WO2005100975A1 - 質量分析を用いる物質の測定方法及びキット - Google Patents

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peptide
sample
acid
protein
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Eiichi Matsuo
Makoto Watanabe
Noriyuki Ojima
Chikako Toda
Hiroki Kuyama
Osamu Nishimura
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Shimadzu Corporation
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    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for measuring a substance using mass spectrometry, and includes the first, second and third inventions.
  • the first invention is a method for measuring a hydrophobic peptide using a MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption / lonization) mass spectrometer, and relates to the field of proteome analysis using a mass spectrometer.
  • MALDI Microx Assisted Laser Desorption / lonization
  • the second invention is a method for selectively measuring a specific substance from a mixture by MALDI mass spectrometry, and relates to mass spectrometry by MALDI method and quantitative proteome analysis.
  • the third invention is a protein quantitative analysis method and kit, and relates to the field of proteome analysis (exhaustive analysis of proteins) using stable isotopes. Background art
  • NBS dihydrobenzenesullaenyl
  • the mass value of a plurality of peptide fragments obtained by enzymatic digestion of one protein is detected by a mass spectrometer, and these are compared with the mass values of theoretical fragments in a database to identify the protein.
  • the sequence is determined by MS / MS analysis of the labeled / enriched peptide, and the original protein is identified by searching the database for proteins containing such a sequence. . Therefore, in the NBS method, sequencing by MS / MS analysis is an essential step for protein identification at the same time as ordinary quantitative analysis by mass spectrometry.
  • the MS / MS analysis consists of three steps: 1) selection of a peptide whose sequence is to be determined, called a precursor ion, 2) fragmentation of the selected precursor ion, and 3) detection of the mass value of the generated fragment ion. It is done through.
  • a mass spectrometer capable of performing such MS / MS analysis is a tandem type, in which a precursor-ion selection / drag mass separation unit for fragment ion detection is connected, and decomposition by the internal energy of the ions themselves.
  • MALDI Microx Assisted Laser Desorption / lonization
  • molecules generally organic compounds
  • the matrix surrounding the sample molecules is instantaneously vaporized, and as a result, the sample molecules are almost simultaneously released into the gas phase.
  • electrons and protons are transferred between the sample molecule and the matrix, and ionization of the sample molecule is achieved.
  • part of the energy is transferred to the sample molecules as internal energy.
  • the matrix not only assists the vaporization and ionization of the sample molecules, but also acts as a dispersant for the sample molecules, so the affinity between the matrix and the sample molecules is important for the efficient ionization of the sample molecules. Is believed to be. Therefore, the optimal organic compound has been searched for and used for each sample to be measured. For example, when measuring a peptide, 4-cyano-4-cynoic acid (4-CHCA) is widely and generally used.
  • MALDI-rr matrix-assisted laser-desorption ionization-one ion trap
  • MALDI-rr-TOF matrix-assisted laser desorption-ionization-one ion trap per flight time
  • MALDI-FOCR matrix-assisted laser desorption / ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance
  • MALDI- ⁇ MALDWT-TOF and MALDI-FTICR mass spectrometers have the disadvantage that if they receive a large internal energy during ionization, many undesired fragment ions are detected during measurement. From this point, using 4-CHCA as a matrix gives excessive internal energy to the sample at the time of ionization, so that MALDI-II, MALD-IT-TOF and MALD-FTICR types are used. Therefore, the matrix that is actually set as the default in the AXIMA-QH ”instrument is said to give relatively small energy to sample molecules during ionization. 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB).
  • DDB 2,5-Dihydroxybenzoic acid
  • a molecule called a matrix (generally an organic compound) mixed in a sample is heated by absorbing the energy of one laser beam, and is vaporized and ionized.
  • the matrix surrounding the sample molecules is instantaneously vaporized, and as a result, the sample molecules are almost simultaneously released into the gas phase (at this time, electrons and protons are exchanged between the sample molecules and the matrix). Thus, ionization of the sample molecules is achieved).
  • the most suitable organic compound is searched for and used for each sample to be measured. For example, when measuring peptides, ⁇ -cyano 4-hydroxycinnamic acid
  • proteome Analysis In the field of prodomic analysis (exhaustive analysis of proteins), PMF (peptide mass fingerprinting) analysis, which combines two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, has been the mainstream.
  • Alternative next-generation proteome analysis methods include, for example, Steven P. Gygi, Beate Rist, Scott A. Gerber, Frantisek Turecek, Michael H. Gelb and Ruedi Aebersold, Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags, Nature Biotechnology,
  • NBS 2-two Toro benzene phenylalanine chloride
  • nitric oxide (NO) and the more reactive nitrogen oxides (such as peroxynitrite) that react with proteins and nucleic acids to produce nitrates I have.
  • NO nitric oxide
  • peroxynitrite the more reactive nitrogen oxides
  • proteins and nucleic acids to produce nitrates I have.
  • a protein it reacts with a phenyl group which is a side chain of tyrosine to generate 3-nitrotyrosine.
  • Cysteine residues are frequently phosphorylated in vivo, and phosphorylation plays a switching role in important biological events such as signal transduction and cell death.
  • biomaterials containing nitrotyrosine have attracted attention not only as an indicator of the formation of reactive nitrogen oxides in the body (biomass) but also from the perspective of biological activity.
  • PMF proteome mass fingerprinting analysis
  • Next generation alternative proteome As analysis methods for example, Steven P. Gygi, Beate Rist, Scott A. Gerber, Frantisek Turecek, Michael H. Gelb and Ruedi Aebersold, Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags, Nature Biotechnology, 994-999, 17, 1999; Kirk C. Hansen, Gerold Schmitt-Ulms, Robert J. Chalkley, Jan Hirsch, Michael A.
  • NBS method 2-two Toro benzene phenylalanine black stable isotope targets ⁇ of Li de (NBSCI) (2-nitro [13 C 6] Benzensurufu I Nirukurorido) ⁇ its unlabeled body (2 twelve Toro [12 C 6 ] benzenesulfenyl chloride).
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently ionizing hydrophobic peptides in a MALDI mass spectrometer, particularly in a MALDWT, MALDI-IT-TOF or MALDI-FTICR mass spectrometer. To provide.
  • the present inventors have found that the above object of the present invention can be achieved by using cyano-3-hydroxygaynamic acid or 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid as a matrix, and completed the present invention. I came to.
  • the present invention includes the following inventions.
  • MALDI matrix-assisted laser-desorption ionization
  • a peptide is an oligopeptide, a polypeptide, or the like. Used in a sense that includes proteins and proteins.
  • a MALDI type mass spectrometer particularly a MALDI-IT type
  • the sample ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the number of molecules that can be ionized in one shot (one shot) is limited. Therefore, when multiple molecular species are mixed in the sample to be measured, the molecular species with a large abundance are ionized stochastically and the molecules with a small abundance are present even if the sample is above the detection limit. However, it is difficult to detect stochastically. In addition, if there is a difference in the ionizability J between the sample molecules to be measured, molecules that are difficult to ionize will have reduced measurement sensitivity. In order to detect molecular species with low abundance, it is important to concentrate the target molecule in advance.
  • the NBS method can detect the NBS-modified molecule, which is the target molecule, without concentration, but the quantification decreases when it overlaps with an unrelated molecule. Sometimes. Therefore, even in this case, from the viewpoint of improving quantitativeness, it is preferable to remove the molecular species not modified with NBS in advance by concentration.
  • An object of the present invention is to provide a simpler, less expensive and more sensitive detection method capable of mainly detecting a target substance in mass spectrometry.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a mass spectrometric method in which a specific substance is more specifically ionized than a substance other than the specific substance by using a matrix that makes it easier to reionize the specific substance, and the specific substance is selectively measured from the mixture.
  • the matrix in the present invention mainly ionizes a specific substance and hardly ionizes a substance other than the specific substance, so that the specific substance can be specifically ionized.
  • the specific substance is a biological substance.
  • the vortex — 7 ⁇ electron interaction between the specific substance to be measured and the matrix is used.
  • the hydrophilic interaction between the specific substance to be measured and the matrix is used.
  • the hydrophobic interaction between the specific substance to be measured and the matrix is used.
  • the hydrophobic peptide or the hydrophobic protein corresponds to the hydrophobic peptide or the hydrophobic protein using a hydrophobic compound having a benzene ring, an aromatic ring other than a benzene ring, and / or a nitro group.
  • the mass spectrometric method according to any one of (20) to (23), which is obtained by chemically modifying a peptide or protein.
  • the peptide or the protein corresponding to the hydrophobic peptide or the hydrophobic protein includes the case where the peptide itself is hydrophobic. That is, the case where the hydrophobic peptide or the hydrophobic protein is derivatized to a more hydrophobic peptide or protein by chemical modification using a hydrophobic compound is also included.
  • the matrix is composed of 4-12 troaniline, 2,4-dinitroaniline, 2-bromo-1,4,6-dinitroaniline, 4-nitrophenol, 2-nitrophenol, 2,5- (19)
  • the mass spectrometric method according to any one of (19) to (29), wherein the method is selected from 4-nitrobenzoic acid, 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid, and 3-hydroxy-12-nitrobenzoic acid. .
  • the present invention it is possible to provide a method capable of mainly detecting a target substance in mass spectrometry without performing a step of concentrating the target substance to be measured.
  • the purpose and outline of the third invention are described below. Purpose of the invention
  • the conventional NBS method developed by the present inventors can be used particularly effectively when a purified standard such as a model protein is used.
  • the present inventors can effectively use not only such a purified sample but also a non-purified sample such as a sample derived from a living body, and have a protein with better detection sensitivity and quantification than the conventional NBS method.
  • the present invention has been completed in order to provide a comprehensive quantitative analysis method. Summary of the Invention
  • the present invention includes the following inventions.
  • the protein sample II is solubilized in a solution containing urea as a denaturant, or solubilized in a solution containing guanidine hydrochloride as a denaturant to obtain a solubilized protein sample II.
  • solubilized protein sample II was replaced with 2-nitro [ 13 C 6 ] benzenesulfenyl chloride or 2-nitro [ 12 C 6 ] benzenesulfenyl chloride.
  • Obtaining a labeled protein sample II by performing a labeling reaction using (iv) mixing and desalting the labeled protein sample I and the labeled protein sample II to obtain a desalted protein sample mixture;
  • step (ix) when 3-hydroxy-14-nitrobenzoic acid is used as the matrix, the 3-hydroxy-14-nitrobenzoic acid and —cyano-4-hydroxygaynamic acid are combined.
  • kits further comprising at least one selected from the group consisting of a desalting column, a gel packed with a column for desalting, a reducing reagent, an alkylating reagent, trypsin, and a column for packing the carrier.
  • the kit according to any one of to (48). According to the present invention, it is possible to provide a method capable of detecting a target peptide from a biological sample in mass spectrometry with higher sensitivity and higher quantitativeness.
  • FIG. 1 shows the comparative MS spectrum (a) obtained by the conventional method and the MS spectra (b) and (c) obtained by the method of the present invention in Example A-1. ).
  • FIG. 2 shows the MS / MS spectrum obtained in Example A-1.
  • Fig. 3 shows MS spectrum (a-1) obtained by measuring with AXIMA-Qrr having an ion trap and AXIMA-CFR plus without an ion trap in Example A-2 (a).
  • MS spectrum (a-2) obtained by the measurement in Example 1 and the MS spectrum obtained by using a mixture of 3H4NBA and 4-CHCA as a matrix in Example A-2 (b).
  • 4 to 13 relate to the second invention.
  • Figure 4 shows the mass spectra obtained by the conventional method ((a) and (b) when the measurement sample was a mixture of ACTH peptide and ACTH peptide labeled with NBS Reagent (light). )) And the mass spectrum ((c) and (d)) obtained by the present invention.
  • Figure 5 shows the results obtained by labeling four types of purified proteins (ovalbumin, glyceraldehyde-13-phosphate dehydrogenase, lysozyme, and -lactalbumin) with NBS Reagent (heavy) and NBS Reagent (light).
  • Figure 6 shows the mass spectrum obtained by the conventional method (a) when the measurement sample was a mixture of the DSIP peptide and the DSIP peptide labeled with NBS Reagent (light), and obtained by the present invention. This is the mass spectrum (b).
  • Figure 7 shows that the measurement sample was prepared by nitrating lysozyme and digesting with tribcine.
  • FIG. 8 is a partially enlarged view of FIG.
  • Figure 9 shows the mass spectrum (a) obtained by the conventional method and the present invention when the measurement sample was a mixture of the peptide IRRP1 labeled with NBS Reagent (light) and the peptide IRRP1 not labeled. This is the mass spectrum (b) obtained by the above.
  • Fig. 10 shows the mass spectrum obtained by the conventional method (a) and the mass spectrum obtained by the present invention (b) when the measurement sample was a peptide HIV sublll containing P-nitrophenylalanine. ).
  • Fig. 11 shows the mass spectrum (a) obtained by the conventional method when the measurement sample was a mixture of ACTH labeled with NBS Reagent (light) and unlabeled ACTH, and according to the present invention.
  • the obtained mass spectra ((b) and (c)).
  • Fig. 12 shows the mass spectrum (a) obtained by the conventional method when the measurement sample was a mixture of ACTH labeled with NBS Reagent (light) and unlabeled ACTH, and according to the present invention.
  • the obtained mass spectra ((b), (c), (d) and (e)).
  • FIG. 13 shows the results of the measurement using the NBS Reagent (heavy) and the NBS Reagent (light) for the four purified proteins (ovalbumin, dariceraldehyde-13-phosphate dehydrogenase, lysozyme, and lactalbumin).
  • the mass spectrum obtained by the conventional method (, and the mass spectrum obtained by the present invention ((a), (b), (c ), (D), (e) and (g))
  • Figures 14 to 23 relate to the third invention.
  • FIG. 14 is an electrophoretogram obtained in Experimental Example c-1.
  • FIG. 15 is an electrophoretogram obtained in Experimental Example C-12.
  • FIG. 16 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example C-13.
  • FIG. 17 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-15.
  • FIG. 18 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-16.
  • Figure 19 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-6.
  • FIG. 20 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-17.
  • FIG. 21 shows the MS / MS spectrum obtained in Experimental Example c-17.
  • FIG. 22 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-8.
  • FIG. 23 shows the MS spectrum obtained in Experimental Example c-19.
  • the method of the present invention is a method for measuring a hydrophobic peptide sample using a mass spectrometer having a MALDI (matrix-assisted laser desorption / ionization) ion source.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • hydrophobic peptide refers to a protein having a relatively high content of hydrophobic amino acids, particularly amino acids having high hydrophobicity, among the constituent amino acid residues of peptide-protein. And those that have undergone the following chemical modification.
  • amino acids having high hydrophobicity include tritophan, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, leucine, valine, and methionine.
  • alanine, glycine, proline, etc. may be considered as hydrophobic amino acids.
  • nitrobenzenesulfonyl phenylalanine group (NBS group: N0 2 PhS group (Ph: phenylene group)) usefully employed if you measure the hydrophobic peptide having a like or nitrophenyl group.
  • hydrophobic peptides include peptides containing nitrotyrosine residues, ditrophenylalanine residues, tryptophan residues having an NBS group as a substituent, and cysteine residues having an NBS group as a substituent. are listed.
  • the hydrophobic peptide may be obtained by chemically modifying the corresponding peptide with a hydrophobic compound.
  • the corresponding peptide includes a case where the peptide itself is hydrophobic. 'In other words, the case where the hydrophobic peptide is derivatized to a more hydrophobic peptide by chemical modification using a hydrophobic compound is also included.
  • the hydrophobic compound is a sulfenyl compound.
  • the sulfonyl compound is a compound that specifically modifies tributophan residues and cysteine residues in peptides or proteins.
  • a particularly preferred example of the sulfenyl compound is 2-nitrobenzenesulfenyl chloride (NBS reagent).
  • a peptide obtained by chemically modifying a peptide having a tryptophan residue or a cysteine residue using an NBS reagent is exemplified.
  • the method of the present invention is particularly useful for a mass spectrometer combined with a MALDI ion source in which the time taken for the generated ions to reach a detector and measured is longer than that of a normal MALDI-TOF type.
  • mass spectrometers include a MALDI-IT (matrix-assisted laser-desorption ionization-ion trap) mass spectrometer and a MALDI-IT-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap flight) Time> mass spectrometer MALDI-FTICR (matrix-assisted laser desorption / ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance) mass spectrometer.
  • MALDI-IT matrix-assisted laser-desorption ionization-ion trap
  • MALDI-IT-TOF matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap flight
  • ⁇ -cyano 3-hydroxy is used as a matrix.
  • these compounds are preferably used as a solution.
  • the concentration of the solution is not particularly limited.
  • the solution can be used as a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration.
  • aqueous solution of acetonitrile As a solvent used for preparing such a solvent, it is preferable to use an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA), or an aqueous solution of acetonitrile-trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TFA acetonitrile-trifluoroacetic acid
  • concentration of the acetonitrile is not particularly limited, but may be 90% or less, preferably about 50%.
  • concentration of TFA is not particularly limited, but may be 1% or less, preferably about 0.1%.
  • matrix solution particularly but not limited to for example 1 m g / m I ⁇ saturation concentration, rather preferably has 1 O mg / m I
  • matrix solution particularly but not limited to for example 1 m g / m I ⁇ saturation concentration, rather preferably has 1 O mg / m I
  • 3H4NBA is used as the matrix, it may be dissolved in such a solvent, but is not particularly limited, for example, as a matrix solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably a matrix solution having a saturated concentration. It can be used as a solution.
  • the standard of the amount expressed in% is v / v% unless otherwise specified.
  • Use of the above matrix has the following advantages.
  • the MALDI- ⁇ mass spectrometer and the MALDWT-TOF mass spectrometer, such as the MALDI-FOCR mass spectrometer take the time until the generated ions reach the detector and are measured. Is longer than the normal MALDI-TOF type.
  • the matrix is heated and vaporized by the received laser energy, and a part of that energy becomes internal energy of the sample molecule, which gradually causes self-destruction of ions.
  • the matrix used in the present invention is considered to give less internal energy to the measured molecules during ionization than the matrix in the conventional method (for example, a method in which 4-CHCA is used alone as a matrix). Can be Therefore, as described above, the progress of self-destruction of the generated ions can be suppressed even when used in a mass spectrometer in which the time until the generated ions reach the detector and is measured is long.
  • the present invention is particularly usefully applied to a mass spectrometer such as an ion trap mass spectrometer in which the time from ionization to ion detection is relatively long. Therefore, it is needless to say that it is usefully used in a mass spectrometer having no ion trap.
  • a matrix with high hydrophobicity is suitable for a sample with high hydrophobicity
  • a matrix with high hydrophilicity is suitable for a sample with high hydrophilicity.
  • 3H4NBA is considered to be more hydrophobic than conventional matrices (eg DHB).
  • conventional matrices eg DHB
  • the peptide sample molecules measured in the present invention also have high hydrophobicity, they are considered to have high affinity for 3-CHCA and 3H4NBA as a matrix.
  • the peptide sample and matrix can easily form uniform microcrystals, It is believed that good ionization can be achieved.
  • 3H4NBA 3-hydroxy-14-nitrobenzoic acid
  • 3H4NBA is converted to ⁇ -cyano 4-hydroxycinnamic acid (4-CHCA; the following formula ⁇ - ⁇ )
  • 4-CHCA 4-hydroxycinnamic acid
  • a matrix used alone without using 4-CHCA in combination and a mixed matrix used in combination with 4-CHCA may be simply referred to as a matrix.
  • the ratio of the combination of 3 ⁇ 4 ⁇ and 4-CHCA is not particularly limited, but can be combined in the following quantitative relationship, for example.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ can be prepared at the concentrations already mentioned. That is, as a solution having a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, for example, an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA, or an aqueous solution of acetonitrile-l-TFA, if a certain solution is used, a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, preferably It can be prepared as a 3H4NBA solution at a saturated concentration.
  • 4-CHCA can be prepared at a concentration conventionally used.
  • it can be prepared as a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration.
  • an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA or an aqueous solution of acetate nitrile-TFA is used as a solvent, as in the case of using the above 3H4NBA, a concentration of 1 mg / mI to a saturation concentration, preferably 1 Omg / mI is used. It can be prepared as a 4-CHCA solution.
  • a MALDI-FTICR device such as a MALDI-FTICR device, which has a long time from ionization to ion detection, it has the disadvantage of causing self-destruction of the measurement sample, but has excellent measurement sensitivity.
  • Another advantage is that it is easy to find the best spot to irradiate the laser on the mass spectrometry sample.
  • the matrix 3H4NBA of the present invention has the advantages of suppressing the progress of self-disintegration of the measurement sample and achieving efficient ionization of a hydrophobic sample, as described above. Have. Then, by combining the matrix 3H4NBA of the present invention with 4-CHCA, a synergistic effect of the advantages of both matrices is achieved. In other words, while maintaining the advantages of suppressing the self-destruction of the measurement sample that 3H4NBA alone has and achieving the ionization of the hydrophobic sample, the high sensitivity detection capability of 4-CHCA is further added, and the reanalysis efficiency is further improved. Mass spectrometry can be performed.
  • the range of methods capable of performing sequence identification of hydrophobic peptides has been greatly expanded.
  • MS / MS analysis using a mass spectrometer using ESI (electrospray ionization method) and PSD analysis using a MALDI mass spectrometer were used.
  • CID impact-induced dissociation
  • MS / MS analysis with a MALDI-IT mass spectrometer, MALDI-rr-TOF mass spectrometer, MALDI-F "HCR mass spectrometer, etc. which can cause phenomena.
  • CID can cause fragmentation more efficiently, it has become possible to improve the peptide identification rate
  • An embodiment for carrying out the second invention is described below.
  • a sample to be subjected to mass spectrometry is a mixture containing a specific substance to be measured and other substances.
  • the specific substance to be measured uses a matrix that is more ionized than the other substances.
  • a matrix is used, which mainly ionizes specific substances to be measured and hardly ionizes other substances. (In the following, other substances may be referred to as other substances.)
  • the sample molecules and the matrix are vaporized almost simultaneously.
  • the matrix has the function of assisting ionization of sample molecules and the function of dispersing sample molecules at the molecular level. It is considered that the affinity between the matrix and sample molecules is important for efficient vaporization and ionization of sample molecules. If the affinity between the two is high, the sample molecules are likely to be uniformly dispersed at the molecular level in the matrix, or it is likely to form a uniform mixed crystal.
  • the matrix has a structure that has an affinity for a specific substance
  • the specific substance has a structure that has an affinity for the matrix.
  • the other substance does not have such a structure.
  • the specific substance is specifically ionized by combining the specific substance and the matrix in view of the affinity between them as described above.
  • Specific substances include, but are not particularly limited to, bio-related substances such as proteins, peptides, sugars, and lipids.
  • Other substances for the specific substance are not particularly limited as long as they do not have a structure compatible with the matrix.
  • the specific substance is a biological substance
  • the other substance is a biological substance in the same category as the specific substance except that it does not have the above structure.
  • the specific substance is a peptide
  • the other substance is often a peptide not having the above structure.
  • other substances may include substances and by-products mixed in the process of preparing a specific substance.
  • proteins, peptides, sugars, and lipids also include these modifications.
  • the modified form also includes a chemically modified form.
  • the modified form corresponds to a specific substance
  • the modified form has a group containing a structure that is compatible with the matrix, and the chemically modified form is obtained by chemically modifying with a group having the above structure. It is something that can be done.
  • the specific substance may be labeled with an isotope. Further, in this case, the specific substance may be a mixture of an isotope-labeled substance and a corresponding unlabeled substance.
  • a mixture sample to be subjected to mass spectrometry is a mixture of a labeled peptide and an unlabeled peptide as obtained by the NBS method or the like described in the related art.
  • the labeled peptide is selectively detected as a specific substance.
  • the labeled peptide as a specific substance to be detected is basically labeled with a stable isotope ( 13 C) -labeled compound and an unlabeled compound. It is a mixture with peptides.
  • the labeled peptide can be specifically ionized by using a matrix that mainly ionizes the labeled peptide and hardly ionizes the non-labeled peptide.
  • a matrix that mainly ionizes the labeled peptide and hardly ionizes the non-labeled peptide.
  • the present invention makes use of the affinity between the matrix and the sample molecules.
  • interactions that provide such affinity van der Waals interactions, 7 ⁇ -7 ⁇ electron interactions, hydrophilic interactions, and hydrophobic interactions are used.
  • a substance capable of interacting with the specific substance in the sample is selected as a matrix.
  • the specific substance is a 7-electron-containing compound
  • a 7-electron-containing compound can be selected as a matrix, and the ⁇ -7-electron interaction between the two can be used.
  • the material is a hydrophobic compound
  • the hydrophobic compound can be selected as a matrix, and the hydrophobic interaction between the two can be used.
  • a hydrophilic compound can be selected as a matrix, and the hydrophilic interaction between the two can be used.
  • the particular substance and matrix type to be measured should be selected so that the above-mentioned interactions are combined.
  • the matrix selected in this way either mixes uniformly with the specified substance through the above-mentioned interaction or forms a uniform mixed crystal, giving priority to the specified substance together with its own vaporization and ionization. It is thought that it is possible to vaporize and ionize the material.
  • hydrophobic peptide ⁇ hydrophobic protein refers to a peptide having a relatively high content of a hydrophobic amino acid, particularly a highly hydrophobic amino acid, among the constituent amino acid residues of a peptide ⁇ protein, , And those having undergone the following chemical modification.
  • highly hydrophobic amino acids include tributofan, isoleucine, tyrosine, fenylalanine, leucine, valine, and methionine.
  • alanine, glycine, proline, etc. may be considered as hydrophobic amino acids.
  • the hydrophobic peptide or hydrophobic protein preferably has a benzene ring and / or an aromatic ring other than the benzene ring, and preferably has a double-ended group.
  • the present invention is usefully applied to a hydrophobic peptide or a hydrophobic protein containing a benzene group having a nitro group as a substituent and / or an aromatic ring other than a benzene ring.
  • the hydrophobic peptide or hydrophobic protein more preferably has a nitrobenzenesulfenyl group (NBS group: NQ 2 PhS group (Ph: phenylene group)), a nitrophenyl group, or the like.
  • proteins or peptides containing a nitrotyrosine residue, a ditrophin dinitroalanine residue, a tributophan residue having an NBS group as a substituent, and a cysteine residue having an NBS group as a substituent are examples of proteins or peptides containing a nitrotyrosine residue, a ditrophin dinitroalanine residue, a tributophan residue having an NBS group as a substituent, and a cysteine residue having an NBS group as a substituent.
  • the hydrophobic peptide or hydrophobic protein may be obtained by chemically modifying the corresponding peptide or protein with a hydrophobic compound.
  • the corresponding peptide or protein includes a case where the peptide itself is hydrophobic. That is, the case where the hydrophobic peptide or the hydrophobic protein is derivatized to a more hydrophobic peptide or protein by chemical modification using a hydrophobic compound is also included.
  • the hydrophobic compound include a hydrophobic compound having a benzene ring, an aromatic ring other than the benzene ring, and / or a nitro group.
  • the hydrophobic compound is preferably a sulfenyl compound.
  • the sulfenyl compound is a compound that specifically modifies a peptide or a tributophan residue and a cysteine residue in a protein.
  • a particularly preferred example of the sulfenyl compound is 2-nitrobenzenesulfenyl chloride (NBS reagent). That is, an example of a preferred hydrophobic peptide or hydrophobic protein in the present invention is obtained by chemically modifying a peptide or protein having a tributan residue or cysteine residue with an NBS reagent. Things.
  • the hydrophobic peptide or hydrophobic protein may be obtained by nitrating the corresponding peptide or protein.
  • the corresponding peptide or protein includes a case where the peptide or protein itself is hydrophobic.
  • Another preferred example of the hydrophobic peptide or hydrophobic protein in the present invention is an aromatic electrophilic substitution using a commonly used method for a peptide or protein having a benzene ring and / or an aromatic ring other than a benzene ring. Examples include those obtained by nitrification by reaction.
  • a matrix used together with such a hydrophobic peptide or a hydrophobic protein includes a functional group for transferring charges to and from a specific substance to be measured and a matrix for imparting hydrophobicity to the matrix molecule itself.
  • An aromatic substituent having a functional group is preferred.
  • a benzene substituent is preferred.
  • the functional group for accepting is a functional group for delivering electrons and protons, such as a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a sulfate group, a nitrate group, an aldehyde group, and the like. Is mentioned.
  • Examples of the functional group for imparting hydrophobicity include a nitro group.
  • nitrobenzoic acid derivatives nitrophenol derivatives, and hydroxynitrobenzoic acid derivatives are preferred in the present invention.
  • those selected from 10 aromatic regioisomers of hydroxynitrobenzoic acid (HNBA) are preferred.
  • the matrix of the present invention include: 4-12 troaniline (4NA; the following formula (Bl)), 2,4-dinitroaniline (2,4 DNA; the following formula (B-ll)), 4, 6-dinitroaniline (2B4,6 DNA; the following formula (B-ll)), 4-nitrophenol (4NP; the following formula (B-IV)), 2-nitrotrop; BV)), 2,5-Dinitrophenol (2,5DNP; following formula (B-VI)), 4-nitrobenzoic acid (4NBA; following formula (B-VII)), 3-hydroxy-4-212 Examples thereof include benzoic acid (3H4NBA: the following formula (B-VIII)) and 3-hydroxy-12-nitrobenzoic acid (3H2NBA; the following formula (B-IX)). These structural formulas are shown below.
  • an aqueous solution of acetonitrile As a solvent used for preparing such a solution, it is preferable to use an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA), or an aqueous solution of acetonitrile-trifluoroacetic acid (TFA).
  • the concentration of the acetonitrile is not particularly limited, 90% or less, preferably about 50% can be used.
  • the concentration of TFA is not particularly limited, but may be 1% or less, preferably about 0.1%.
  • 2,4-dinitroaniline, 2-bromo-4,6-dinitroaniline, 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid, 4-nitrobenzoic acid, and 3-hydroxy-14-nitrobenzoic acid By dissolving in a suitable solvent, it can be used as a matrix solution of, for example, but not limited to, 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably 1 mg / ml.
  • 4-dinitroaniline, 4-nitrophenol, 2-nitrophenol, 2,5-dinitrophenol, and 3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid can be particularly dissolved by dissolving in such a solvent.
  • a solvent for example, as a matrix solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably a matrix solution having a saturated concentration.
  • a particularly preferred combination of the specific substance to be measured and the matrix is a combination of a peptide or protein modified with an NBS reagent and an aromatic substituent having a nitro group.
  • the specific substances to be measured and the matrix listed here both have a nitrobenzene structure.
  • the sample is vaporized and ionized almost simultaneously with the matrix, so that in the detection of the sample, the affinity between the sample and the matrix, which is required for uniform mixed crystal formation, is required. It is thought to be involved.
