩
基数部位である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、λＤＮＡの５００塩基数部位（配列
番号１に示す通り、５’末端より７１３１〜７６３０位
まで）をＰＣＲ増幅した試料（このものは、センス側お
よびアンチセンス側の両方を含有するために、分子量は
１５３６９５．６または１５５２８８である）を用い
た。このものをスピンカラムにより脱塩精製することに
よって得られた溶液を、被験試料溶液として使用した。
マトリックス溶液は、ｐ−ニトロフェノール（３０ｍ
ｇ）を水（１００μＬ）、メタノール（１００μＬ）、
０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μ
Ｌ）に溶解することによって調製した。これら被験試料
溶液およびマトリックス溶液の各々１μＬずつを、サン
プルプレート上で直接に混合した。次いで、そのサンプ
ルプレートを真空中で乾燥させて溶媒を徐々に蒸発させ
ることによって、混晶を形成させた。この混晶をＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレートに挿入し、
波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、質量分析および解
析を行なった。その結果、ｍ／ｚ＝１５３５３３に主ピ
ーク、ｍ／ｚ＝７６９３９．５に二次ピークおよびｍ／
ｚ＝５１２８０．２に三次ピークを観察した（図１を参
照）。ここで、主ピークは、１価の電荷を有する該λＤ
ＮＡの５００塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イ
オンピークであり、二次ピークは２価の電荷を有する分
子イオンピークに相当し、三次ピークは３価の電荷を有
する分子イオンピークに相当する。この結果から明らか
な通り、被験試料の分子量の理論値（１５３６９５．６
または１５５２８８）と分析値（ＭＷ＝１５３５３３）
とは当該分野で許容される誤差の範囲内で一致した。
基数部位である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、λＤＮＡの５００塩基数部位（配列
番号１に示す通り、５’末端より７１３１〜７６３０位
まで）をＰＣＲ増幅した試料（このものは、センス側お
よびアンチセンス側の両方を含有するために、分子量は
１５３６９５．６または１５５２８８である）を用い
た。このものをスピンカラムにより脱塩精製することに
よって得られた溶液を、被験試料溶液として使用した。
マトリックス溶液は、ｐ−ニトロフェノール（３０ｍ
ｇ）を水（１００μＬ）、メタノール（１００μＬ）、
０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μ
Ｌ）に溶解することによって調製した。これら被験試料
溶液およびマトリックス溶液の各々１μＬずつを、サン
プルプレート上で直接に混合した。次いで、そのサンプ
ルプレートを真空中で乾燥させて溶媒を徐々に蒸発させ
ることによって、混晶を形成させた。この混晶をＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレートに挿入し、
波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、質量分析および解
析を行なった。その結果、ｍ／ｚ＝１５３５３３に主ピ
ーク、ｍ／ｚ＝７６９３９．５に二次ピークおよびｍ／
ｚ＝５１２８０．２に三次ピークを観察した（図１を参
照）。ここで、主ピークは、１価の電荷を有する該λＤ
ＮＡの５００塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イ
オンピークであり、二次ピークは２価の電荷を有する分
子イオンピークに相当し、三次ピークは３価の電荷を有
する分子イオンピークに相当する。この結果から明らか
な通り、被験試料の分子量の理論値（１５３６９５．６
または１５５２８８）と分析値（ＭＷ＝１５３５３３）
とは当該分野で許容される誤差の範囲内で一致した。
【００２５】実施例２．被験試料がヒトゲノムＤＮＡの
２０５塩基数部位である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡの２０５塩基数部
位（配列番号２に示す通り、β−グロビン領域中の５’
末端より６２０５５〜６２２５９位まで）をＰＣＲ増幅
した試料（このものは、センス側およびアンチセンス側
の両方を含有するために、分子量は６３０８３または６
３５９５である）を用いた。このものをスピンカラムに
より精製することによって得られた溶液を、被験試料溶
液として使用した。マトリックス溶液は、ｐ−ニトロフ
ェノール（３０ｍｇ）を水（１００μＬ）、メタノール
（１００μＬ）、０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水
溶液（２００μＬ）に溶解することによって調製した。
これら被験試料溶液およびマトリックス溶液の各々１μ
Ｌずつを、サンプルプレート上で直接に混合した。次い
で、そのサンプルプレートを真空中で乾燥させて溶媒を
徐々に蒸発させることによって、混晶を形成させた。こ
の混晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレ
ートに挿入し、波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、質
量分析および解析を行なった。その結果、ｍ／ｚ＝６３
２５３．３に主ピークを観察した（図２を参照）。該主
ピークは、１価の電荷を有する該ヒトゲノムＤＮＡの２
０５塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イオンピー
クである。この結果から明らかな通り、被験試料の分子
量の理論値（６３０８３および６３５９５）と分析値
（ＭＷ＝６３２５３．３）とは当該分野で許容される誤
差の範囲内で一致した。
２０５塩基数部位である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡの２０５塩基数部
位（配列番号２に示す通り、β−グロビン領域中の５’
末端より６２０５５〜６２２５９位まで）をＰＣＲ増幅
した試料（このものは、センス側およびアンチセンス側
の両方を含有するために、分子量は６３０８３または６
３５９５である）を用いた。このものをスピンカラムに
より精製することによって得られた溶液を、被験試料溶
液として使用した。マトリックス溶液は、ｐ−ニトロフ
