DE69830057T2

DE69830057T2 - MARKIERTE FAKTOR XIIIa SUBSTRATE

Info

Publication number: DE69830057T2
Application number: DE69830057T
Authority: DE
Inventors: Michael Alan High Wycombe FORSTER; Peter Knox; Marivi Merton Park MENDIZABAL; Charles Timothy Great Missenden RICHARDSON; Eamon Anthony Amersham STOREY; Andrew Ian Hitchin WILSON; Susan Chesham CHAMPION; Alex Little Chalfont GIBSON; Benedicte Guilbert
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-19
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: ES2244042T3; EP0994730A2; US6897209B2; US20040076580A1; DE69830057D1; US6653299B1; EP0994730B1; WO1998031399A3; AU5570898A; WO1998031399A2; JP2001512502A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die bei der Diagnose von Thrombose-, Embolie- oder Infektionsstellen nützlich sind, auf pharmazeutische Formulierungen, die diese enthalten, ihre Verwendung bei der Diagnose von Krankheiten und Verfahren zu deren Herstellung.
Bisherige Ansätze für Thrombus-abbildende Radiopharmazeutika umfassen radioaktiv markiertes Fibrinogen oder Plasminogen; radioaktiv markiertes Fragment E des menschlichen Fibrins; radioaktiv markierte Plasminogenaktivatoren wie Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) und markierte Anti-Fibrin-Antikörper. Verfahren, die auf der Detektion von Stellen von Blutplättchenakkumulation basieren, wie die Verabreichung von radioaktiv markierten Blutplättchen (z. B. unter Verwendung von ¹¹¹In-oxin) oder radioaktiv markierten Anti-Blutplättchen-Antikörpern, sind ebenso beschrieben worden. Jüngere Bemühungen richteten sich auf radioaktiv markierte Peptide oder Polypeptide wie das Zelladhäsions-Strukturprinzip RGD (wo R, G und D die Standardabkürzungen für die Aminosäuren Arginin-, Glycin- bzw. Asparaginsäure sind); Bluplättchenfaktor 4 oder Fragmente hiervon oder gerinnungshemmende Peptide wie Disintegrine.
Faktor XIII ist ein Plasmaglycoprotein, das im Blut und in bestimmten Geweben in katalytisch inaktiver (oder zymogener) Form vorkommt. Faktor XIII wird durch Thrombin in Gegenwart von Calciumionen in seine aktive Form Faktor XIIIa umgewandelt. Faktor XIIIa ist auch als Plasmatransglutaminase, Fibrinoligase oder Fibrinstabilisierungsfaktor bekannt. Der letzte Schritt bei der Bildung eines Blutgerinnsels ist die kovalente Vernetzung des Fibrins, das durch die proteolytische Spaltung von Fibrinogen durch Thrombin gebildet wird. Fibrinmoleküle richten sich aus und das Enzym Faktor XIIIa katalysiert die kovalente Vernetzung der NH₂- und CO₂NH₂-Gruppen von Lysyl- bzw. Glutaminylresten, was dem Blutgerinnsel strukturelle Rigidität verleiht. Die Vernetzung stabilisiert die Fibringerinnselstruktur und verleiht Widerstandskraft gegen Fibrinolyse. Die Bildung einer Vernetzung ist ein wichtiger Aspekt der normalen Blutkoagulation und Wundheilung sowie pathologischer Zustände wie Thrombose. Sie kann auch mit Atherosklerose und dem Tumorwachstum und Metastasen in Verbindung stehen. WO 91/16931 offenbart, daß radioaktiv markierte Analoga von Faktor XIII (in dem die aktive Stelle durch Aminosäuresubstitution inaktiviert wurde) als Thrombusabbildende Radiopharmazeutika nützlich sind.
Bekanntermaßen katalysiert Faktor XIIIa auch die Einführung von Aminen mit niedrigem Molekulargewicht in die γ-Glutaminstellen von Proteinen. Daher agieren diese Amine mit niedrigem Molekulargewicht als konkurrierende Inhibitoren der Faktor XIIIa-induzierten Glutaminylvernetzung von Proteinen. Es ist ein breiter Bereich an synthetischen Aminen beschrieben worden, die konkurrierende Inhibitoren der Aufnahme von markiertem Putreszin (1,4-Butandiamin) in N,N'-Dimethylcasein, katalysiert durch Schweinelebertransglutaminase [L. Lorand et al., Biochem., 18, 1756 (1979)], sind.
Die mögliche Verwendung radioaktiv markierter Diamine der Formel H₂N(CH₂)_nNHR (n und R nicht definiert) als potentielle Gerinnsel-abbildende Mittel wurde von Rhodes et. al., (Kapitel 54, S. 521 in „Radiopharmaceuticals", G. Subramanian, B. A. Rhodes, J. F. Cooper & V. J. Sodd [Herausgeber], Society of Nuclear Medicine Inc., 1975) offenbart. Sie hielten für möglich, daß ein radioaktiv markiertes Amin, das ein Inhibitor für die Vernetzung von Fibrin ist, ein Substrat für Faktor XIIIa bilden könnte und so an das Fibrin von Blutgerinnseln angelagert werden kann. US 4406075 (Mallinckrodt) offenbart radioaktiv markierte aliphatische Amine für die Blutgerinnselabbildung der Formel: Y(CH₂)₂-X-(CH₂)₂NH₂ worin X O, S, Se, Te oder Niederalkylen ist.
Wenn X Se oder Te ist, ist Y eine Hydrocarbylaminogruppe, und
wenn X O, S oder Niederalkylen ist, ist Y eine radioiodierte Hydrocarbylaminogruppe (oder ein Salz hiervon).
WO 89/00051 (Cytrx Biopool Ltd.) beansprucht ein Verfahren für das Targeting von Fibrinablagerungen unter Verwendung einer markierten Verbindung, die durch Faktor XIIIa kovalent an Fibrin gebunden ist. Es wird behauptet, daß die Fibrin-bindende Verbindung „irgendein Peptid, das ein Substrat für das Blutenzym ist, allgemein als Faktor XIIIa bekannt" ist.
Nunmehr ist entdeckt worden, daß Metallkomplexe mit geeigneten funktionellen Seitengruppen auch als Substrate für den Enzym-Faktor XIIIa agieren können. Da Faktor XIIIa nur an pathologischen Stellen aus einem inaktiven Präkursor freigesetzt wird, liefert das Targeting dieses Enzyms ein Mittel für das Targeting eines diagnostischen Bildgebungsmittels für die Stelle der Faktor XIIIa-Freisetzung.
Die vorliegende Erfindung liefert in einem Aspekt ein Metall-komplexierendes Mittel, an das mindestens ein Substituent der Formel -(Y)_m-A-NHR gebunden ist, worin:
Y an verschiedenen Stellen im Molekül gleich oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus: einer A-Gruppe, einer C_4-8-Cycloheteroalkylengruppe, einer C_4-8-Cycloalkylengruppe, einer C_5-12-Arylengruppe, einer C_3-12-Heteroarylengruppe oder einer Polyalkylenglykol-, Polyessigsäure- oder Polyglykolsäure-Einheit,
m eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 20 ist,
A eine Kette mit 3 bis 10 Atomen aus Einheiten ist, die ausgewählt sind aus -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂- oder CR₂ZCR₂-, worin Z -CH₂-, O, S, Se oder -NR- ist,
R an verschiedenen Stellen im Molekül gleich oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkenyl, C_1-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl oder C_1-4-Hydroxyalkyl,
mit der Maßgabe, daß an das komplexierende Mittel nicht auch eine Hypoxie-lokalisierende Einheit gebunden ist.
Die Erfindung liefert auch einen Metallkomplex aus einem oder mehreren Radiometall- oder paramagnetischen Metallionen mit dem Metall-komplexierenden Mittel wie definiert; sowohl als neue Verbindung an sich als auch für die Verwendung bei der Diagnose oder Therapie von Thrombose, Embolie, Atherosklerose, Entzündungen oder Krebs.
Vorzugsweise ist das Metall-komplexierende Mittel ein Metall-chelatisierendes Mittel, zum Beispiel ein Diamindioxim. In bevorzugten Substituenten ist A -NHCO(CH₂)₂Z(CH₂)₂- oder -SO₂NH(CH₂)₂Z(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂Z(CH₂)₂-.
Vorzugsweise ist Z CH₂. Besonders bevorzugte Substituenten haben die Formel -(Y)_b-Ar-SO₂NH(CH₂)₅NH₂ worin b eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 19 ist und Ar eine Arylen- oder Heteroarylengruppe ist.
An die komplexierenden Mittel der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt nur eine Art von Targetmolekül gebunden, d. h., der -(Y)_m-A-NHR-Substituent. Andere Substituenten an dem komplexierenden Mittel können vorhanden sein, aber der -(Y)_m-A-NHR-Substituent ist der eine, der erwartungsgemäß primär für die Biolokalisationseigenschaften verantwortlich ist. Der -(Y)_m-A-NHR-Substituent kann entweder an die Hauptkette, die Metalldonatoratome eines Metall-komplexierenden oder -chelatisierenden Mittels verbindet, oder an ein Metalldonatoratom des Metall-komplexierenden oder -chelatisierenden Mittels gebunden sein.
Wenn Y ein biokompatibles, hydrophiles Polymer wie ein Polyalkylenglykol, eine Polylessigsäure oder eine Polyglykolsäure umfaßt, kann diese polymere Verknüpfungsgruppe zur Verlängerung der Verweilzeit des Metallkomplexes im Blutstrom dienen, das heißt, zur Verlangsamung der Clearancerate aus dem Blut nach der Verabreichung. Das hydrophile Polymer ist bevorzugt ein Polyalkylenglykol, am stärksten bevorzugt Polyethylenglykol (PEG). Das hydrophile Polymer hat bevorzugt ein Molekulargewicht von 2.000 bis 20.000 Dalton.