  • the affinity between the sample and the matrix which is required for uniform mixed crystal formation, is required. It is thought to be involved.
  • the specific detection of NBS-modified peptides or proteins using an aromatic substituent having a nitro group as a matrix such a combination of a sample and a matrix depends on the hydrophobic interaction between the two and the ⁇ — In addition to the affinity caused by the ⁇ -electron interaction, the presence of a nitro group is thought to be involved.
  • the present invention is particularly usefully used for a measurement sample which is not subjected to a treatment such as concentration separation. Concentration and separation can sometimes be difficult or inadequate, and can lead to an increase in the number of processing steps up to measurement, resulting in an increase in sample loss, and an increase in time and cost.
  • the method of the present invention can be said to be a very simple and inexpensive method. Needless to say, the method of the present invention capable of performing specific detection with high sensitivity is also usefully applied to a measurement sample that has been subjected to a treatment such as concentration separation.
  • the mixed matrix of the present invention is a mixture of the above-described matrix and Qi-cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-CHCA; the following formula (BX)).
  • 4- cyanoic acid is a matrix that has been widely and generally used for measuring peptides. (Hereinafter, in the present specification, a matrix that is used alone without using 4-CHCA in combination and a mixed matrix that uses 4-CHCA in combination may be simply referred to as a matrix.)
  • the matrix can be prepared in the amounts described above. sand That is, it can be prepared as a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration.
  • a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration For example, 2,4-dinitroproline, 2-bromo-1,6-dinitroaniline, 3-hydroxy4-nitrobenzoic acid, 4-nitrobenzoic acid, and 3-hydroxy-4--2-
  • the oral benzoic acid can be prepared as a matrix solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably a saturated concentration.
  • 412-nitroaniline, 4-nitrophenol, 2-nitrophenol, 2,5-dinitrophenol, and 3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid can be obtained by using the above aqueous solution as a solvent. It can be prepared as a matrix solution from mg / ml to a saturation concentration, preferably 1 O mg / ml.
  • 4-CHCA can be prepared as a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration.
  • an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA, or an aqueous solution of acetonitrile-TFA is used as a solvent, the same as when used as the above matrix, 4-CHCA of 1 mg / mI to saturation concentration, preferably 1 Omg / mI. It can be prepared as a solution.
  • Both solutions prepared as described above are preferably mixed and used in a volume ratio of 1:10 to 10: 1, more preferably 1: 3 to 3: 1, for example, 1: 1.
  • the conventional matrix 4-CHCA cannot always specifically detect a specific substance in, for example, mass spectrometry of a measurement sample that has not been concentrated. However, it has the advantages of excellent measurement sensitivity and the ability to easily find the optimum spot on the mass spectrometry sample to be irradiated with a laser.
  • a target substance can be selectively detected.
  • the present invention is particularly useful when the target NBS-labeled peptide is detected from a mixed sample containing a labeled peptide and an unlabeled peptide in the above-mentioned NBS method.
  • the target NBS-labeled peptide is detected from a mixed sample containing a labeled peptide and an unlabeled peptide in the above-mentioned NBS method.
  • a pair peak derived from the peptide is specifically detected.
  • the present invention it is possible to easily recognize a protein contained only in one of the original sample to be analyzed and the control sample.
  • a protein contained in only one of them can be recognized as follows.
  • the samples for mass spectrometry obtained by performing the step (5) immediately above include labeled peptides derived from proteins contained in both the protein samples I and II to be analyzed (each of them). A and A ') and a labeled peptide derived from a protein contained in either one (B).
  • the sample for mass spectrometry further includes unlabeled peptide (referred to as C) which was not removed if insufficiently concentrated.
  • a and A ' are detected as paired peaks, but the B and C peptides are detected as single peaks and labeled with B and C. ⁇ Distinction of non-labeling is difficult.
  • the matrix in the present invention the labeled A, A 'and B are detected preferentially, and C is hardly detected.
  • the paired peaks are labeled peptides A and A 'derived from the proteins contained in both samples, and the single peak is contained in one of the samples. This indicates that the protein is labeled peptide B derived from the protein.
  • B which was also detected by mass spectrometry using the matrix of the present invention, was detected as a single peak, and the protein B contained in only one of the samples was included.
  • C which is a labeled peptide derived from quality and rarely detected, can be distinguished as an unlabeled peptide.
  • the method of the present invention comprises a sample preparation step (i), a solubilization step (ii), a labeling step (iii), a desalting step (iv), a re-solubilizing step (v), a reductive 'alkylation step (vi ), Digestion step (vii), concentration separation step (viii), and mass spectrometry step (xi).
  • protein sample I to analyze protein sample I protein sample II It can be a sample containing a control protein of the included protein. More specifically, the protein sample I to be analyzed can be a pathological sample protein sample, and the control protein sample 11 can be a normal sample protein sample.
  • quantitative analysis of the expression proteome between the protein sample I and the protein sample II is performed.
  • a protein sample having a relatively low molecular weight such as a peptide is also included as a protein sample.
  • This step is performed separately for protein sample I and protein sample II under the same conditions.
  • the protein sample is solubilized using urea or guanidine hydrochloride as a denaturant.
  • concentration of the denaturing agent is not particularly limited, and may be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of protein sample, other conditions, and the like so that solubilization and denaturation of the protein sample occur.
  • urea can be used in an aqueous solution having a concentration of 2M to saturation concentration, preferably 2 to 10M. More preferably, it is used at a concentration of 8M.
  • Guanidine hydrochloride can be used as an aqueous solution having a concentration of 1.5 M to a saturation concentration, preferably 1.5 to 8 M. More preferably, it is used at a concentration of 6M.
  • the denaturant can be used together with about 5 mM EDTA.
  • the above-mentioned denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 yg of the protein sample.
  • a preferred amount is about 25 ⁇ .
  • the concentration of the denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 yg of the protein sample.
  • a preferred amount is about 25 ⁇ .
  • the concentration of the denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 yg of the protein sample.
  • a preferred amount is about 25 ⁇ .
  • the concentration of the denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 yg of the protein sample.
  • a preferred amount is about 25 ⁇ .
  • the concentration of the denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 yg of the protein sample.
  • a preferred amount is about 25 ⁇ .
  • the concentration of the denaturing agent can be used so that the concentration is 5 to 50 ⁇ M per 100 y
  • the temperature for solubilization is 0 to 30 ° C., preferably about room temperature.
  • the temperature is 0 to 100 ° C., preferably about room temperature.
  • the protein sample is solubilized as described above, labeled reagents two types, or isotopically labeled 2-nitro [13 C 6] benzene sul Fuenirukurorido (NBSCI (heavy))
  • NSSCI Bok port
  • benzene sulphates We sulfonyl chloride Li de (NBSCI (light)).
  • tributophan residues in a protein are selectively modified, that is, labeled.
  • protein sample I (NBSCI (heavy)) and
  • the labeling reagent is preferably used as an acetic acid solution.
  • it can be used as a solution obtained by dissolving 0.17 mg of 2-nitrobenzenesulfenyl chloride in 25 ⁇ l of acetic acid.
  • Such a labeling reagent can be used in a large excess of about 20 equivalents of the protein sample.
  • it is preferable to use the solution so that the amount of 2-nitrobenzenesulfenyl chloride in the solution is 0.17 mg per 100 g of the protein sample.
  • tryptophan residues in protein samples will be labeled as close to 100 O / O as possible.
  • the labeling reaction can be performed by adding a labeling reagent to a protein sample and incubating the sample.
  • a reaction time of about 4 hours is sufficient. That is, the reaction may be terminated within 4 hours immediately after the start of the reaction.
  • the reaction time should be 1 hour.
  • the labeling reaction time is significantly reduced as compared with the conventional NBS method. For this reason, it is possible to reduce the total working time of the entire protocol from 3 days to 2 days.
  • the labeled protein sample I and the labeled protein sample II obtained in the above step (iii) are mixed. Then, the obtained protein sample mixture is desalted.
  • a desalting method a conventional method can be used without particular limitation. For example, using a Sephax LH-20 column and an aqueous solution of acetonitrile may be used.
  • the desalted protein sample mixture obtained in the above step (iv) is resolubilized using urea or guanidine hydrochloride as a denaturant.
  • concentration of the denaturing agent is not particularly limited, and may be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of the protein sample, other conditions, and the like so that solubilization and denaturation of the protein sample occur.
  • urea can be used in an aqueous solution having a concentration of 2M to saturation concentration, preferably 2 to 10M. More preferably, it is used at a concentration of 8M.
  • Guanidine hydrochloride can be used in an aqueous solution of 1.5M to saturation concentration, preferably 1.5 to 8M. Preferably, use at a concentration of 6M.
  • about 5 O mM of Tris HCI (about PH8.8) is further added as a buffer, and used for pH adjustment in the subsequent reductive alkylation step.
  • trypsin digestion is performed.
  • This step is performed in the presence of urea or guanidine hydrochloride as a denaturant.
  • concentration of the denaturing agent urea can be used in a concentration of 0.08 to 4 M, preferably 0.8 M to 1.6 M.
  • the guanidine hydrochloride can be in the range of 0.03 to 3M, preferably 0.6M.
  • the residue in the sample of the one used in the re-solubilizing step can be used.
  • a tribcine digestion buffer to the sample after completion of the re-solubilization step and the reduction-alkylation step, so as to obtain a desired concentration.
  • the pH is adjusted to be near the optimal pH of the trypsin enzyme.
  • the reaction time is usually about 4 to 16 hours at 37 ° C. In this way, a peptide mixture containing a labeled peptide fragment and an unlabeled peptide fragment is obtained.
  • the labeled peptide is selectively concentrated from the peptide mixture by using a carrier having a phenyl group.
  • This process utilizes the inherent selectivity resulting from the 7 ⁇ —7 ⁇ electron interaction acting between ⁇ -electron compounds. In other words, the interaction between the 7-electron of the indole group and nitrophenylthio group of tryptophan in the labeled peptide and the ⁇ -electron of the phenyl group in the carrier allows the carrier to have an excellent ability to retain the labeled peptide. It can be used for selective concentration separation.
  • Such a carrier examples include Hi-Trap phenyl FF, Hi-Trap phenyl HP, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, (above, manufactured by Amersham Bioscience), and YMC * GEL Ph (manufactured by YJMS). Select as appropriate and use it as a phenyl column can do.
  • the labeled peptide concentrated and separated in the above step (viii) is subjected to mass spectrometry.
  • a MALDI mass spectrometer for the measurement in the present invention, in addition to the MALDI-TOF mass spectrometer (for example, AXIMA-CFR manufactured by Shimadzu Corporation) used in the conventional NBS method, MAIDI-IT -A TOF mass spectrometer (for example, AXIMA-QH "manufactured by Shimadzu Corporation) is also used.
  • 4-CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • the matrix is 3-CHCA (a-cyano-3-hydroxycinnamic acid) or 3H4NBA (3-hydroxy- 4-nitrobenzoic acid;
  • these compounds are preferably used as a solution.
  • it can be used as a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration.
  • Solvents used for preparing such a solution include an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA), or acetonitrile-trifluoroacetic acid.
  • an aqueous solution of (TFA) it is preferable to use an aqueous solution of (TFA).
  • the concentration of the acetonitrile is not particularly limited, but may be 90% or less, preferably about 50%.
  • the concentration of TFA is not particularly limited, but may be 1% or less, preferably about 0.1%.
  • It can be used as a matrix solution having a concentration of I to saturation concentration, preferably 1 O mg / ml.
  • 3-CHCA By dissolving 3-CHCA in such a solvent, it can be used as a matrix solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturation concentration, preferably 1 Omg / ml.
  • 3H4NBA By dissolving 3H4NBA in such a solvent, 3H4NBA can be used as a matrix solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably a matrix solution having a saturated concentration.
  • the quadrupole ion trap In order to identify peptide sequences that differ in abundance between samples, from the viewpoint of sensitivity, the quadrupole ion trap (QIT) is more expensive than the PSD analysis of AXIMA-CFR (manufactured by Shimadzu Corporation). MS / MS analysis using a mass spectrometer such as AXIMA-QH "(manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a) is preferable. In the measurement of such an ion trap type mass spectrometer, DHB (2, 5 —Dihydroxybenzoic acid: 2,5-dihydroxybenzoic acid) was used as the matrix, however, when DHB was used as the matrix, almost no NBS-labeled peptide was detected.
  • 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid 3H4NBA
  • 3H4NBA 3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid
  • 4-CHCA -cyano 4-hydroxycinnamic acid
  • a matrix used alone without using 4-CHCA in combination and a mixed matrix used in combination with 4-CHCA may be simply referred to as a matrix.
  • the ratio of the combination of 3H4NBA and 4-CHCA is not particularly limited, but, for example, can be combined in the following quantitative relations.
  • 3H4NBA can be prepared in the amounts described above. That is, when a solution having a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, for example, an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA or an aqueous solution of acetonitrile-TFA is used as a solvent, a solution of 1 mg / mI to a saturated concentration, preferably a saturated concentration of 3H4NBA is used. It can be prepared as a solution.
  • a solution having a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration for example, an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA or an aqueous solution of acetonitrile-TFA is used as a solvent
  • a solution of 1 mg / mI to a saturated concentration preferably a saturated concentration of 3H4NBA is used. It can be prepared as a solution.
  • 4-CHCA can also be prepared in the amounts described above. That is, when an aqueous solution of acetonitrile, an aqueous solution of TFA or an aqueous solution of acetonitrile-TFA is used as a solvent having a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, 1 mg / mI to a saturated concentration, preferably 1 Omg / ml. It can be prepared as a solution of mI in 4-CHCA.
  • Both solutions prepared as described above are preferably mixed and used in a volume ratio of 1:10 to 10 : 1, more preferably 1: 3 to 3: 1, for example, 1: 1.
  • the traditional Matrix 4-CHCA is MALDI-, MALD-TOF,
  • a MALDI-FTICR device such as a MALDI-FTICR device, which has a long time from ionization to ion detection, it has the disadvantage of causing self-destruction of the measurement sample, but has excellent measurement sensitivity.
  • the optimal scanning method for It has the advantage that it is easy to find a pot.
  • the matrix 3H4NBA of the present invention can suppress the progress of self-disintegration of the measurement sample, as described above, and at the same time, can prevent the hydrophobic sample, particularly the NBS-labeled peptide from being specifically ionized. It has the advantage that it can be achieved. Then, by combining with the matrix 3H4NBA force 4-CHCA of the present invention, a synergistic effect of the advantages of both matrices is achieved. In other words, while the specific detection ability of 3H4NBA alone is secured, the high sensitivity detection ability of 4-CHCA further accompanies the mass spectrometry with higher analysis efficiency. Examples in which such effects were actually shown are shown in Experimental Examples C-18 and C-19 described later.
  • NBS reagent (heavy) solution acetic acid solution containing 0.17 mg of NBSCI (heavy)
  • step 5 Repeat step 5 while increasing the concentration of acetate nitrile by 5% until it reaches 40%.
  • hydrochloric acid may be used instead of the 0.1% TFA aqueous solution used in the concentration of the labeled peptide.
  • concentration of hydrochloric acid should be adjusted to 10 mM.
  • the sample may be used as is for MS analysis, or may be further fractionated using HPLC or the like.
  • MALDI-MS measurement mix the sample with the matrix solution and perform MS measurement.
  • the present invention provides a kit comprising 2-nitro [ 13 C 6 ] benzenesulfenyl chloride, 2-nitro [ 12 C 6 ] benzenesulfenyl chloride, and a carrier having a phenyl group.
  • the carrier having a phenyl group can be used for carrying out the concentration separation step (viii).
  • kit of the present invention can be used for performing comprehensive quantitative analysis of proteins, for example, for performing the above-mentioned protocol.
  • the kit of the present invention comprises 2-nitro [ 13 C 6 :] benzenesulfenyl chloride which is a labeling reagent for performing the labeling step (iii).
  • NBSCI no; NBS (heavy) reagent
  • NBSCI 2-nitro [ 12 C 6 ] benzenesulfenyl chloride
  • the kit of the present invention may include various solvents used in the above-described method of the present invention.
  • the denaturant can be used to perform the solubilizing step ( ⁇ ) and the re-solubilizing step (V). Therefore, as the denaturing agent, urea or guanidine hydrochloride as described in the solubilizing step ( ⁇ ) and the re-solubilizing step (V) are preferable.
  • the denaturing agent may be dissolved in a solvent as described in the solubilizing step ( ⁇ ) and the re-solubilizing step (V).
  • the modifier is guanidine hydrochloride, it can be provided as a solution dissolved in a solvent.
  • an aqueous solution of guanidine hydrochloride having a concentration of 1.5% to saturation concentration, preferably 1.5 to 8%, and more preferably 6% can be obtained.
  • the aqueous urea solution can have a concentration of 2 ⁇ to saturation concentration, preferably 2 ⁇ 10 ⁇ , and more preferably 8 ⁇ .
  • the matrix can be used to perform the mass spectrometry step (ix). Therefore, as the matrix, 4-CHCA ( ⁇ -cyano 4-hydroxycinnamic acid), 3-CHCA ( ⁇ -cyano 3-hydroxycinnamic acid), and 3 ⁇ 4 ⁇ (3 —Hydroxy-412-benzoic acid). Also, a set of 3 ⁇ ⁇ ⁇ 4 ⁇ and 4-CHCA for use as a mixed matrix is preferable. .
  • matrices and auxiliary matrices may be dissolved in a solvent as described in the mass spectrometry step (ix).
  • a solution having a concentration of 1 mg / ml to a saturated concentration can be used.
  • the concentration of monocyano-3-hydroxycinnamic acid is from 1 m / m I to a saturation concentration, preferably 0.1 mg / m I
  • 3-hydroxy- 4-Nitrobenzoic acid has a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, preferably a saturated concentration
  • 1-cyano-1-hydroxyxycinnamic acid has a concentration of 1 mg / mI to a saturated concentration, preferably 1 Omg / mI. Solution.
  • 3-hydroxy-14 Preferably, the solution of benzoic acid and the solution of mono-
  • the kit of the present invention may further include a column for packing a desalting column and a gel packed with a desalting column, a reducing reagent and an alkylating reagent, trypsin, and the above-mentioned carrier having a fluorine group.
  • the desalting column and the gel packed with the desalting column can be used, for example, for performing the desalting step (iv) described above.
  • the reducing reagent and the alkylating reagent can be used, for example, to carry out the above-mentioned reduction-alkylation step (vi). Trypsin 'can be used, for example, for performing the digestion step (vii).
  • the column packed with the carrier having a phenyl group can be used, for example, for the concentration and separation step (viii). That is, a column filled with the carrier having a phenyl group can be used as a concentration column, and a carrier having a phenol group can be used as a gel packed with a column for concentration.
  • the above-mentioned exhaustive quantitative analysis of the protein of the present invention can be performed, and therefore, the following effects as already described in the method of the present invention can be obtained.
  • NBS-labeled peptide a peptide modified with an NBS (heavy) reagent labeled with six stable isotopes 13 C
  • a peptide modified with an unlabeled NBS (light) reagent was used.
  • Mixture was used as a measurement sample, and the matrix of the present invention, 3-CHCA ( ⁇ -cyano 3-hydroxygaynamic acid, formula ⁇ - ⁇ ) and 3 ⁇ 4 ⁇ (3-hydroxy-4-212 benzoic acid, formula ⁇ - ⁇ )
  • the measurement was performed with a mass spectrometer using a conventional matrix DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid, formula A-IV) for comparison.
  • the sample was freeze-dried, suspended in 500 ⁇ of a 0.1% aqueous trifluoroacetic acid (TFA) solution, and loaded on a HiTrap Phenyl FF (high sub) column (Amersham Bioscience) equilibrated with a 0.1% TFA aqueous solution. .
  • the column was washed with 3 ml of 0.1% TFA aqueous solution and then eluted with 1 ml of 0.1% TFA aqueous solution containing 10% acetonitrile. Subsequently, the acetonitrile concentration of the TFA aqueous solution used for elution was changed to 15, 20, 25, 30, 35, and 40% in order, and elution was performed in the same manner.
  • 3-CHCA of the present invention (—cyano-3-hydroxycinnamic acid, formula AI) and 3H4NBA (3-hydroxy-4,2-benzobenzoic acid, formula A-ll), and for comparison, conventional Three types of matrix DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid, formula A-IV) were prepared.
  • the matrix used was prepared as follows. Using a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA as the solvent, add 3-CHCA, 3H4NBA and DHB Each was dissolved. DHB and 3-CHCA were each a 10 mg / ml solution, and 3H4NBA was a saturated solution.
  • the solution of the measurement sample and the solution of the matrix obtained as described above were mixed at 0.5 ⁇ 0.5 each, and dropped on a mass plate. After the solution was dried, measurement was performed using an AXIMA-QIT device (MALDI-IT-TOF mass spectrometer, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • FIG. 1 The MS spectrum of the AXIMA-QH "instrument is shown in Fig. 1.
  • the horizontal axis represents the mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of the ions.
  • Spectrum of NBS-modified peptide when used for matrix (b) Spectrum of NBS-modified peptide when 3-CHCA was used for matrix, (C) 3H4NBA for matrix
  • (N, (N) and (iii) show the paired peaks of the peptide modified with NBS. Each paired peak shows two labeling reagents.
  • Fig. 2 shows the fragment spectrum obtained by MS / MS analysis after selectively trapping the ion (GTDVQAWIR) corresponding to the pair peak (1198.53 m / z in Fig. 1).
  • the horizontal axis shows the mass / charge, and the vertical axis shows the relative intensity of ions.
  • mixed matrix of the present invention i.e. 3H4NBA (3- hydro carboxy - 4 twelve Toro benzoic acid of formula A-II) and Measurements were performed with a mass spectrometer using a mixture with the conventional matrix 4-CHCA (cyano 4-hydroxycaetic acid, formula A-III).
  • the matrix used was prepared as follows. Using a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA as a solvent, 3H4NBA and 4-CHCA were dissolved respectively. 3H4NBA was a saturated solution, and 4-CHCA was a 10 mg / ml solution. The solutions thus prepared were mixed at a volume ratio of 1: 1 to obtain a matrix mixed solution. Add 0.5 ⁇ of the matrix mixed solution onto the prepared mass plate on which the measurement sample has been applied, dry it, and then dry it.
  • the horizontal axis represents the mass charge (m / z)
  • the vertical axis represents the relative intensity of the ions (% lnt.).
  • (A-1) is a spectrum obtained by measuring with an AXIMA-Qrr having an ion trap
  • (a-2) is a spectrum obtained by measuring with an AXIMA-CFR plus without an ion trap. It is an obtained spectrum.
  • the peak pairs marked with arrows indicate that the peptides are BS-modified peptides.
  • the same measurement sample as in the above (a) was diluted 1000-fold with a 0.1% TFA aqueous solution, and 0.5 ⁇ of the diluted sample was applied on a mass plate.
  • a matrix used alone with 3 ⁇ 4 ⁇ and a mixed matrix of 3 ⁇ 4 ⁇ with 4-CHCA were used.
  • a mixed matrix of 3H4NBA and 4-CHCA was prepared in the same manner as in (a) above.
  • a 3H4NBA solution and a mixed solution of 3H4NBA and 4-CHCA are added to a mass plate on which a measurement sample has been prepared in advance, and the mixture is dried. After drying, a MALDI-TOF mass spectrometer (AXIMA- (CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the horizontal axis represents mass charge (m / z)
  • the vertical axis represents the relative intensity (%) of ions.
  • (B-1) is a spectrum obtained by using a mixture of 3H4NBA and 4-CHCA as a matrix
  • (b-2) is a spectrum obtained by using 3H4NBA as a matrix.
  • Vector is a spectrum obtained by using 3H4NBA as a matrix.
  • the peak pairs marked by arrows indicate that the peptides are those of NBS-modified peptides.
  • Each paired peak is composed of two labeling reagents, NBS Reagent (heavy) (2-two-port [ 13 C 6 ] benzenesulfenyl chloride) and NBS Reagent (light) (2-nitro).
  • the feature of 3H4NBA is that it can suppress the self-destruction of the sample even when measured with an ion trap-type MALDI mass spectrometer, which takes a relatively long time from ionization to ion detection.
  • -It was confirmed that the feature of CHCA was that it was possible to simultaneously perform "highly sensitive measurement" in the j-state where the optimum spot for laser irradiation can be easily searched.
  • Examples A-1 and A-2 two specific embodiments within the scope of the present invention have been described. However, the present invention is not limited to these, and may be implemented in other various embodiments. it can. Therefore, the above-described embodiment is merely an example in every aspect, and should not be interpreted in a limited manner.
  • ACTH (5-10) peptide purchased from BACHEM Inc.
  • NBS Reagent light
  • the matrix 3H4NBA of the present invention (3-hydroxy-4,2-nitrobenzoic acid) and 4H3NBA (4-hydroxy-13-nitrobenzoic acid)
  • the measurement was carried out with a mass spectrometer using DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid) and 4-CHCA (Hycyan-1-hydroxycinnamic acid) as conventional matrices for comparison.
  • Peptide labeling was performed by reacting 10 pg of ACTH in a reagent solution obtained by adding 20 equivalents of NBS Reagent (light) to 50 ⁇ l of a 70% aqueous acetic acid solution for 1 hour. After the reaction, desalting was performed using ZipTip (yC18) to obtain a labeled sample. On the other hand, ACTH lOpg was stirred for 1 hour in a 50 ⁇ 70% acetic acid aqueous solution without NBS Reagent (light), and desalted as in the above, to obtain an unlabeled sample. . Equal amounts of the obtained labeled sample and unlabeled sample were mixed to prepare a sample for mass spectrometry.
  • a matrix As a matrix, two types of isomers of DHB, 4-CHCA, and HNBA, that is, four types of 3H4NBA and 4H3NBA were prepared. These matrices were dissolved in a 50% aqueous solution of acetonitrile I containing 0.1% TFA, and 4-CHCA, DHB and 4H3NBA were used at 10 mg / ml, and 3H4NBA was used as a saturated solution.
  • Fig. 4 shows the spectrum obtained at this time.
  • the horizontal axis represents mass charge (Mass / Charge)
  • the vertical axis represents the relative intensity of ions (hereinafter, in all figures, the horizontal axis represents mass charge (Mass / Charge; m), and the vertical axis represents the relative ion Represents intensity).
  • A) is the spectrum when DHB is used for the matrix
  • (b) is the spectrum when 4-CHCA is used for the matrix
  • C) is the spectrum when 3H4NBA is used for the matrix.
  • D) is a spectrum when 4H3NBA is used for the matrix.
  • the thick arrow indicates the position of the NBS-labeled ACTH peptide, ie, the target peptide
  • the thin arrow indicates the position of the unlabeled ACTH peptide peak.
  • a mixture of a labeled and modified protein and an unlabeled and modified protein was used as a measurement sample, and mass spectrometry was performed using the matrix 3H4NBA of the present invention and the conventional matrix 4-CHCA for comparison. The measurement was performed with the device.
  • Example I-8 was lyophilized and desalted those resuspended in 0.1% TFA aqueous solution of 50 Myuiota in ⁇ ⁇ (Myu_ ⁇ _I8). This was used as a measurement sample, and the same 4-CHCA solution and 3-4% solution as in Example I-1 were used as a matrix, and measurement was performed with a mass spectrometer in the same manner as in Example I-1.
  • FIG. 5 shows the spectrum obtained at this time.
  • (a) shows the spectrum when 4-CHCA is used for the matrix
  • (b) shows the spectrum when 3H4NBA is used for the matrix.
  • DSIP peptide delta sleep-inducing peptide (manufactured by Peptide Laboratories); 500 fmol) and DSIP peptide (500 fmol) labeled with BS Reagent (light) was used as a measurement sample.
  • the measurement was performed with a mass spectrometer using the matrix 3H4NBA of the present invention and the conventional matrix 4-CHCA for comparison.
  • Example B-1 Labeling was performed in the same manner as in Example B-1, except that the DSIP peptide was used as a sample for labeling, and a measurement sample was obtained.
  • measurement was carried out with a mass spectrometer in the same manner as in Example B-1.
  • Figure 6 shows the spectrum obtained at this time. In FIG. 6, (a) shows the spectrum when 4-CHCA is used for the matrix, and (b) shows the spectrum when 3H4NBA is used for the matrix.
  • lysozyme (Lysozyme) was reduced and alkylated, and further distillated, and then digested with trypsin.
  • the digest thus obtained was used as a measurement sample, and the measurement was performed using a matrix 3H4NBA of the present invention and a conventional matrix 4-CHCA for comparison using a mass spectrometer.
  • Lysozyme 1 mg was reduced and alkylated according to a standard method.
  • nitration was performed using tetranitromethane according to the method described in Riordan J.F. et al., 1966; Sokolovsky M. et al., 1966.
  • trypsin was added according to a standard method to digest the peptide fragment.
  • An equivalent of 14 yg of the obtained digest was collected and freeze-dried. This was redissolved in 50 ⁇ of a 0.10 / 0 TFA aqueous solution, and then desalted using ZipTip ⁇ .018. The digest obtained in this manner was used as a measurement sample.
  • tyrosine residues of the peptide fragment were ditrotized. That is, it is a mixture of a peptide fragment containing nitrotyrosine, a peptide fragment containing non-nitro-tyrosine, and a peptide fragment containing no tyrosine.
  • the measurement was carried out with a mass spectrometer using 3H4NBA and a conventional matrix CHCA for comparison.
  • the peptide IRRP1 (Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp (SEQ ID NO: 11); purchased from BACHEM) 10 was dispensed using a 50% aqueous acetonitrile solution containing 0.1% TFA. Lyophilized. This was dissolved in 15 ⁇ of Milli-Q water (Millipore), mixed with 35 ⁇ of NBS reagent solution (0.17 mg of NBS reagent dissolved in 35 ⁇ of acetic acid), and reacted at room temperature for 1 hour. I let it. This was desalted using ZipTip- c18 and used as a labeled peptide sample.
  • Equal amounts of the labeled peptide sample and the unlabeled peptide sample were mixed to obtain a measurement sample.
  • a peptide containing P-nitroph: t-dialanine was used as a measurement sample, and the measurement was performed with a mass spectrometer using the matrix 3H4NBA of the present invention and a conventional matrix 4-CHCA for comparison. went.
  • the method for preparing the measurement sample is described below. Two kinds of measurement samples with different concentrations were prepared.
  • Example B-1 The same procedure as in Example B-1 was followed, except that purification by chromatography using a C18 column (YMC-Pack Pro C18; manufactured by YMC) was performed instead of desalting treatment with ZipTipM- G18.