ェノール（３０ｍｇ）を水（１００μＬ）、メタノール
（１００μＬ）、０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水
溶液（２００μＬ）に溶解することによって調製した。
これら被験試料溶液およびマトリックス溶液の各々１μ
Ｌずつを、サンプルプレート上で直接に混合した。次い
で、そのサンプルプレートを真空中で乾燥させて溶媒を
徐々に蒸発させることによって、混晶を形成させた。こ
の混晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置のサンプルプレ
ートに挿入し、波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、質
量分析および解析を行なった。その結果、ｍ／ｚ＝６３
２５３．３に主ピークを観察した（図２を参照）。該主
ピークは、１価の電荷を有する該ヒトゲノムＤＮＡの２
０５塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イオンピー
クである。この結果から明らかな通り、被験試料の分子
量の理論値（６３０８３および６３５９５）と分析値
（ＭＷ＝６３２５３．３）とは当該分野で許容される誤
差の範囲内で一致した。
【００２６】実施例３．被験分析試料が、合成プライマ
ー：５'−ＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴ
ＣＣ−３'である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、５'−ＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴ
ＧＡＧＡＣＴＴＣＣ−３'（配列番号３）の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである合成プライマー（分子
量は６６６０である）を用いた。該合成プライマーの１
００μＭ水溶液を被験試料溶液として使用した。マトリ
ックス溶液は、ｐ−ニトロフェノール（３０ｍｇ）を水
（１００μＬ）、メタノール（１００μＬ）、０．１Ｍ
クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μＬ）に溶解
することによって調製した。これら被験試料溶液および
マトリックス溶液の各々１μＬずつを、サンプルプレー
ト上で直接に混合した。次いで、そのサンプルプレート
を真空中で乾燥させて溶媒を徐々に蒸発させることによ
って、混晶を形成させた。この混晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ／ＭＳ装置のサンプルプレートに挿入し、波長３３７
ｎｍのレーザーを照射し、質量分析および解析を行なっ
た。その結果、ｍ／ｚ＝６６５９．５９に主ピークおよ
びｍ／ｚ＝３３３０．９１に二次ピークを観察した（図
３を参照）。ここで、主ピークは、１価の電荷を有する
該合成プライマーの分子イオンピークであり、二次ピー
クは２価の電荷を有する分子イオンピークに相当する。
この結果から明らかな通り、被験試料の分子量の理論値
（６６６０）と分析値（ＭＷ＝６６５９．５９）とは一
致した。
ー：５'−ＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴ
ＣＣ−３'である場合の質量分析の結果 被験試料ＤＮＡは、５'−ＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴ
ＧＡＧＡＣＴＴＣＣ−３'（配列番号３）の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドである合成プライマー（分子
量は６６６０である）を用いた。該合成プライマーの１
００μＭ水溶液を被験試料溶液として使用した。マトリ
ックス溶液は、ｐ−ニトロフェノール（３０ｍｇ）を水
（１００μＬ）、メタノール（１００μＬ）、０．１Ｍ
クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μＬ）に溶解
することによって調製した。これら被験試料溶液および
マトリックス溶液の各々１μＬずつを、サンプルプレー
ト上で直接に混合した。次いで、そのサンプルプレート
を真空中で乾燥させて溶媒を徐々に蒸発させることによ
って、混晶を形成させた。この混晶をＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ／ＭＳ装置のサンプルプレートに挿入し、波長３３７
ｎｍのレーザーを照射し、質量分析および解析を行なっ
た。その結果、ｍ／ｚ＝６６５９．５９に主ピークおよ
びｍ／ｚ＝３３３０．９１に二次ピークを観察した（図
３を参照）。ここで、主ピークは、１価の電荷を有する
該合成プライマーの分子イオンピークであり、二次ピー
クは２価の電荷を有する分子イオンピークに相当する。
この結果から明らかな通り、被験試料の分子量の理論値
（６６６０）と分析値（ＭＷ＝６６５９．５９）とは一
致した。
【００２７】比較例．従来のマトリックスである３−ヒ
ドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を用いた場合の比較
実験 上記の実験例１と同一の被験試料について比較実験を行
なった。マトリックス溶液は、３−ＨＰＡ（２０ｍｇ）
を水（１００μＬ）、エタノール（１００μＬ）および
０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μ
Ｌ）に溶解することによって調製した。これら被験試料
溶液およびマトリックス溶液の各々１μＬずつを直接に
サンプルプレート上で混合した。次いで、真空中で乾燥
させて溶媒を徐々に蒸発させて混晶を形成させた。この
混晶に波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ／ＭＳ質量分析計を用いて分析および解析を行
なった。その結果、被験試料であるλＤＮＡの５００塩
基数部位についての分子イオンに相当するピークは検出
されなかった。
ドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を用いた場合の比較
実験 上記の実験例１と同一の被験試料について比較実験を行
なった。マトリックス溶液は、３−ＨＰＡ（２０ｍｇ）
を水（１００μＬ）、エタノール（１００μＬ）および
０．１Ｍ クエン酸ジアンモニウム水溶液（２００μ
Ｌ）に溶解することによって調製した。これら被験試料