Der Metallkomplex der vorliegenden Erfindung kann eines oder mehrere Metallionen enthalten, die gleich oder unterschiedlich sein können. Daher können unter gewissen Umständen polynukleare Komplexe vorteilhafte Eigenschaften haben, wie bestimmte Metallcluster, die superparamagnetische Eigenschaften haben und daher insbesondere als MRI-Kontrastmittel nützlich sind. Bevorzugte Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung umfassen nur ein einzelnes Metallion. Wenn das Metall des Metallkomplexes ein radioaktives Metall ist, kann es entweder ein Positronenstrahler (wie ⁶⁸Ga oder ⁶⁴Cu) oder ein γ-Strahler wie ^99mTc, ¹¹¹In, ^113mIn oder ⁶⁷Ga sein. Geeignete Metallionen zur Verwendung in der MRI sind paramagnetische Metallionen wie Gadolinium(III) oder Mangan(II). Am stärksten bevorzugte radioaktive Metalle für die diagnostische Bildgebung sind γ-Strahler, insbesondere ^99mTc. Metallkomplexe bestimmter Radionuklide können als Radiopharmazeutika für die Radiotherapie verschiedener Krankheiten wie Krebs oder die Behandlung von Thrombose oder Restenose nützlich sein. Nützliche Radioisotope für solche radiotherapeutischen Anwendungen umfassen: ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁶⁹Er, ¹⁵³Sm und ¹⁹⁸Au. Welcher Metallkomplex auch immer ausgewählt wird, wird dieser überaus bevorzugt so an das Faktor XIIIa-Substrat gebunden, daß er nicht einem leichten Metabolismus im Blut unterliegt, mit dem Ergebnis, daß der Metallkomplex von dem Faktor XIIIa-Substrat abgespalten wird, bevor das markierte Faktor XIIIa-Substrat die gewünschte in vivo-Stelle erreicht, die abgebildet werden soll. Das Faktor XIIIa-Substrat wird daher bevorzugt kovalent an die Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung gebunden.
Die Metallionen der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung eines Metall-komplexierenden Mittels oder stärker bevorzugt eines Metall-chelatisierenden Mittels komplexiert. Die chelatisierenden Mittel umfassen 2 bis 10 Metalldonatoratome, die durch eine nicht koordinierende Hauptkette kovalent miteinander verknüpft sind. Bevorzugte chelatisierende Mittel haben 4 bis 8 Metalldonatoratome und die Metalldonatoratome befinden sich entweder in einer offenen Ketten- oder einer macrocyclischen Anordnung oder Kombinationen hiervon. Am stärksten bevorzugt haben chelatisierende Mittel 4 bis 6 Metalldonatoratome und bilden 5- oder 6-gliedrige Chelatringe, wenn sie an das Metallzentrum koordinieren. Solche mehrzähligen und/oder macrocyclischen, chelatisierenden Mittel bilden stabile Metallkomplexe, die den Angriff durch endogene Konkurrenzliganden für das Metall in vivo wie Transferrin- oder Plasmaproteine überleben. Alternativ ist es möglich, einzählige komplexierende Mittel zu verwenden, die starke stabile Komplexe mit den gewünschten Metallionen bilden. Beispiele für bekannte komplexierende Mittel dieser Art, die besonders für die Verwendung mit ^99mTc geeignet sind, sind Hydrazine, Phosphine, Arsine und Isonitrile. Anders als chelatisierende Mittel, besetzen komplexierende Mittel nicht notwendigerweise alle koordinierenden Zentren des Metallions.
Der Metallkomplex sollte bevorzugt auch eine niedrige Lipophilie aufweisen (da eine hohe Lipophilie oft mit einer nicht spezifischen Aufnahme in Verbindung steht), und geringe Plasmaproteinbindung (PPB) zeigen, da eine Plasma-gebundene Markierung wiederum zu einem unerwünschten hohen, nicht spezifischen Bluthintergrund für das Bildgebungsmittel beiträgt.
Beispiele für geeignete chelatisierende Mittel sind Diamindioxime ( US 4615876 ) oder solche Liganden, die Amiddonatoren einbeziehen (WO 94/08949); die vierzähligen Liganden aus WO 94/22816; N₂S₂ Diamindithiole, Diamiddithiole oder Amidamindithiole; N₃S Thiotriamide; N₄-Liganden wie Tetraamine, makrocyclische Amin- oder Amidliganden wie Cyclam, Oxocyclam (das einen neutralen Technetiumkomplex bildet) oder Dioxocyclam; oder Dithiosemicarbazone. Die oben beschriebenen Liganden sind besonders für Technetium geeignet, sind aber für andere Metalle auch nützlich. Andere geeignete Liganden werden in Sandoz WO 91/01144 beschrieben, das Liganden umfaßt, die besonders für Indium, Yttrium und Gadolinium geeignet sind, insbesondere makrocyclische Aminocarboxylat- und Aminophosphonsäureliganden. Liganden, die nicht-ionische (d. h., neutrale) Metallkomplexe aus Gadolinium bilden, sind bekannt und werden in US 4885363 beschrieben. Der Ligand kann auch eine kurze Sequenz aus Aminosäuren umfassen, wie das Cys/Aminosäure/Cys-Tripeptid aus WO 92/13572 oder die Peptidliganden, die in EP 0719790 A2 beschrieben werden.
Allgemein bekannt ist die Herstellung chelatisierender Mittel, an die eine funktionelle Gruppe gebunden ist („bifunktionelle Chelate"). Funktionelle Gruppen, die an chelatisierende Mittel gebunden worden sind, umfassen: Amin, Carbonsäure, Cyanat, Thiocyanat, Maleimid und aktiven Ester wie N-Hydroxysuccinimid. Beispiele für Chelat-Amin-Konjugate für Diamindioximliganden werden in WO 95/19187 angegeben. Die Liganden der vorliegenden Erfindung können durch die Umsetzung einer bifunktionellen Verbindung, die sowohl eine Amingruppe (bevorzugt unter Verwendung geeigneter Schutzgruppen, die einem Fachmann bekannt sind, geschützt), als auch eine reaktive Gruppe wie ein Sulphonylchlorid, Säurechlorid, einen aktiven Ester oder ein Alkyl/Benzylhalogenid enthält, hergestellt werden. Die reaktive Gruppe kann dann entweder an die Aminseitengruppe eines bifunktionellen Chelats gebunden werden oder zur Derivatisierung von einem oder mehreren Amindonatoratomen eines N-enthaltenden Liganden verwendet werden. Alternativ könnte ein mono-geschütztes Diamin mit einem bifunktionellen Chelat mit einem anhängenden aktiven Ester oder einer Carboxylgruppe umgesetzt werden, um die geschützte Amingruppe, die mit dem Ligandensystem über eine Amidbindung verknüpft ist, zu erhalten. In beiden oben angegebenen synthetischen Wegen wird das resultierende Liganden-geschützte Aminkonjugat dann unter geeigneten Bedingungen entschützt, um den gewünschten Amin-funktionalisierten Liganden zu erhalten.
Die Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung können durch die Umsetzung einer Lösung aus dem Metall in dem geeigneten Oxidationszustand mit dem Liganden mit dem geeigneten pH hergestellt werden. Die Lösung kann bevorzugt einen Liganden enthalten, der schwach an das Metall komplexiert (wie Chlorid, Gluconat oder Citrat), d. h., der Metallkomplex wird durch Ligandenaustausch oder Transchelation hergestellt. Solche Bedingungen sind zur Unterdrückung unerwünschter Nebenreaktionen wie Hydrolyse des Metallions nützlich. Wenn das Metallion ^99mTc ist, ist das übliche Ausgangsmaterial Natriumpertechnetat aus einem ⁹⁹Mo-Generator. Technetium liegt in ^99mTc-Pertechnetat im Tc(VII)-Oxidationszustand vor, was relativ unreaktiv ist. Die Herstellung von Technetiumkomplexen in einem niedrigeren Oxidationszustand Tc(I) bis Tc(V) erfordert daher für gewöhnlich die Zugabe von geeigneten Reduktionsmitteln wie Zinnion, um die Komplexierung zu erleichtern. Weitere geeignete Reduktionsmittel werden nachstehend beschrieben.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf diagnostische Mittel für die Abbildung von Stellen im Körper eines Säugers, wo der Enzym-Faktor XIIIa hochreguliert und Fibrin abgeschieden wird. Die betreffenden Mittel sind insbesondere für die diagnostische Abbildung des menschlichen Körpers geeignet. Die Mittel umfassen Substrate für den Enzym-Faktor XIIIa, die mit einem Metallkomplex, der für die externe Abbildung geeignet sind, wie einem radioaktiven Metal (für die Szintigraphie) oder einem paramagnetischen Metallion (für die MRI) markiert sind. Der Metallkomplex der vorliegenden Erfindung weist eine Amino-funktionelle Seitengruppe auf, die kovalent an Proteinglutamylcarboxamidgruppen durch den Enzym-Faktor XIIIa geknüpft werden kann. Die enge Beziehung von Fibrin und Faktor XIIIa hebt die potentielle Verwendung der Mittel der vorliegenden Erfindung für die Diagnose von Krankheitszuständen, wo sowohl Fibrinabscheidung oder Akkumulation als auch Hochregulierung von Faktor XIIIa stattfindet, hervor. Gesteigerte Fibrinabscheidung ist bekanntermaßen für Krankheiten wie Thrombose, Atheriosklerose, fibrotische Leber und disseminierte intravaskuläre Gerinnungshemmung charakteristisch. Fibrin wird auch an Stellen von Gewebeentzündungen abgeschieden, die mit vielen Krankheitsverläufen in Verbindung stehen, wie Infektion, Autoimmunkrankheiten oder Krebs. Faktor XIIIa und Gewebetransglutaminase werden während bekannter physiologischer Zustände hochreguliert. Während der Apoptose und der Erzeugung von neuen Matrixproteinstrukturen sind erhöhte Enzymniveaus zu beobachten. Die betreffenden Mittel können daher auch für die Detektion von Apoptose und Krankheitszuständen wie Arthritis verwendet werden, wo eine erhöhte Matrixproteinabscheidung auftritt. Da Faktor XIIIa an der in Frage stehenden Stelle in vivo (d. h., Thrombus, Embolie usw.) hochreguliert wird, liefert dies einen Lokalisierungsmechanismus für die Metallkomplexe der vorliegende Erfindung. Die kovalent verknüpften Metallkomplexe können dann extern durch Radionuklidszintigraphie oder Magnetresonanz-Bilddarstellung (MRI) abgebildet werden, wodurch ein nicht-invasives Mittel zur Diagnose der Krankheitsstelle bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Kits zur Herstellung von Metallkomplexen, die an Faktor XIIIa-Substrate geknüpft sind. Die Kits sind so gestaltet, daß sterile Produkte, die zur Verabreichung an einen Menschen, zum Beispiel über Injektion in den Blutstrom, geeignet sind, erhalten werden. Mögliche Ausführungsformen werden nachstehend erörtert. Ist die detektierbare Komponente ^99mTc, wird der Kit ein Glasgefäß, enthaltend den freien Liganden oder das chelatisierende Mittel für das Metall, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Reduktionsmittel wie Natriumdithionit, Natriumbisulphit, Ascorbinsäure, Formamidinsulphinsäure, Zinnion, Fe(II) oder Cu(I), bevorzugt ein Zinnsalz wie Zin(II)chlorid oder Zinntartrat, umfassen. Alternativ könnte der Kit einen Metallkomplex umfassen, der bei Zugabe des radioaktiven Metalls oder des paramagnetischen Metalls einer Transmetallierung (das heißt, einem Ligandenaustausch) unterliegt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wird. Für ^99mTc wird der Kit bevorzugt lyophilisiert und so gestaltet, daß er mit sterilem ^99mTc-Pertechnetat (TcO₄ ^–) aus einem ^99mTc-Radioisotopengenerator rückgebildet wird, wodurch eine Lösung erhalten wird, die für die Verabreichung an einen Menschen ohne weitere Manipulation geeignet ist.