  • Labeled ACTH was prepared. Mix the labeled peptide sample and the unlabeled peptide sample (unlabeled ACTH) in equimolar amounts, and adjust the concentration to 0.10 / oTFA so that the respective concentrations are 0.5 pmol / ⁇ or 5 pmol / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . was obtained by dissolving in a 50% aqueous solution of acetonitrile containing
  • the matrices include 2,4 DNA, 2B4,6 DNA, 4NA, 4NBA, 2NP, and 2.5DNP (4NA was purchased from SIGMA and all others were purchased from ALDRICH) were dissolved in a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • 4NA, 2NP, and 2,5DNP 10 mg / ml was used, and for 2,4DNA, 2B4,6DNA, and 4NBA, a saturated solution was used.
  • the conventional 4-CHCA for comparison used was 10 mg / ml.
  • Fig. 11 (a) is a spectrum measured using 4-CHCA as a matrix, (b) is a spectrum measured using 2,4 DNA as a matrix, and (c) is a matrix. Is a spectrum measured using 2B4,6 DNA. These spectra are those of measurement samples in which the concentration of the labeled peptide and the concentration of the unlabeled peptide were each adjusted to 0.5 pmol / ⁇ .
  • Fig. 12 shows the spectrum measured using 4-CHCA as the matrix, (b) shows the spectrum measured using 4NA as the matrix, and (c) shows the spectrum measured using 4NBA as the matrix.
  • D is a spectrum measured using 2NP as a matrix, and (e) is a spectrum measured using 2,5DNP as a matrix.
  • a mixture of a peptide modified with an NBS reagent and an unmodified peptide was used as a measurement sample, and a matrix of the present invention, a mixed matrix of 4-CHCA and 3H4NBA, 4-CHCA and 3H2NBA (3-Hydroxy-2-nitrobenzoic acid), Matrix of 4-CHCA and 2,4 DNA, Matrix of 4-CHCA and 4NA, 4-CHCA and 4NP (4-nitrophenol) ), And a matrix using only 3H4NBA alone and a conventional matrix 4-CHCA for comparison were measured with a mass spectrometer.
  • the digested sample was desalted with ZipTipp-C18 and eluted with a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • the obtained eluate was used as a measurement sample.
  • the eluate was diluted 10-fold with a 50% aqueous solution of acetate nitrile containing 0.1% TFA, and 0.5 ⁇ of the diluted solution was applied on a mass plate.
  • the matrix used was prepared as follows. Using a 500/0 acetate nitrile aqueous solution containing 0.1% TFA as a solvent, 4-CHCA, 3H4NBA, 3H2NBA, 2,4DNA, 4NA, and 4NP were respectively dissolved. 4-CHCA, 3H2NBA, 4NA, and 4NP was a 10 mg / ml solution, and 3H4NBA and 2,4 DNA were each a saturated solution.
  • the solutions thus prepared were mixed and used at a volume ratio of 1: 1.
  • the solutions prepared in this way were used as they were.
  • FIG. 13 shows the mixed matrix of 4-CHCA and 3H4NBA (+ 3H4NBA), (b) shows the mixed matrix of 4-CHCA and 3H2NBA (+ 3H2NBA), and (C) shows the 4-CHCA (D) is the mixed matrix of 4-CHCA and 4NA (+ 4NA), and (e) is the mixed matrix of 4-CHCA and 4NP (+2,4 DNA).
  • (f) is a spectrum measured using a conventional matrix 4-CHCA for comparison
  • (g) is a spectrum measured using a matrix using 3H4NBA alone. Further, the peak pair indicated by the black arrow indicates that the peak pair is of the target NBS-modified peptide.
  • the detection sensitivity of the target peak is better than when 3H4NBA is used alone as in (g).
  • (a) to (e) using the mixed matrix in the matrix of the present invention correspond to the target substance which is achieved when a single compound is used in the matrix of the present invention as in (g).
  • the detection sensitivity is improved to the same degree as 4-CHCA, which has been used conventionally. It can be said that this is a preferable measurement condition.
  • Examples B-1 to B-8 eight specific embodiments within the scope of the present invention have been described. However, the present invention can be implemented in other various embodiments without being limited thereto. .
  • samples (S) Two types were prepared.
  • One of the samples (S) was prepared as follows. That is, 100 g of the same protein mixture as the sample (C) described above was solubilized in a 0.1 w / v% SDS aqueous solution containing 5 mM EDTA as in the conventional NBS protocol, and then heated at 100 ° C for 3 minutes. It was obtained by performing labeling using a (light) reagent and desalting using an LH-20 column.
  • the solubilization described in this experimental example and the following experimental examples is a different step from the solubilization generally performed for preparing a sample for SDS-PAGE.
  • the other sample (S) was prepared as follows. Perform the same SDS solubilization on 100 pg of the same protein mixture as sample (C), Labeling was performed using NBS (light) reagent. Separately, the same SDS solubilization was performed on 100 yg of the same protein mixture as sample (C), and labeling was performed using an NBS (heavy) reagent equivalent to the NBS (light) reagent described above. Was. Then, the obtained NBS (light) -labeled product and NBS (heavy) -labeled product were mixed, and desalted using an LH-20 column.
  • the samples (C), (S), (G), and (U) obtained as described above were subjected to electrophoresis, and the amount corresponding to 10 pg of the sample (C) was applied to lane 1. On the other hand, for each of the samples (S), (G) and (U), the amount corresponding to 1/20 of the sample was developed (lanes 2 to 7).
  • lane 1 is a control sample (C); lane 2 is a sample containing only NBS (light) labeled protein (S); lane 3 is a sample containing only NBS (light) labeled protein); lane 4 is a sample containing only NBS (light) labeled protein (U); Lane 5 is a sample obtained by mixing equal amounts of NBS (light) labeled protein and NBS (heavy) labeled protein (S); Lane 6 is Sample (G) in which equal amounts of NBS (light) -labeled protein and NBS (heavy) -labeled protein were mixed; Lane 7 shows equal mixing of NBS (light) -labeled protein and NBS (heavy) -labeled protein This is for the sample (U).
  • mice (C57BL) serum 100 g was used as a control sample (C).
  • samples (S) Two types were prepared.
  • One of the samples (S) was prepared as follows. That is, 100 ⁇ 9 of the same mouse serum as the sample (C) described above was solubilized in a 0.1 w / v% SDS aqueous solution containing 0.5 mM EDTA as in the conventional NBS protocol, and then heated at 100 ° C. for 3 minutes. Labeling was performed using the (light) reagent.
  • 100 yg of the same mouse serum as that of the sample (C) was solubilized in SDS in the same manner as described above, and labeled using an NBS (heavy) reagent equivalent to the NBS (light) reagent described above. Then, the obtained NBS (light) labeled product and NBS (heavy) labeled product were mixed to obtain a labeled mixture.
  • the other sample (S) was prepared as follows. That is, a labeled mixture was prepared for 100 pg of mouse serum in the same manner as described above, and further desalted using an LH-20 column.
  • the obtained samples (C), (S), (U) and (G) were subjected to electrophoresis.
  • sample (C) the amount corresponding to 10 yg was developed in lane 2, and the amount equivalent to 2 pg was developed in lane 3.
  • samples (S), (U) and (G) the amount corresponding to 1/20 of that was developed (lanes 4 to 9).
  • lane 1 is molecular weight marker 1
  • lanes 2 and 3 are control samples (C); lane 4 is labeled sample
  • Lane 5 is the sample after labeling and desalting (S);
  • Lane 6 is the sample after labeling (U);
  • Lane 7 is the sample after labeling and desalting (U);
  • Lane 9 is for sample (G) after labeling and desalting.
  • denaturing agents such as guanidine hydrochloride and urea for solubilization allows the sample to remain soluble with little loss of sample. It has been shown.
  • Mouse liver extract was used as an analysis sample.
  • This analysis sample was subjected to solubilization with SDS, labeling, desalting, re-solubilization with SDS, reductive ⁇ alkylation, and digestion according to the conventional NBS protocol.
  • the analysis sample was subjected to urea solubilization, labeling, desalting, urea resolubilization, reduction / alkylation, and digestion operations according to the protocol of the present invention.
  • the solubilized sample was labeled with the NBS (light) reagent; on the other hand, an equivalent amount of the solubilized sample was Labeling was performed using NBS (heavy) reagent; thereafter, the obtained both labeled products were mixed.
  • NBS-labeled peptides were separated using a phenyl column (column manufactured by Amersham Bioscience; HiTrap phenyl). Elution was performed with a step concentration gradient of acetonitrile (specifically, the concentration was carried out at a concentration of 5 steps from 10 to 40 ° /. In 7 steps), and two fractions were fractionated at each concentration. .
  • the method using SDS as in the conventional NBS protocol only observed a total of 14 paired peaks, while the method using urea as in the protocol of the present invention showed a total of 76 paired peaks.
  • the mass spectrum of the EL5 fraction (ie, acetonitrile concentration of 20%) in the table is shown in Figs. 16 (a) and (b).
  • the peak indicated by the arrow is a paired peak of the labeled peptide.
  • a mixture of three purified proteins (G3P, Lys and a-lact) was used as a model protein.
  • This mixture can be subjected to SDS according to the traditional NBS protocol. , Labeling, desalting, re-solubilization with SDS, reduction-alkylation and quenching.
  • the mixture was subjected to solubilization with guanidine hydrochloride, labeling, desalting, re-solubilization with guanidine hydrochloride, reduction-alkylation and digestion according to the protocol of the present invention. Further, the same operation as that according to the above-described protocol of the present invention was performed on the mixture separately, except that urea was used for solubilization.
  • NBS-labeled peptides were separated using a phenyl column, and MS analysis was performed.
  • the area ratio of the monoisotopic peak of each paired peak was quantified and compared. Specifically, of the paired peaks, the relative area of the smaller peak was determined when the area of the larger peak was set to 100, and the two spectra were compared using this as an index of quantitativeness.
  • Table 2 As shown in Table 2, in the method using SDS as in the conventional NBS protocol, the average value of the relative areas of the peaks was 80.3, whereas guanidine hydrochloride was used as in the protocol of the present invention.
  • the values using (GdnHCI) and urea (Urea) were 90.0 and 92.6, respectively. This indicates that the present invention has greatly improved the quantitativeness.
  • the dispersion is 186.4 in the method using SDS as in the conventional protocol, whereas it is 186.4 in the method using guanidine hydrochloride and urea as in the protocol of the present invention. They were 37.1 and 30.5, respectively.
  • the standard deviation is 13.7 in the method using SDS as in the conventional protocol, whereas it is 6.1 and 5.5 in the method using guanidine hydrochloride and urea as in the protocol of the present invention. there were. The smaller the value of the variance and the standard deviation, the smaller the data variation. Therefore, it was shown that such variation was greatly improved by the method of the present invention.
  • both samples were fractionated using a phenyl column, and one fraction was prepared by performing the operation according to the conventional NBS protocol.
  • One fraction was collected and prepared according to the protocol of the present invention. For those obtained, a fraction corresponding to the one fraction was collected.
  • Each collected fraction is
  • Fig. 17 (a) shows the result by the conventional NBS protocol
  • Fig. 17 (b) shows the result by the protocol of the present invention
  • each figure shows the mass / charge on the horizontal axis.
  • Figure 19 shows the mass spectrum of a typical elution fraction. In each figure, the horizontal axis represents the mass Z charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of ions.
  • Figure 18 shows the results of the first, third, fifth, seventh and ninth fractions (Fr.1, Fr.3, Fr.5, Fr.7 and Fr.9) of all 10 fractions by LH-20. The result.
  • Figure 19 shows the results for the 1, 4, 7, ⁇ 0, 12 and 14th fractions ⁇ .1, 4, 7, 10 12 and ⁇ 14) of the total 18 fractions from the phenyl column.
  • Fig. 18 and Fig. 19 in the method of the present invention, most of the unlabeled peptides near 1200-1700 (m / z), which were frequently observed in the conventional NBS method, were used.
  • peptides 1, 2, 4, 9, 10, 12, and 13 were the fractions of the eluted fractions to be measured. Although almost all of the peptide was eluted, in FIG. 19, the peptides were eluted with some separation.
  • a mixture of four purified proteins (Ova, G3P, Lys and ⁇ -lact) was used as a model protein, and urea solubilization, labeling, desalting, urea resolubilization, and reduced alkyl according to the protocol of the present invention.
  • one fraction eluted by fractionation using a phenyl column was prepared as an I ⁇ material for mass spectrometry, and the following three types of matrices were subjected to mass spectrometry using AXIMA-QIT.
  • DHB and 3-CHCA which are conventionally used, 3-CHCA and 3H4NBA used in the present invention, and 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA, respectively, are used as solvents. 10 mg / ml and 3H4NBA were used as saturated solutions. Equal amounts of the prepared sample and matrix solution were mixed and measured with AXIMA-QIT. The results obtained at this time are shown in FIGS. 20 (a) to (c).
  • the horizontal axis represents mass charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of ions.
  • the peaks indicated by arrows (ri to (iii)) It is a pair peak of a labeled peptide.
  • DHB DHB
  • the NBS-labeled peptide is hardly ionized and thus is not detected on the mass spectrum, but 3-CHCA
  • the NBS-labeled protein was efficiently ionized, enabling detection on the mass spectrum.
  • the measurement sample was prepared as follows.
  • NBS Reagent (heavy) (2- nitro [13 C 6] benzenesulfenyl phenylalanine black Li de), while the NBS Reagent (light) (2- nitro [12 C 6] Benzensurufu
  • the samples were unlabeled and modified with Enilk®, mixed, desalted, resolubilized with urea, reduced, alkylated, and trypsin digested.
  • the digested sample was desalted with ZipTip-C18 and eluted with 4 ⁇ l of a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA, which was used as a measurement sample.
  • the matrix used was prepared as follows. Using a 50O / O acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA as a solvent, 3H4NBA and 4-CHCA were respectively dissolved. 3H4NBA was a saturated solution, and 4-CHCA was a 10 mg / ml solution. The solutions thus prepared were mixed at a volume ratio of 1: 1 to obtain a matrix mixed solution. 'Add 0.5 ⁇ of the matrix mixed solution onto the prepared mass plate on which the measurement sample has been applied, dry it, and then hold the ion trap.
  • the measurement was performed using a MALDI-rr-TOF mass spectrometer (AXIMA-Q, manufactured by Shimadzu Corporation) and a MALDI-TOF mass spectrometer without ion trap (AXIMA-CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the MS spectrum obtained at this time is shown in FIG.
  • the horizontal axis represents mass charge (m / z), and the vertical axis represents the relative intensity of ions (% lnt.).
  • (A) is a spectrum obtained by measuring with an AXIMA-Qrr having an ion trap
  • (b) is a spectrum obtained by measuring with an AXIMA-CFR plus having no ion trap. It is a spectrum.
  • the peak pair marked with an arrow indicates that the pair is of the NBS-modified peptide.
  • a matrix used solely for 3 ⁇ 4 ⁇ and a mixed matrix combining 3 ⁇ 4 4- and 4-CHCA were used.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ was dissolved in a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA to obtain a saturated solution.
  • This 3H4NBA solution is added to a prepared mass plate on which a measurement sample has been applied, dried, and then measured using a MALDI-TOF mass spectrometer (AXIMA-CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • MALDI-TOF mass spectrometer AXIMA-CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation.
  • a mixed matrix of 3H4NBA and 4-CHCA was prepared in the same manner as in Experimental Example C-8. This mixed solution is added to a prepared mass plate on which a measurement sample has been applied, dried, and then measured using a MALDI-TOF mass spectrometer (AXIMA-CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation). went.