溶液およびマトリックス溶液の各々１μＬずつを直接に
サンプルプレート上で混合した。次いで、真空中で乾燥
させて溶媒を徐々に蒸発させて混晶を形成させた。この
混晶に波長３３７ｎｍのレーザーを照射し、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ／ＭＳ質量分析計を用いて分析および解析を行
なった。その結果、被験試料であるλＤＮＡの５００塩
基数部位についての分子イオンに相当するピークは検出
されなかった。
【００２８】
【本発明の効果】従来のマトリックスでは、塩基数が２
００以上の核酸については、質量分析の分析および検出
が極めて困難であったが、本発明に記載のマトリックス
であるｐ−ニトロフェノールを用いることにより、塩基
数が２００以上の高分子量の核酸についても容易に質量
を分析し、検出することが可能である。従って、本発明
のマトリックスを用いた質量分析法により、核酸関連物
質、特に長鎖ＤＮＡについて質量分析を行なうことが可
能である。
００以上の核酸については、質量分析の分析および検出
が極めて困難であったが、本発明に記載のマトリックス
であるｐ−ニトロフェノールを用いることにより、塩基
数が２００以上の高分子量の核酸についても容易に質量
を分析し、検出することが可能である。従って、本発明
のマトリックスを用いた質量分析法により、核酸関連物
質、特に長鎖ＤＮＡについて質量分析を行なうことが可
能である。
【００２９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NIHON PARKERIZING HIROSHIMA CO., LTD
<120> MALDI-TOF質量分析法のためのマトリックス
<130> 179399
<160> 3
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> λphage
<400> 1
gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatggccct tcggggccat tgtttctctg 60
tggaggagtc catgacgaaa gatgaactga ttgcccgtct ccgctcgctg ggtgaacaac 120
tgaaccgtga tgtcagcctg acggggacga aagaagaact ggcgctccgt gtggcagagc 180
tgaaagagga gcttgatgac acggatgaaa ctgccggtca ggacacccct ctcagccggg 240
aaaatgtgct gaccggacat gaaaatgagg tgggatcagc gcagccggat accgtgattc 300
tggatacgtc tgaactggtc acggtcgtgg cactggtgaa gctgcatact gatgcacttc 360
acgccacgcg ggatgaacct gtggcatttg tgctgccggg aacggcgttt cgtgtctctg 420
ccggtgtggc agccgaaatg acagagcgcg gcctggccag aatgcaataa cgggaggcgc 480
tgtggctgat ttcgataacc 500
<210> 2
<211> 205
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggttggccaa tctactccca ggagcaggga gggcaggagc cagggctggg cataaaagtc 60
agggcagagc catctattgc ttacatttgc ttctgacaca actgtgttca ctagcaacct 120
caaacagaca ccatggtgca cctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg 180
ggcaaggtga acgtggatga agttg 205
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<221> promoter
<400> 3
ctaaaacgat cctgagactt cc 22
【図１】 図１は、マトリックスとしてｐ−ニトロフェ
ノールを用い、被験試料としてλＤＮＡの５００塩基数
部位（その塩基配列を配列番号１に示す）をＰＣＲ増幅
した試料を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質
量分析を行なった場合の結果を示す図である。図１中、
主ピークは１価の電荷を有する該λＤＮＡの５００塩基
数部位（一本鎖として検出）の分子イオンピークであ
り、二次ピークは２価の電荷を有する分子イオンピーク
に相当し、三次ピークは３価の電荷を有する分子イオン
ピークに相当する。
ノールを用い、被験試料としてλＤＮＡの５００塩基数
部位（その塩基配列を配列番号１に示す）をＰＣＲ増幅
した試料を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質
量分析を行なった場合の結果を示す図である。図１中、
主ピークは１価の電荷を有する該λＤＮＡの５００塩基
数部位（一本鎖として検出）の分子イオンピークであ
り、二次ピークは２価の電荷を有する分子イオンピーク
に相当し、三次ピークは３価の電荷を有する分子イオン
ピークに相当する。
【図２】 図２は、マトリックスとしてｐ−ニトロフェ
ノールを用い、被験試料としてヒトゲノムＤＮＡの２０
５塩基数部位（その塩基配列を配列番号２に示す）をＰ
ＣＲ増幅した試料を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ
による質量分析を行なった場合の結果を示す図である。
図２中、主ピークは１価の電荷を有する該ヒトゲノムＤ
ＮＡの２０５塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イ
オンピークである。
ノールを用い、被験試料としてヒトゲノムＤＮＡの２０
５塩基数部位（その塩基配列を配列番号２に示す）をＰ
ＣＲ増幅した試料を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ
による質量分析を行なった場合の結果を示す図である。
図２中、主ピークは１価の電荷を有する該ヒトゲノムＤ
ＮＡの２０５塩基数部位（一本鎖として検出）の分子イ
オンピークである。
【図３】 図３は、マトリックスとしてｐ−ニトロフェ