Die Mittel der vorliegenden Erfindung können auch in einer Einzeldosierform, die für die Injektion in einen Menschen bereit ist, geliefert werden, und können beispielsweise in einer vorgefüllten sterilen Spritze geliefert werden. Wenn die detektierbare Komponente ein radioaktives Isotop wie ^99mTc ist, wird die Spritze, die die Einzeldosis enthält, in einem Spritzengehäuse geliefer (um den Bediener vor einer möglichen radioaktiven Dosis zu schützen).
Die obigen Kits oder vorgefüllten Spritzen können gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Puffer; pharmazeutisch akzeptable Löslichmacher (z. B. Cyclodextrine oder oberflächenaktive Mittel wie Pluronic, Tween oder Phospholipide); pharmazeutisch akzeptable Stabilisatoren oder Antioxidationsmittel (wie Askorbinsäure, Gentisinsäure oder para-Aminobenzoesäure) oder Füllstoffe für die Lyophilisierung (wie Natriumchlorid oder Mannitol).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihre Verwendung bei der Bildgebung. Die Synthesen von bestimmten Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in den Beispielen 1 bis 20, und deren Radiomarkierung mit ^99mTc in den Beispielen 21 bis 23 angegeben. Der Beweis für die Aufnahme von Blutgerinnseln in vitro und in vivo wird in den Beispielen 25, 26, 28 mit normaler Rattenbioverteilung der radioaktiv markierten Verbindungen, dargelegt in Beispiel 27, angegeben. Die in vivo-Ergebnisse von Beispiel 27 zeigen eine schnelle Clearance der Verbindungen aus dem Blut an. Die Kinetiken vom Verschwinden von Radioaktivität aus Schlüsselhintergrundorganen (z. B. der Lunge, dem Herzen, den Muskeln) folgten einem Muster ähnlich dem des Blutes. Die Analysen einer Vielzahl von Organen zeigten keine spezifische Akkumulation, mit Ausnahme der Verbindungen, die vorwiegend durch das Leber-Gallen-System (HBS) ausgeschieden wurden, die sich für gewöhnlich in der Leber ansammeln. Die schnelle Hintergrund-Clearance und das Fehlen der Organakkumulation der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind wichtige Merkmale für diagnostische Bildgebungsmittel, da die in Frage stehende Fläche (z. B. Thrombus) dadurch deutlicher umrissen wird. Der Prozentsatz der injizieren Dosis (% ID), der 60 Minuten nach der Injektion für die Verbindungen im Blut zu finden war, variiert zwischen 0,3 und 2,5% mit den meisten der injizierten Dosen, die innerhalb von 4 Stunden nach der Injektion ausgeschieden wurden. Der Großteil von Verbindungen hat das HBS als den Hauptweg der Exkretion, mit 70 bis 90% ID, die innerhalb von 4 Stunden auf diesem Weg ausgeschieden wurden, bei mehreren Verbindungen (Verbindung 17, Verbindung 24, Verbindung 25) ist jedoch das Harnsystem der Hauptexkretionsweg, 50 bis 90% ID, die innerhalb von 4 Stunden ausgeschieden werden. Die biologische Halbwerts zeit dieser Verbindungen variiert, ist jedoch bei allen sehr kurz. Die relativ kurze Halbwertszeit dieser Verbindungen und die nicht vorhandene Akkumulation an Schlüsselorganen sind für die mögliche Verwendung bei der diagnostischen Abbildung von Thromben wichtig.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen eine Gerinnselaufnahme in einem Tiermodell (Beispiel 28). Eine höhere Gerinnselaufnahme (% ID/g 0,2 bis 0,3%) ist bei den Tracern zu beobachten, die eine langsamere Clearancerate haben. Die Gerinnsel/Hintergrund-Verhältnisse sind im allgemeinen für die Bildgebung bevorzugt (d. h., > 1) aber für die Verbindungen, die über das HBS ausgeschieden werden, sind die Gerinnsel/Leber-Verhältnisse schlechter.
Experimenteller Teil
Beispiel 1: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-(4-(N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzamidomethyl)4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim, Trifluoracetatsalz (Verbindung 3).
(a): Synthese von 4-(N-(5-N'-^tButoxycarbonylaminopentyl)amidosulphonyl)benzoesäure (Verbindung 1).
Zu einer Lösung aus mono-N-^tButoxycarbonyl-1,5-diaminopentan (543 mg, 2,69 mmol; Fluka Chemicals) in Dichlormethan (10 ml) wurde Triethylamin (748 ml, 5,37 mmol, 2 Äq.) zugegeben. Eine Aufschlämmung aus 4-Chlorsulphonylbenzoesäure (592 mg, 2,69 mmol, 1 Äq.) in Dichlormethan (3 ml) wurde zugegeben und der Kolben mit mehr Dichlormethan gespült (5 ml). Die resultierende gelbe Lösung wurde bei Raumtemperatur 19 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 10% wässeriger HCl aufgenommen. Sie wurde dann mit drei Teilen EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde dann aus Ethylacetat/Benzin umkristallisiert, wodurch die Titelverbindung als ein gelbbraunes Pulver erhalten wurde (667 mg, 64%).
δH (270 MHz, CD₃OD) 1,16–1,5 (15H, m, -C(CH ₃)₃, -(CH ₂)₃-), 2,86 (2H, t, J 8,44 Hz, -CH ₂NHBoc), 2,94 (2H, t, J 8,44 Hz, -SO₂NHCH ₂-), 7,92 (2H, d, J 8,44 Hz, aromatische Protonen), 8,19 (2H, d, J 8,44 Hz, aromatische Protonen).
(b): Synthese von Verbindung 3
Zu einer Lösung aus Verbindung 1 (202 mg, 0,52 mmol, 1,1 Äq.) und Py-BOP (272 mg, 0,52 mmol, 1,1 Äq.) in DMF (5 ml) unter N₂ wurde DIPEA (91 ml, 0,52 mmol, 1,1 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, als die HPLC die Bildung einer neuen Spezies mit einer Verweilzeit von 14,7 min (System A) zeigte. Eine Lösung aus Verbindung 2 (6-Aminomethyl-3,3,6,9,9-pentamethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim, 150 mg, 0,48 mmol; hergestellt wie in WO 95/19187 beschrieben) in DMF (2 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit zeigte die HPLC die Abwesenheit des Peaks bei 14,7 min, und eine weitere neue Spezies bei 10,1 min. Das Reaktionsgemisch wurde in eine gesättigte Lösung aus Natriumbicarbonat gegossen und mit drei Teilen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Das Rohmaterial wurden in Ethylacetat (20 ml) aufgenommen, woraus ein 10 ml Aliquot entnommen und zur Trockne eingedampft wurde. Es wurde dann mit TFA (3 ml) 3,5 Stunden behandelt. Nachdem diese Zeit abgelaufen war, zeigte die HPLC (System A), daß das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht worden war. Das Gemisch wurde zur Trockne eingedampft und durch RP-HPLC (System B) gereinigt.
Beispiel 2: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N-(6-aminohexoyl)aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 4)
Die Synthese ist wie für Verbindung 3 beschrieben, aber zu einer Lösung aus Verbindung 2 in DMF (2 ml) wurden nacheinander BOC-6-aminohexansäure, Py-BOP und DIPEA zugegeben. Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung und RP-HPLC wie für Verbindung 3 beschrieben erhalten.
Beispiel 4: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N-[N-(6-aminohexanoyl)-D-phenylalanyl]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 5)
BOC-6-Aminohexanosäure (2,14 g, 9,25 mmol) wurde an D-Phenylalaninbenzylesterhydrochlorid (2,7 g, 9,25 mmol) mit Py-BOP in Gegenwart von DIPEA gebunden und das resultierende Produkt wurde in 95% Ethanol bei Atmosphärendruck in Gegenwart von 10% Palladium über Aktivkohle hydriert, wodurch BOC-6-Aminohexanoyl-D-phenylalanin (3,35 g, 85%) erhalten wurde. Die Titelverbindung wurde durch die Verknüpfung von BOC-6-Aminohexanoyl-D-phenylalanin an Verbindung 2, Entschützung und RP-HPLC, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 5: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N-[4-N-(6-aminohexanoyl)aminobenzoyl]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 6)
BOC-6-Aminohexansäure wurde an 4-Aminobenzoesäurebenzylesterhydrochlorid durch ein symmetrisches Anhydrid in Gegenwart von DIPEA und einer katalytischen Menge DMAP geknüpft, und das resultierende Produkt wurde in 95% Ethanol bei Atmosphärendruck in Gegenwart von 10% Palladium über Aktivkohle hydriert, wodurch BOC-6-Aminohexanoyl-4-aminobenzoesäure erhalten wurde. Die Titelverbindung wurde durch die Verknüpfung von BOC-6-Aminohexanoyl-4-aminobenzoesäure an Verbindung 2, TFA-Entschützung und RP-HPLC-Reinigung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 6: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N[4-N-{(4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl}aminomethylcyclohexylcarbonyl]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 8)