  • MALDI-TOF mass spectrometer AXIMA-CFR plus, manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the MS spectrum obtained at this time is shown in FIG. In FIG. 23, the horizontal axis represents the mass charge (m), and the vertical axis represents the relative intensity of the ions (% lnt.).
  • (A) is a spectrum obtained by using a mixture of 3H4NBA and 4-CHCA as a matrix, and ib) is a spectrum obtained by using 3H4NBA as a matrix.
  • Vector Furthermore, the peak pair marked with an arrow in FIG. 23 indicates that the peptide is of the NBS-modified peptide.
  • the paired peak of the NBS-modified peptide is detected with higher sensitivity in (a) than in (b).
  • 4-CHCA's J Highly sensitive measurement can be performed.

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Abstract

質量分析を用いた物質の測定方法及びキットを提供する。より詳しくは、MALDI質量分析装置による疎水性ペプチドの測定方法。MALDI質量分析によって混合物から特定の物質を選択的に測定する方法、及びタンパク質の定量解析方法及びキットを提供する。MALDI質量分析装置によって、ペプチドをα-シアノ-3-ヒドロキシケイ皮酸又は3-ヒドロキシ-4-ニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて測定する方法。質量分析において、測定すべき特定の物質とそれ以外の物質とを含む混合物に含まれる、特定の物質を、特定の物質をそれ以外の物質よりもイオン化させやすいマトリックスを用いることによって特異的にイオン化し、混合物から特定の物質を選択的に測定する質量分析方法。タンパク質の定量解析方法及びキット。

Description

明 細 書 質量分析を用いる物質の測定方法及びキット 技術分野
本発明は、 質量分析を用いる物質の測定方法及びキットに関し、 第 1、 第 2及び第 3の発明が含まれる。
第 1の発明は、 MALDI (マトリックス支援レーザー脱離イオン化 （Matrix Assisted Laser Desorption/lonization) ) 質量分析装置による疎水性ぺプチドの測 定方法であり、 質量分析装置を用いたプロテオーム解析の分野に関する。
第 2の発明は、 MALDI質量分析によって混合物から特定の物質を選択的 に測定する方法であり、 MALDI法による質量分析、及び定量的プロテオーム解析 に関する。
第 3の発明は、 タンパク質の定量解析方法及びキットであり、 安定同位 体を用いたプロテオーム解析 （タンパク質の網羅的解析） 分野に関する。 背景技術
第 1の発明についての背景技術を以下に述べる。
<定量解析 >
プロテオ一厶解析 （タンパク質の網羅的解析） 分野において、 これまで は二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせた PMF (ぺプチドマスフインガ —プリンティング） 解析法が主流であつたが、 これに代わる次世代のプロテオ一 ム解析法として、 安定同位体を用いた手法が考案されている。例えば、 Salvatore Sechi and Yoshiya Oda, Quantitative proteomics using mass spectrometry, Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7， 70-77には、 ICAT(lsotope-Coded Affinity Tag)試薬を用いた、マススぺク卜ロメ トリーを用いた定量的プロテオミク スが'言己載されてし、る。 さらに、 Hirokj Kuyama, Makoto Watanabe, Chikako Toda, Eiji Ando, Koichi Tanaka and Osamu Nishimura, An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2003, 17, 1642-1650及び国際公報第 2 0 0 4 / 0 0 2 9 5 0号パンフレッ トには、 本発明者らによって開発された、 2—ニトロベンゼンス ルフエニルク口リ ド (NBSCI)の安定同位体標識体と非標識体とをラベル化試薬と して用い、 タンパク質又はペプチドのトリブトファン残基を修飾し、 これらをト リブシンで酵素消化して得られるペプチド混合物中から疎水クロマトグラフィー カラムを用いて二トロベンゼンスルラエニル （NBS)ラベル化卜リプ卜ファンを 含有するペプチドを濃縮し、 定量解析を行う方法 （以下、 NBS法と表記する。） が記載されている。
<MS/MS解析による酉己列同定 >
PMF法においては、 1つのタンパク質を酵素消化して得られる複数のぺ プチド断片のマス値を質量分析装置によって検出し、 これらをデータベース上の 理論断片のマス値と比較することでタンパク質の同定を行う。一方、 NBS法では ラベル化■濃縮されたぺプチドを MS/MS解析して配列を決定し、 データベース 上でそのような配列を含むタンパク質の検索を行うことで、 元のタンパク質の同 定を行う。従って、 NBS法においては、通常の質量分析による定量解析と同時に、 MS/MS解析による配列決定がタンパク質同定のための必須の工程となる。
MS/MS解析は、 1 ) プレカーサ一イオンと呼ばれる、 配列を決定したい ペプチドの選択、 2 )選択したプレカーサ一イオンのフラグメント化、及び、 3 ) 生じたフラグメントイオンのマス値の検出、 の三段階を経て行われる。 このよう な MS/MS解析を行うことができる質量分析装置としては、 プレカーサ一イオン 選択■フラグメントイオン検出のための二合の質量分離部が連結されたタンデム 型、 イオン自身の持つ内部エネルギーによる分解 （PSD; post-source decay) を 利用するもの、 イオンを補足することによって複数回の MS解析 （MSn解析） を 行うことができるイオントラップ型、及び、イオンサイクロトロン共鳴（ICR; Ion Cyclotron Resonance)技術を用いて得られたデータをフーリエ変換（FT; Fourier Transform) してマススぺクトルの信号とする FTICR型が挙げられる。
MALDI (マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization)) 型質量分析装置では、試料に混ぜられたマトリックスと 呼ばれる分子 （一般的に有機化合物） がレーザー光のエネルギーを吸収すること で加熱され、 気化するとともにイオン化される。 試料分子を取り囲んでいたマ卜 リックスが瞬時に気化することで、 結果として試料分子もほぼ同時に気相に放出 されることになる。 この時、 試料分子とマトリックスとの間で電子やプロトンの 受け渡しが行われ、 試料分子のイオン化が達成される。 また、 これと同時にエネ ルギ一の一部が内部エネルギーとして試料分子に受け渡される。
このように、 マトリックスは試料分子の気化■イオン化を補助するだけ でなく、 試料分子の分散剤としても働いているので、 試料分子の効率良いイオン 化にはマトリックスと試料分子との親和性が重要であると考えられている。 その ため、測定する試料ごとに最適とされる有機化合物が検索され、用いられてきた。 例えば、 ペプチドを測定する際には、 ーシァノー 4ーヒドロキシゲイ皮酸 (4-CHCA) が広く一般的に用いられている。
一方、 MALDI-rr (マトリックス支援レ ザ一脱離イオン化一イオントラ ップ） 型、 MALDI-rr-TOF (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一イオント ラップ一飛行時間） 型 （例えば AXIMA-QH" (島津製作所製）） や MALDI-FOCR (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一フーリエ変換イオンサイクロトロン 共鳴）型の質量分析装置では、 MALDI法によってイオン化した試料分子を一度セ ル内に閉じ込めてから、イオンの検出や選択、或いは MS/MS解析を行っていく。 このため、 一度生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が、 通 常の MALDI-TOF (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一飛行時間） 型装置 に比べ、 2 ~ 3桁以上長くなる。 イオン化された試料分子ば余剰の内部エネルギ 一を持っているため、 徐々に自己崩壊が起こることが知られている。 実際に、
MALD卜 TOF 型質量分析装置の PSD 測定においては、 この原理を利用して擬似 MS/MS解析を行っている。
従って、 MALDI-Π"型、 MALDWT-TOF型や MALDI-FTICR型の質量分析 '装置においては、 イオン化の際に大きな内部エネルギーを受け取ると、 測定時に 望まないフラグメントイオンがたくさん検出されてしまい不都合である。 この点 から、 4-CHCAをマトリックスとして用いることは、 イオン化の際に試料に過剰 の内部エネルギーを与えることとなるため、 MALDI-ΓΓ型、 MALD卜 IT-TOF型や MALD卜 FTICR型の質量分析装置において好ましくない。 そのため、 AXIMA-QH" 装置で実際にデフォルトとして設定されているマトリックスは、 イオン化の際に 試料分子に与えるエネルギーが比較的小さいとされている 2， 5—ジヒドロキシ 安息香酸 （DHB)である。 第 2の発明についての背景技術を以下に述べる。
<MALDI法による質量分析 >
MALDI型質量分析装置では、 試料に混ぜられたマ卜リックスと呼ばれる 分子 （一般的に有機化合物） がレーザ一光のエネルギーを吸収することで加熱さ れ、 気化すると共にイオン化される。 試料分子を取り囲んでいたマトリックスが 瞬時に気化することで、 結果として試料分子もほぼ同時に気相に放出されること になる （この時、 試料分子とマトリックスとの間で電子やプロトンの受け渡しが 行われ、 試料分子のイオン化が達成される）。 MALDI法による質量分析において は、 測定する試料ごとに最適とされる有機化合物が検索され、 用いられている。 例えば、 ペプチドを測定する際には、 α—シァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸
(4-CHCA) や 2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸 （DHB) が一般的に用いられてい る。
くプロテオーム解析 > プロ亍オーム解析 （タンパク質の網羅的解析） 分野においては、 これま で二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせた PMF (ぺプチドマスフインガ 一プリンティング） 解析法が主流であった。 これに代わる次世代のプロテオ一ム 解析法として、 例えば、 Steven P. Gygi, Beate Rist, Scott A. Gerber, Frantisek Turecek, Michael H. Gelb and Ruedi Aebersold, Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags, Nature Biotechnology,
994-999, 17, 1999； Kirk C. Hansen, Gerold Schmitt-Ulms, Robert J. Chalkley, Jan Hirsch, Michael A. Baldwin and A.し. Burlingame, Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixtures at Low Levels Using Cleavable 3C-lsotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography, Molecular & Cellular
PROTEOMICS, 299-314, 2, 2003；及び Salvatore Sechi and Yoshiya Oda, Quantitative proteomics using mass spectrometry, Current Opinion in Chemical Biology, 70-77, 7, 2003に記載されているような、 安定同位体を用いた手法が考 案されている。
また、 Hiroki Kuyama, Makoto Watanabe, Chikako Toda, Eiji Ando, Koichi Tanaka and Osamu Nishimura, An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17, 2003；及び国際公報第 2 0 0 4 / 0 0 2 9 5 0号パシフレツ卜に は、 本発明者らによって開発された手法 （NBS法） が記載されている。 NBS法 においては、 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリド (NBSCI)の安定同位体標 識体（2—二トロ [13 C6]ベンゼンスルフエニルクロリド）及びその非標識体（2 一二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリド） を用いる。 すなわち、 （1)解析 すべきタンパク質試料 Iとその対照タンパク質試料 IIとの 2種類の状態のタンパ ク質試料を用意し、 （2)前記タンパク質試料 Iを、 2—ニトロ [13C6] ベンゼンス ルフエニルクロリド及び 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ドのい ずれか一方を用いてラベル化し、別途、前記タンパク質試料 IIを、 2—ニトロ [13 C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド及ぴ 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエ二 ルクロリドのいずれか他方を用いてラベル化し、（3)ラベル化されたダンパク質試 料 I及びラベル化されたタンパク質試料 IIを混合し、 （4)脱塩カラムを用いて未反 応の試薬を除き、（5)得られたラベル化タンパク質混合物を還元'アルキル化した 後、 ラベル化ぺプチド断片と非ラベル化べプチド断片とを含むぺプチド混合物へ 消化し、（6)ペプチド混合物からラベル化ペプチド断片を、疎水クロマトグラフィ 一力ラムを用いて濃縮分離し、 （7)質量分析を行う。
<二卜ロチロシン >
生体内において、 一酸化窒素 （NO) や、 それから生じるより反応性の高 い窒素酸化物 （パーォキシナイトライトなど） が、 タンパク質や核酸と反応して ニトロ化物を生成することが知られている。 例えばタンパク質の場合には、 チロ シンの側鎖であるフエニル基に対して反応し、 3-ニトロチロシンが生成する。 チ 口シン残基は生体内でしばしばリン酸化を受けるが、 リン酸化はシグナル伝達や 細胞死など生体内の重要なイベントにおけるスィッチ的役割を果たしている。 こ のような理由から、 ニトロチロシンを有する生体関連物質は、 生体内における反 応性窒素酸化物生成の指標 （バイオマ一力一） としてのみならず、 生物活性とい う視点からも注目されている。
なお、 タンパク質のチロシン残基のニトロ化の方法は、 A reagent for the nitration of tyrosine and tyrosyl residues of proteins, Journal of the American Chemical Society, 1966, 88, 4104-4105や、 A reagent for the nitration of tyrosyl residues in proteins, Biochemistry, 1966, 5, 3582-3589 Iこ記載されてしゝる。 第 3の発明についての背景技術を以下に述べる。
プロテオーム解析 （タンパク質の網羅的解析） 分野においては、 これま で二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせた PMF (ぺプチドマスフインガ 一プリンティング） 解析法が主流であった。 これに代わる次世代のプロテオーム 解析法として、 例えば、 Steven P. Gygi, Beate Rist, Scott A. Gerber, Frantisek Turecek, Michael H. Gelb and Ruedi Aebersold, Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags, Nature Biotechnology, 994-999, 17, 1999； Kirk C. Hansen, Gerold Schmitt-Ulms, Robert J. Chalkley, Jan Hirsch, Michael A. Baldwin and A. L. Burlingame, Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixtures at Low Levels Using Cleavable 13C-lsotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography, Molecular & Cellular PROTEOMICS, 299-314， 2, 2003； 及び Salvatore Sechi and Yoshiya Oda, Quantitative proteomics using mass spectrometry, Current Opinion in Chemical Biology, 70-77, 7， 2003に記載されているような、 安定同位体を用いた手法が考 案されている。
また、 Hiroki Kuyama, Makoto Watanabe, Chikako Toda, Eiji Ando, Koichi Tanaka and Osamu Nishimura, An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17， 2003；及び国際公報第 2 0 O 4 / 0 0 2 9 5 0号パンフレツ 卜に は、 本発明者らによって開発された手法 （NBS法） が記載されている。 NBS法 においては、 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリ ド (NBSCI)の安定同位体標 識体（2—ニトロ [13C6]ベンゼンスルフ Iニルクロリド）及 その非標識体（2 一二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） を用いる。 すなわち、 （1)角军析 すべきタンパク質試料 Iとその対照タンパク質試料 IIとの 2種類の状態のタンパ ク質試料を用意し、 （2)前記タンパク質試料 Iを、 2—二トロ [13 C6] ベンゼンス ルフエニルクロリド及び 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ドのい ずれか一方を用いてラベル化し、別途、前記タンパク質試料 IIを、 2—ニトロ [13 C6] ベンゼンスルフエニルクロリド及び 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエ二 ルク口リ ドのいずれか他方を用いてラベル化し、（3)ラベル化されたタンパク質試 料 I及びラベル化されたタンパク質試料 IIを混合し、（4)得られたラベル化タンパ ク質混合物を還元■アルキル化した後、 ラベル化ぺプチド断片と非ラベル化ぺプ チド断片とを含むぺプチド混合物へ消化し、（5)ぺプチド混合物からラベル化ぺプ チド断片を、疎水クロマトグラフィーカラムを用いて濃縮分離し、（6)質量分析を 行う。
NBS法のプロトコルの一例を、 以下に挙げる。
-テスト試料とコントロール試料との 2系統のタンパク質試料を、 それぞれ 0.1 w/v % SDSを含む溶液で可溶化し、 熱変性 （100°C、 3分間） させる
'—方の試料に対して NBS (Heavy)試薬を溶解した酢酸溶液を加え、 他方の試料 に対して NBS (Light)試薬を溶解した酢酸溶液を加え、 それぞれ NBSラベル化反 応を行う （室温、 終夜）
■両方の試料を混合し、 脱塩カラム （LH-20) を用いて未反応の試薬を除く »脱塩後の試料を乾燥し、 0.01W/V % SDSを含む溶液に再懸濁する
- TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride ； 卜リス ( 2—力ノレボキシ ェチル） ホスフィン塩酸塩)を加えて、 還元反応を行う （37°C、 30分）
- ョードアセトアミド溶液を加えてアルキル化反応を行う （室温、 45分） - トリプシンを加え、 部位特異的切断を行う （37°C、 16時間）
•濃縮カラム （LH-20) を用いて、 NBSラベル化ペプチドを濃縮する
'濃縮画分を質量分析装置を用いて解析する 発明の開示
第 1の発明の目的及び概要について、 以下に述べる。
発明の目的
上述のように、 MALDI- 型、 MALD卜 IT-TOF型や MALD卜 FTICR型の質 量分析装置においてはマトリックスとして主に DHB を用いている。 しかし、 疎 水性のぺプチドを含む試料の測定を行う場合は、 DHBを用いても疎水性ぺプチド を効率よくイオン化することができない。 そこで本発明の目的は、 MALDI型質量分析装置、 特に MALDWT型、 MALDI-IT-TOF型や MALDI-FTICR型の質量分析装置において、 疎水性のぺプチ ドを効率よくイオン化することができる方法を提供することにある。
'発明の概要
本発明者らは、 鋭意検討した結果、 マトリックスとして ーシァノー 3 ーヒドロキシゲイ皮酸又は 3—ヒドロキシー4一二トロ安息香酸を用いることに よって上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、 以下の発明を含む。
( 1 ) MALDI (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化） イオン源を有 する質量分析装置によって、 ぺプチドを ーシァノー 3—ヒドロキシケィ皮酸又 は 3—ヒドロキシ一 4—ニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて測定する方 法。
( 2 ) 前記マトリックスとして 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸を 用いる場合に、 前記 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸とひーシァノー 4ーヒ ドロキシゲイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックスを用いて測定する、 （1 )に 記載のぺプチドの測定方法。
( 3 ) 前記ぺプチドが、 疎水性化合物によリ化学修飾されたぺプチドで ある、 （1 ) 又は （2 ) に記載のペプチドの測定方法。
( 4 ) 前記ペプチドが、 スルフエニル化合物によって修飾されたアミノ酸残基 を含有するペプチドである、 （1 ) ~ ( 3 ) のいずれかに記載のペプチドの測定方 法。
( 5 ) 前記ペプチドが、 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリ ドによって誘 導体化されたペプチドである、 （1 ) ~ ( 4 ) のいずれかに記載のペプチドの測定 方法。
ここで、 本明細書においてペプチドとは、 オリゴペプチド、 ポリべプチ ド及びタンパク質を含む意味で用いる。
(6) MALD卜 IT (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一イオントラ ップ） 型質量分析装置による、 （1 ) 〜 （5) のいずれかに記載のペプチドの測定 方法。
(7) MALDI-IT-TOF (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一イオン トラップ一飛行時間） 型質量分析装置による、 （1 ) ~ (5) のいずれかに記載の ぺプチドの測定方法。
(8) MALDI-FTICR (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一フーリ ェ変換イオンサイクロトロン共鳴） 型貪量分析装置による、 （1 ) 〜 （5) のいず れかに記載のぺプチドの測定方法。
(9)前記マトリックスを、 1 mg/m I〜飽和濃度の溶液として用いる、 (1 ) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドの測定方法。
( 10) 前記 一シァノー 4—ヒドロキシゲイ皮酸を、 1 mg/m I〜飽 和濃度の溶液として用いる、 （2) ~ (9)のいずれかに記載のペプチドの測定方 法。
(1 1 ) 前記 3—ヒドロキシ _4一二トロ安息香酸の溶液と、 前記 一 シァノー 4—ヒドロキシゲイ皮酸の溶液とを、 1 ： 1 0〜10 ： 1の体積比で組 み合わせて用い 、 （1 0) に記載のペプチドの測定方法。 本発明によると、 MALDI型質量分析装置、 特に MALDI-IT型、
MALDI-IT-TOF型や MALDI-FTICR型の質量分析装置において、 疎水性のぺプチ ドを効率よくイオン化することができる方法を提供することができる。 第 2の発明の目的及び概要について、 以下に述べる。
発明の目的
MALDI法ではレーザー光の照射で試料 'マトリックス混合物の気化およ びイオン化を行うが、 一回 （1 ショット） でイオン化できる分子の数には限度が ある。 そのため、 測定する試料に複数の分子種が混在している場合、 存在量の多 い分子種が確率的に多くイオン化し、 存在量の少ない分子は、 たとえ検出限界以 上の試料が存在していても、 確率的に検出されにくくなつてしまう。 また、 測定 'する試料分子間に 「イオン化されやすさ J の差がある場合も、 イオン化されにく い分子は測定の感度が下がってしまうことになる。 このように、 イオン化されに くい分子種や存在量の少ない分子種を検出するためには、 あらかじめ目的とする 分子の濃縮を行っておくことが重要である。
定量性が必要となるような解析の中でも NBS法の場合、濃縮せずに目的 分子である NBS修飾分子の検出は可能であるが、 関係のない分子と重なってし まうと定量性が下がってしまうことがある。 従って、 この場合でも、 定量性の向 上という観点から、 濃縮によりあらかじめ NBS で修飾されていない分子種を除 いておく方が好ましいと考えられる。
本発明の目的は、 質量分析において目的の物質を主として検出すること ができる、 より簡便、 安価で且つ感度の良い検出方法を提供することにある。 発明の概要
本発明は以下の発明を含む。
( 1 2 ) 質量分析において、 測定すべき特定の物質と前記特定の物質以 外の物質とを含む混合物サンプルに含まれる、 前記特定の物質を、
前記特定の物質以外の物質よリも、 前記特定の物質をよリイオン化させ やすいマトリックスを用いることによって特異的にイオン化し、 混合物から特定 の物質を選択的に測定する質量分析方法。
すなわち、 本発明におけるマトリックスは、 特定の物質を主としてィォ ン化し、 且つ前記特定の物質以外の物質をイオン化しにくいため、 特定の物質を 特異的にイオン化することができる。 (1 3) 前記特定の物質が生体関連物質である、 （1 2) に記載の質量分 析方法。
(1 4) 前記生体関連物質が、 タンパク質、 ペプチド、 糖及び脂質から選ば れる、 .（1 3) に記載の質量分析方法。
(1 5) 前記特定の物質が同位体標識されている、 （1 2) 〜 （1 4) のい ずれかに記載の質量分析方法。
(1 6) 前記マトリックスが、 前記特定の物質とファンデルワールス相互作 用することができる物質である、 （1 2) 〜 （1 5) のいずれかに記載の質量分析方 法。
( 1 7) 前記特定の物質が 7Γ電子含有物質であり、 且つ前記マトリックスが 7Γ電子含有物質である、 （1 2) 〜 （1 6) のいずれかに記載の質量分析方法。
すなわち本発明のこの形態においては、測定すべき特定の物質とマトリック スとの兀 _ 7Γ電子相互作用を利用する。
(1 8) 前記特定の物質が親水性物質であり、 且つ前記マトリックスが親水 性物質である、 （1 2) ~ (1 6) のいずれかに記載の質量分析方法。
すなわち本発明のこの形態においては、測定すべき特定の物質とマトリック スとの親水性相互作用を利用する。
(1 9) 前記特定の物質が疎水性物質であ.リ、 且つ前記マトリックスが疎水 性物質である、 （1 2) 〜 （1 7) のいずれかに記載の質量分析方法。
すなわち本発明のこの形態においては、測定すべき特定の物質とマトリック スとの疎水性相互作用を利用する。
以下は、 上記 （1 9) の形態についての発明である。
(20) 前記特定の物質が、 疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質である、 (1 9) に記載の質量分析方法。
(21 )前記疎水性べプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環及び/又は ベンゼン環以外の芳香環を有する、 （20) に記載の質量分析方法。 (22) 前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、 さらにニトロ基を有 する、 （20) 又は （21 ) に記載の質量分析方法。
(23) 前記疎水性ペプチド又はタンパク質が、 ニトロベンゼンスルフエ二 ル基又はニトロフ I二ル基を有する、 （20) 〜 （22) のいずれかに記載の質量分 析方法。
(24) 前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、 ベンゼン環、 ベンゼ ン環以外の芳香環、 及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物を用いて、 前記疎水性 ぺプチド又は疎水性タンパク質に対応するぺプチド又はタンパク質を化学修飾する ことによって得られる、 （20) 〜 （23) のいずれかに記載の質量分析方法。
ここで、疎水性べプチド又は疎水性タンパク質に対応するべプチド又はタン パク質としては、 それ自体が疎水性である場合も含まれる。すなわち、 疎水性べプチ ド又は疎水性タンパク質が、疎水性化合物を用いた化学修飾によって、 より疎水性の 高いぺプチド又はタンパク質に誘導体化される場合も含まれる。
(25) 前記疎水性化合物が、 スルフヱニル化合物である、 （24) に記載 の質量分析方法。
(26)前記スルフヱニル化合物が 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリ ドである、 （25) に記載の質量分析方法。
(27) 前記マトリックスが、 前記特定の物質との間で電荷の接受を行うた めの官能基と、前記マトリックス自身に疎水性を与えるための官能基とを有する、ベ ンゼン環又はベンゼン環以外の芳香環の置換体である、 （1 9) 〜 （26) のいずれ かに記載の質量分析方法。
(28) 前記電荷の授受を行うための官能基が力ルポキシル基、 水酸基、 ァ ミノ基、 硫酸基、 硝酸基及びアルデヒド基から選ばれる、 （27) に記載の質量分析 方法。
(29) 前記疎水性を与えるための官能基がニトロ基である、 （27) 又は (28) に記載の質量分析方法。 (30)前記マトリックスがニトロ安息香酸誘導体又はニトロフヱノール誘 導体である、 （1 9) ~ (29) のいずれかに記載の質量分析方法。
(3 1 ) 前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸誘導体である、 （1 9) 〜 （30) のいずれかに記載の質量分析方法。
(32)前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸の位置異性体から選 ばれる、 （1 9) 〜 （31 ) のいずれかに記載の質量分析方法。
(33) 前記マトリックスが、 4一二トロア二リン、 2, 4—ジニトロア二 リン、 2—ブロモ一4， 6—ジニトロア二リン、 4—ニトロフエノール、 2—二トロ フエノール、、 2, 5—ジニトロフエノール 4—ニトロ安息香酸、 3—ヒ ドロキシー 4一二トロ安息香酸、 及び 3—ヒドロキシ一 2_ニトロ安息香酸から選ばれる、 （1 9) 〜 （29) のいずれかに記載の質量分析方法。
(34)前記マトリックスに ーシァノー 4—ヒドロキシケィ皮酸を組み合 わせた混合マトリックスを用いる、 （1 9) 〜 （33) のいずれかに記載の質量分析 方法。
(35) 前記マトリックスを、 1 mg/m I〜飽和濃度の溶液として用いる、 (1 9) ~ (34) のいずれかに記載の質量分析方法。
(36)前記 一シァノ _4ーヒドロキシゲイ皮酸を、 1 mg/m I〜飽和濃 度の溶液として用いる、 （34) 又は （35) に記載の質量分析方法。
(37) 前記マトリックスの溶液と、 前記 ーシァノ一4ーヒ ドロキシ ケィ皮酸の溶液とを、 1 ： 1 0~ 1 0 : 1の体積比で用いる、 （36) に記載の質 量分析方法。
本発明によると、 測定すべき目的の物質の濃縮工程を行わなくとも、 質 量分析において目的の物質を主として検出することができる方法を提供すること ができる。 第 3の発明の目的及び概要について、 以下に述べる。 発明の目的
本発明者らによって開発された従来の NBS法は、モデルタンパク質のよ うな精製された標品を用いた場合に特に効果的に用いることができる。 本発明者 らは、 このような精製試料だけでなく生体由来試料など非精製の試料についても 効果的に用いることができ、 なおかつ、 従来の NBS法よりも検出感度及び定量 性に優れたタンパク質の網羅的定量解析方法を提供するために、 本発明を完成さ せた。 発明の概要
本発明は以下の発明を含む。
( 3 8 ) (i) 解析すべきタンパク質試料 I とその対照タンパク質試料 II との 2種類の状態のタンパク質試料を用意する工程と、 .
(ii) 前記タンパク質試料 Iを、 尿素を変性剤として含む溶液中で可溶化 するか、 又はグァニジン塩酸塩を変性剤として含む溶液中で可溶化することによ つて、 可溶化されたタンパク質試料 Iを得て、
別途、 前記タンパク質試料 II を、 尿素を変性剤として含む溶液中で可 溶化するか、 又はグァニジン塩酸塩を変性剤として含む溶液中で可溶化すること によって、 可溶化されたタンパク質試料 IIを得る.工程と、
(iii)前記可溶化されたタンパク質試料 Iを、 2—二トロ [13C 6] ベンゼ ンスルフエニルク口リ ド及び 2—二トロ [12C 6] ベンゼンスルフエニルク口リ ド のいずれか一方を用いてラベル化反応させることによって、 ラベル化タンパク質 試料 Iを得て、
別途、 前記可溶化されたタンパク質試料 IIを、 2—ニトロ [13 C 6] ベ ンゼンスルフエニルクロリ ド及ぴ 2—二トロ [12 C 6] ベンゼンスルフエニルクロ リ ドのいずれか他方を用いてラベル化反応させることによって、 ラベル化タンパ ク質試料 IIを得る工程と、 (iv) 前記ラベル化タンパク質試料 I及びラベル化タンパク質試料 IIを、 混合及び脱塩することによって、 脱塩タンパク質試料混合物を得る工程と、
(V) 前記脱塩タンパク質試料混合物を、 尿素又はグァニジン塩酸塩を用 いて再可溶化することによって、 再可溶化されたタンパク質試料混合物を得るェ 程と、
( i)前記再可溶化されたタンパク質試料混合物を還元，アルキル化する ことによって、 還元■アルキル化されたタンパク質試料混合物を得る工程と、
(vii) 前記還元■アルキル化されたタンパク質試料混合物を、 尿素又は グァニジン塩酸塩の存在下でトリプシン消化することによって、 ラベル化ぺプチ ド断片と非ラベル化べプチド断片とを含むぺプチド混合物を得る工程と、
(viii) 前記ペプチド混合物を、 フエ二ル基を有する担体を用いて分離す ることによって、 濃縮されたラベル化ぺプチド断片を得る工程と、
(ix) 前記濃縮されたラベル化べプチド断片を質量分析する工程とを含 む、 タンパク質の網羅的定量解析方法。
| (39) 前記工程 （ix) において、 _シァノ一3—ヒドロキシ桂皮酸又 は 3—ヒドロキシー4一二卜口安息香酸をマトリックスとして用いて質量分析す る、 （38) に記載の方法。
(40) 前記工程 （ix) において、前記マトリックスとして 3—ヒドロキ シ一 4—ニトロ安息香酸を用いる場合に、 前記 3—ヒドロキシ一 4—ニトロ安息 香酸と —シァノー 4—ヒドロキシゲイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックス を用いて質量分析する、 （38) に記載の方法。