ノールを用い、被験試料として合成プライマー（その塩
基配列を配列番号３に示す）を用いて、ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ／ＭＳによる質量分析を行なった場合の結果を示す
図である。図３中、主ピークは１価の電荷を有する該合
成プライマーの分子イオンピークであり、二次ピークは
２価の電荷を有する分子イオンピークに相当する。
ノールを用い、被験試料として合成プライマー（その塩
基配列を配列番号３に示す）を用いて、ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ／ＭＳによる質量分析を行なった場合の結果を示す
図である。図３中、主ピークは１価の電荷を有する該合
成プライマーの分子イオンピークであり、二次ピークは
２価の電荷を有する分子イオンピークに相当する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 中島 龍生
広島県広島市中区大手町２丁目８番４号
株式会社日本パーカーライジング広島工場
内
(72)発明者 高橋 浩二郎
広島県広島市南区宇品御幸１丁目９番26号
Ｆターム(参考） 5C038 EE02
Claims (4)
- 【請求項１】 ｐ−ニトロフェノールを含む、マトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）のためのマトリックス。 - 【請求項２】 分析物はＤＮＡである、請求項１に記載
のマトリックス。 - 【請求項３】 マトリックスとしてｐ−ニトロフェノー
ルを用いた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−
飛行時間型質量分析法による質量分析法。 - 【請求項４】 分析物はＤＮＡである、請求項３に記載
の質量分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001291540A JP2003098151A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001291540A JP2003098151A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003098151A true JP2003098151A (ja) | 2003-04-03 |
Family
ID=19113668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001291540A Pending JP2003098151A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析法のためのマトリックス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003098151A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004340971A (ja) * | 2003-05-13 | 2004-12-02 | Becton Dickinson & Co | 生物学的サンプルを精製および脱塩する方法並びに装置 |
| WO2005100975A1 (ja) * | 2004-04-13 | 2005-10-27 | Shimadzu Corporation | 質量分析を用いる物質の測定方法及びキット |
| US7354996B2 (en) | 2004-09-07 | 2008-04-08 | Shimadzu Corporation | Method and kit for quantitative analysis of protein |
| JP2013130570A (ja) * | 2011-11-21 | 2013-07-04 | Yokohama City Univ | タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合の特異的切断方法 |
| CN105203623A (zh) * | 2015-08-31 | 2015-12-30 | 陕西师范大学 | 六叔丁基-六己氧基-六苯并[ab,de,lm,op,rs,uv]晕蒄作为MALDI-TOF MS基质在小分子检测中的应用 |
| CN105929015A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-09-07 | 东南大学 | 一种木质素液相解聚产物中低聚物分子结构判定的方法 |
| KR20200118765A (ko) * | 2019-04-08 | 2020-10-16 | 주식회사 엘지화학 | Maldi 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법 |
-
2001
- 2001-09-25 JP JP2001291540A patent/JP2003098151A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP4575708B2 (ja) * | 2003-05-13 | 2010-11-04 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 生物学的サンプルを精製および脱塩する方法並びに装置 |
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| CN105203623A (zh) * | 2015-08-31 | 2015-12-30 | 陕西师范大学 | 六叔丁基-六己氧基-六苯并[ab,de,lm,op,rs,uv]晕蒄作为MALDI-TOF MS基质在小分子检测中的应用 |
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| CN105929015B (zh) * | 2016-04-18 | 2019-07-12 | 东南大学 | 一种木质素液相解聚产物中低聚物分子结构判定的方法 |
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| KR102362170B1 (ko) | 2019-04-08 | 2022-02-11 | 주식회사 엘지화학 | Maldi 질량분석을 이용한 고분자의 상대적 정량분석방법 |
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