(a): Synthese von 4-(N-(5-N'-^tButoxycarbonylaminopentyl)amidosulphonyl)benzamidomethyl-6-cyclohexancarbonsäure (Verbindung 7)
Zu einer Lösung aus trans-4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonsäure (1 g, 6,36 mmol) in 4 M NaOH (15 ml) bei 0°C wurde BOC-Anhydrid (1,46 ml, 6,36 mmol, 1 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde bei 0°C gerührt und konnte sich auf Raumtemperatur über 24 Stunden er wärmen. Im Verlauf der Reaktion bildete sich ein weißer Niederschlag, der sich mit der Zeit wieder auflöste. Nach 24 Stunden wurde das Gemisch auf pH 3 mit 10% HCl angesäuert. Bei pH 6 war viel weißer Feststoff zu beobachten. Dieser Feststoff wurde in EtOAc extrahiert und dann wurde das Ansäuern der wässerigen Phase fortgesetzt. Als das Gemisch pH 3 erreichte, wurde es mit drei Teilen EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wurde (1,384 g, 85%), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Zu einer Lösung aus trans-4-(N-BOC-Aminomethyl)cyclohexancarbonsäure (1,359 g, 5,28 mmol) in Dichlormethan (15 ml) wurde DMAP (katalytische Menge) und Benzylalkohol (550 ml, 5,28 mmol, 1 Äq.) zugegeben. DCC (1 M Lösung in CH₂Cl₂, 5,28 ml, 1 Äq.) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt (Eluent 3:1 Benzin:EtOAc), wodurch das gewünschte Produkt als ein gelbes Öl erhalten wurde, das sich verfestigte, wodurch beim Stehenlassen ein grauweißer Feststoff erhalten wurde (1,742 g, 95%).
Zu einer Lösung aus trans-4-(N-BOC-Aminomethyl)cyclohexancarbonsäurebenzylester (1,401 g, 4,03 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde TFA (10 ml) zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 10 min gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, wodurch das Produkt als gelbes Öl erhalten wurde (1,44 g, 99%).
Zu einer Lösung aus trans-4-(Aminomethyl)cyclohexancarbonsäurebenzylester (0,5 g, 1,38 mmol) in trockenem DMF (2 ml) unter N₂ wurde Verbindung 1 (533 mg, 1,38 mmol, 1 Äq.), HBTU (523 mg, 1,38 mmol, 1 Äq.) und DIPEA (1,7 ml, 9,76 mmol, 7 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, und mit drei Teilen einer 10%igen Zitronensäurelösung extrahiert. Die organische Phase wurde dann zweimal mit gesättigter NaHCO₃ gewaschen und dann mit Salzlösung gereinigt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt (Eluent 7:3 EtOAc:Benzin), wodurch das gewünschte Produkt als ein grauweißer Schaum erhalten wurde (0,554 g, 65%). Zu einer Lösung aus diesem Schaum (437 mg, 7,09 × 10^–4 mol) in Ethanol (15 ml) wurden 10% Palladium über Aktivkohle (440 mg) und Cyclohexen (720 ml, 7,09 mmol, 10 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde auf Rückflußtemperatur 4,5 Stunden erwärmt, filtriert und dann zur Trockne eingedampft, wodurch Verbindung 7 als ein weißer Feststoff (375 mg, 100%) erhalten wurde. Dieser Feststoff wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
δH (CDCl₃, 300 MHz): 7,88 (4H, s, aromatisch), 6,667 (1H, br, s, Cyclohexyl-CH₂NH), 4,87 (1H, t, J 9,0 Hz, SO₂NH), 4,54 (1H, br, s, NHBoc), 3,28 (2H, t, J 9,0 Hz, SO₂NHCH ₂), 2,93–3,03 (4H, m, CH ₂NH, CH ₂NHBoc), 2,21–2,33 (1H, m, CHCO₂ H), 1,85–2,06 (4H, m, 2 × RingCH₂), 0,96–1,66 (20H, m, 2 × RingCH₂, RingCH, BOC -(CH₂)₃-),
(b): Synthese von Verbindung 8
Verbindung 7 (150 mg, 2,85 × 10^–4 mol), Verbindung 2 (90 mg, 2,85 × 10^–4 mol, 1 Äq.) und HBTU (108 mg, 2,85 × 10^–4 mol, 1 Äq.) wurden in DMF (2 ml) unter N₂ gelöst. DIPEA (250 ml, 1,43 mmol, 5 Äq.) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt, gefolgt von RP-HPLC (System D). Das rohe Reaktionsgemisch wurde durch RP-HPLC (System E) gereinigt, wodurch das gewünschte geschützte Produkt erhalten wurde (142 mg, 63%). Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung, wie für Verbindung 2 beschrieben, erhalten. Das Rohprodukt wurde durch RP-HPLC (System F) gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt als ein weißer Feststoff erhalten wurde (8 mg, 23%).
Beispiel 7: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethvl-6-(4-(N-[(S-aminoethyl)thioethyl]amidosulphonyl)benzamidomethyl)-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 9)
Zu einer Lösung aus Thiacadaverin (0,5 g, 4,16 mmol) in Dichlormethan (5 ml) bei –78°C unter N₂ wurde langsam eine Lösung aus BOC-Anhydrid (478 ml, 2,08 mmol, 0,5 Äq.) in Dichlormethan (1 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei –78°C 5 Stunden gerührt, dann konnte es sich stufenweise auf Raumtemperatur über 18 Stunden erwärmen. Während dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch opak. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt, und der weiße Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie (Eluent 80:20:1 CH₂Cl₂:MeOH:NH₃) gereinigt, wodurch das Produkt als ein gelbes Öl (388 mg, 85%) erhalten wurde. Zu Mono-N-Boc-thiacadaverin (369 mg, 1,68 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde Triethylamin (470 ml, 3,36 mmol, 2 Äq.) und eine Aufschlämmung aus 4-Chlorsulphonylbenzoesäure in Dichlormethan (2 ml) gegeben und, wie für Verbindung 1 beschrieben, umgesetzt (429 mg, 63%). Die Titelverbindung wurde, wie für Verbindung 8 beschrieben, durch Verknüpfung der obigen Säure (150 mg, 3,71 × 10^–4 mol), der Verbindung 2 (117 mg, 3,71 × 10^–4 mol, 1 Äq.) und HBTU (141 mg, 3,71 × 10^–4 mol, 1 Äq.) in DMF (2 ml) mit DIPEA (330 ml, 1,85 mmol, 5 Äq.) erhalten. Die TFA-Entschützung und die RP-HPLC-Reinigung (System F) waren wie für Verbindung 3 (27 mg, 52%) beschrieben.
Beispiel 8: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N-[N-(4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl-D-serin-D-serin-D-serin]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 10)
4-(BOC-5-Aminopentyl)amidosulphonylbenzoyl-D-Ser(tBu)I-D-Ser(tBu)I-D-Ser(tBu)-OH wurde an ein 2-Chlortritylharz durch Verankerung von Fmoc-D-Ser(tBu) an das Harz, und durch aufeinanderfolgende Entschützungs-/Verknüpfungskreisläufe (wie in P. Lloyd-Williams, F. Albericio und E. Girald; Chemical Approaches to the Synthese of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997 beschrieben) mit Fmoc-D-Ser(tBu), Fmoc-D-ser(tBu), Fmoc-D-ser(tBu) und Verbindung 1 angelagert. Die geschützte Verbindung wurde durch Spaltung von 1% TFA in Dichlormethan erhalten. Die Titelverbindung wurde durch die Verknüpfung mit Py-BOP des geschützten Zwischenproduktes mit Verbindung 2, TFA-Entschützung und RP-HPLC-Reinigung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 9: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-[4-N{4-(N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl}aminomethylpiperazinylcarbonyl]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 11)
Das pseudo-geschützte Peptid wurde wie in Beispiel 8 erhalten. Die Titelverbindung wurde durch Verknüpfung mit Verbindung 2, TFA-Entschützung und RP-HPLC-Reinigung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 10: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-N{4-(N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl}amidododecanoylaminomethyl-4,8-diazundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 13)
(a): Synthese von 4-(N-(5-N'-^tButoxycarbonylaminopentyl)amidosulphonyl)benzoylamidododecansäure (Verbindung 12)
12-Aminododecansäure (1 g, 4,64 mmol) wurde BOC-geschützt, wie in Beispiel 7 beschrieben (0,467 g, 35%). Der Benzylester der obigen Verbindung wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gebildet, wodurch die gewünschte Verbindung als ein viskoses Öl (0,821 g) erhalten wurde. Zu einer Lösung aus der N-BOC-12-Aminododecansäurebenzylester (821 mg) in Dichlormethan (5 ml) wurde TFA (5 ml) tropfenweise unter Rühren zugegeben. Die Lösungsmittel wurden dann im Vakuum entfernt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wurde ohne jede weitere Reinigung verwendet. Zu einer Lösung aus dem resultierenden Rohprodukt (1 g) in DMF (3 ml) unter N₂ wurden Verbindung 1 (1,27 g, 3,29 mmol), HBTU (1,24 g, 3,27 mmol) und DIPEA (2 ml, 11,48 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Dünnschichtchromatographie (DC) (3:7, Benzin:EtOAc) anzeigte, daß die Reaktion beendet war. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt, dann mit drei Teilen einer 10%igen Zitronensäurelösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Der rohe Rückstand wurde der Flashsäulenchromatographie (3:7, Benzin:EtOAc) unterzogen, wodurch die gewünschte Verbindung als ein gelber Feststoff erhalten wurde (1,433 g, 66%).
Zu einer Lösung aus der Benzyl-geschützten Verbindung (1,4 g, 2,07 mmol) in Ethanol (20 ml) wurden 10%iges Palladium über Aktivkohle (1,4 g) und Cyclohexen (1 ml, 9,87 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Rückflußtemperatur erwärmt, bis die DC (3:7, Benzin:EtOAc) anzeigte, daß die Reaktion beendet war. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wurde, der durch RP-HPLC (System G) gereinigt wurde, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wurde (80 mg).