(41 ) 前記マトリックスを、 1 mg/m I〜飽和濃度の溶液として用い る、 （39) 又は （40) に記載の方法。
(42) 前記 一シァノ一4ーヒドロキシゲイ皮酸を、 1 mg/m I〜飽 和濃度の溶液として用いる、 （40) 又は （41 ) に記載の方法。
(43) 前記 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸の溶液と、 前記 一 シァノー 4ーヒドロキシゲイ皮酸の溶液とを、 1 ： 1 0〜 1 0 ： 1の体積比で組 み合わせて用いる、 （42) に記載の方法。
(44) 2—二トロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド、 2—二卜 口 [12C6] ベンゼンスルフヱニルクロリド、 及ぴフヱ二ル基を有する担体を含む ント。
(45) 前記 （38) - (43) のいずれか 1項に記載の方法を行うた めの、 2—二卜口 [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド、 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリド、 及びフエ二ル基を有する担体を含むキッ卜。
(46) 変性剤をさらに含む、 （44) 又は （45) に記載のキット。
(47) マトリックスとして α—シァノー 3—ヒドロキシ桂皮酸、 3— ヒドロキシー 4—ニトロ安息香酸、 ーシァノー 4—ヒドロキシ桂皮酸、 又は混 合マトリックスとして 3—ヒ ドロキシ一 4—ニトロ安息香酸と —シァノ一4一 ヒドロキシ桂皮酸との混合物をさらに含む、 （44) 〜 （46) のいずれかに記載 のキット。
(48)前記変性剤が尿素又はグァニジン塩酸塩である、（46)又は（4 7) に記載のキット。
(49) 脱塩用カラム、 脱塩用カラム充填ゲル、 還元試薬、 アルキル化 試薬、 トリプシン、 及び前記担体を充填するためのカラムからなる群から選ばれ る少なくとも 1つをさらに含む、 （44) ~ (48) のいずれかに記載のキット。 本発明によると、 生体由来試料から目的のぺプチドを質量分析において より感度良く、 且つより定量性高く検出することができる方法を提供することが できる。 図面の簡単な説明
図 1〜図 3は、 第 1の発明に関するものである。 図 1は、 実施例 A— 1において、 従来の方法によって得られた比較用の MS スぺク卜ル (a)と、 本発明の方法によって得られた MS スぺクトル (b)及び (c) である。
図 2は、 実施例 A— 1において得られた MS/MSスぺクトルである。 図 3は、実施例 A— 2 ( a )において、イオントラップを持つ AXIMA-Qrr で測定することによって得られた MSスぺクトル (a-1)、 及びイオントラップを持 たない AXIMA-CFR plusで測定することによって得られた MSスぺクトル (a-2)、 及び、 実施例 A— 2 ( b ) において、 マトリックスとして 3H4NBAと 4-CHCA とを混合して用いることによって得られた MSスぺクトル (b-1)、及びマトリック スとして 3H4NBAを用いることによって得られた MSスぺクトル (b-2)である。 図 4〜図 1 3ほ、 第 2の発明に関するものである。
図 4は、 測定サンプルを、 ACTHペプチドと、 NBS Reagent (light)でラ ベル化した ACTHぺプチドとの混合物とした場合の、従来法によって得られたマ ススぺクトル （(a)及び (b))、 及び、 本発明によって得られたマススぺクトル （(c) 及び (d)) である。
図 5は、 測定サンプルを、 精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 グ リセルアルデヒド一 3—ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 —ラク トアルブミン） の NBS Reagent (heavy)による標識ラベル化物と NBS Reagent (light)による非標識ラベル化物との 1 ： 1混合物を消化したものとした場合の従 来法によって得られたマススぺクトル (a)、及び本発明によって得られたマススぺ クトル (b)である。
図 6は、測定サンプルを、 DSIPぺプチドと NBS Reagent (light)でラベル 化した DSIPぺプチドとの混合物とした場合の、 従来法によって得られたマスス ぺクトル (a)、 及び本発明によって得られたマススぺクトル (b)である。
図 7は、 測定サンプルを、 リゾチームをニトロ化し卜リブシン消化して 得られた混合物とした場合の、従来法によって得られたマススぺクトル (a)、及び 本発明によって得られたマススぺクトル (b)である。
図 8は、 図 7の部分拡大図である。
図 9は、 測定サンプルを、 NBS Reagent (light)でラベル化したペプチド IRRP1 とラベル化していないペプチド IRRP1 との混合物とした場合の、 従来法 によって得られたマススぺクトル (a)、及び本発明によって得られたマススぺク卜 ル (b)である。
図 1 0は、 測定サンプルを、 P-ニトロフエ二ルァラニンを含むペプチド HIV sublllとした場合の、 従来法によって得られたマススぺクトル (a)、 及び本発 明によって得られたマススぺクトル (b)である。
図 1 1は、 測定サンプルを、 NBS Reagent (light)でラベル化した ACTH とラベル化していない ACTHとの混合物とした場合の、従来法によって得られた マススぺクトル (a)、 及び本発明によって得られたマススぺク卜ル （(b)及び (c)) である。
図 1 2は、 測定サンプルを、 NBS Reagent (light)でラベル化した ACTH とラベル化していない ACTHとの混合物とした場合の、従来法によって得られた マススぺクトル (a)、 及び本発明によって得られたマススぺクトル （(b)、 （c)、 （d) 及び (e)) である。
図 1 3は、 測定サンプルを、 精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 ダリセルアルデヒド一 3—ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 ーラ クトアルブミン） の NBS Reagent (heavy)によるラベル化物と NBS Reagent (light)によるラベル化物との 1 ： 1混合物を消化したものとした場合の、 従来法 によって得られたマススぺクトル ( 、 及び本発明によって得られたマススぺクト ル ((a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)及び (g)) である。 図 1 4〜図 2 3は、 第 3の発明に関するものである。 図 1 4は、 実験例 c― 1で得られた電気泳動図である。
図 1 5は、 実験例 C一 2で得られた電気泳動図である。
図 1 6は、 実験例 C一 3で得られた MSスぺクトルである。
図 1 7は、 実験例 c一 5で得られた MSスぺクトルである。
図 1 8は、 実験例 c一 6で得られた MSスぺクトルである。
図 1 9は、 実験例 c - 6で得られた MSスぺクトルである。
図 2 0は、 実験例 c一 7で得られた MSスぺクトルである。
図 2 1は、 実験例 c一 7で得られた MS/MSスぺクトルである。
図 2 2は、 実験例 c - 8で得られた MSスぺクトルである。
図 2 3は、 実験例 c一 9で得られた MSスぺクトルである。
発明を実施するための形態
第 1の発明を実施するための形態について、 以下に述べる。
本発明の方法は、 MALDI (マトリックス支援レーザー脱離イオン化） ィ オン源を有する質量分析装置を用いて、 疎水性のぺプチド試料を測定する方法で ある。 なお、 現在に至るまで、 MALDI法のイオン化機構については完全に解明さ れているとはいえない。 本明細書の記載は、 現在最も多く受け入れられている解 釈に基づく。
本発明において疎水性ぺプチド■疎水性タンパク質とは、 ぺプチド -タ ンパク質の組成アミノ酸残基のうち、 疎水性のアミノ酸、 特に疎水性の高いアミ ノ酸の含量が比較的高いもの、 下記の基を有するもの、 及び下記の化学修飾を受 けたものをいう。 疎水性の高いアミノ酸としては、 例えば、 卜リブトフアン、 ィ ソロイシン、 チロシン、 フエ二ルァラニン、 ロイシン、 バリン、 メチォニンなど を挙げることができる。 さらに、 ァラニン、 グリシン、 プロリンなども疎水性の アミノ酸とみなすこともある。 特に本発明は、ニトロベンゼンスルフエニル基（NBS基： N02PhS基 (Ph： フエ二レン基） ) やニトロフエニル基などを有している疎水性ペプチドを測定す る場合に有用に用いられる。 このような疎水性ペプチドとしては、 ニトロチロシ ン残基、二トロフエ二ルァラニン残基、 NBS基を置換基として有するトリプトフ ァン残基、 NBS基を置換基として有するシスティン残基などを含むぺプチドが挙 げられる。
疎水性べプチドは、 対応するぺプチドを疎水性化合物によって化学修飾 することによって得たものでもよい。 ここで、 対応するペプチドとしては、 それ 自体が疎水性である場合も含まれる。 'すなわち、 疎水性ペプチドが、 疎水性化合 物を用いた化学修飾によって、 より疎水性の高いぺプチドに誘導体化される場合 も含まれる。疎水性化合物は、スルフエニル化合物であることが好ましい。なお、 スルフヱニル化合物は、 ぺプチド又はタンパク質中のトリブトファン残基及びシ スティン残基を特異的に修飾する化合物である。 スルフエニル化合物の特に好ま しい例として、 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリド （NBS試薬） が挙げら れる。 すなわち、 本発明において好ましい疎水性ペプチドの一例としては、 トリ プ卜ファン残基やシスティン残基を有するぺプチドを NBS試薬を用いて化学修 飾することによって得たものが挙げられる。
本発明の方法は、 MALDIイオン源と組み合わされる質量分析計として、 生成したイオンが検出器に到達して測定されるまでの時間が通常の MALDI-TOF 型のものに比べて長いものに特に有用に用いることができる。 このような質量分 析装置としては、 MALDI-IT (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化一イオント ラップ） 型質量分析装置、 MALDI-IT-TOF (マトリックス支援レーザー脱離ィォ ン化ーイオン卜ラップ一飛行時間〉 型質量分析装置 MALDI-FTICR (マトリック ス支援レーザー脱離イオン化一フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴） 型質量 分析装置などが挙げられる。
本発明においては、 マトリックスとして、 α—シァノー 3—ヒドロキシ ケィ皮酸 （3-CHCA; 下記式 A-l) 又は 3—ヒドロキシー 4—ニトロ安息香酸
(3H4NBA; 下記式 A-II) を用いる。
< CH=C(CN)COOH 02M ^)" COOhl
HO H0
(A-l) (A-II) これらの化合物は、 質量分析用マトリックスとして用いるという目的に おいて、 当業者が適宜その使用形態を決定することができる。 たとえば、 これら 化合物は、 溶液として用いることが好ましい。 溶液の濃度としては特に限定され ないが、 例えば、 1 m g/m I〜飽和濃度の溶液として用いることができる。
このような溶 ¾の調製に用いられる溶媒としては、 ァセトニトリル水溶 液、 トリフルォロ酢酸 （TFA) 水溶液、 又はァセトニトリル一トリフルォロ酢酸 (TFA) 水溶液を用いることが好ましい。 ァセトニトリル水溶液又はァセトニ卜 リル一 TFA水溶液を用いる場合、 ァセトニトリルの濃度は特に限定されないが、 9 0 %以下、 好ましくは 5 0 %程度用いることができる。 TFA水溶液又はァセト 二トリル一 TFA水溶液を用いる場合、 TFAの濃度も特に限定されないが、 1 %以 下、 好ましくは 0 . 1 %程度用いることができる.。
そして、 マトリックスとして 3-CHCAを用いる場合は、 上述の溶媒に溶 解させることにより、特に限定されないが例えば 1 m g /m I〜飽和濃度、好まし くは 1 O m g /m Iのマトリックス溶液として用いることができる。また、 マトリ ックスとして 3H4NBAを用いる場合は、このような溶媒に溶解させることによリ、 特に限定されないが例えば 1 m g /m I〜飽和濃度のマトリックス溶液として、好 ましくは、 飽和濃度のマトリックス溶液として用いることができる。
なお、 本明細書における、 ％で表された量の基準に関しては、 特に断り のない限り v/v%とする。 上記のマ卜リックスを用いることにより、 以下のような利点がある。 まず、 先に述べたように、 MALDI-ΓΓ型質量分析装置、 MALDWT-TOF型 質量分析装置 MALDI-FOCR型質量分析装置などは、 生成したイオンが検出器に 到達して測定されるまでの時間が通常の MALDI-TOF型のものに比べて長い。 ま た、 マトリックスは、 受け取ったレーザーのエネルギーにより加熱され気化 -ィ オン化するが、 そのエネルギーの一部は試料分子の内部エネルギーとなり、 徐々 にイオンの自己崩壊をもたらす。 すなわち、 生成したイオンが検出器に到達して 測定されるまでの時間が長いほど自己崩壊が進み、 結果として望まないフラグメ ントイオンがたくさん検出されることとなる。 本発明において用いられるマトリ ックスは、従来法（例えば 4-CHCAが単独でマトリックスとして用いられる方法） におけるマ卜リックスに比べ、 イオン化の際に測定分子に対して与える内部エネ ルギ一が小さいと考えられる。 そのため、 上述のように、 生成したイオンが検出 器に到達して測定されるまでの時間が長い質量分析装置において用いられても、 生成したイオンの自己崩壊の進行を抑えることができる。
このような理由で、 本発明は、 イオントラップ型質量分析装置のように イオン化からイオンの検出までの時間が比較的長い質量分析装置において特に有 用に用いられる。 従って、 イオントラップを持たない質量分析装置においても有 用に用いられることはいうまでもない。
さらに、 先に述べたように、 マトリックスと試料分子との親和性は、 ィ オン化の際の重要なファクターである。 従って、 疎水性度の高い試料には疎水性 度の高いマトリックスが、 親水性度の高い試料には親水性度の高いマトリックス が合うと考えられる。 本発明において用いられるマトリックス 3-CHCAや
3H4NBAは、従来のマトリックス （例えば DHB) に比べ、疎水性度が高いと考え られる。 一方、 本発明において測定されるペプチド試料分子も疎水性度が高いた め、マトリックスとしての 3-CHCAや 3H4NBAとの親和性が高いと考えられる。 その結果、 ぺプチド試料とマトリックスとが均一な微小結晶を作りやすく、 効率 良いイオン化を達成することができると考えられる。
本発明においては、 マトリックスとして 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安 息香酸 （3H4NBA) を用いる場合に、 3H4NBAを α—シァノー 4—ヒドロキシケ ィ皮酸 （4-CHCA; 下記式 Α-ΙΙΙ) と組み合わせた混合マトリックスとして用いる ことが好ましい。 4-CHCAは、 ペプチドを質量分析測定する際に広く一般的にマ 卜リックスとして用いられている化合物である。 （以下本明細書において、
4-CHCAを組み合わせて用いずに単独で使用するマトリックスと、 4-CHCAを組 み合わせて用いる混合マトリックスとを、 単にマトリックスと記載することがあ る。）
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(A-III)
3Η4ΝΒΑと 4-CHCAとの組み合わせの比率は、 特に制限はないが、 例え ぱ以下のような量的関係で組み合わせることができる。
例えば、 3Η4ΝΒΑは、すでに述べたような濃度で調製することができる。 すなわち、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として、 例えばァセトニ卜リル水溶液、 TFA水溶液又はァセトニ小リル一 TFA水溶液を溶^!某とした場合、 1 m g /m I〜飽 和濃度、 好ましくは飽和濃度の 3H4NBA溶液として調製することができる。
一方、 4-CHCAは、 従来から用いられてきた濃度で調製することができ る。 例えば、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として調製することができる。 上記 3H4NBAを用いる場合と同様の、 ァセトニトリル水溶液、 TFA水溶液又はァセ卜 二卜リル一TFA水溶液を溶媒として用いる場合は、 1 m g /m I〜飽和濃度、好ま しくは 1 O m g /m Iの 4-CHCA溶液として調製することができる。
以上のように調製された双方の溶液を、好ましくは 1 ： 1 0 ~ 1 0： 1、 より好ましくは 1 ： 3 ~ 3 ： 1、 例えば 1 ： 1の体積比で混合して用いる。 従来のマトリックス 4-CHCAは、 MALD卜 IT、 MALD卜 -TOF、
MALDI-FTICR装置など、 ィォン化からィオンの検出までの時間が長い MALDI装 置での測定において、 測定試料の自己崩壊を生ぜしめるという欠点はあるが、 測 定の感度には優れておリ、 また、 質量分析試料においてレーザーを当てる最適ス ポットを探すのが容易であるという利点を有する。
一方、 本発明のマトリックス 3H4NBAは、 すでに述べたように、 測定試 料の自己崩壊の進行を抑えることができるとともに、 疎水性の試料の効率的なィ オン化を達成することができるという利点を有する。 そして、 本発明のマトリツ クス 3H4NBAが、 4-CHCAと組み合わされることによって、双方のマトリックス が有する利点の相乗効果が奏される。 すなわち、 3H4NBAが単独で有する測定試 料の自己崩壊の抑制と疎水性試料のィォン化達成という利点を確保したまま、 4-CHCAが有する高感度検出能がさらに伴い、 よリ解析効率に優れた質量分析を 行うことが可能になる。
本発明によると、 疎水性ペプチド （例えば NBSラベル化ペプチド） の配 列同定を行うことが可能な方法の範囲が大幅に広まった。 従来の技術では、 ESI (エレクトロスプレーイオン化法）を利用した質量分析装置による MS/MS解析、 MALDI型質量分析装置の PSD解析が用いられていたが、本発明により、 CID (衝 突誘起解離） を起こすことができる、 MALDI-IT型質量分析装置、 MALDI-rr-TOF 型質量分析装置 MALDI-F"HCR型質量分析装置などによる MS/MS解析が新たに 可能となった。さらに、 PSDよりも CIDのほうが効率的にフラグメント化を起こ すことができるため、 ぺプチドの同定率を向上させることが可能となった。 第 2の発明を実施するための形態について、 以下に述べる。
なお、 MALDI法のイオン化機構は完全に解明されているとはいえない。 本明細書において示す考え方は現在有力に支持されている考え方に基づいている が、 あくまで推定の域を出ない。 本発明において質量分析の対象となるサンプルは、 測定すべき特定の物 質とそれ以外の物質とを含む混合物である。 そして、 測定すべき特定の物質を、 それ以外の物質よりもイオン化しゃすいマトリックスを用いる。 好ましくは、 主 として測定すべき特定の物質をイオン化し、 それ以外の物質はほとんどイオン化 しないマトリックスを用いる。 （以下において、それ以外の物質をその他の物質と 表記することがある。）
MALDI法においては、 試料分子とマトリックスとがほぼ同時に気化■ィ オン化される。 すなわちマトリックスには、 試料分子のイオン化を補助する働き と同時に、 試料分子を分子レベルで分散させる働きもある。 試料分子の効率良い 気化■イオン化にはマトリックスと試料分子との親和性が重要であると考えられ ている。 両者の親和性が高いと、 マトリックスに試料分子が分子レベルで一様に 分散されやすい、 あるし、は一様な混合結晶を形成しやすいと考えられる。
従って、 イオン化と親和性との関係という観点からいうと、 本発明にお いては、 マトリックスは、 特定の物質と親和する構造を有するものであり、 特定 の物質は、 マトリックスと親和する構造を有するものであり、 その他の物質は、 そのような構造を有しないものであることが好ましい。 本発明においては、 この ように特定の物質とマトリックスとの親和性という観点から両者を組み合わせる ことによって、 特定の物質を特異的にイオン化す,る。
特定の物質としては、特に限定されないが、 タンパク質、ぺプチド、糖、 脂質などの生体関連物質が挙げられる。 特定の物質に対してその他の物質は、 マ トリックスと親和する構造を有しないものであれば特に限定されない。 本発明に おいては通常、 特定の物質が生体関連物質であれば、 その他の物質は上記構造を 有しない以外は特定の物質と同様のカテゴリーの生体関連物質である。 例えば、 特定の物質がペプチドである場合、 その他の物質は、 上記構造を有しないぺプチ ドであることが多い。 また本発明においては、 その他の物質には、 特定の物質の 調製過程において混在した物質や副生成物などが含まれることもある。 なお、 本明細書においてタンパク質、 ペプチド、 糖、 及び脂質には、 こ れ の修飾体も含まれる。 また修飾体には、 化学修飾体も含まれる。 修飾体が特 定の物質に相当する場合、 上記修飾体は、 マトリックスと親和する構造を含む基 を有するものであり、 上記化学修飾体は、 上記構造を有する基で化学修飾するこ とにより得られるものである。
また、特定の物質は、同位体標識されていても良い。さらにこの場合は、 特定の物質は、 同位体標識された物質とそれに対応する非標識体との混合物であ つても良い。
質量分析の対象となる混合物サンプルの一例としては、 従来技術におい て述べた NBS法などで得られるような、 ラベル化べプチドと非ラベル化ぺプチ ドとの混合物が挙げられる。 この混合物サンプルにおいては、 ラベル化ぺプチド を特定の物質として選択的に検出する。上述のように、 NBS法では、検出すべき 特定の物質としてのラベル化ぺプチドは、基本的に安定同位体 (13C)標識化合物で ラベル化されたぺプチド及び非標識化合物でラベル化されたぺプチドとの混合物 である。 本発明においては、 ラベル化ペプチドを主としてイオン化し、 非ラベル 化べプチドをほとんどイオン化しないマトリックスを用いることによって、 ラベ ル化ぺプチドを特異的にイオン化させることができる。 このように本発明を用い ると、 ラベル化ぺプチドと非ラベル化べプチドとを分離することなく混合物の状 態であっても、 質量分析でラベル化べプチドを選択的に検出することができる。
すでに述べたように、 本発明は、 マトリックスと試料分子との親和性を 利用する。 すなわち、 このような親和性をもたらす相互作用として、 ファンデル ワールス相互作用、 7Γ— 7Γ電子相互作用、 親水性相互作用、 疎水性相互作用など を利用する。 そして、 測定するサンプルに応じ、 サンプル中の特定の物質と上記 相互作用することが可能な物質をマトリックスとして選択する。 例えば、 特定の 物質が 7Γ電子含有化合物である場合には、 マトリックスとして 7Γ電子含有化合物 を選択し、 両者の π— 7Γ電子相互作用を利用することができる。 また、 特定の物 質が疎水性化合物である場合、 マトリックスとして疎水性化合物を選択し、 両者 の疎水性相互作用を利用することができる。 さらに、 特定の物質が親水性化合物 である場合、 マトリックスとして親水性化合物を選択し、 両者の親水性相互作用 を利用することができる。 上述の相互作用が組み合わされるように測定すべき特 定の物質及びマトリックスの種類を選択すると良い。 このようにして選択された マトリックスは、 特定の物質と上記相互作用を介して一様に混ざり合うか、 ある いは一様な混合結晶を形成し、 自身の気化■イオン化とともに特定の物質を優先 的に気化，イオン化することが可能となると考えられる。
以下に、 測定すべき特定の物 ¾が疎水性べプチド又は疎水性タンパク質 である場合を挙げて、 測定すべき特定の物質について説明する。 本発明において 疎水性べプチド■疎水性タンパク質とは、 ペプチド■タンパク質の組成アミノ酸 残基のうち、 疎水性のアミノ酸、 特に疎水性の高いアミノ酸の含量が比較的高い もの、 下記の基を有するもの、 及び下記の化学修飾を受けたものをいう。 疎水性 の高いアミノ酸としては、 例えば、 トリブトファン、 イソロイシン、 チロシン、 フエ二ルァラニン、 ロイシン、 バリン、 メチォニンなどを挙げることができる。 さらに、 ァラニン、 グリシン、 プロリンなども疎水性のアミノ酸とみなすことも ある。疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、ベンゼン環及び/又はベンゼン環 以外の芳香環を有していることが好ましく、 二卜口基を有していることが好まし い。
特に本発明は、 ニトロ基を置換基として有するベンゼン及び/又はベンゼ ン環以外の芳香環を含有する疎水性ぺプチド又は疎水性タンパク質に有用に用い られる。 より具体的には、 疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、 ニトロベン ゼンスルフエニル基 （NBS基： NQ2PhS基 (Ph： フエ二レン基） ) やニトロフエ ニル基などを有していることがより好ましい。 例えば、 ニトロチロシン残基、 二 トロフ I二ルァラニン残基、 NBS基を置換基として有するトリブトファン残基、 NBS基を置換基として有するシスティン残基 どを含むタンパク質又はべプチ ドが挙げられる。
疎水性ぺプチド又は疎水性タンパク質は、 対応するべプチド又はタンパ ク質を疎水性化合物によって化学修飾することによって得たものでもよい。 ここ で、 対応するペプチド又はタンパク質としては、 それ自体が疎水性である場合も 含まれる。 すなわち、 疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、 疎水性化合物を 用いた化学修飾によって、 より疎水性の高いぺプチド又はタンパク質に誘導体化 される場合も含まれる。 疎水性化合物としては、 ベンゼン環、 ベンゼン環以外の 芳香環、及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物が挙げられる。本発明において は、 疎水性化合物がスルフエニル化合物であることが好ましい。 なお、 スルフエ ニル化合物は、 ぺプチド又はタンパク質中のトリブトファン殫基及びシスティン 残基を特異的に修飾する化合物である。 スルフエニル化合物の特に好ましい例と して、 2—ニトロベンゼンスルフエニルクロリド （NBS試薬） が挙げられる。 す なわち、 本発明において好ましい疎水性べプチド又は疎水性タンパク質の一例と しては、 卜リブトフアン残基やシスティン残基を有するぺプチド又はタンパク質 を NBS試薬を用いて化学修飾することによって得たものが挙げられる。
また、 疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、 対応するペプチド又は タンパク質を、 ニトロ化することによって得たものでも良い。 すでに述べたよう に、 対応するペプチド又はタンパク質としては、 それ自体が疎水性である場合も 含まれる。 本発明において好ましい疎水性べプチド又は疎水性タンパク質の他の 一例として、ベンゼン環及び/又はベンゼン環以外の芳香環を有するぺプチド又は タンパク質に対し、 通常行われる方法を用いた芳香族求電子置換反応による二ト 口化によって得たものが挙げられる。
このような疎水性べプチド又は疎水性タンパク質とともに用いられるマ トリックスとしては、 測定すべき特定の物質との間で電荷の授受を行うための官 能基とマトリックス分子自体に疎水性を与えるための官能基とを有する芳香族置 換体が好ましい。 芳香族置換体としては、 ベンゼン置換体が好ましい。 電荷の授 受を行うための官能基とは、 電子やプロトンの受け渡しを行うための官能基であ リ、 このような官能基としては、 カルボキシル基、 水酸基、 アミノ基、 硫酸基、 硝酸基、アルデヒド基などが挙げられる。疎水性を与えるための官能基としては、 ニトロ基などが挙げられる。
このような芳香族置換体の中でも、 本発明においてはニトロ安息香酸誘 導体、 ニトロフエノール誘導体、 ヒドロキシニトロ安息香酸誘導体が好ましい。 特に、 ヒドロキシニトロ安息香酸 （HNBA) の 1 0個の芳香族位置異性体から選 ばれるものが好ましい。
本発明のマトリックスの具体例としては、 4一二トロア二リン （4NA ; 下記式 (B-l))、 2 , 4ージニトロア二リン （2,4DNA；下記式 (B-ll))、 2—ブロモ 一 4 , 6—ジニトロア二リン （2B4,6DNA；下記式 (B-lll))、 4—ニトロフエノー ル （4NP；下記式 (B-IV))、 2—二トロフ; rノール （2NP；下記式 (B-V))、 2 , 5 —ジニトロフエノール （2,5DNP；下記式 (B-VI))、 4一二卜口安息香酸 （4NBA； 下記式 (B-VII))、3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸（3H4NBA:下記式 (B-VIII))、 3—ヒドロキシ一 2—ニトロ安息香酸（3H2NBA；下記式 (B-IX)) などが挙げられ る。 これらの構造式を以下に示す。
Figure imgf000032_0001
(B-l) 4NA (B-ll) 2,4-DNA
Figure imgf000032_0002
(B-lll) 2B4.6-DNA (B-IV) 4NP
Figure imgf000033_0001
(B-VI) 2,5-DNP
Figure imgf000033_0002
(B-VII) 4NBA (B-VI 11) 3H4NBA
Figure imgf000033_0003
(B-IX) 3H2NBA これらの化合物は、 質量分析用マトリックスとして用いるという目的に おいて、 当業者が適宜その使用形態を決定することができる。 たとえば、 これら 化合物は、溶液として用いることが好ましい。例えば、 1 m g /m I〜飽和濃度の 溶液として用いることができる。
このような溶液の調製に用いられる溶媒としては、 ァセトニトリル水溶 液、 トリフルォロ酢酸 （TFA) 水溶液、 又はァセトニトリル一トリフルォロ酢酸 (TFA) 水溶液を用いることが好ましい。 ァセトニトリル水溶液又はァセトニト リル一TFA水溶液を用いる場合、 ァセトニトリルの濃度は特に限定されないが、 9 0 %以下、 好ましくは 5 0 %程度用いることができる。 TFA水溶液又はァセ卜 二トリル一 TFA水溶液を用いる場合、 TFAの濃度も特に限定されないが、 1 %以 下、 好ましくは 0 . 1 %程度用いることができる。
そして、 2， 4ージニトロア二リン、 2—ブロモー 4 , 6—ジニトロア 二リン、 3—ヒドロキシー 4—ニトロ安息香酸、 4—ニトロ安息香酸、 及び 3— ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸は、 このような溶媒に溶解させることにより、 特に限定されないが例えば 1 m g /m I〜飽和濃度、 好ましくは 1 O m g /m Iの マトリックス溶液として用いることができる。
また、 4—二卜ロア二リン、 4—ニトロフエノール、 2—ニトロフエノ —ル、 2， 5—ジニトロフエノール、 及び 3—ヒドロキシー 2—ニトロ安息香酸 は、 このような溶媒に溶解させることにより、特に限定されないが例えば 1 m g / m I〜飽和濃度のマトリックス溶液として、 好ましくは、 飽和濃度のマ卜リック ス溶液として用いることができる。
なお、 本明細書における、 ％で表された量の基準に関しては、 特に断り のない限り V/V%とする。
本発明において、 測定すべき特定の物質とマトリックスとの特に好まし い組み合わせは、 NBS試薬で修飾されたペプチド又はタンパク質と、ニトロ基を 有する芳香族置換体との組み合わせである。 ここに挙げた測定すべき特定の物質 とマトリックスとは、 双方がニトロベンゼン構造を有する。
すでに述べたように、 MALDI法では試料はマトリックスとほぼ同時に気 化 -イオン化されるため、 試料の検出においては、 試料とマトリックスとの一様 な混合結晶形成に必要とされる両者の親和性が関わつていると考えられている。 ニトロ基を有する芳香族置換体をマ卜リックスとして用いた、 NBS修飾べプチド 又はタンパク質の特異的検出においては、 このような試料とマトリックスとの組 み合わせは、 両者の疎水性相互作用及び π— π電子相互作用に起因する親和力に 加え、 ニトロ基の存在も関わっていると考えられる。 このように測定すべき特定の試料とマトリックスとが好ましく組み合わ されるため、 本発明は、 濃縮分離などの処理を行わない測定サンプルに対して特 に有用に用いられる。 濃縮分離は、 時として困難セあつたり不十分であったりす ることもあり、 測定までの処理工程の増加及びそれに伴う試料のロスの増加や、 時間、 費用などの増加につながることがあるため、 本発明の方法は非常に簡便且 つ安価な方法といえる。 なお、 感度の良い特異的検出を行うことが可能な本発明 の方法が、 濃縮分離などの処理を行った測定サンプルに対しても有用に用いられ ることはいうまでもない。
さらに、 本発明においては、 以上に述べたような化合物をそれぞれ単独 でマトリックスとして用いることのほかに、 以下のような混合マトリックスを用 いることも好ましい。
本発明の混合マ卜リックスは、 以上に述べたマトリックスと Qi—シァノ —4ーヒドロキシケィ皮酸（4-CHCA ;下記式 (B-X)) とを混合させたものである。 ーシァノー 4ーヒドロキシケィ皮酸は、 従来からペプチドを測定する際に広く 一般的に用いられるマトリックスである。 （以下本明細書において、 4-CHCAを組 み合わせて用いずに単独で使用するマトリックスと、 4-CHCAを組み合わせて用 いる混合マトリックスとを、 単にマトリックスと記載することがある。）
Figure imgf000035_0001
(B-X) 4-CHCA マトリックスと 4-CHCAとの組み合わせの比率は、 特に制限はない力 例えば以下のような量的関係で組み合わせることができる。
マトリックスは、 すでに述べたような量で調製することができる。 すな わち、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として調製することができる。 例えば、 2， 4一ジニ卜ロア二リン、 2—ブロモ一4， 6—ジニトロア二リン、 3—ヒドロキ シー 4一二トロ安息香酸、 4一二卜口安息香酸、 及び 3—ヒドロキシー 4—二ト 口安息香酸は、 ァセトニトリル水溶液、 TFA水溶液、 又はァセトニトリル一 TFA 水溶液を溶媒として用いた場合、 1 m g /m I〜飽和濃度、好ましくは飽和濃度の マトリックス溶液として調製することができる。 また例えば、 4一二トロアニリ ン、 4—ニトロフエノール、 2—ニトロフエノール、 2， 5—ジニトロフエノー ル、 及び 3—ヒドロキシー 2—二トロ安息香酸は、 上記水溶液を溶媒として用い た場合、 1 m g /m I〜飽和濃度、 好ましくは 1 O m g /m Iマトリックス溶液と して調製することができる。
一方、 4-CHCAは、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として調製することが できる。 上記マトリックスとして用いられるときと同様の、 ァセトニトリル水溶 液、 TFA水溶液、 又はァセトニトリル一 TFA水溶液を溶媒として用いた場合、 1 m g /m I〜飽和濃度、 好ましくは 1 O m g /m Iの 4-CHCA溶液として調製する ことができる。
以上のように調製された双方の溶液を、好ましくは 1 ： 1 0 ~ 1 0： 1、 より好ましくは 1 ： 3 ~ 3 ： 1、 例えば 1 ： 1の体積比で混合して用いる。
従来のマトリックス 4-CHCAは、 例えば濃縮処理を行っていない測定試 料の質量分析測定において、 必ずしも特定の物質を特異的に検出することはでき ない。 しかしながら、 測定の感度には優れておリ、 また、 質量分析試料において レーザーを当てる最適スポットを探すのが容易であるという利点を有する。
一方、 4—二卜ロア二リン、 2， 4—ジニトロア二リン、 2—ブロモー 4 , 6—ジニトロア二リン、 4一二トロフエノール、 2—二トロフエノール、 2， 5—ジニトロフ； Lノール、 4一二トロ安息香酸、 3—ヒ ドロキシ一 4—ニトロ安 息香酸、 及び 3—ヒドロキシー 2—ニトロ安息香酸として例示される、 ニトロべ ンゼン誘導体などの本発明のマトリックスは、 すでに述べたように、 本発明の測 定試料中の特定の物質との親和性に優れていると考えられ、 そのため、 特定の物 質の効率的なイオン化を達成することができるという利点を有する。 そして、 こ れらのマトリックスが、混合マトリックスとして 4-CHCAと組み合わされること によって、 双方のマトリックスが有する利点の相乗効果が奏される。 すなわち、 これらのマトリックスが単独でも有する特異的検出能を実用レベルで損ねること なく、 4-CHCAが有する高感度検出能が相伴い、 より解析効率に優れた質量分析 を行うことが可能になる。