(b): Synthese von Verbindung 13
Zu einer Lösung aus Verbindung 12 (70 mg, 1,2 × 10^–4 mol), Verbindung 2 (50 mg, 1,58 × 10^–4 mol, 1,3 Äq.) und HBTU (59 mg, 1,56 × 10^–4 mol, 1,3 Äq.) in trockenem DMF (4 ml) unter N₂ wurde DIPEA (135 ml, 9,13 × 10^–4 mol, 6,5 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt und dann durch RP-HPLC (System G) gereinigt, wodurch das Zwischenprodukt als ein weißer Feststoff erhalten wurde (60 mg, 57%). Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten und durch RP-HPLC (System H) (10 mg, 23%) gereinigt.
Beispiel 11: Synthese von 3,3,6,9,9-Pentamethyl[α-N-(4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl)amino-polyethyleneglycol)-ω-carbonyl]aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (Verbindung 14)
Eine Lösung aus α-N-(tert-Butoxycarbonyl)-poly(ethylenglykol)amino-ω-succinimidylcarbonat (500 mg, 147 mmol) und Verbindung 2 (46,3 mg, 147 mmol) in trockenem THF (5 ml) 5 Stunden unter N₂ unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum reduziert, was zu einem weißen Feststoff führte, der durch Flashchromatographie (ⁱPrOH/NH₃/H₂O, 10:1:1) gereinigt wurde, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde (456 mg, 86%). 37%ige HCl (1,34 ml) wurde tropfenweise zu einer eiskalten Lösung aus dem obigen (520 mg, ~144 mmol) in Methanol (3,16 ml) gegeben. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 10 durch die Zugabe von 4 M NaOH (4,18 ml) basisch gemacht, und das resultierende Produkt wurde durch RP-HPLC (System I) isoliert. Zu einer Lösung aus dem obigen (100 mg, 28,6 mmol) und Verbindung 1 (11 mg, 28,6 mmol) in DMF (2 ml) wurden HBTU (10,8 mg, 28,6 mmol) und DIPEA (25 ml, 143 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter N₂ 22 Stunden gerührt, dann mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, mit NaHCO₃ (10 ml), Wasser (10 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum reduziert und der Rückstand wurde durch RP-HPLC (System J) gereinigt, wodurch ein farbloses Öl erhalten wurde (36,8 mg, 33%). Das Öl (36,8 mg, ~9,5 mmol) wurde in einer Lösung aus 3 M HCl in Methanol (600 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 5,5 Stunden gerührt, bevor das Reaktionsgemisch auf pH ~10 durch die Zugabe von 4 M Na-OH (550 ml) basisch gemacht wurde. Die Titelverbindung wurde durch RP-HPLC (System K) als ein weißer Gummi erhalten (29,5 mg, 82%).
Beispiel 12: Synthese on 3,3,11,11-Tetramethyl-7-(4-N-(5-aminopentyl)-amidosulphonyl)benzamidoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (Verbindung 16)
(a): Synthese von 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (Verbindung 15)
Zu einer Lösung aus tris-(2-Aminoethyl)amin (1 ml, 6,68 mmol) in Acetonitril (10 ml) wurde Natriumbicarbonat (1,12 g, 13,36 mmol, 2 Äq.) zugegeben. Eine Lösung aus 3-Chlor-3-methyl-2-nitrosobutan (1,359 g, 10,02 mmol, 1,5 Äq.) in trockenem Acetonitril (5 ml) wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zum Rühren bei Raumtemperatur für 3 Tage stehengelassen und dann filtriert. Der Rückstand wurde gründlich mit Acetonitril gewaschen und das Filtrat eingedampft. Das Rohprodukt wurde dann durch RP-HPLC (System L) gereinigt, wodurch Verbindung 15 erhalten wurde (164 mg, 7%).
δH (CD₃OD, 300 MHz): 2,77 (2H, t, J 6 Hz, CH ₂NH₂), 2,50–2,58 (10H, m, H₂NCH ₂CH ₂N(CH ₂CH ₂NH)₂), 1,85 (6H, s, 2 × CH ₃C=N), 1,23 (12H, s, 2 × (CH ₃)₂CNH).
(b): Synthese von Verbindung 16
Zu einer Lösung aus Verbindung 15 (201 mg, 0,583 mmol) in DMF (2 ml) wurden nacheinander Verbindung 1 (225 mg, 0,583 mmol), Py-BOP (258 mg, 0,583 mmol) und DIPEA (0,102 ml, 0,583 mmol) gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum konzentriert, wodurch ein schaumiger Rückstand zurückblieb. Der obige Rückstand wurde in einem Gemisch aus TFA und Wasser (95/5, v/v, 10 ml) gelöst, und die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Titelverbindung fiel bei der Zugabe von Diethylether (150 ml) aus. Sie wurde gesammelt und mit Diethylether gewaschen, im Vakuum getrocknet und durch RP-HPLC (System A) gereinigt.
Beispiel 13: Synthese von 3,3,11,11-Tetramethyl-7-N-[4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoyl)aminomethylcyclohexylcarbonyl]aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (Verbindung 17)
Zu einer Lösung aus Verbindung 7 (84 mg, 1,6 × 10^–4 mol), Verbindung 15 (65 mg, 1,89 × 10^–4 mol) und HBTU (61 mg, 1,6 × 10^–4 mol, 1 Äq.) in trockenem DMF (2 ml) unter N₂ wurde DIPEA (140 ml, 8,00 × 10^–4 mol, 5 Äq.) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, und das rohe Gemisch wurde durch RP-HPLC (System L) gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wurde (56 mg, 41%). Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten und durch RP-HPLC (System L) gereinigt (19 mg, 39%).
Beispiel 14: Synthese von 1-N-[4-(N-(5-Aminopentyl)-amidosulphonyl)benzoyl-3,7-diazanonyl-1,9-diamin (Verbindung 18)
Zu einer kalten Lösung (–70°C) aus N,N'-bis(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin (2 g, 12,48 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) wurde tropfenweise unter N₂ eine Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat in Dichlormethan (4 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei –70°C 0,5 Stunden und bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wodurch ein Öl erhalten wurde, daß über Kieselgel (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 80:20:2) chromatographiert wurde, was das mono-geschützte Tetraamin (1,08 g, 33%) ergab.
Eine Lösung aus Verbindung 1 (170 mg, 0,44 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (51 mg, 0,44 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (4 ml) wurde auf –10°C unter N₂ abgekühlt. Eine 1 M Lösung aus DCC in Dichlormethan (440 ml, 0,44 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit einer Lösung aus dem mono-geschützten Tetraamin (95,6 mg, 0,37 mmol) in wasserfreiem THF (4 ml) behandelt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 18 Stunden wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum reduziert. Der erhaltene weiße Feststoff wurde über Kieselgel (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃, 90:20:2) chromatographiert, wodurch ein farbloses Öl erhalten wurde (120 mg, 52%). Eine Lösung aus 35%iger HCl/MeOH 1:1 (2,3 ml) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus dem obigen Öl (120 mg, 191 mmol) in Methanol (0,7 ml) über 21 Stunden gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 2 Stunden gerührt und der weiße Feststoff, der sich bildete, wurde durch Filtration rückgewonnen, dreimal mit Methanol (1 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, was zu einem weißen Pulver des Hydrochloridsalzes der Titelverbindung führte (94,7 mg, 86%).
Beispiel 15: Synthese von 1-N-(4-(N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)]benzoyl-6-oxo-7,10,14-triazahexadecyl-1,16-diamin (Verbindung 19)
Zu einer Lösung aus dem mono-geschützten Tetraamin, wie in Beispiel 14 beschrieben, (161 mg, 0,62 mmol) und Z-Aminocapronsäure (164 mg, 0,62 mmol) in DMF (3 ml) wurden HBTU (235 mg, 0,62 mmol) und DIPEA (539 ml, 3,1 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter N₂ 23 Stunden gerührt, dann mit Dichlormethan (10 ml) verdünnt, mit NaHCO₃ (10 ml) und Wasser (20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum reduziert und der Rückstand wurde über Kieselgel (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃, 70:30:2) chormatographiert, wodurch ein blaßgelbes Öl (121,7 mg, 39%) erhalten wurde. Zu einer Lösung aus diesem Öl (116 mg, 0,23 mmol) in wasserfreiem Ethanol (3 ml) wurden Cyclohexen (232 ml, 2,3 mmol) und 10%iges Palladium über Aktivkohle gegeben (116 mg). Das Reaktionsgemisch wurde bei 60°C 2 Stunden erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde mit Methanol gewaschen, die Filtrate vereinigt und in Vakuum reduziert, wodurch ein farbloses Öl (81,2 mg, 94,6%) erhalten wurde. Zu einer Lösung aus diesem Öl (81,2 mg, 0,22 mmol) und Verbindung 1 (84,0 mg, 0,22 mmol) in DMF (3 ml) wurden HBTU (82,6 mg, 0,22 mmol) und DIPEA (190 ml, 1,1 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter N₂ 5 Stunden gerührt, dann mit Dichlormethan (15 ml) verdünnt, mit NaHCO₃ (20 ml) und Wasser (2 × 10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum reduziert, und der Rückstand wurde über Kieselgel (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃, 70:30:2) chromatographiert, wodurch ein weißer Gummi erhalten wurde (73,5 mg, 45%). Die Titelverbindung wurde durch Säureentschützung, wie für Verbindung 18 beschrieben, als ein blaßgelber Feststoff erhalten (30,8 mg, 100%).
Beispiel 16: Synthese von 1-(4-(N-(5-aminopentyl)-amidosulphonyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Verbindung 20)
Zu einer Lösung aus mono-BOC-1,5-diaminopentan (0,5 ml, 2,40 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde Triethylamin (400 ml, 2,87 mmol, 1,2 Äq.) gegeben. Eine Lösung aus Brommethylbenzolsulphonylchlorid (0,648 g, 2,40 mmol, 1 Äq.) in Dichlormethan (2 ml) wurde tropfenweise unter Rühren für 3 Stunden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser gewaschen, und die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashsäulenchromatographie (3:2 Benzin:EtOAc) gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt als ein Öl erhalten wurde (190 mg, 18%). Zu einer Lösung aus Cyclam (170 mg, 8,49 × 10^–4 mmol, 7 Äq.) unter N₂ in trockenem THF (5 ml) und trockenem Ethanol (2 ml) wurde Natriumhydrid (8 mg, 2 × 10^–4 mol, 2 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min gerührt, wonach eine Lösung aus N-BOC-Brommethylbenzolsulphonylcadaverin (50 mg, 1,15 × 10^–4 mol) in THF (1 ml) zugegeben wurde. Die Reaktion wurde durch DC (70:30:1 CH₂Cl₂:MeOH:NH₃) beobachtet. Als die Reaktion beendet war, wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. Der rohe Rückstand wurde durch RP-HPLC (System L) gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt (20 mg, 31%) erhalten wurde. Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten und durch RP-HPLC (System L) gereinigt (7 mg, 43%).
δH (CDCl₃, 300 MHz): 7,77 (2H, d, J 8,4 Hz, aromatisches CH), 7,51 (2H, d, J 8,4 Hz, aromatisches CH), 3,61 (2H, s, PhCH ₂), 2,55–2,96 (20H, m, SO₂NHCH ₂, CH ₂NHBoc, 8 × CyclamCH ₂N), 1,33–1,54 (6H, m, -(CH ₂)₃-).
Beispiel 17: Synthese von S-Acetyl-mercaptoacetylglycylglycylglycin (Verbindung 21)
Eine Lösung aus H-Gly-Gly-Gly-OH (1,28 g, 6,76 mmol), S-Acetylthioglykolsäurepentafluorphenylester (Novabiochem, 2 g, 6,76 mmol) und DIPEA (1,14 ml, 6,76 mmol) in einem Gemisch aus DMF (25 ml) und Wasser (12 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um etwas verbleibendes H-Gly-Gly-Gly-OH zu entfernen, mit 1 M wässeriger HCl auf pH 2 gebracht und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Aceton verrieben, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
Beispiel 18: Synthese von N-[S-Acetyl-mercaptoacatylglycylglycylglycyl)-N(4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoylpropan-1,3-diamin (Verbindung 23)
(a): Synthese von N-4-(N-(5-N'-^tButoxycarbonylaminopentyl)sulphonamido)benzoyl)-N'-fluorenylmethoxycarbonylpropan-l,3-diamin (Verbindung 22)
BOC-1,3-Diaminopropan wurde mit Fmoc-OSu in Dichlormethan in der Gegenwart von DIPEA umgesetzt, und das resultierende Produkt wurde mit 4 M HCl in Dioxan behandelt, wodurch Fmoc-1,3-Diaminopropanhydrochlorid in einer quantitativen Ausbeute erhalten wurde. Zu einer Lösung aus Fmoc-Diaminopropanhydrochlorid (1,1 g, 3,3 mmol), Verbindung 1 (1,27 g, 3,3 mmol) und Py-BOP (1,46 g, 3,3 mmol) in DMF (10 ml) wurde DIPEA (1,15 ml, 6,6 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc (200 ml) verdünnt, mit Wasser, gesättigtem wässerigen Natriumhydrogencarbonat, 1 M wässerigem Kaliumhydrogensulfat, Salzlösung gewaschen und unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch Verbindung 22 als ein weißer Feststoff erhalten wurde, der mit Hexan verrieben, durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet wurde.
(b): Synthese von Verbindung 23
Verbindung 22 (1 g, 1,5 mmol) wurde mit Diethylamin (2 ml) in DMF 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wurde zur Trockne konzentriert und der resultierende Gummi in Diethylether verrieben, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde an Verbindung 21 (370 mg) mit Py-BOP, wie zuvor für Verbindung 3 beschrieben, geknüpft, wodurch ein weißer Feststoff nach dem Verreiben mit Diethylether erhalten wurde. Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung und RP-HPLC, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 19: Synthese von N-[6-Hydrazinopyridin-3-carbonyl]-N'-(4-N-(5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzoylpropan-l,3-diamin (Verbindung 24)
6-BOC-Hydrazinopyridin-3-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde gemäß Schwartz et al. (US-Patent 5,206,370, 1993) hergestellt. Er wurde dann an Diaminopropan in DMF geknüpft und durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Die Titelverbindung wurde durch Verknüpfung des obigen mit Verbindung 1, TFA-Entschützung und RP-HPLC-Reinigung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten.
Beispiel 20: Synthese von N,N'-Bis-(2-hydroxybenzyl)-2-(4-N-5-aminopentyl)amidosulphonyl)benzamidomethyl-2-methyl-propan-l,3-diamin (Verbindung 25)
Zu einer Lösung aus 2-[Bis-(aminomethyl)]propylamin (0,5 g, 4,26 mmol) in trockenem Dichlormethan (49 ml) unter N₂ wurde trockenes Triethylamin (0,29 ml, 2,08 mmol) gegeben. Die resultierende Lösung wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus BOC-Anhydrid (0,465 g, 2,13 mmol, 0,5 Äq.) in trockenem Dichlormethan (49 ml) wurde tropfenweise über eine Stunde zugegeben. Das Gemisch konnte sich über mehrere Stunden auf Raumtemperatur erwärmen und wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich während dieser Zeit eine weiße wolkige Suspension bildete. Eine 1 M NaOH Lösung (30 ml) wurde zugegeben und die organische Schicht abgetrennt. Die wässerige Schicht wurde dann mit drei Teilen Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, wodurch das gewünschte Produkt als ein farbloses Öl (0,58 g, 63%) erhalten wurde. Zu einer Lösung aus mono-N-BOC-2-[bis(aminomethyl)]propylamin (0,58 g, 2,67 mmol) in trockenem Ethanol (27 ml) unter Argon wurde Salicylaldehyd (0,57 ml, 5,34 mmol, 2 Äq.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Rückflußtemperatur 1 Stunde erwärmt, wobei sich während dieser Zeit eine gelbe Lösung bildete. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wodurch das gewünschte Produkt als ein gelbes Öl erhalten wurde (0,66 g, 58%).
Zu einer Lösung aus dem obigen Rohprodukt (0,47 g, 1,11 mmol) in trockenem Ethanol (15 ml) wurde Natriumborhydrid (146 mg, 3,86 mmol, 3,5 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, wobei während dieser Zeit die gelbe Farbe verschwand, wodurch eine farblose Lösung erhalten wurde. Wasser (3 ml) wurde zugegeben und Ethanol/Wasser wurden aus dem weißen öligen Feststoff, der sich bildete, abdekantiert. Das Ethanol wurde im Vakuum entfernt, und die verbleibende wässerige Phase wurde mit zwei Teilen Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, wodurch ein farbloses Öl erhalten wurde. Das rohe Öl wurde durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 70% EtOAc/Benzin zu 100% EtOAc gereinigt, was das gewünschte Produkt als ein farbloses Öl ergab (250 mg, 52%). Das Öl (105 mg, 2,45 × 10^–4 mol) wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde mit 9:1 TFA:CH₂Cl₂ (5 ml) behandelt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, wodurch das gewünschte Produkt als ein Öl erhalten wurde (109 mg, 100%).
Zu einer Lösung aus dem obigen Öl (109 mg, 2,45 × 10^–4 mol) und Verbindung 1 (95 mg, 2,45 × 10^–4 mol, 1 Äq.) in DMF (2 ml) unter N₂ wurden HBTU (93 mg, 2,45 × 10^–4 mol, 1 Äq.) und DIPEA (300 ml, 1,72 mmol, 7 Äq.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden gerührt und dann mit Dichlormethan verdünnt, bevor es mit drei Teilen 10%iger Zitronensäure gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde dann mit zwei Teilen einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit einem Teil Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft, wodurch ein rohes Produkt erhalten wurde. Das rohe Reaktionsgemisch wurde ohne weitere Reinigung in den nächsten Schritt übernommen. Die Titelverbindung wurde durch TFA-Entschützung, wie für Verbindung 3 beschrieben, erhalten und durch RP-HPLC (System L) gereinigt (14 mg).
Beispiel 21: Tc-99m Markierung der Verbindungen 2 bis 6, 8 bis 11, 13,14, 16 bis 20, 25.
Ein 0,1 ml-Aliquot der Verbindung, gelöst in Methanol oder H₂O (1 mg/ml; 7,5 mg/ml für Verbindung 14) wurde in ein mit Stickstoff gefülltes 10 ml-Glasgefäß zusammen mit desoxydierter Kochsalzlösung (0,9% Gew./V., 1 ml) und 0,035 ml wässeriger NaOH (0,1 M) (für Verbindung 20 wurde 1 M NaOH verwendet) überführt. Zu dieser Lösung wurde Technetiumgeneratoreluat (1 ml, ungef. 0,4 GBq) und dann eine wässerige Zinn(II)chloridlösung (0,1 ml, ca. 10 μg) gegeben. Der Markierungs-pH betrug 9,0–10,0 (pH 11–12 für Verbindung 20). Die Gefäße wurden bei Laborumgebungstemperatur (15–25°C) 30 Minuten inkubiert, um die Markierung zu bewirken. Die HPLC-Reinigung wurde durchgeführt (System C; System H für Verbindung 14; System N für die Verbindungen 18, 19), um nicht markiertes Ausgangsmaterial und radioaktive Verunreinigungen vor dem Test zu entfernen. Nach der Reinigung wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und die Probe wurde in etwa 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, wieder gelöst, wodurch eine Arbeitskonzentration von 6–9 MBq/ml erhalten wurde. Die radiochemische Reinheit wurde vor der Verwendung durch ein Dünnschichtchromatographiesystem (DC), wie nachstehend beschrieben, bewertet:

i) ITLC SG 2 cm × 20 cm, eluiert mit 0,9% Gew./V. Kochsalzlösung
ii) Whatman Nr. l2 cm × 20 cm eluiert mit 50:50 V/V Acetonitril: H₂O

Die makierten Substrate bleiben in oder nahe ihrem Ursprung in dem DC-System (i) und bewegen sich nahe an die Lösungsmittelfront in System (ii). Bei einer Analyse durch geeignete Detektionsausrüstung ist die radiochemische Reinheit typischerweise in einem Überschuß von 85% der markierten Verbindung.
Beispiel 22: Tc-99m-Markierung von Verbindung 23
Ein Gluconatkit wurde mit Technetiumgeneratoreluat (5 ml, 2 GBq) rekonstituiert und konnte bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren, um die Markierung herbeizuführen. Ein Aliquot (0,1 ml) der Verbindung, die frisch in Methanol (5 mg/ml) gelöst war, wurde in ein mit Stickstoffgefülltes 10 ml-Glasgefäß zusammen mit 0,025 ml wässerigem NaOH (0,1 M) und 2 ml der 99mTc-Gluconatlösung überführt. Der Markierungs-pH betrug 9,0. Die Gefäße wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert, um die Markierung herbeizuführen. Die Reinigung und Bewertung der radiochemischen Reinheit wurde wie in Beispiel 21 durchgeführt.
Beispiel 23: Tc-99m-Markierung von Verbindung 24
Ein Aliquot (0,1 ml) der Verbindung, die in Methanol (1 mg/ml) gelöst war, wurde in ein mit Stickstoffgefülltes 10 ml-Glasgefäß zusammen mit Tricin, gelöst in Wasser (0,5 ml, 37,5 mg) und Phosphindynetris(benzolsulfonsäure)trisnatriumsalz, gelöst in Wasser (0,1 ml, 1 mg) überführt. Zu dieser Lösung wurde Technetiumgeneratoreluat (1 ml, ungef. 0,4 GBq) gegeben und dann eine Lösung aus Zinn(II)chlorid in 0,1 M HCl (0,02 ml, ca. 2 μg). Der Markierungs-pH betrug 4,5–5,5. Die Gefäße wurden bei 60°C 30 Minuten inkubiert, um die Markierung herbeizuführen. Die Reinigung und Bewertung der radiochemischen Reinheit wurde wie in Beispiel 21 durchgeführt.
Beispiel 24: HPLC-Systeme
Beispiel 25: Einführung in menschliche Plasmagerinnsel
Die Einführung radioaktiv markierter Substrate in Fibrin wurde durch Induktion eines menschlichen in vitro-Plasmagerinnsels auf die folgende Art und Weise untersucht. In ein silikonisiertes 5 ml-Glasgefäß wurden (a) 800 μl Tris(hydroxymethyl)aminomethangepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5, enthaltend Calciumchlorid (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 4 mM Calciumchlorid), (b) 40 μl physiologische Kochsalzlösung, enthaltend 100 Einheiten Thrombin pro ml, (c) 400 μl menschliches Plasma, enthaltend das radioaktiv markierte Substrat bei einer Konzentration von typischerweise 10 kBq/ml gegeben. Um die Induktion des Gerinnsels zu unterstützen, wurde ein angerauhter Glasstab in das Reaktionsgefäß gegeben. Es wurden ähnliche Kontrollgefäße hergestellt, jedoch ohne Thrombin und Calciumchlorid.
Nach der Inkubation der Testlösung bei Laborumgebungstemperatur (ca. 20°C) für 60 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von etwa 400 μl einer kalten Lösung aus 33,5 mM Ethylendiamintetra-essigsäuredinatriumsalz unterbrochen. Die Gerinnsel wurden aus dem Serum durch Vakuumfiltration auf 0,45 μM Nitrocellulosefiltern (in 1,5% BSA/Tris(hydroxymethyl)aminoethan-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, enthaltend 0,1% Tween 20) abgetrennt und mit etwa 2 × 10 ml Tris(hydroxymethyl)aminomethan-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, enthaltend Tween 20, auf eine Endkonzentration von 0,1% V/V gewaschen. Der Anteil der Gesamtradioaktivität wurde durch das Zählen in einem geeigneten Detektionsapparat berechnet.
Die Fraktion mit Radioaktivität, die in dem Filter verblieb, nach Abzug der nicht-spezifischen Bindung, bestimmt aus der Kontrolle, ist ein Maß der Einführung in die filtrierten Gerinnsel.
Beispiel 26: Faktor XIIIa-Abhängigkeit der Einführung
Die radioaktiv markierten Substrate können für die Faktor XIIIa-vermittelte Einführung in Fibrin und seine Analoga durch eine Modifikation des Verfahrens von Dvilansky A. et al [Br. J. Haematol., 18 399–410 (1970)] getestet werden. Der Assay wurde durch den Austausch von Mercaptoethanol mit Aprotinin bei einer Endkonzentration von 2 μg/ml verändert, und Dimethylcasein (DMC) wurde anstelle von Casein verwendet. Die Faktor XIIIa-Spezifität der Reaktion wird durch den Vergleich von menschlichem Plasma mit Plasma, dem es an Faktor XIII mangelt, demonstriert.
Der modifizierte Assay wurde zum Screening der Testverbindungen (1 KBq/ml) verwendet, und die Aufnahme nach 60 Minuten wurde bestimmt. Die Verbindungsaktivität wurde als spezifische Aufnahme durch Abzug der Aufnahme in Plasma, dem es an Faktor XIII mangelt, von normalem Plasma ausgedrückt (siehe Ergebnistabelle). Der Assay zeigte an, daß 99mTc markierte Verbindungen hergestellt werden können, die einen Bereich an Einführungsniveaus hatten. Es wurde gezeigt, daß diese Verbindungen durch eine Faktor XIII-spezifische Art eingeführt wurden.
Ergebnisse:

* verbleibende % in Plasmagerinnselassay (mit Thrombin) – verbleibende % in Plasmagerinnselassay (ohne Thrombin)

Beispiel 27: Normale Bioverteilung bei Ratten
Die Wiederauflösung eines Gerinnselbildes hängt von der Kombination der Einführungsrate des Radiopharmazeutikums und seiner Blut/Gewebeclearancerate ab. Aus diesem Grund ist die Bioverteilung mehrerer Verbindungen bei Ratten bestimmt worden. Männlichen Wistar-Ratten (100–150 g) wurden i. v. 0,1 bis 0,2 ml einer radioaktiv markierten Tracerlösung (8 MBq/ml) injiziert und diese wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion dis seziert. Die % ID in jedem der ausgewählten Gewebe wurde gemessen. Einige Tiere wurden in Metabolismuskäfigen gehalten, um die im Urin und dem Kot ausgeschiedene % ID zu bestimmen. Die Dissektionszeiten für die meisten der Mittel betrugen 2, 15, 30, 60, 240 min. Die Daten werden als % ID, Mittel + Standardabweichung, (n = 3) gezeigt.
Ergebnisse:
Beispiel 28: Einführung in Gerinnsel, induziert in einem Rattenmodell Rat Inferior vena cava model (IVC)
Die Ratten (männliche Wistar, 250–350 g) wurden mit 15% Urethan anästhesiert. Nach der Laparotomie wurde das Vena cava isoliert und von dem umliegenden Fettgewebe befreit. Ein Platindraht (1,5 cm × 0,5 mm) wurde in das Inferior vena cava eingeführt und 5 min nach dem chirurgischen Eingriff wurden 0,4 ml Ellagsäure (1,2 × 10^–4 M) intravenös durch die Femoralvene, die vorher kanüliert wurde, injiziert, und das Gerinnsel konnte sich bilden. Das durchschnittliche Gewicht der Gerinnsel, die sich in diesem Modell bildeten betrug um die 27 mg, n = 32, (5 bis 50 mg-Bereich). Die Verbindungen wurden 5 min nach der Induktion injiziert. Nach 60 min wurden die Tiere getötet und das Gerinnsel entfernt, gewogen und gezählt. Andere Gewebe, z. B. Blut, Lunge und Herz, wurden auch disseziert und gezählt. Die Aufnahme von Tracer in das Gerinnsel wurde als die relative Konzentration (cpm/g Gerinnsel durch Dosis/g Tier) und Gerinnsel an Hintergrundgewebe bestimmt.
Abkürzungen

BOC

^tButoxycarbonyl

br. s

breites Singulett

d

chemische Verschiebung in Teilen pro Million (ppm)

DCC

Dicyclohexylcarbodiimid

DIPEA

Diisopropylethylamin

DMAP

Dimethylaminopyridin

DMC

Dimethylcasein

DMF

Dimethylformamid

ES

Elektrospray

EtOAc

Ethylacetat

FAB

Ionisierung durch Atombeschuß

Fmoc

Fluorenylmethoxycarbonyl

HBTU

O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat

HPLC

Hochdruckflüssigchromatographie

h

Stunden

Hz

Hertz

J

Kopplungskonstante

m

Multiplett

MALDI-Tof

matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie

MeOH

Methanol

min

Minuten

ⁱPrOH

iso-Propanol

Py-BOP

Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat

RCP

radiochemische Reinheit

RP-HPLC

Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatograpie

s

Singulett

t

Triplett

TEA

Triethylamin

TFA

Trifluoressigsäure

THF

Tetrahydrofuran

DC

Dünnschichtchromatographie

Z

Benzylcarbamat

Claims

Metall-komplexierendes Mittel, an das mindestens ein Substituent der Formel -(Y)_m-A-NHR, gebunden ist, worin Y an verschiedenen Stellen im Molekül gleich oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus: einer A-Gruppe, einer C_4-8-Cycloheteroalkylen-Gruppe, einer C_4-8-Cycloalkylen-Gruppe, einer C_5-12-Arylen-Gruppe, einer C_3-12-Heteroarylen-Gruppe oder einer Polyalkylenglycol-, Polyessigsäure- oder Polyglycolsäure-Einheit, m eine ganze Zahl mit einem Wert von 0–20 ist, A eine Kette mit 3–10 Atomen aus Einheiten ist, die ausgewählt sind aus -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂- oder -CR₂ZCR₂-, worin Z -CH₂-, O, S, Se oder -NR- ist, R an verschiedenen Stellen im Molekül gleich oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkenyl, C_1-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl oder C_1-4-Hydroxyalkyl, mit der Maßgabe, daß an das komplexierende Mittel nicht auch eine Hypoxie-lokalisierende Einheit gebunden ist.
Metall-komplexierendes Mittel gemäß Anspruch 1, wobei A -NHCO(CH₂)₂Z(CH₂)₂- oder -SO₂NH(CH₂)₂Z(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂Z(CH₂)₂- ist.
Metall-komplexierendes Mittel gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Z CH₂ ist.
Metall-komplexierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mindestens einmal vorhandene Substituent die Formel -(Y)_m-A-NH₂ aufweist.
Metall-komplexierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Substituent die Formel -(Y)_b-Ar-SO₂NH(CH₂)₅NH₂ aufweist, worin b eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 19 ist und Ar eine Arylen- oder Heteroarylen-Gruppe ist.
Metall-komplexierendes Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das komplexierende Mittel ein Metallchelatisierendes Mittel ist.
Metall-komplexierendes Mittel gemäß Anspruch 6, wobei das Metall-chelatisierende Mittel ein Diamindioxim ist.
Metallkomplex eines oder mehrerer radioaktiver oder paramagnetischer Metallionen mit dem Metallkomplexierenden Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Metallkomplex gemäß Anspruch 8, wobei das radioaktive Metall ^99mTc, ¹¹¹In oder ⁶⁷Ga ist.
Metallkomplex gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Verwendung in der Diagnose oder Therapie von Thrombosen, Embolien, Arteriosklerose, Entzündungen oder Krebs.
Kit zur Herstellung eines Metallkomplexes nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
Behältnis, das eine Einzeldosis des Metallkomplexes nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Verabreichung an einen Menschen enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in der Diagnose oder Therapie von Thrombosen, Arteriosklerose, Entzündungen oder Krebs, das die Überführung des Metallkomplexes nach einem der Ansprüche 8 bis 10 in eine Form, die für eine Verabreichung an den Menschen geeignet ist, umfaßt.