本発明によると、 目的の物質を選択的に検出することができる。 本発明 は特に、 上述の NBS法において、 ΝΒέラベル化ペプチドと非ラベル化ペプチド を含む混合サンプルから目的の NBSラベル化べプチドを検出するときに有用に 用いられる。 この場合、 基本的に、 2—ニトロ [13 C6] ベンゼンスルフエニルク 口リ ドでラベル化され ペプチドと 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルク 口リドでラベル化されたぺプチドとに由来するペアピークが特異的に検出される。
本発明によると、 元の解析すべきサンプル又は対照サンプルのどちらか 片方にのみ含まれていたタンパク質も容易に認識することが可能である。例えば、 上述の NBS法の （6)の工程において本発明の方法を用いると、以下のようにして 片方にのみ含まれていたタンパク質を認識することができる。直前の (5)の工程を 行うことによって得られた質量分析用サンプルには、 解析すべきタンパク質試料 I及び IIの両方のサンプルに含まれるタンパク質に由来するラベル化べプチド（そ れぞれを A、 A 'とする。） と、 どちらか片方に含まれるタンパク質に由来するラベ ル化ペプチド （Bとする。） とが含まれる。 ここで、 質量分析用サンプルには、 濃 縮分離が不十分だと除かれ損ねたラベル化されていないべプチド (Cとする。 ）が さらに含まれる。 従来におけるマトリックス （例えば 4-CHCA) を用いて質量分 析すると、 A及び A'はペアピークとして検出されるが、 B及び Cのぺプチドはシ ングルピークとして検出され、なおかつ Bと Cとでラベル化■非ラベル化の区別 がっかない。 しかし、 本発明におけるマトリックスを用いると、 ラベル化された A、 A'及び Bが優先的に検出され、 Cについてはほとんど検出されなくなる。 そ して、 優先的に検出されたピークの中でも、 ペアピークは両方のサンプルに含ま れていたタンパク質に由来するラベル化べプチド A及び A'であり、シングルピー クは片方のサンプルに含まれていたタンパク質に由来するラベル化べプチド Bと いうことが分かる。つまり、従来におけるマトリックスを用いた質量分析の結果、 シングルピークとして検出されたもののうち、 本発明におけるマトリックスを用 いた質量分析においても検出された Bは、片方のサンプルにのみ含まれていたタ ンパク質に由来するラベル化べプチドであり、 ほとんど検出されなかった Cは、 非ラベル化べプチドである、 という区別をつけることができる。
また、従来法のようにたとえば NBSラベル化べプチドを 4-CHCAをマト リックスとして用いて解析すると、 目的のぺプチドのピークから m/z=16小さい 位置にもピークが観察される。 また、 目的のペプチドのピークから m/z=32小さ い位置にも微小なピークが観察されることもある。 さらに、 測定するペプチドに よっては、 目的のペプチドのピークから m/z=155 (NBSCI (light) (島津製作所製） でラベル化した場合） 小さい位置にもピークが検出される。 本発明を用いると、 これらのピークがほとんど見られなくなリ、 マスピークがシンプルになるため、 解析が容易になる。 第 3の発明を実施するための形態について、 以下に述べる。
本発明の方法は、試料の準備工程（i)、可溶化工程（ii)、ラベル化工程（iii)、 脱塩工程 (iv)、再可溶化工程 （v)、還元'アルキル化工程 （vi)、消化工程 （vii)、 濃縮分離工程 （viii)、 及び質量分析工程 （xi) を含む。
(i：試料の準備工程）
まず、 2種類の異なる状態のタンパク質試料し IIを用意する。 例えば、 タンパク質試料 Iを解析すべきタンパク質試料、 タンパク質試料 IIを、 試料 Iに 含まれるタンパク質の対照タンパク質を含む試料とすることができる。 より具体 的には、 解析すべきタンパク質試料 Iを病態試料のタンパク質試料、 対照タンパ ク質試料 11を正常試料のタンパク質試料とすることができる。本発明においては、 これらタンパク質試料 I及びタンパク質試料 IIの間での発現プロテオームの定量 的な解析を行う。 なお本発明においては、 試料となるタンパク質試料としてぺプ チドのような比較的低分子量のものも含まれる。
(ii：可溶化工程）
本工程は、 タンパク質試料 I及びタンパク質試料 IIについて、 同じ条件 でそれぞれ別個に行う。
本工程においては、 変性剤である尿素又はグァニジン塩酸塩を用いて、 タンパク質試料を可溶化する。 変性剤の濃度は特に限定されず、 タンパク質試料 の可溶化及び変性が起こるように、 タンパク質試料の種類やその他の条件等を考 慮して当業者が適宜決定すればよい。 例えば、 尿素は 2M〜飽和濃度、 好ましく は 2〜10Mの濃度の水溶液で用いることができる。 より好ましくは、 8Mの濃度 で用いる。 グァニジン塩酸塩は 1.5M〜飽和濃度、 好ましくは 1.5~8Mの水溶液 で用いることができる。より好ましくは、 6Mの濃度で用いる。 さらに変性剤は、 5mM程度の EDTAとともに用いることができる。
さらに、 上述の変性剤は、 タンパク質試料 100ygに対して 5~50μΙとな るように用いることができる。 好ましい量としては、 25μΙ程度である。 例えばタ ンパク質試料が凍結乾燥した粉末状態のものであれば変性剤を 25μΙ用いればよ <、タンパク質試料が溶液状の場合は、全量で 25μΙとなるように変性剤の濃度を 調整して用いればよい。
可溶化の温度としては、 尿素を用いる場合は 0〜30°C、 好ましくは室温 程度である。また、 グァニジン塩酸塩を用いる場合は 0~100°C、好ましくは室温 程度である。 (iii： ラベル化工程）
本工程においては、 上述のように可溶化されたタンパク質試料に、 2種 類のラベル化試薬、 すなわち同位体標識された 2—ニトロ [13 C6] ベンゼンスル フエニルクロリド （NBSCI(heavy)) と、 同位体非標識の 2—二卜口 [12C6] ベン ゼンスルフヱニルクロリ ド （NBSCI(light)) とを用いてラベル化を行う。 本発明 のラベル化試薬によって、 タンパク質中のトリブトファン残基が選択的に修飾す なわちラベル化される。 タンパク質試料 Iについては、 （NBSCI(heavy)) 及び
(NBSCI(light)) のいずれか一方を用いてラベル化する。 これとは別に、 タンパ ク質試料 IIについては、 (NBSCI(heavy)) 及び (NBSCl(light)) のいずれか他方を 用いてラベル化する。
ラベル化試薬は、 酢酸溶液として用いることが好ましい。 例えば、 酢酸 25μΙに 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリドを 0.17mg溶解させた溶液とし て用いることができる。 このようなラベル化試薬はタンパク質試料の 20倍当量 程度の大過剰を用いることができる。例えば、 タンパク質試料 100 gに対し、 溶 液中の 2—二トロベンゼンスルフエニルク口リドが 0.17mgとなるように用いる と良い。これにより、タンパク質試料中のトリプ卜ファン残基は、限りなく 100O/O 近くラベル化されることになる。
なお、 2—ニトロベンゼンスルフエニルクロリドは、 厳密には
NBSCI(lig t) と NBSCI(heavy)とで 3%程度分子量に差が生じる。 しかしながら、 本明細書において 2—ニトロベンゼンスルフエニルクロリ ドの質量を記載する場 合、 同物質量における両者の質量差は計算的に無視できる量とする。 従って、 両 者は同じ質量を用いれば良い。
ラベル化反応は、 タンパク質試料にラベル化試薬を加え、 インキュベー 卜することによって行うことができる。 反応時間は 4時間程度で十分である。 す なわち、 反応開始直後〜 4時間以内に反応を終了させて良い。 標準プロトコルと しては、 反応時間は 1時間とすると良い。 このように本発明においては、 従来の NBS法に比べてラベル化反応時間が大 幅に短縮される。 このため、 プロトコル全体を通した作業時間を通算 3日間から 2日間に短縮することが可能になる。
(iv：脱塩工程）
本工程では、上述の工程 （iii) によって得られたラベル化タンパク質試料 I及びラベル化タンパク質試料 IIを混合する。 そして、 得られたタンパク質試料 混合物を脱塩する。 脱塩方法としては、 従来からの方法を特に限定することなく 用いることができる。例えば、 セファ^ックス LH-20カラムを用い、 ァセトニト リル水溶液を用いて行うとよい。
(V：再可溶化工程）
本工程においては、 変性剤である尿素又はグァニジン塩酸塩を用いて、 上述の工程 （iv) によって得られた脱塩タンパク質試料混合物を再可溶化する。 変性剤の濃度は特に限定されず、 タンパク質試料の可溶化及び変性が起こるよう に、 タンパク質試料の種類やその他の条件等を考慮して当業者が適宜決定すれば よい。 例えば、 尿素は 2M〜飽和濃度、 好ましくは 2~ 10Mの濃度の水溶液で用 いることができる。 より好ましくは、 8Mの濃度で用いる。 グァニジン塩酸塩は 1.5M〜飽和濃度、好ましくは 1.5〜8Mの水溶液で用いることができる。よリ好ま しくは、 6Mの濃度で用いる。本工程においては、 さらに 5 O mM程度の Tris HCI (PH8.8程度)を緩衝剤として加えておき、 後の還元■アルキル化工程における pH 調整のために用いる。
本発明において、 可溶化工程 （Π) 及び再可溶化工程 （V) において上述 のような条件にすることによって、 従来多くのタンパク質試料に起きていたァグ リゲーシヨンの問題を回避することができる。 したがって、 試料をほとんどロス することなく、 後述の消化工程 （vii) まで可溶性を保つことができる。 このよう な効果が実際に示された例を、 後述の実験例 C— 1及び実験例 C一 2に示した。 上述のように、本発明の方法によると従来の NBS法に比べてサンプルの ロスを著しく低減することができるため、 質量分析において NBSラベル化ぺプ チドイオン検出率が大きく改善される。 この効果によって、 本発明は、 特に血清 や臓器の抽出液などの生体由来の試料を解析する場合に有用に用いることが可能 になった。このような効果が実際に示された例を、後述の実験例 C一 3に示した。
さらに本発明によると、従来の NBS法に比べて定量性も大きく改善され た。 このような効果が実際に示された例を後述の実験例 C— 4に示した。
(vi：還元■アルキル化工程）
本工程においては、 従来の試薬及び反応条件を特に限定することなく用 いると良い。 なお、 アルキル化反応は主にスルフヒドリル基に対して起こるが、 イミダゾリル基ゃァミノ基などに対しても起こりうる。 したがって、従来の NBS 法では、システィンのようにスルフヒドリル基を有するアミノ酸残基だけでなく、 他のアミノ基を有するアミノ酸残基に対しても一部アルキル化反応が起こること がある。この結果、マススぺクトルにおいて目的のぺプチドのピークより m/z=57 大きいピーク （+57(m/z)のピーク） が見られることがある。 一方本発明において は、 本工程の反応溶液に尿素又はグァニジン塩酸塩が含まれている。 これらはァ ミノ基を有する。 そして、 従来他のイミダゾリル基ゃァミノ基などを有するアミ ノ酸残基に対して起こっていた一部アルキル化反応が、 本発明では反応系中に存 在する尿素又はグァニジン塩酸塩のアミノ基に対して起こると考えちれる。 すな わち、 従来法において起こっていた副反応のアルキル化が競合的に阻害されると 考えられる。 この結果、 本発明によるとマススペクトルにおいて上記の +57(m/z) のピークがほとんど検出されなくなる。 このような効果が実際に示された例を後 述の実験例 C— 5に示した。 (vii：消化工程）
本工程においては、 トリプシン消化を行う。 本工程においては、 変性剤 である尿素又はグァニジン塩酸塩の存在下で行う。 変性剤の濃度としては、 尿素 は 0 . 0 8〜4 M、 好ましくは 0 . 8 M~ 1 . 6 Mとすることができる。 また、 グァニジン塩酸塩は 0 . 0 6〜3 M、 好ましくは 0 . 6 Mとすることができる。 本工程においては、 トリプシンの構造安定化ならびに活性化のため、 さらに 5 m M程度の CaCI2を加えておくことが望ましい。
本工程における変性剤は、 前記再可溶化工程で用いられたものの試料中 残存分を利用することができる。 例えば'、 再可溶化工程及び還元 'アルキル化工 程終了後の試料に卜リブシン消化バッファーを加え、 所望の濃度になるようにす れぱ良い。消化のための他の条件として、 pHは卜リプシン酵素の至適 pH近傍と なるように調整する。 また反応時間は、 通常 37°Cで 4〜16時間程度でよい。 こ のようにして、 ラベル化べプチド断片と非ラベル化べプチド断片とを含むぺプチ ド混合物が得られる。
(viii：濃縮分離工程）
本工程においては、 フエ二ル基を有する担体を用いることによって、 上 記ペプチド混合物から、 ラベル化ペプチドを選択的に濃縮する。 本工程は、 π電 子性化合物間に働く 7Γ— 7Γ電子相互作用に起因する固有の選択性を利用している。 すなわち、 ラベル化ペプチドにおけるトリプトファンのインドール基及びニトロ フェ二ルチオ基が有する 7Γ電子と、 担体におけるフエニル基が有する Γ電子との 相互作用によって、 担体はラベル化ぺプチドに対して優れた保持能力を発揮し、 選択的な濃縮分離が可能になる。 このような担体としては、 Hi-Trap phenyl FF、 Hi-Trap phenyl HP、 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、 Phenyl Sepharose High Performance, (以上、 アマシャムバイオサイエンス社製）、 YMC*GEL Ph (ワイ ェムシィ社製） などから適宜選択し、 フエ二ルカラム (phenyl column)として使用 することができる。
—方、 LH-20カラムを用いる従来の NBS法では、 溶出画分に相当数の非 ラベル化ペプチドが混在していた。 本発明によると、 混在する非ラベル化ぺプチ ドの数が少なくなリ、 特に従来の NBS法で多数見られた 1200-1700(m/z)近辺の 非ラベル化ペプチドについては、 ほとんど見られない。 さらに従来の NBS法で は、 濃縮分離の際に、 各ペプチドは溶出画分のほぼ全体に亘つて溶出されていた が、 本発明によると、 各ペプチド同士もある程度分離が可能である。 この結果、 検出されるぺプチドのカバー率も従来法に比べて優れている。 このような効果が 実際に示された例を、 後述の実験例 C一 6に示した。
(ix：質量分析工程）
上記工程 （viii) によって濃縮分離されたラベル化ペプチドは、 質量分析 に供される。 本発明における測定に MALDI型質量分析装置を用いる場合は、 従 来の NBS法において用いられていた MALDI-TOF型質量分析装置（例えば島津製 作所製 AXIMA-CFR) 等に加え、 MAIDI-IT-TOF型質量分析装置 （例えば島津製作 所製 AXIMA-QH") 等も用いられる。
MALDI-TOF型質量分析装置を用いる場合、 マトリックスとしては
4-CHCA (α—シァノ一 4—ヒドロキシ桂皮酸； a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 等を用いる。一方、 MAIDI-rr-TOF型質量分析装置を用いる場合、マトリックスと しては 3-CHCA (a—シァノ一 3—ヒドロキシ桂皮酸； a-cyano-3-hydroxycinnamic acid) 又は 3H4NBA ( 3—ヒドロキシ一 4—ニトロ安息香酸；
3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid) を用しゝる <>
これらの化合物は、 質量分析用マトリックスとして用いるという目的に おいて、 当業者が適宜その使用形態を決定することができる。 たとえば、 これら 化合物は、 溶液として用いることが好ましい。例えば、 1 m g /m I〜飽和濃度の 溶液として用いることができる。 このような溶液の調製に用いられる溶媒としては、 ァセトニトリル水溶 液、 トリフルォロ酢酸 （TFA) 水溶液、 又はァセトニトリル—トリフルォロ酢酸
(TFA) 水溶液を用いることが好ましい。 ァセトニトリル水溶液又はァセトニ卜 リル一 TFA水溶液を用いる場合、 ァセトニトリルの濃度は特に限定されないが、 9 0 %以下、 好ましくは 5 0 %程度用いることができる。 TFA水溶液又はァセト 二トリル一 TFA水溶液を用いる場合、 TFAの濃度も特に限定されないが、 1 %以 下、 好ましくは 0 . 1 %程度用いることができる。
4-CHCAの場合は、 このような溶媒に溶解させることにより、 1 m g /m
I〜飽和濃度、好ましくは 1 O m g /m Iのマトリックス溶液として用いることが できる。
そして、 3-CHCAは、 このような溶媒に溶解させることにより 1 m g /m I〜飽和濃度、好ましくは 1 O m g /m Iのマトリックス溶液として用いることが できる。
また、 3H4NBAは、 このような溶媒に溶解させることにより、 1 m g /m I〜飽和濃度のマトリックス溶液として、 好ましくは、 飽和濃度のマトリックス 溶液として用いることができる。
なお、 本明細書における、 ％で表された量の基準に関しては、 特に断り のない限り v/v%とする。
試料間で存在量に差があるぺプチドの配列を同定するためには、 感度の 点から考えると、 AXIMA-CFR (島津製作所製） の PSD解析よりも、 四重極型ィ オントラップ（QIT) を搭載した質量分析装置例えば AXIMA-QH" (島津製作所製） を用いた MS/MS解析の方が望ましい。 このようなイオントラップ型の質量分析 装置の測定では標準的に DHB( 2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸： 2,5-dihydroxy benzoic acid)がマトリックスとして使用されていた。 しかしながら、 DHBをマト リックスとして用いた場合は、 NBSラベル化ぺプチドはほとんど検出されない。 そこで、 本発明においてイオントラップ型の質量分析装置による測定を行う場合 は、 マトリックスとして 3-CHCA又は 3H4NBAを用いる。 このことによって、 NBSラベル化べプチドの効率良いイオン化が可能になった。 従って、 本発明の NBSラベル化べプチドの MS/MS解析効率は、 従来の NBS法に比べて大きく改 善された。このような効果が実際に示された例を、後述の実験例 C一 7に示した。
本発明においては、 マトリックスとして 3—ヒドロキシー 4—二トロ安 息香酸 （3H4NBA) を用いる場合に、 3H4NBAを —シァノー 4—ヒドロキシケ ィ皮酸 （4-CHCA) と組み合わせた混合マトリックスとして用いることが好まし い。 （以下本明細書において、 4-CHCAを組み合わせて用いずに単独で使用するマ トリックスと、 4-CHCAを組み合わせて用いる混合マトリックスとを、 単にマト リックスと記載することがある。）
3H4NBAと 4-CHCAとの組み合わせの比率は、 特に制限はないが、 例え ば以下のような量的関 で組み合わせることができる。
3H4NBAは、すでに述べたような量で調製することができる。すなわち、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として、例えばァセトニ卜リル水溶液、 TFA水溶液 又はァセトニトリル一 TFA水溶液を溶媒とした場合、 1 m g /m I〜飽和濃度、好 ましくは飽和濃度の 3H4NBA溶液として調製することができる。
—方、 4-CHCAも、 すでに述べたような量で調製することができる。 す なわち、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として、 ァセトニトリル水溶液、 TFA水溶 液又はァセトニトリル一 TFA水溶液を溶媒として用いる場合は、 1 m g /m I〜飽 和濃度、 好ましくは 1 O m g /m Iの 4-CHCA溶液として調製することができる。
以上のように調製された双方の溶液を、好ましくは 1 ： 1 0〜 1 0 : 1、 より好ましくは 1 ： 3〜3 ： 1、 例えば 1 ： 1の体積比で混合して用いる。
従来のマ卜リックス 4-CHCAは、 MALDI- 、 MALD卜 -TOF、
MALDI-FTICR装置など、 ィォン化からィオンの検出までの時間が長い MALDI装 置での測定において、 測定試料の自己崩壊を生ぜしめるという欠点はあるが、 測 定の感度には優れておリ、 また、 質量分析試料においてレーザーを当てる最適ス ポッ卜を探すのが容易であるという利点を有する。
一方、 本発明のマトリックス 3H4NBAは、 すでに述べたように、 測定試 料の自己崩壊の進行を抑えることができるとともに、 疎水性試料、 特に NBSで ラベル化されたぺプチドの特異的なィォン化を達成することができるという利点 を有する。 そして、本発明のマトリックス 3H4NBA力 4-CHCAと組み合わされ ることによって、 双方のマトリックスが有する利点の相乗効果が奏される。 すな わち、 3H4NBAが単独でも有する特異的検出能を確保したまま、 4-CHCAが有す る高感度検出能がさらに伴い、 より解析効率に優れた質量分析を行うことが可能 になる。 このような効果が実際に示さ た例を、 後述の実験例 C一 8及び C一 9 に示した。 以下に、 具体的な本発明のプロトコルを示す。 このプロトコルは、 状態 1及び状態 2の試料各々 100pgの処理について記載する。 （NBSCI及び NBSラベ ル化ペプチドは、本プロ卜コルを通してできる限り遮光する。） なお、 このプロト コル及び後に示す実験例において％で表された量の基準に関しては、 すでに述べ たように、 特に断りのない限り v/v%とする。
[試料の可溶化 （状態 1及び状態 2の試料について別々に行う）]
1 . "状態 1 "及び"状態 2 "の試料をそれぞれ 100pg用意する。
2 . 両試料を凍結乾燥する。 （或いは、 真空濃縮機を用いて乾固する。）
3 . 両試料を変性バッファー （5mM EDTAを含む 8M尿素水溶液、 又は 5mM EDTAを含む 6Mグァニジン塩酸塩水溶液） 25μΙに溶解する。
4 . ボルテックスミキサ でよく攪拌する。
[NBSCIによるトリブトファン残基のラベル化（状態 1及び状態 2の試料につい て別々に行う）] 1 . NBS試薬 (light)溶液 (0.17mgの NBSCI(light)を含む酢酸溶液) 25μΙ を"状態 1 "の試料に加え、 ボルテックスミキサ一で攪拌する。
別途、 NBS試薬 (heavy)溶液（0.17mgの NBSCI(heavy)を含む酢酸溶 液） 25μΙを"状態 2 "の試料に加え、 ポルテックスミキサーで攪拌する。
' 2 . 両試料について、 静かに攪拌しながら 1時間インキュベートする。
[反応溶液の脱塩及び過剰の NBS試薬の除去 （本工程で、 2種のラベル化試料 を混合する）]
1 . LH-20カラム （LH-20 500μΙを 30% ァセトニトリル水溶液であらか じめ平衡化する。） を用意し、 上澄をレジン層の高さまで自然落下させる。
2 . 混合試料 （NBSCI(light) によってラベル化された試料と
NBSCI(heavy)によってラベル化された試料との混合物、 合計 100μΙ) を静かに力 ラムにアプライする。 （素通り画分は廃棄する。）
3 . カラムを 30% ァセト トリル水溶液 100μΙで洗浄する。
4 . 脱塩された試料を 30% ァセトニトリル水溶液 200μΙで溶出する。
5 . 溶出画分を凍結乾燥する。
[還元■アルキル化]
1 . 50mM Tris HCI (pH8.8)を含む 8M尿素水溶液、 又は 50mM Tris HCI (pH8.8)を含む 6Mグァニジン塩酸塩水溶液 48μΙ中に試料を溶解する。
2 . 還元溶液 （200mM TCEP水溶液） 1 μΙを加え、 静かに攪拌する。
3 . 3 7 °Cで 3 0分インキュベートする。
4 . アルキル化溶液 （500mMョ一ドアセトアミド水溶液） 1 μΙを加え、 静かに攪拌する。
5 . 室温で 4 5分インキュベートする。 [卜リブシン消化]
1. 10 gのトリプシン （プロメガ社製、 sequencing grade) を、 消化バ ッファー (50mM Tris HCI (ρΗ7·8)、 5mM CaCI2) 450μΙに溶解する。
2. トリプシン溶液を試料に加えてピペッティングして静かに混ぜる。
' 3. 37°Cで 4 ~ 1 6時間インキュベートする。
4. カラムにロードする前に 1%TFA水溶液を 50μΙ (終濃度 0.1%)加え る。或いは、 TFAの代わリに塩酸を用いても良い。この場合、塩酸の終濃度が 10mM となるように調整すると良い。
[ラベル化べプチドの濃縮]
1 - Phenyl Sepharose™ High Performance (アマシャムバイオサイェン ス社製） などのフエ二ルカラム （phenyl column) 1mlをオープンカラムに充填す る。
2. 水 5ml、 その後に 0.1%TFA水溶液 5mlによってカラムを平衡化す る。
3. 消化した試料 550μΙをカラムにアプライする。 （この際の溶出液を "Flow-through"画分として分取する。）
4. カラムを 0.1% TFA水溶液 1mlで洗浄する。 （この際の溶出液を "Wash"画分として分取する。）
この操作を後 2回繰り返す。 （全部で 3回行う。）
5.溶出バッファー（10% ァセトニ卜リルを含む 0.1 °/oTFA水溶液） 0.5ml で溶出し、 （この際の溶出液を "Elute"画分として分取する。） この操作をもう一度 繰り返す。
6. 工程 5を、 ァセ卜二トリルの濃度を 5%ずつ上げながら 40%になる まで繰り返す。
7. (任意工程：必要に応じて行う。） MS分析のために、 "Flow-through" 画分及び" Wash"画分から ZipTipを用いてぺプチドを脱塩及び濃縮する。
8 . "Elute"画分を真空濃縮機によって乾固する。 MS分析又は HPLC等 を用いた更なる分離のために、 乾固した試料を 5~50μΙ程度の量の 0.1 % TFA水 溶液に懸濁する。
、 なお、 ラベル化ぺプチドの濃縮において用いられる 0.1% TFA水溶液の 代わりに塩酸を用いても良い。 この場合、塩酸の濃度は 10mMとなるように調整 すると良い。
[質量分析]
試料はこのまま MS解析に用いても良いし、 HPLCなどを利用してさら に分画しても良い。 MALDI-MS測定を行う場合は、 試料をマ卜リックス溶液と混 ぜ、 MS測定を行う。
さらに本発明は、 2—二トロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド、 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリド、 及びフエ二ル基を有する担 体を含むキットを提供する。 ここで、 2—ニトロ [13 C6] ベンゼンスルフエニル クロリド、 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリドは、 例えば上記ラ ベル化工程 （iii) を実施するためのラベル化試薬として用いることができる。 フ ェニル基を有する担体は、 上記濃縮分離工程 （viii) を実施するために用いること ができる。
従って、本発明のキットは、タンパク質の網羅的定量解析を行うための、 例えば上述のプロトコルを実施するために使用することができる。
すなわち、 本発明のキッ卜は、 上記ラベル化工程 （iii) を実施するためのラベ ル化試薬である 2—ニトロ [13C 6:] ベンゼンスルフエニルクロリ ド
(NBSCI(heavy)； NBS(heavy)試薬） 及び 2—ニトロ [12 C 6] ベンゼンスルフエ ニルクロリ ド (NBSCI(light) ； NBS(light)試薬） と、 上記濃縮分離工程 (viii) を 実施するためのフエ二ル基を有する担体を含み、好ましくは、変性剤及び/又はマ 卜リックスをさらに含む。 また、 本発明のキットは、 上述の本発明の方法におい て用いられる各種溶媒を含んでも良い。
変性剤は、 上記可溶化工程 （Π) 及び再可溶化工程 （V) を実施するため に用いることができる。従って変性剤としては、上記可溶化工程 （Π) 及び再可溶 •ί匕工程 （V) で述べたような、尿素又はグァニジン塩酸塩が好ましい。また変性剤 は、 上記可溶化工程 （Π) 及び再可溶化工程 （V) で述べたような溶媒に溶解して いても良い。 例えば変性剤をグァニジン塩酸塩とする場合など、 溶媒に溶解させ たものとして提供することができる。 このとき、 1.5Μ〜飽和濃度、 好ましくは 1.5〜8Μ、 よリ好ましくは 6Μの濃度のグァニジン塩酸塩水溶液とすることがで きる。 変性剤として尿素を溶媒に溶解させたものとする場合は、 2Μ〜飽和濃度、 好ましくは 2〜10Μ、 よリ好ましくは 8Μの濃度の尿素水溶液とすることができ る。
マトリックスは、上記質量分析工程（ix) を実施するために用いることが できる。従ってマトリックスとしては、上記質量分析工程（ix)で述べたような、 4-CHCA (α—シァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸）、 3-CHCA (α—シァノー 3—ヒド ロキシ桂皮酸）、 及び 3Η4ΝΒΑ ( 3—ヒドロキシ— 4一二トロ安息香酸） から選 ばれることが好ましい。 また、 混合マトリックスとして用いるための、 3Η4ΝΒΑ と 4-CHCAとのセットであることも好ましい。 .
またこれらマトリックス及び補助マトリックスは、上記質量分析工程（ix) で述べたような溶媒に溶解していても良い。例えば、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶 液とすることができる。 ァセトニトリル水溶液、 TFA水溶液又はァセトニトリル 一 TFA水溶液を溶媒とした場合は、 一シァノ一3—ヒドロキシケィ皮酸は、 1 m /m I〜飽和濃度、 好ましくは.1 O m g /m I 、 3—ヒドロキシー 4—ニトロ 安息香酸は、 1 m g /m I〜飽和濃度、 好ましくは飽和濃度、 一シァノ一4ーヒ ドロキシゲイ皮酸は、' 1 m g /m I〜飽和濃度、 好ましくは 1 O m g /m Iの溶液 とすることができる。 また、 これら溶液のうち、 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安 息香酸の溶液と、 一シァノ一4—ヒドロキシケィ皮酸の溶液とが、 好ましくは
1 ： 1 0〜 "！ 0 ： 1、 より好ましくは 1 ： 3 ~ 3 ： 1、 例えば 1 ： 1の体積比で 混合された混合溶液とすることもできる。
さらに本発明のキットは、 脱塩用カラム及び脱塩用カラム充填ゲル、 還 試薬及びアルキル化試薬、 トリプシン、 及び、 上記フ I二ル基を有する担体を 充填するカラムをさらに含んでも良い。 脱塩用カラム及び脱塩用カラム充填ゲル は、 例えば上述の脱塩工程 （iv) を実施するために用いることができる。 還元試 薬及びアルキル化試薬は、 例えば上記還元■アルキル化工程 （vi) を実施するた めに用いることができる。 トリプシン'は、 例えば上記消化工程 （vii) を行うため に用いることができる。 上記フエ二ル基を有する担体を充填するカラムは、 例え ば上記濃縮分離工程 （viii) のために用いることができる。 すなわち、 上記フエ二 ル基を有する担体を充填するカラムを濃縮用カラムとして、 上記フ X二ル基を有 する担体を濃縮用カラム充填ゲルとして用いることができる。
本発明のキッ卜によって、 上述した本発明のタンパク質の網羅的定量解 析を行うことができ、 したがって、 本発明の方法においてすでに述べたような以 下の効果が得られる。
■試料ロスの低下
' +57(m/z)バンドの減少
■非ラベル化ペプチド混入率の低下
-各ぺプチドの分離効率の向上
■ QITを用いた MS/MS解析の実現
-検出できるペアピーク数の増加
-プロトコル通算での作業時間の短縮
■定量性の改善 実施例
以下に実施例 A— 1及び A— 2により第 1の発明をさらに詳しく説明 するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。すでに述べたように、％ で表された量の基準に関しては、 特に断りのない限り v/v%とする。 なお、 実施 例においては、 NBS試薬によるラベル化を修飾又は NBS修飾と表記することが める。
[実施例 A— 1 ]
本実施例においては、 NBS ラベル化ペプチド （安定同位体元素 13C 6つ で標識された NBS(heavy)試薬によって修飾されたべプチ ドと非標識の NBS(light)試薬によって修飾されたべプチドとの混合物） を測定サンプルに用い、 本発明のマトリックス 3-CHCA ( α—シァノー 3—ヒドロキシゲイ皮酸、 式 Α-Ι) 及び 3Η4ΝΒΑ ( 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸、 式 Α-ΙΙ) と、 比較用の従 来のマ卜リックス DHB ( 2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸、式 A-IV) とを用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
Figure imgf000053_0001
(A-I) (A-II)
Figure imgf000053_0002
(A-IV) 測定サンプルは、 以下のように調製した。
精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 グリセルアルデヒド一 3—ホ スフエイ卜デヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 —ラク卜アルブミン；全て SIGMA 社製） を 25ygずつ混合し合計 100 gとしたものを 2つ用意した。 変性剤として 終濃度 8Mの尿素を用いて、それぞれの混合物についての可溶化及び NBS修飾試 料混合物の再可溶化を行ったこと以外は、 「13CNBS Isotope Labeling キット」 (島津製作所製） のプロトコルに従って測定サンプルを調製した。 すなわち、 2 つの混合物のうち一方を NBS Reagent (heavy) ( 2—二トロ [13C6] ベンゼンス ルフエ二ルクロリド） で、 他方を NBS Reagent (light) ( 2—二卜口 [12C6] ベン ゼンスルフエニルクロリド） で修飾し、 両修飾試料の混合、 脱塩、 尿素による再 可溶化、 還元■アルキル化、 及びトリプシン消化を行った。
その後、 試料を凍結乾燥し、 500μΙの 0.1 %トリフルォロ酢酸 （TFA) 水 溶液に懸濁し、 0.1 %の TFA水溶液で平衡化した HiTrap Phenyl FF (high sub) column (アマシャムバイオサイエンス社製） にロードした。 このカラムを 3ml の 0.1 %TFA水溶液で洗浄し、その後、 10%のァセトニトリルを含む 0.1 %の TFA 水溶液 1 mlを用いて溶出した。続いて、溶出に用いる TFA水溶液のァセトニトリ ル濃度を順に 15、 20、 25、 30、 35、 40%と変え、 同様に溶出を行った。溶出後、 10%のァセトニトリルを含む 0.1 %TFA水溶液で溶出した画分を、 凍結乾燥し、 50μΙの 0.1 %TFA水溶液に再懸濁し、 ZipTip(yC18)で脱塩処理した。 このように して、 測定サンプルを得た。
マトリックスとしては、 本発明の 3-CHCA ( —シァノ一 3—ヒドロキ シケィ皮酸、 式 A-I) 及び 3H4NBA ( 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸、 式 A-ll)、及び比較のために従来のマトリックス DHB ( 2， 5—ジヒドロキシ安息香 酸、 式 A-IV) の 3種を用意した。
マトリックスとしては、 以下のように調製したものを用いた。 0.1 %TFA を含む 50%ァセトニトリル水溶液を溶媒とし、 3-CHCA、 3H4NBA及び DHBを それぞれ溶解させた。 DHBと 3-CHCAとはそれぞれ 10mg/mlの溶液、 3H4NBA は飽和溶液とした。
上述のようにして得られた測定サンプルの溶液とマトリックスの溶液と を、 それぞれ 0.5μΙずっとって混合し、 マスプレート上に滴下した。 溶液を乾燥 させた後、 AXIMA-QIT装置 （MALDI-IT-TOF型質量分析装置、 島津製作所製） に て測定した。
AXIMA-QH"装置による MSスペクトルを、 図 1に示す。 図 1中、 横軸は 質量ノ電荷 (Mass/Charge)、 縦軸はイオンの相対強度を表す。 また、 （a)は、 DHB をマトリックスに用いたときの NBS修飾ぺプチドのスぺクトル、（b)は、 3-CHCA をマトリックスに用いたときの NBS修飾ぺプチドのスぺクトル、（C)は、 3H4NBA をマトリックスに用いたときの NBS修飾ぺプチドのスぺクトルである。図中、（り、 (N)及び (iii)は、 NBS で修飾されたペプチドのペアピークを示す。 それぞれのペア ピークは、 2つのラベル化試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—ニトロ [13C6] ベン ゼンズルフエニルクロリド） と NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ [12C6] ベンゼ ンスルフエニルクロリ ド） との質量差に相当する、 m/z=6の差を有するピークの 組として検出された。 それぞれのペアピークに相当する理論マス値、 配列、 及び 由来するタンパク質は次のとおりである。
(1)1198.53, 1204.55 (m/z)、 GTDVQAWIR (配列番号 1 )、 リゾチーム
(ii)1244.51 , 1250.53 (m/z), LDQWLCEK (配列番号 2 )、 Of —ラク卜アルブミン (出)2011.95, 2017.97 (m/z)、 ELINSWVESQTNGIIR (配列番号 3 )、 オボアルブミ ン
図 2は、 図 1 中のペアピーク（りの 1198.53 m/z に相当するイオン (GTDVQAWIR)を選択的にトラップした後、 MS/MS解析したときのフラグメン卜 スぺクトルである。 図 2中、 横軸は質量ノ電荷 (Mass/Charge)、 縦軸はイオンの 相対強度を表す。 [実施例 A— 2 ]
( a ) イオントラップを持つ質量分析装置とイオントラップを持たない質量分 析装置とによる質量分析測定
NBS試薬によって修飾されたぺプチドと非修飾べプチドとの混合物を測 定サンプルに用い、 本発明の混合マトリックス、 すなわち 3H4NBA ( 3—ヒドロ キシ—4一二トロ安息香酸、 式 A—II) と従来のマトリックス 4-CHCA ( ーシァ ノー 4—ヒドロキシケィ皮酸、 式 A-III) との混合物を用い、 質量分析装置にて測 定を行った。
Figure imgf000056_0001
(Α-Μ) (Α-ΙΙΙ) 測定サンプルは、 以下のように調製した。
精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 ダリセルアルデヒド一 3—ホ スフエイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 —ラクトアルブミン；全て SIGMA 社製） を 25 gずつ混合し合計 100 gとしたものを 2つ ffl意した。 変性剤として 終濃度 8M の尿素を用いてそれぞれの混合物について変性を行った以外は、 r13CNBS Isotope Labeling キット J (島津製作所製） のプロトコルに従った。 す なわち、 一方を NBS Reagent (heavy) ( 2—ニトロ [13C6] ベンゼンスルフエ二 ルクロリ ド） で標識修飾し、 他方を NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ [12C6] ベ ンゼンスルフエニルクロリ ド） で非標識修飾し、 両修飾試料の混合、 脱塩、 尿素 による再可溶化、 還元、 アルキル化、 及びトリプシン消化を行った。 消化後のサ ンプルを ZipTip -C18で脱塩処理し、 0.1 %TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶 液 4μΙにより溶出したものを、測定サンプルとした。 このうち、 0.5μΙをマスプレ 一卜上に塗布した。
マトリックスとしては、 以下のように調製したものを用いた。 0.1 %TFA を含む 50%ァセトニトリル水溶液を溶媒とし、 3H4NBA及び 4-CHCAをそれぞ れ溶解させた。 3H4NBAは飽和溶液、 4-CHCAは 10mg/mlの溶液とした。 このよ 'うに調製した溶液を、 1 ： 1の体積比で混合し、 マトリックス混合溶液を得た。 あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、 マトリ ックス混合溶液 0.5μΙ を添加し、 乾燥した後、 イオン トラップを持つ MALDI-IT-TOF型質量分析装置 （AXIMA-QH"、 島津製作所製） 及びイオントラッ プを持たない MALDI-TOF型質量分析装置（AXIMA-CFR plus、島津製作所製） に て測定を行った。
このとき得られた MSスペクトルを、 図 3 (a-1)及び図 3 (a-2)に示す。 こ れらの図において、横軸は質量ノ電荷 (m/z)、縦軸はイオンの相対強度 (％lnt.)を表 す。 また、 （a-1)は、 イオントラップを持つ AXIMA-Qrrで測定することによって 得られたスぺクトル、 （a-2)は、 イオントラップを持たない AXIMA-CFR plusで測 定することによって得られたスペクトルである。 さらにこれらの図において、 矢 印でマークされたピーク対は、 BS修飾されたべプチドのものであることを示し ている。 それぞれのペアピークは、 2つの修飾試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2 - ニトロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） と NBS Reagent (light) ( 2—二 卜口 [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリド） との質量差に相当する、 m/z=6の 差を有する。
図 3 (a-1)及び図 3 (a-2)のスぺクトルを互いに比較してわかるように、 両 者でほとんど同じスぺクトルが得られた。 イオントラップを持つ質量分析装置と イオン卜ラップを持たない質量分析装置とで、 ほとんど同じスぺクトルが得られ るということは、 イオントラップを持つ質量分析装置の測定において測定試料の 自己崩壊が抑制されていることを示す。 すなわち、 本発明のマトリックス混合物 を用いると、従来 4-CHCAを単体でマトリックスとして用いたイオントラップ型 質量分析装置 （すなわちイオン化からイオンの検出までの時間が比較的長い質量 分析装置） での測定において起こっていた、 測定試料の自己崩壊が抑制されてい ることがわかった。
( b ) 3H4NBA単独使用のマ卜リックスと、 3H4NBA及び 4-CHCAの混 ^マトリックスとによる質量分析測定
上記 （a ) と同じ測定サンプルを用い、 本発明のマトリックスである 3H4NBA単独使用のマトリックス、 及び 3H4NBAと 4-CHCAとの混合マ卜リッ クスを用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
上記 （a ) と同じ測定サンプルを、 0.1 %TFA水溶液により 1000倍希釈 し、 そのうちの 0.5μΙをマスプレート上に塗布した。
マトリックスとしては、 3Η4ΝΒΑ単独使用のマ卜リックス、及び 3Η4ΝΒΑ と 4-CHCAとの混合マ卜リックスを用いた。
3Η4ΝΒΑ単独使用のマトリックスについては、 3Η4ΝΒΑを、 0.1 %TFAを 含む 50%ァセトニ卜リル水溶液に溶解し、 飽和溶液とした。
3H4NBAと 4-CHCAとの混合マトリックスについては、 上記 （a ) と同 様の方法によって調製した。
あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、 3H4NBA溶液及び 3H4NBAと 4-CHCAとの混合溶液をそれぞれ添加し、 乾燥さ せた後、 MALDI-TOF型質量分析装置 （AXIMA-CFR plus、 島津製作所製） にて測 定を行った。
このとき得られた MSスペクトルを、 図 3 (b-1)及び図 3 (b-2)に示す。 こ れらの図において、横軸は質量 電荷 (m/z)、縦軸はイオンの相対強度 (％)を表す。 また、 （b-1)は、 マトリックスとして 3H4NBAと 4-CHCAとを混合して用いるこ とによって得られたスぺクトル、（b-2)は、マトリックスとして 3H4NBAを用いる ことによって得られたスぺクトルである。 さらにこれらの図において矢印でマ一 クされたピーク対は、 NBS修飾されたぺプチドのものであることを示している。 それぞれのペアピークは、 2つのラベル化試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—二卜 口 [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリド） と NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ
[12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） との質量差に相当する、 m/z=6 の差を 有する。
図 3の (b-1)及び (b-2)のスペクトルを互いに比較してわかるように、 NBS 修飾ペプチドのペアピークが、（b-1)において、（b-2)よりも感度良く検出されてい る。 このことは、 マトリックスとして 3H4NBAに 4-CHCAをさらに混合するこ とによって、 より感度良く検出することができるということを示す。 すなわち、 3H4NBA の、 「質量分析において疎水性試料の検出ができる」 という特長はその ままに、さらに、 4-CHCAの、 「レーザーを当てる最適スポットを容易に探すこと ができる J状態で、 「感度の良い測定をおこなうことができる」という特長が付加 されたことが確認できた。 すなわち、 3H4NBA の特長である、 「イオン化からィ オンの検出までの時間が比較的長いイオントラップ型 MALDI 質量分析装置で測 定してもサンプルの自己崩壊を抑制することができる」 ことと、 4-CHCAの特長 である、 「レーザーを当てる最適スポットを容易に探すことができる j 状態で、 「感度の良い測定をおこなうことができる」 こととが同時に達成されたことが確 認できた。 上記実施例 A— 1及び A— 2では、 本発明の範囲における具体的な 2つ の形態について示したが、 本発明は、 これらに限定されることなく他のいろいろ な形態で実施することができる。 そのため、 上記実施例はあらゆる点で単なる例 示に過ぎず、 限定的に解釈してはならない。 さらに、 クレームの均等範囲に属す る変更は、 すべて本発明の範囲内 ある。 以下に実施例 B— 1 ~ B _ 8によリ第 2の発明をさらに詳しく説明する が、 本発明はこれらにより限定されるものではない。 すでに述べたように、 ％で 表された量の基準に関しては、 特に断りのない限り v/v%とする。 また、 実施例 においては、 NBS試薬によるラベル化を修飾又は NBS修飾と表記することがあ る。 '
'[実施例 B— 1 ]
本実施例においては、 ACTH(5-10)ペプチド (BACHEM社から購入）と、 2 一二トロ [12 c6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド （NBS Reagent (light)；島津製 作所製）でラベル化した ACTH(5-10)ぺプチドとの混合物を測定サンプルに用い、 本発明のマトリックス 3H4NBA ( 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸） 及び 4H3NBA ( 4—ヒドロキシ一 3—二トロ安息香酸）、及び比較用の従来のマトリッ クスとして DHB ( 2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸） 及び 4-CHCA (ひ一シァノ一 4ーヒドロキシ桂皮酸） を用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
ぺプチドのラベル化は、 ACTH 10pgを、 50μΙの 70%酢酸水溶液中に 20 当量の NBS Reagent (light)を加えた試薬溶液中で 1時間反応させることにより 行った。 反応後、 ZipTip(yC18)を用いて脱塩し、 ラベル化体のサンプルとした。 一方、 ACTH lOpgを NBS Reagent (light)を含まない 50μΙの 70%酢酸水溶液中で 1時間撹拌する処理を行ったものを、 上述と同様!こ脱塩し、 非ラベル化体のサン プルとした。 得られたラベル化体サンプルと非ラベル化体サンプルとを等量混ぜ 合わせ、 質量分析用サンプルとした。
マトリックスとして、 DHB、 4-CHCA,及び、 HNBAの異性体 2種すなわ ち 3H4NBA及び 4H3NBAの 4種を用意した。 これらマトリックスは、 0.1 %TFA を含む 50%ァセトニトリル水溶液 Iこ溶解し、 4-CHCA、 DHB及び 4H3NBAは 10 mg/ml、 3H4NBAは飽和溶液としたものを用いた。
上記測定サンプルを 0.5μΙとってマスプレート上に滴下し乾燥させ、次に、 マトリックス溶液を 0.5μΙとって、 先に乾燥させたサンプルの上に滴下し、 乾燥 させた。 （以下、 すべての実施例において同じ操作を行った。） これを、 4種のマ トリックスについて同様に行った。このようにして得られたマスプレートを用い、 AXIMA-CFR装置 （島津製作所製） にて測定を行った。
このとき得られたスペクトルを図 4に示す。 図 4中、 横軸は質量 電荷 (Mass/Charge), 縦軸はイオンの相対強度を表す （以下、 すべての図において横 軸は質量 電荷 (Mass/Charge; m )、 縦軸はイオンの相対強度を表す）。 （a)は、 DHBをマトリックスに用いたときのスペクトル、 （b)は、 4-CHCAをマトリック スに用いたときのスぺクトル、（C)は、 3H4NBAをマトリックスに用いたときのス ぺク卜ル、（d)は、 4H3NBAをマトリックスに用いたときのスぺクトルである。 ま た、 太矢印は NBSラベル化された ACTHペプチドすなわち目的のペプチド、 細 矢印はラベル化されていない ACTHぺプチドのピークの位置を表す。図 4が示す ように、本発明のマトリックスを用いた (c)及び (d)において、選択的に目的のラベ ル化ぺプチドが検出された。
[実施例 B— 2 ]
本実施例においては、 標識修飾されたタンパク質と非標識修飾されたタ ンパク質との混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス 3H4NBA及び 比較用の従来のマトリックス 4-CHCAを用いて、質量分析装置にて測定を行った。
精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 グリセルアルデヒド一 3—ホ スフエイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 一ラクトアルブミン；全て SIGMA 社製） を 25ygずつ混合し合計 100ygとしたものを 2つ用意した。 「13CNBS Isotope Labeling キット J (島津製作所製） のプロトコルに従って、 2つの混合物 のうち一方を 2—二卜口 [13 C6] ベンゼンスルフエニルクロリド （NBS Reagent ( heavy)；島津製作所製） で、 他方を 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルク ロリ ド （NBS Reagent (light)；島津製作所製） で修飾した。 修飾された 2つの試 料を混合し、 脱塩した後、 還元アルキル化 · トリプシン消化を行った。 サンプル を凍結乾燥し、 50 μΙの 0.1 %TFA水溶液に再懸濁したものを ΖίρΉΡ(μ〇ί8)で脱塩 処理した。 これを測定サンプルとし、 マトリックスとして実施例 Β— 1と同じ 4-CHCA溶液及び 3Η4ΝΒΑ溶液を用い、実施例 Β— 1と同様にして質量分析装置 にて測定を行った。
このとき得られたスぺクトルを図 5に示す。 図 5中、 （a)は、 4-CHCAを マトリックスに用いたときのスぺクトル、（b)は、 3H4NBAをマトリックスに用い たときのスぺクトルである。 図 5においては、 （a)で検出されたピークのうち、 修 飾に用いた 2つの試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—二トロ [13C6] ベンゼンスル フエニルクロリ ド） と NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフ ェニルクロリ ド） との質量差又はその倍数の差に相当する、 m/z=6又は m/z=12 の差を有する目的の修飾べプチドのペアピークが、 本発明のマトリックスを用い た (b)において選択的に検出された。
[実施例 B— 3 ]
本実施例においては、 DSIPぺプチド (delta sleep-inducing peptide (ぺプチド研 究所製)； 500 fmol) と BS Reagent (light)でラベル化した DSIPぺプチド (500 fmol) との混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス 3H4NBA及び比 較用の従来のマ卜リックス 4-CHCAを用いて、 箅量分析装置にて測定を行った。
ラベル化のためのサンプルとして DSIPぺプチドを用いた以外は、 実施 例 B— 1と同様にラベル化を行い、 測定サンプルを得た。 マトリックスとして実 施例 B— 1と同じ 3H4NBA溶液及び 4-CHCA溶液を用いて、 実施例 B— 1と同 様にして質量分析装置にて測定を行った。 このとき得られたスぺクトルを図 6に 示す。 図 6中、 （a)は、 4-CHCAをマトリックスに用いたときのスペクトル、 （b) は、 3H4NBAをマトリックスに用いたときのスぺクトルである。また、太矢印は、 NBSラベル化された DSIPペプチドの位置を表し、 楕円で囲んだ部分は、 矢印が 示すピークよりそれぞれ m/z=16, 32, 155小さいピークを表す。 （a)において見ら れるこれらのピークは、本発明のマトリックスを用いた (b)においてはほとんど検 出されず、 これによつて、 目的のペプチドのピークが選択的に検出されたことが 示された。
'[実施例 B _ 4 ]
本実施例においては、 リゾチーム （Lysozyme) を還元 'アルキル化し、 さらに二卜口化した後、 トリプシン消化した。 これにより得られた消化物を測定 サンプルに用い、 本発明のマトリックス 3H4NBA、 及び比較用の従来のマトリッ クス 4-CHCAを用いて質量分析装置にて測定を行った。
以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
まず、 1 mgの Lysozymeを定法に従って還元，アルキル化処理した。 次 に、 Riordan J.F. et al.， 1966; Sokolovsky M. et al.， 1966に記載の方法に従い、 テ トラニトロメタンを用いてニトロ化を行った。 その後、 定法に従ってトリプシン を加えてぺプチド断片へと消化した。 得られた消化物のうちの 14yg相当を分取 して凍結乾燥させた。これを 50 μΙの 0.10/0の TFA水溶液に再溶解させた後、 ZipTip μ.018を用いて脱塩した。このようにして得られた消化物を、測定サンプルとした。 この測定サンプルにおいて、 ペプチドフラグメントのチロシン残基は、 一部が二 トロ化されている。 つまり、 ニトロチロシンを含むペプチドフラグメント、 ニト 口化されていないチロシンを含むぺプチドフラグメント、 及びチロシンを含まな いべプチドフラグメン卜の混合物となっている。
マトリックスとしては、 比較用の従来の 4-CHCA (a-cyano-4-hydroxy cinnamic acid； SIGMA社から購入）、 又は 3H4NBA (3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid； ALDRICH社から購入） を用いた。 これらマトリックスは、 0.1 %TFAを含 む 50%ァセトニトリル水溶液に溶解し、 4-CHCAは 10 mg/ml、 3H4NBAは飽和 溶液としたものを用いた。
上記マトリックスを用いて、 上記測定サンプルを質量分析装置 AXIMA-CFR (島津製作所製）を用いてリフレクト口ンモードでの MS測定を行つ た。 （以下のすべての実施例においても、 AXIMA-CFRを用いたリフレクトロンモ ードでの MS測定を行った。） このとき得られたスぺクトルを、図 7及び図 8 ( A 及び B ) に示す。 図 8の Aは、 図 7の m/z=850-960の部分の拡大図、 図 8の Bは 囪 7の m/z=1740-1820の部分の拡大図である。図 7及び図 8 ( A及び B ) におい て、 （a)は、 マトリックスとして 4-CHCAを用いて測定したスペクトル、 （b)は、 マ卜リックスとして 3H4NBAを用いて測定したスぺクトルである。
さらに、 黒矢印で示されたピーク （(2*)： m/z=1798.83；
Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr*-Gly-lle-Leu-Gln-lle-Asn-Ser-Arg (配列番号 4 )、 及び (8*)： m/z=919.41； His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr*-Arg (配列番号 5 )、 ここで Tyr* は、 ニトロ化されだチロシン残基を示す） は、 目的のニトロ化されたチロシン残 基を含むトリプシン消化べプチドのピークである。
白矢印で示されたピーク （(2) ： m/z=1753.84；
Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-lle-Leu-Gln-lle-Asn-Ser-Arg (配列番号 6 ) 及び (8) ： m/z=874.42； His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg (配列番号 7 ) ) は、 ニトロ 化されなかった以外は上記目的の消化べプチドと同じ配列を有する消化べプチド である。
矢印が付されていない (3)： m/z=1675.80；
lle-Val-Ser-Asp-Gly-Asn-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Ala-Trp-Arg (配列番号 8 )、 (5)： m/z=1268.61 ； Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys (配列番号 9 )及び (6) ： m/z=1045.54 ; Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-lle-Arg (配列番号 1 0 ) は、 Lysozyme由来のトリプシン消化べプチドのピークである。
破線の楕円で囲まれたピークは、 上記目的の消化べプチドのピークより m/z=16又は m/z=32小さいピークでる。
これらの図が示すように、 マトリックスとして 3H4NBAを用いた場合に のみ、 目的のニトロ化されたチロシン残基を含むぺプチドフラグメン卜のピーク がはっきりと検出され、 ニトロ化されていないチロシン残基を含むぺプチドフラ グメン卜のピークや前記の m/z=16、 m/z=32小さいピークがほとんど検出されな くなった。 つまり、 3H4NBAをマトリックスとして用いることで、 選択的に目的 のピークのみが検出された。
' [実施例 B _ 5 ]
本実施例においては、 NBS試薬 （2-nitrobenzenesulfenyl chloride (MW = 189.62)；島津製作所製） でシスティンをラベル化したペプチドと、 ラベル化して いないペプチドとの混合物を測定サンプルに用い、 本発明のマトリックス
3H4NBA、 及び比較用の従来のマトリックス CHCAを用いて質量分析装置にて 測定を行った。
以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
まず、ぺプチド IRRP1 (Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp (配列番号 1 1 ) ； BACHEM社から購入） 10 を、 0.1 %TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液を 用いて分注し、 凍結乾燥させた。 これを 15μΙの Milli-Q水 （ミリポア社製） に溶 解し、 これと 35μΙの NBS試薬溶液 （NBS試薬 0.17 mgを 35μΙの酢酸に溶解し たもの） とを混合して室温で一時間反応させた。 これを ZipTip -c18を用いて脱塩 したものを、 ラベル化ペプチドサンプルとした。
別途、 10pgのべプチド IRRP1を 15μΙの Milli-Q水に溶解し、 35μΙの酢 酸と混合して室温で一時間静置し、 ZipTip -c18を用いて脱塩したものを、 非ラベ ル化ぺプチドサンプルとした。
ラベル化ぺプチドサンプルと非ラベル化べプチドサンプルとを等量混合 し、 測定サンプルとした。
マトリックスとしては、 寒施例 B— 4と同じものを調製して用い、 上記 測定サンプルを質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、 図 9に示す。図 9において、 「X 5Jで示した m/z=845-940に相当する範囲は、縦 方向に 5倍に拡大表示している。図 9中、（a)は、マトリックスとして 4-CHCAを 用いて測定したスペクトル、 （b)は、 マトリックスとして 3H4NBAを用いて測定 したスペクトルである。 さらに、 黒矢印で示されたピーク （m/z=1038.40) は、 目的のラベル化べプチドサンプルのピーク、 白矢印で示されたピーク
(m/z=886.42) は、 非ラベル化ペプチドサンプルのピーク、破線の楕円で囲まれ たピークは、 目的のぺプチドのピークより m/z=16小さいピークである。
これらの図が示すように、 マトリックスとして 3H4NBAを用いた場合に のみ、目的のラベル化べプチドサンプルのピークがはっきりと検出され、 4-CHCA を用いた場合に検出されていた非ラベル化ぺ チドのピーク及び上記の m/z=16 小さいピークが検出されなくなった。 つまり、 3H4NBAをマトリックスとして用 いることで、 選択的に目的のピークのみが検出された。
[実施例 B— 6 ]
本実施例においては、 P-ニトロフ: t二ルァラニンを含むぺプチドを測定 サンプルに用い、 本発明のマトリックス 3H4NBA、 及び比較用の従来のマトリツ クス 4-CHCAを用いて質量分析装置にて測定を行った。
以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
ぺプチド HIV sublll
(His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Phe*-Glu-Ala-nLeu-Ser-NH2 (配列番号 1 2 )； Phe * = p-ニトロフエ二ルァラニン、 nLeu =ノルロイシン、 Ser-NH2=カルボキシル基がァ ミド化されたセリン； BACHEM社から購入） 10 を、 0.1 %TFAを含む 50% ァセトニトリル水溶液を用いて分注し、 凍結乾燥させた。 これを 50μΙの 0.1 % TFA水溶液に溶解し、 ΖϊρΤΐρμ.οι 8を用いて処理したものを、測定サンプルとした。
マ卜リックスとしては、 寒施例 Β— 4と同じものを調製して用い、 上記 測定サンプルを質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、 図 1 0に示す。図 1 0中、（a)は、マトリックスとして 4-CHCAを用いて測定した スペクトル、 （b)は、 マトリックスとして 3H4NBAを用いて測定したスペクトル である。 さらに、 黒矢印で示されたピーク （m/z=1314.73) は、 目的のペプチド HIV sublllのピーク、 破線の楕円で囲まれたピークは、 目的のペプチドのピーク より m/z=16小さいピークである。
これらの図が示すように、 マトリックスとして 3H4NBAを用いた場合に めみ、 目的の HIV sublllのピークのみが検出され、 4-CHCAを用いた場合に検出 されていた m/z=16小さいピークが検出されなくなった。 つまり、 3H4NBAをマ トリックスとして用いることで、 選択的に目的のピークが検出された。
[実施例 B _ 7 ]
本実施例においては、 NBS試薬 （2-nitrobenzenesulfenyl chloride (MW = 189.62)；島津製作所製） でラベル化した ACTHと、 ラベル化していない ACTH との混合物を測定サンプルに用い、 本発明のマトリックスである 2,4DNA ( 2 , 4ージニトロアニリン）、 2B4,6DNA ( 2—ブロモ一 4， 6—ジニ卜ロアニリン）、 4NA ( 4—ニトロァニリン）、 4NBA ( 4—ニトロ安息香酸）、 2NP ( 2—二トロ フエノール）、 及び 2,5DNP ( 2， 5—ジニトロフエノール） と、 比較用の従来の マトリックス 4-CHCAとを用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
以下に測定サンプルの調製方法を述べる。 測定サンプルは、 濃度の違う ものを 2種用意した。
ZipTipM-G18による脱塩処理の代わりに C18カラム（ YMC-Pack Pro C18； YMC社製）を用いたクロマトグラフィ一による精製を行った以外は、実施例 B— 1と同様にしてラベル化ペプチドサンプル （ラベル化 ACTH) を調製した。 この ラベル化ペプチドサンプルと、 非ラベル化ペプチドサンプル （ラベル化していな い ACTH)とを等モルずつ混合して、それぞれの濃度が 0.5 pmol/μΙ又は 5 pmol/μΙ となるように 0.1 0/oTFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液に溶解させて調製した 測定サンプルを得た。
マトリックスとしては、 2,4DNA、 2B4,6DNA、 4NA、 4NBA、 2NP、 及び 2.5DNP (4NAは SIGMA社から、 その他は全て ALDRICH社から購入した） をそ れぞれ、0.1 % TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液に溶解させた。 4NA、2NP、 2,5DNPはそれぞれ 10 mg/ml、 2,4DNA、 2B4,6DNA、 4NBAは飽和溶液としたも のを用いた。 比較用の従来の 4-CHCAは、 10 mg/mlとしたものを用いた。
' 上記マトリックスを用いて、 上記測定サンプルを質量分析装置にて測定 を行った。 このとき得られたスペクトルを、 図 1 1及ぴ図 1 2に示す。
図 1 1中 (a)は、 マトリックスとして 4-CHCAを用いて測定したスぺクト ル、 （b)は、 マトリックスとして 2,4DNAを用いて測定したスぺクトル、 （c)は、 マ トリックスとして 2B4,6DNAを用いて測定したスぺクトルである。 これらのスぺ クトルは、 ラベル化ペプチド及び非ラベル化ペプチドの濃度をそれぞれ 0.5 pmol/μΙに調製した測定サンプルのものである。
図 1 2中、 （a)は、 マトリックスとして 4-CHCAを用いて測定したスぺク トル、 （b)は、 マトリックスとして 4NAを用いて測定したスペクトル、 （c)は、 マ トリックスとして 4NBAを用いて測定したスペクトル、 （d) は、 マ卜リックスと して 2NPを用いて測定したスペクトル、 （e) は、 マトリックスとして 2,5DNPを 用いて測定したスペクトルである。 これらのスペクトルは、 ラベル化ペプチド及 び非ラベル化ぺプチドの濃度をそれぞれ 5 ρηιοΙ/μΙに調製した測定サンプルのも のである。
さらに、 黒矢印で示されたピーク （m/z=983.37) は、 目的のラベル化ぺ プチドサンプルのピーク、 白矢印で示されたピーク （m/z=831.39) は、 非ラベル 化ぺプチドサンプルのピーク、 破線の楕円で囲まれたピークは、 目的のぺプチド のピークよリ m/z=16又は m/z=32小さいピークである。
これらの図が示すように、 本発明のマトリックスとして用いた場合はい ずれも、 4-CHCAを用いたときに検出されていた非ラベル化ぺプチドのピークや、 目的のペプチドのピークより m/z= 16及び m/z=32小さいピークが検出されなく なり、 主にラベル化ペプチドのピークのみが検出されるようになった。 つまり、 本発明のマ卜リックスを用いることで、 選択的に目的のピークのみが検出される ようになったことがわかる。
[実施例 B— 8 ]
' 本実施例においては、 NBS試薬によって修飾されたペプチドと非修飾べ プチドとの混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックスである、 4-CHCA と 3H4NBAとの混合マトリックス、 4-CHCAと 3H2NBA ( 3—ヒドロキシー 2— ニトロ安息香酸） との混合マトリックス、 4-CHCAと 2,4DNAとの混合マトリツ クス、 4-CHCAと 4NAとの混合マ卜リックス、 4-CHCAと 4NP ( 4—ニトロフエ ノール） との混合マトリックス、 及び 3H4NBA単独使用のマトリックスと、比較 用の従来のマ卜リックス 4-CHCAとを用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 グリセルアルデヒド一 3—ホ スフエイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 一ラクトアルブミン；全て SIGMA 社製） を 25pgずつ混合し合計 100ygとしたものを 2つ用意した。 変性剤として 終濃度 8Mの尿素を用いてそれぞれの混合物について変性を行った以外は、 r 3CNBS Isotope Labeling キット J (島津製作所製） のプロトコルに従い、 一方 を NBS Reagent (heavy) ( 2—ニトロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） で標識修飾し、 他方を NBS Reagent (light) ( 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフ ェニルクロリ ド） で非標識修飾し、 両修飾試料の混合、 還元、 アルキル化、 及び 卜リプシン消化を行った。消化後のサンプルを ZipTipp-C18で脱塩処理し、 0.1 % TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液によリ溶出し、得られた溶出液を測定サン プルとした。 この溶出液を 0.1 %TFAを含む 50%ァセ卜二トリル水溶液を用いて 10倍に希釈し、 そのうち 0.5μΙを、 マスプレート上に塗布した。
マトリックスとしては、 以下のように調製したものを用いた。 0.1 %TFA を含む 500/0ァセ卜二トリル水溶液を溶媒とし、 4-CHCA、 3H4NBA, 3H2NBA、 2,4DNA、 4NA、 4NPをそれぞれ溶解させた。 4-CHCA、 3H2NBA、 4NA、及び 4NP はそれぞれ 10 mg/mlの溶液、 3H4NBA及び 2,4DNAはそれぞれ飽和溶液とした。 混合マトリックスについては、 このように調製した溶液を、 1 ： 1の体積比で混 合して使用した。 3H4NBA単独使用のマトリックスと、 比較用の従来のマトリツ クス 4-CHCAとについては、 このように調製した溶液をそのまま用いた。
1 あらかじめ用意しておいた、 測定サンプルの塗布を行ったマスプレート 上に、 上記マトリックスの溶液 0.5μΙを添加し、 乾燥した後、 質量分析装置にて 測定を行った。 このとき得られたスぺクトルを、 図 1 3に示す。 図 1 3中、 （a) は 4-CHCAと 3H4NBAとの混合マトリックス （+3H4NBA) を、 （b)は 4-CHCA と 3H2NBAとの混合マトリックス （+3H2NBA) を、 （C)は 4-CHCAと 2，4DNA との混合マトリックス （+2，4DNA) を、 （d)は 4-CHCAと 4NAとの混合マトリッ クス （+4NA) を、 （e)は 4-CHCAと 4NPとの混合マトリックス （+4NP) を、 （f) は比較用の従来のマ卜リックス 4-CHCAを、 （g)は 3H4NBA単独使用のマトリッ クスをそれぞれ用いて測定したスペクトルである。 さらに、 黒矢印で示されたピ ーク対は、 目的の NBS修飾ペプチドのものであることを示している。 なお、 こ の目的の修飾べプチドフラグメントのペアピークは、 修飾に用いた 2つの試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—二トロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） と NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） との 質量差又はその倍数の差に相当する、 m/z=6 又は m/z=12の質量差を有する。
図 1 3が示すように、（a)~(e)のように混合マ卜リックスを用いた場合は、
(f)のように 4-CHCAを単独で用いた場合に比べて目的のピークが特異的に検出さ れていることがわかる。 さらに、 混合マトリックスを用いた (a)~(e)においては、
(g)のように 3H4NBAを単独で用いた場合よリも、 目的のピークの検出感度がよ リ良くなつていることもわかる。 つまり、 本発明のマトリックスの中でも混合マ トリックスを用いた (a)〜(e)は、 （g)のように本発明のマトリックスの中でも単独 の化合物を用いる場合に達成されるような目的物質に対する特異的イオン化能力 を残しつつ、 従来から用いられてきた 4-CHCAと同程度に検出感度が向上する、 という好ましい測定条件であるといえる。 上記実施例 B— 1〜B— 8では、 本発明の範囲における具体的な 8つの 形態について示したが、 本発明は、 これらに限定されることなく他のいろいろな 形態で実施することができる。 そのため、 上記実施例はあらゆる点で単なる例示 に過ぎず、 限定的に解釈してはならない。 さらに、 クレームの均等範囲に属する 変更は、 すべて本発明の範囲内である。 上述した第 3の発明のプロ卜コルの一部の工程又は全部の工程を用いて、 本発明の効果を示した実験例を、 以下の実験例 C一 1 ~ C一 9に示す。
<実験例 C—1 >
モデルタンパク質として精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン
ovalbumin(Ova), グリセルアルデヒド一3—ホスフェートデヒドロゲナーゼ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3P)、 リゾチーム lysozyme (し ys)、 及び ーラクトアルブミン a-lactalbumin(a-lact)、すべて SIGMA社製）を各 25yg 用意し、 混合して合計 100pgとしたものをコントロールサンプル (C)とした。
別途、サンプル (S)を 2種類調製した。サンプル (S)のうち一方は、 以下の ようにして調製した。 すなわち、 上述のサンプル (C)と同じタンパク質混合物 100 gを、 従来の NBSプロトコルのように、 5mM EDTAを含む 0.1w/v % SDS 水溶液で可溶化した後 100°Cで 3分間加熱し、 NBS(light)試薬を用いたラベル化 及び LH-20カラムを用いた脱塩を行うことにより得た。 なお、本実験例及び以下 の実験例において記載する可溶化とは、 SDS-PAGEのサンプル調製のために一般 的に行われる可溶化とは別の工程である。
サンプル (S)のうちもう一方は、以下のようにして調製した。サンプル (C) と同じタンパク質混合物 100pgに対し、 上述と同様の SDS可溶化を行い、 NBS(light)試薬を用いたラベル化を行った。 また別途、 サンプル (C)と同じタンパ ク質混合物 100ygに対し、 上述と同様の SDS可溶化を行い、 上述の NBS(light) 試薬と等量の NBS(heavy)試薬を用いたラベル化を行った。 そして、 得られた NBS(light)ラベル化物と NBS(heavy)ラベル化物とを混合し、 LH-20カラムによる 脱塩を行った。
別途、 サンプル (G)を 2種類調製した。 いずれも、 本発明のプロ卜コルの ように 5mM EDTAを含む 6Mグァニジン塩酸塩水溶液を用いて可溶化した以外は 上述のサンプル (S)の調製と同様に行うことにより得た。
別途、 サンプル (U)を 2種類調製した。 いずれも、 本発明のプロトコルの ように 5mM EDTAを含む 8M尿素水溶液を用いて可溶化した以外は上述のサンプ ル (S)の調製と同様に行うことにより得た。
上述のようにして得られたサンプル (C)、 （S)、 （G)及び (U〉について、 電気 泳動を行った。 サンプル (C)については、 その 10pgに相当する量をレーン 1に展 開した。 一方、 サンプル (S)、 （G)及び (U)の各々については、 その 1/20に相当す る量を展開した （レーン 2〜7 )。
電気泳動の結果を図 1 4に示す。 図 1 4中、 レーン 1はコントロールサ ンプル (C)； レーン 2は NBS(light)ラベル化タンパク質のみを含むサンプル (S)； レーン 3は NBS(light)ラベル化タンパク質のみを含むサンプル ）； レーン 4は NBS(light)ラベル化タンパク質のみを含むサンプル (U)； レーン 5は NBS(light)ラ ベル化タンパク質と NBS(heavy)ラベル化タンパク質とを等量混合したサンプル (S)； レーン 6は NBS(light)ラベル化タンパク質と NBS(heavy)ラベル化タンパク 質とを等量混合したサンプル (G)； レーン 7は NBS(light)ラベル化タンパク質と NBS(heavy)ラベル化タンパク質とを等量混合したサンプル (U)についてのもので ある。 図 1 4のレーン 3、 4、 6及び 7の結果が示すように、 可溶化のために変 性剤であるグァニジン塩酸塩や尿素を用いると、 サンプルをほとんどロスするこ となく可溶性を保つことができることが示された。 <実験例 C一 2 >
マウス (C57BL)の血清 100 gを、 コントロールサンプル (C)とした。
別途、サンプル (S)を 2種類調製した。サンプル (S)のうち一方は、 以下の ようにして調製した。すなわち、上述のサンプル (C)と同じマウス血清 100μ9を、 従来の NBSプロトコルのように、 0.5mM EDTAを含む 0.1w/v % SDS水溶液で 可溶化した後 100°Cで 3分間加熱し、 NBS(light)試薬を用いたラベル化を行った。 また別途、サンプル (C)と同じマウス血清 100ygを、上述と同様の SDS可溶化を 行い、上述の NBS(light)試薬と等量の NBS(heavy)試薬を用いたラベル化を行った。 そして、得られた NBS(light)ラベル化物と NBS(heavy)ラベル化物とを混合し、ラ ベル化混合物を得た。
サンプル (S)のうちもう一方は、 以下のようにして調製した。 すなわち、 マウス血清 100pgに対し、 上述と同様にしてラベル化混合物を調製し、 さらに LH-20カラムによる脱塩を行うことによリ得た。
別途、 サンカレ (G)を 2種類調製した。 いずれも、 本発明のプロトコルの ように 5mM EDTAを含む 6Mグァニジン塩酸塩水溶液を用いて可溶化した以外は 上述のサンプル (S)の調製と同様に行うことにより得た。
別途、 サンプル (U)を 2種類調製した。 いずれも、 本発明のプロトコルの ように 5mM EDTAを含む 8M尿素水溶液を用いて可溶化した以外は上述のサンプ ル (S)の調製と同様に行うことにより得た。
得られたサンプル (C)、 （S)、 （U)及び (G)について、 電気泳動を行った。 な お、 サンプル (C)については、 その 10ygに相当する量をレーン 2に、 2pgに相当 する量をレーン 3に展開した。 サンプル (S)、 （U)及び (G)についてはいずれも、 そ の 1/20に相当する量を展開した （レーン 4 ~ 9 )。
電気泳動の結果を図 1 5に示す。図 1 5中、レーン 1は分子量マーカ一、 レーン 2及び 3はコントロールサンプル (C)； レーン 4はラベル化後のサンプル (S)； レーン 5はラベル化及び脱塩後のサンプル (S)； レーン 6はラベル化後のサ ンプル (U) ; レーン 7はラベル化及び脱塩後のサンプル (U)； レーン 8はラベル化 後のサンプル (G)； レーン 9はラベル化及び脱塩後のサンプル (G)についてのもの である。 図 1 5のレーン 6、 7、 8及び 9の結果が示すように、 可溶化のために 変性剤であるグァニジン塩酸塩や尿素を用いると、 サンプルをほとんどロスする ことなく可溶性を保つことができることが示された。
<実験例 C— 3 >
解析試料としてマウス肝臓の抽出液を用いた。 この解析試料に対し、 従 来の NBSプロトコルに従って、 SDSによる可溶化、 ラベル化、 脱塩、 SDSによ る再可溶化、還元■アルキル化及び消化の操作を行った。別途、解析試料に対し、 本発明プロ卜コルに従 όて、 尿素による可溶化、 ラベル化、 脱塩、 尿素による再 可溶化、 還元 ·アルキル化及び消化の操作を行った。 なお、 いずれのラベル化操 作においても、 一方で、 可溶化試料に対し NBS(light)試薬を用いてラベル化し； 他方で、等量の可溶化試料に対し NBS(light)試薬と等量の NBS(heavy)試薬を用い てラベル化し；その後、 得られた両ラベル化物を混合した。 以下の実験例におい ても、 ラベル化操作についてはこれと同様の操作を行う。 得られたそれぞれの試 料に対し、 phenyl column (アマシャムバイオサイエンス社製カラム； HiTrap phenyl) を用いて NBSラベル化ぺプチドの分離を行った。溶出は、ァセトニトリ ルの段階濃度勾配により行い （具体的には、 10~40°/。の間で 5%毎の 7段階の濃 度について行った。）、 各濃度において 2フラクションを分画した。
各溶出フラクション （EL1 ~EL14) について AXIMA-CFRを用いて解析 し、 観察されたペアピークの数を表 1にまとめた。 表中、 （a ) は SDSを用いた 方法、 （b ) は尿素 (Urea)を用いた方法についての結果を示す。 表 1
Figure imgf000075_0001
この表が示すように、 従来の NBSプロトコルのように SDSを用いた方 法では合計 14のペアピークしか観察されなかったものが、 本発明のプロトコル のように尿素を用いた方法では合計 76のペアピークが観察された。 また、 表中 の EL5のフラクション （すなわちァセトニトリル濃度 20%) についてのマスス ぺクトルを図 1 6 ( a ) 及び （b ) に示す。 図中、 矢印で示されるピークがラベ ル化ぺプチドのペアピークである。
<実験例 C一 4 >
モデルタンパク質として精製タンパク質 3種類 （G3P、 Lys及び a-lact) の混合物を用いた。 この混合物に対し、 従来の NBSプロトコルに従って、 SDS による可溶化、 ラベル化、 脱塩、 SDSによる再可溶化、 還元■アルキル化及び消 化の操作を行った。 別途混合物に対し、 本発明のプロトコルに従って、 塩酸グァ 二ジンによる可溶化、 ラベル化、 脱塩、 塩酸グァニジンによる再可溶化、 還元 - アルキル化及び消化の操作を行った。 さらに別途混合物に対し、 可溶化のために 尿素を用いた以外は、 上述の本発明のプロトコルに従った操作と同様の操作を行 つた。得られたそれぞれの試料に対し、 phenyl columnを用いて NBSラベル化ぺ プチドの分離を行い、 MS解析を行った。
得られた MSスぺクトルについて、 ペアピークそれぞれのモノアイソ卜 ピックピーク（monoisotopic peak)の面積比を定量し比較した。 具体的には、 ペア ピークのうち、 ピークが大きいほうの面積を 100としたときの、 ピークが小さい ほうの相対面積を求め、これを定量性の指標として双方のスぺクトルを比較した。 その結果を表 2に示す。表 2が示すように、従来の NBSプロトコルのように SDS を用いた方法ではピークの相対面積の平均値が 80.3であるのに対し、本発明のプ 口卜コルのようにグァ二ジン塩酸塩 (GdnHCI)及び尿素 (Urea)を用いた方法では それぞれ 90.0、 92.6であった。 このことから、本発明によって定量性が大きく改 善されたことが示された。
表 2
Figure imgf000077_0001
さらに、 ペアピークの面積比分散及び標準偏差を求めた。 その結果も表
2に示す。 表 2が示すように、分散については、従来のプロ卜コルのように SDS を用いた方法では 186.4であるのに対し、 本発明のプロトコルのようにグァニジ ン塩酸塩及び尿素を用いた方法ではそれぞれ 37.1、 30.5であった。一方、標準偏 差については、 従来のプロトコルのように SDSを用いた方法では 13.7であるの に対し、 本発明のプロトコルのようにグァニジン塩酸塩及び尿素を用いた方法で はそれぞれ 6.1、 5.5であった。分散及び標準偏差は値が小さいほど、 データのば らつきが小さい。 従って、 本発明の方法によってこのようなばらつきも大きく改 善されたことが示された。
<実験例 C一 5 > モデルタンパク質として精製タンパク質 4種類 （Ova、 G3P、 Lys及び α-lact) の混合物を用い、 従来の NBSプロトコルに従って可溶化、 ラベル化、 脱 塩、 再可溶化、 還元■アルキル化及び消化の操作を行った。 一方、 同じモデルタ ンパク質を用い、 本発明のプロトコルに従って尿素による可溶化、 ラベル化、 脱 ½、 尿素による再可溶化、 還元 'アルキル化及び消化の操作を行った。 さらに、 両方のサンプルについてそれぞれ phenyl columnを用いて分画し、 従来の NBS プロトコルに従って操作を行うことによって調製されたものについて一画分を回 収し、 本発明のプロトコルに従って操作を行うことよって調製されたものについ ては、 前記一画分に相当する画分を回収した。 回収したそれぞれの画分を、
AXIMA-CFRを用いて解析した。 このとき得られた結果を図 1 7 ( a ) 及び （b ) に示す。 図 1 7中、 （a ) は従来の NBSプロトコルによる結果、 （b ) は本発明 のプロトコルによる結果を表し、 それぞれの図は、 横軸に質量 電荷
(Mass/Charge)、 縦軸にイオンの相対強度を表す。 図 1 7の結果が示すように、 従来法においては副反応のアルキル化が起こったことを示す +57(m/z)のピークが 検出されるが、 本発明の方法においてはそのようなピークは検出されない。
<実験例 C一 6 >
モデルタンパク質として精製タンパク質 4種類 （Ova、 G3P、 Lys及び α-lact) の混合物を用い、 従来の NBSプロトコルに従って可溶化、 ラベル化、 脱 塩、再可溶化、還元■アルキル化、消化、及び濃縮カラム（LH-20) を用いた NBS ラベル化ぺプチド分離の操作を行った。 代表的な溶出フラクションのマススぺク トルを図 1 8に示す。 一方、 同じモデルタンパク質を用い、 本発明プロトコルに 従って尿素による可溶化、 ラベル化、 脱塩、 尿素による再可溶化、 還元 'アルキ ル化、消化、及び phenyl column (アマシャムバイオサイエンス社製カラム； HiTrap phenyl)を用いた NBSラベル化タンパク質分離の操作を行った。代表的な溶出フ ラクシヨンのマススぺクトルを図 1 9に示す。 それぞれの図は、 横軸に質量 Z電荷 （Mass/Charge)、 縦軸にイオンの相 対強度を表す。図 1 8は、 LH-20による全 10フラクションのうち、 1、 3、 5、 7及び 9番目のフラクション （Fr.1、 Fr.3、 Fr.5、 Fr.7及び Fr.9) についての結果 である。図 1 9は、 phenyl columnによる全 18フラクションのうち、 1、 4、 7、 Ί 0、 1 2及び 1 4番目のフラクション 「.1、 4、 7、 10 12及び「に14) についての結果である。 図 1 8及び図 1 9の結果が示すように、 本発明の方法に おいては、 従来の NBS法において多数見られた 1200-1700(m/z)近辺の非ラベル 化ペプチドがほとんど検出されなかった。 また、 図 1 8では 1、 2、 4、 9、 1 0、 1 2及び 1 3番目のペプチド （図中に矢印で表記） が、 測定対象となった溶 出画分のほぼ全体にわたって溶出されていたが、 図 1 9では、 それらのペプチド がある程度分離されて溶出された。
<実験例 C— 7 >
モデルタンパク質として精製タンパク質 4種類 （Ova、 G3P、 Lys及び α-lact)の混合物を用い、本発明のプロ卜コルに従って尿素による可溶化、 ラベル 化、 脱塩、 尿素による再可溶化、 還元■アルキル化、 消化、 及び phenyl column を用いた NBSラベル化べプチド分離の操作を行った。次に、 phenyl columnによ つて分画溶出した 1フラクションを質量分析用 I ^料として調製し、 以下の 3種の マトリックスについてそれぞれ AXIMA-QITによる質量分析を行った。 マトリツ クスとしては、 従来用いられていた DHB、 本発明において用いられる 3-CHCA 及び 3H4NBAの 3種を、それぞれ 0,1%TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液を 溶媒として、 DHBと 3-CHCAとはそれぞれ 10mg/ml、 3H4NBAは飽和溶液とし て用いた。調製した試料とマトリックス溶液とを等量混ぜ合わせ、 AXIMA-QITに て測定した。 このとき得られた結果を図 2 0 ( a ) ~ ( c ) に示す。
それぞれの図は、 横軸に質量 電荷 （Mass/Charge)、 縦軸にイオンの相 対強度を表し、図 2 0 ( b )及び（c )において矢印 (り〜 (iii)で示されるピークは、 ラベル化ペプチドのペアピークである。 図 2 0 ( a ) ~ ( c ) が示すように、 マ トリックスとして DHBを用いた場合 （a ) は、 NBSラベル化ペプチドはほとん どイオン化されないためマススぺクトル上で検出されないが、 3-CHCA ( b ) や 3H4NBA ( c ) を用いた場合は、 NBSラベル化タンパク質が効率よくイオン化さ れたため、 マススペクトル上での検出が可能になった。 さらに、 図 2 0 ( b ) で 得られた矢印 (i)で示されるペアピークのうち NBS(light)ラベル化ぺプチドに相当 する 1198.53(m/z)に相当するイオンについて MS/MS解析した結果を図 2 1に示 す。
<実験例 C一 8 >
本実験例においては、 NBS試薬によって修飾されたべプチドと非修飾べ プチドとの混合物を測定サンプルに用い、 3H4NBAと 4-CHCAとの混合マ卜リッ クスを用い、 質量分析装置にて測定を行った。
測定サンプルは、 以下のように調製した。
精製タンパク質 4種類 （オボアルブミン、 グリセルアルデヒド一 3—ホ スフエイトデヒドロゲナーゼ、 リゾチーム、 一ラクトアルブミン；全て SIGMA 社製） を 25ygずつ混合し合計 100 gとしたものを 2つ用意した。 変性剤として 終濃度 8Mの尿素を用いて、それぞれの混合物についての可溶化及び NBS修飾試 料混合物の再可溶化を行った以外は、 「13CNBS Isotope Labeling キット」 （島津 製作所製）のプロトコルに従って測定サンプルを調製した。すなわち、一方を NBS Reagent (heavy) ( 2—ニトロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） で標識修 飾し、 他方を NBS Reagent (light) ( 2—ニトロ [12C6] ベンゼンスルフエニルク 口リ ド）で非標識修飾し、両修飾試料の混合、脱塩、尿素による再可溶化、還元、 アルキル化、 及びトリプシン消化を行った。 消化後のサンプルを ZipTip -C18で 脱塩処理し、 0.1 %TFAを含む 50%ァセトニトリル水溶液 4μΙによリ溶出したも のを測定サンプルとした。 このうち、 0.5μΙをマスプレート上に塗布した。 マトリックスとしては、 以下のように調製したものを用いた。 0.1 %TFA を含む 50O/Oァセトニトリル水溶液を溶媒とし、 3H4NBA及び 4-CHCAをそれぞ れ溶解させた。 3H4NBAは飽和溶液、 4-CHCAは 10mg/mlの溶液とした。 このよ うに調製した溶液を、 1 ： 1の体積比で混合し、 マトリックス混合溶液を得た。 'あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、 マトリ ックス混合溶液 0,5μΙを添加し、 乾燥した後、 イオントラップを持つ
MALDI-rr-TOF型質量分析装置 （AXIMA-Q 、 島津製作所製） 及びイオントラッ プを持たない MALDI-TOF型質量分析装置（AXIMA-CFR plus、 島津製作所製） に て測定を行った。
このとき得られた MSスぺクトルを、 図 2 2に示す。 図 2 2中、 横軸は 質量 電荷 (m/z)、縦軸はイオンの相対強度 (％lnt.)を表す。 また、 （a)は、 イオント ラップを持つ AXIMA-Qrrで測定することによって得られたスぺクトル、 （b)は、 イオン卜ラップを持たない AXIMA-CFR plusで測定することによつて得られたス ぺクトルである。 図 2 2において、 矢印でマークされたピーク対は、 NBS修飾さ れたペプチドのものであることを示している。 それぞれのペアピークは、 2つの 修飾試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—二トロ [13C6] ベンゼンスルフエニルクロ リ ド） と NBS Reagent (light) ( 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエニルクロリ ド） との質量差に相当する、 m/z=6の差を有す 。
図 2 2の (a)及び (b)のスぺクトルを互いに比較してわかるように、両者で ほとんど同じスぺクトルが得られた。 イオントラップを持つ質量分析装置とィォ ントラップを持たない質量分析装置とで、 ほとんど同じスぺクトルが得られると いうことは、 イオントラップを持つ質量分析装置の測定において測定試料の自己 崩壊が抑制されていることを示す 9 すなわち、 本発明のマトリックス混合物を用 いると、従来 4-CHCAを単体でマトリックスとして用いたイオントラップ型質量 分析装置 （すなわちイオン化からイオンの検出までの時間が比較的長い質量分析 装置） での測定において起こっていた、 測定試料の自己崩壊が抑制されているこ とがわかった。 また、 検出されたピークは、 そのほとんどが NBS修飾されたぺ プチドのペアピークであることから、マトリックス 3H4NBAが単独で有する特異 的検出能は、混合マトリックスを用いた場合でも保持されていることがわかった。
< 実験例 C— 9 >
本実験例では、 実験例 C一 8と同じ測定サンプルを用い、 3H4NBA単独 使用のマトリックス、及び 3H4NBAと 4-CHCAとの混合マトリックスを用いて、 質量分析装置にて測定を行った。
実験例 C一 8と同じ試料を用い、 同じ操作により 4μΙの溶出液を測定サ ンプルとして得た。 このうち 1 μΙを、 0.1 %TFA水溶液により 1000倍希釈し、 そ のうちの 0.5μΙをマスプレート上に塗布した。
マトリックスとしては、 3Η4ΝΒΑ単独使用のマトリックス、及び 3Η4ΝΒΑ と 4-CHCAとを組み合わせた混合マトリックスを用いた。
3Η4ΝΒΑ単独使用のマトリックスについては、 3Η4ΝΒΑを、 0.1 %TFAを 含む 50%ァセトニトリル水溶液に溶解し、飽和溶液とした。あらかじめ用意して おいた測定サンプル塗布を行ったマスプレート上に、この 3H4NBA溶液を添加し、 乾燥した後、 MALDI-TOF型質量分析装置 （AXIMA-CFR plus、 島津製作所製） に て測定を行った。
3H4NBAと 4-CHCAとの混合マトリックスについては、 実験例 C— 8と 同様の方法によって調製した。 あらかじめ用意しておいた測定サンプル塗布を行 つたマスプレート上に、 この混合溶液を添加し、 乾燥した後、 MALDI-TOF型質 量分析装置 （AXIMA-CFR plus、 島津製作所製） にて測定を行った。
このとき得られた MSスぺクトルを、 図 2 3に示す。 図 2 3中、 横軸は 質量 電荷 (m )、縦軸はイオンの相対強度 (％lnt.)を表す。 また、（a)は、 マトリツ クスとして 3H4NBAと 4-CHCAとを混合して用いることによって得られたスぺ クトル、 ib)は、 マトリックスとして 3H4NBAを用いることによって得られたス ぺクトルである。 さらに図 2 3において矢印でマークされたピーク対は、 NBS修 飾されたペプチドのものであることを示している。 それぞれのペアピークは、 2 つのラベル化試薬 NBS Reagent (heavy) ( 2—ニトロ [13C6] ベンゼンスルフエ ニルクロリ ド） と NBS Reagent l(ight) ( 2—二トロ [12C6] ベンゼンスルフエ二 ルクロリ ド） との質量差に相当する、 m/z=6 の差を有する。
図 2 3の (a)及び (b)のスぺクトルを互いに比較してわかるように、 NBS修 飾ペプチドのペアピークが、（a)において、（b)よりも感度良く検出されている。 こ のことは、 マトリックスとして 3H4NBA に 4-CHCAをさらに混合することによ つて、より感度良く検出することができるということを示す。すなわち、 3H4NBA の、 「質量分析において NBS修飾ペプチドの特異的検出ができる」 という特長は そのままに、さらに、 4-CHCAの、 「レーザーを当てる最適スポットを容易に探す ことができる J状態で、 「感度の良い測定をおこなうことができる」という特長が 付加されたことが確認できた。
以上の実験例 C一 8と実験例 C一 9との結果を合わせると、 3H4NBAの 特長である、 「質量分析において NBS修飾ペプチドの特異的検出ができる」 こと 及び 「イオン化からイオンの検出までの時間が比較的長いイオントラップ型 MALDI質量分析装置で測定してもサンプルの自己崩壊を抑制することができる」 ことと、 4-CHCAの特長である、 「レーザーを当てる最適スポットを容易に探すこ とができる」状態で、 「感度の良い測定をおこなうことができる」こととが同時に 達成されたことが確認できた。 上記実験例のうち実験例 C— 3、 C— 4、 C一 5及び C— 7では、 本発 明の範囲における具体的な形態について示したが、 本発明は、 これらに限定され ることなく他のいろいろな形態で実施することができる。 そのため、 上記実験例 はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、 限定的に解釈してはならない。 さらに、 ク レームの均等範囲に属する変更は、 すべて本発明の範囲内である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. MALDI (マトリックス支援レーザー脱離イオン化） イオン源を有す る質量分析装置によって、 ぺプチドを —シァノー 3—ヒドロキシケィ皮酸又は 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸をマトリックスとして用いて測定する方法。
2. 前記マトリックスとして 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香酸を用 いる場合に、 前記 3—ヒドロキシー 4—ニトロ安息香酸と α—シァノー 4—ヒド ロキシゲイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックスを用いて測定する、 請求の範 囲第 1項に記載のぺプチドの測定方法。
3. 前記ぺプチドが、 疎水性化合物によリ化学修飾されたべプチドであ る、 請求の範囲第 1項に記載のぺプチドの測定方法。
4. 前記ペプチドが、 スルフヱニル化合物によって修飾されたアミノ酸 残基を含有するペプチドである、請求の範囲第 1項に記載のぺプチドの測定方法。
5. 前記ペプチドが、 2—二トロベンゼンスルフエニルクロリドによつ て誘導体化されたぺプチドである、 請求の範囲第 1項に記載のぺプチドの測定方 法。
6. MALDI-IT (マトリックス支援レーザー脱離イオン化一イオントラッ プ） 型質量分析装置による、 請求の範囲第 1項に記載のペプチドの測定方法。
7. MALDI-IT-TOF (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化一イオント ラップ—飛行時間） 型質量分析装置による、 請求の範囲第 1項に記載のペプチド の測定方法。
8. MALDI-FTICR (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化一フーリエ 変換イオンサイクロトロン共鳴） 型質量分析装置による、 請求の範囲第 1項に記 載のペプチドの測定方法。
9. 前記マトリックスを、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として用いる、 請求の範囲第 1項に記載のぺプチドの測定方法。
10. 前記 ーシァノー 4ーヒドロキシケィ皮酸を、 1 m g /m I ~飽和濃 度の溶液として用いる、 請求の範囲第 2項に記載のぺプチドの測定方法。
11. 前記 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸の溶液と、 前記 ーシァ ノ一4—ヒドロキシゲイ皮酸の溶液とを、 1 ： 1 0 ~ 1 0 ： 1の体積比で組み合 わせて用いる、 請求の範囲第 10項に記載のぺプチドの測定方法。
12. 質量分析において、測定すべき特定の物質と前記特定の物質以外の 物質とを含む混合物サンプルに含まれる、 前記特定の物質を、
前記特定の物質以外の物質よりも、 前記特定の物質をよリイオン化さ せやすいマトリックスを用いることによって特異的にイオン化し、 混合物から特 定の物質を選択的に測定する質量分析方法。
13. 前記特定の物質が生体関連物質である、 請求の範囲第 12項に記載 の質量分析方法。
14. 前記生体関連物質が、 タンパク質、 ペプチド、 糖及び脂質から選ば れる、 請求の範囲第 13項に記載の質量分析方法。
15. 前記特定の物質が同位体標識されている、 請求の範囲第 12項に記 載の質量分析方法。
16. 前記マ卜リックスが、前記特定の物質とファンデルワールス相互作 用することができる物質である、 請求の範囲第 12項に記載の質量分析方法。
17. 前記特定の物質が π電子含有物質であり、且つ前記マトリックスが 7Γ電子含有物質である、 請求の範囲第 12項に記載の質量分析方法。
18. 前記特定の物質が親水性物質であり、且つ前記マトリックスが親水 性物質である、 請求の範囲第 12項に記載の質量分析方法。
19. 前記特定の物質が疎水性物質であリ、且つ前記マトリックスが疎水 性物質である、 請求の範囲第 12項に記載の質量分析方法。
20. 前記特定の物質が、 疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質である、 請求の範囲第 12項に記載の質量分析方法。
21. 前記疎水性べプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環及び/又は ベンゼン環以外の芳香環を有する、 請求の範囲第 20項に記載の質量分析方法。
22. 前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、 さらにニトロ基を有 する、 請求の範囲第 20項に記載の質量分析方法。
23. 前記疎水性ペプチド又はタンパク質が、 ニトロベンゼンスルフエ二 ル基又は二トロフエ二ル基を有する、請求の範囲第 20項に記載の質量分析方法。
24. 前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、 ベンゼン環、 ベンゼ ン環以外の芳香環、及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物を用いて、前記疎水 性ぺプチド又は疎水性タンパク質に対応するぺプチド又はタンパク質を化学修飾 することによって得られる、 請求の範囲第 20項に記載の質量分析方法。
25. 前記疎水性化合物が、スルフエニル化合物である、請求の範囲第 24 項に記載の質量分析方法。
26. 前記スルフエニル化合物が 2—二トロベンゼンスルフヱニルク口 リドである、 請求の範囲第 25項に記載の質量分析方法。
27. 前記マトリックスが、前記特定の物質との間で電荷の授受を行うた めの官能基と、前記マトリックス自身に疎水性を与えるための官能基とを有する、 ベンゼン環又はベンゼン環以外の芳香環の置換体である、 請求の範囲第 19項に 記載の質量分析方法。
28. 前記電荷の授受を行うための官能基が力ルポキシル基、 水酸基、 ァ ミノ基、 硫酸基、 硝酸基及びアルデヒド基から選ばれる、 請求の範囲第 27項に 記載の質量分析方法。
29. 前記疎水性を与えるための官能基がニトロ基である、請求の範囲第 27項に記載の質量分析方法。
30. 前記マトリックスがニトロ安息香酸誘導体又はニトロフ： ϋノール 誘導体である、 請求の範囲第 19項に記載の質量分析方法。
31. 前記マ卜リックスがヒドロキシニトロ安息香酸誘導体である、 請求 の範囲第 19項に記載の質量分析方法。
32. 前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸の位置異性体から 選ばれる、 請求の範囲第 19項に記載の質量分析方法。
33. 前記マトリックスが、 4一二トロア二リン、 2， 4—ジニ卜ロア二 0ン、 2—ブロモー 4， 6—ジニトロア二リン、 4—ニトロフエノール、 2—二 トロフエノール、 2， 5—ジニトロフエノール、 4一二トロ安息香酸、 3—ヒ ド 口キシー 4一二トロ安息香酸、 及び 3—ヒドロキシー 2—二トロ安息香酸から選 ばれる、 請求の範囲第 19項に記載の質量分析 法。
34. 前記マトリックスに ーシァノー 4—ヒドロキシゲイ皮酸を組み 合わせた混合マトリックスを用いる、請求の範囲第 19項に記載の質量分析方法。
35. 前記マトリックスを、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として用いる、 請求の範囲第 19項に記載の質量分析方法。
36. 前記 一シァノ一4ーヒドロキシケィ皮酸を、 1 m g /m I〜飽和濃 度の溶液として用いる、 請求の範囲第 34項に記載の質量分析方法。
37. 前記マトリックスの溶液と、 前記 一シァノ一4ーヒドロキシゲイ 皮酸の溶液とを、 1 ： 1 0 ~ 1 0 ： 1の体積比で用いる、 請求の範囲第 36項に 記載の質量分析方法。
38. (i) 解析すべきタンパク質試料 Iとその対照タンパク質試料 IIとの 2種類の状態のタンパク質試料を用意する工程と、
(Π) 前記タンパク質試料 Iを、 尿素を変性剤として含む溶液中で可溶 化するか、 又はグァニジン塩酸塩を変性剤として含む溶液中で可溶化することに よって、 可溶化されたタンパク質 料 Iを得て、
別途、 前記タンパク質試料 IIを、 尿素を変性剤として含む溶液中 で可溶化するか、 又はグァニジン塩酸塩を変性剤として含む溶液中で可溶化する ことによって、 可溶化されたタンパク質試料 IIを得る工程と、 (iii) 前記可溶化されたタンパク質試料 Iを、 2—ニトロ [13 C 6] ベ ンゼンスルフエニルク口リ ド及び 2—二トロ [12C 6] ベンゼンスルフエニルク口 リ ドのいずれか一方を用いてラベル化反応させることによって、 ラベル化タンパ ク質試料 Iを得て、
' 別途、前記可溶化されたタンパク質試料 IIを、 2—二トロ [13C 6] ベンゼンスルフエニルク口リ ド及び 2—二トロ [12C 6] ベンゼンスルフエニルク ロリ ドのいずれか他方を用いてラベル化反応させることによって、 ラベル化タン パク質試料 IIを得る工程と、
(iv) 前記ラベル化タンパク質試料 I及びラベル化タンパク質試料 II を、 混合及び脱塩することによって、 脱塩タンパク質試料混合物を得る工程と、
(V) 前記脱塩タンパク質試料混合物を、 尿素又はグァニジン塩酸塩を 用いて再可溶化することによって、 再可溶化されたタンパク質試料混合物を得る 工程と、
(vi)前記再可溶化されたタンパク質試料混合物を還元■アルキル化す ることによって、 還元■アルキル化されたタンパク質試料混合物を得る工程と、
( ii) 前記還元■アルキル化されたタンパク質試料混合物を、 尿素又 はグァニジン塩酸塩の存在下でトリプシン消化することによって、 ラベル化ぺプ チド断片と非ラベル化ぺプチド断片とを含むぺプチド混合物を得る工程と、
(viii) 前記ペプチド混合物を、 フエ二ル基を有する担体を用いて分離 することによって、 濃縮されたラベル化べプチド断片を得る工程と、
(ix)前記濃縮されたラベル化べプチド断片を質量分析する工程とを含 む、 タンパク質の網羅的定量解析方法。
39. 前記工程 （ix) において、 ーシァノー 3—ヒドロキシ桂皮酸又は 3—ヒドロキシー 4—ニトロ安息香酸をマトリックスとして用いて質量分析する、 請求の範囲第 38項に記載の方法。
40. 前記工程 （ίχ) において、 前記マトリックスとして 3—ヒドロキシ —4—ニトロ安息香酸を用いる場合に、 前記 3—ヒドロキシー 4一二トロ安息香 酸と ーシァノー 4ーヒドロキシゲイ皮酸とを組み合わせた混合マトリックスを 用いて質量分析する、 請求の範囲第 38項に記載の方法。
41 . 前記マトリックスを、 1 m g /m I〜飽和濃度の溶液として用いる、 倉青求の範囲第 39項に記載の方法。
42. 前記ひ一シァノー 4ーヒドロキシゲイ皮酸を、 1 m g /m I〜飽和濃 度の溶液として用いる、 請求の範囲第 40項に記載の方法。
43. 前記 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸の溶液と、前記 ーシァ ノー 4—ヒドロキシゲイ皮酸の溶液どを、 1 ： 1 0 ~ 1 0 ： 1の体積比で組み合 わせて用いる、 請求の範囲第 42項に記載の方法。
44. 2—ニトロ [13 C 6 ]ベンゼンスルフエニルクロリ ド、 2—二トロ [12 C 6 ] ベンゼンスルフヱニルクロリド、 及びフヱ二ル基を有する担体を含むキッ 卜 c
45. 請求の範囲第 38項に記載の方法を行うための、 2—二トロ [13 C 6 ] ベンゼンスルフエニルクロリ ド、 2—ニトロ [12 C 6 ] ベンゼンスルフエニルクロ リ ド、 及びフエ二ル基を有する担体を含むキット。
46. 変性剤をさらに含む、 請求の範囲第 44項に記載のキット。
47. マトリックスとして —シァノ一 ーヒドロキシ桂皮酸、 3—ヒド 口キシー 4一二トロ安息香酸、 α—シァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸、 又は混合マ トリックスとして 3—ヒドロキシ一 4一二トロ安息香酸と α—シァノー 4ーヒド ロキシ桂皮酸との混合物をさらに含む、 請求の範囲第 44項に記載のキッ卜。
48. 前記変性剤が尿素又はグァニジン塩酸塩である、 請求の範囲第 46 項に記載のキッ卜。
49. 脱塩用カラム、脱塩用カラム充填ゲル、還元試薬、アルキル化試薬、 トリプシン、 及び前記担体を充填するためのカラムからなる群から選ばれる少な くとも 1つをさらに含む、 請求の範囲第 44項に記載のキット。
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