CZ20004191A3 - Značené analogy glutaminu a lysinu - Google Patents

Abstract

Syntetické analogy lysinu a glutaminu, které fungují jako substráty fibrin-stabilizujícího enzymového faktoru XlIIa značené detekovatelnou skupinou. Použití vhodných chránících skupin poskytuje sloučeniny, které odolávají in vivo metabolismu zejména peptidasami a jsou proto vhodnými činidly pro diagnózu trombózy, embólie, aterosklerózy, zánětů nebo rakoviny.

Description

Značené analogy glutaminu a lysinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká skupiny sloučenin vhodných pro diagnózu a nalezení místa trombózy žil a tepen, embólie ;iebo infekce, farmaceutických prostředků, které je obsahují, jejich použití při diagnóze chorob a způsobů jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Předchozí radiofarmaka pro diagnózu trombu zahrnují ' radioaktivním izotopem značený fibrinogen nebo plasminogen; radioaktivním izotopem značený fragment E lidského fibrinu; radioaktivním izotopem značený jako tkáňový aktivátor plasminogenu (t-PA) a radioaktivním izotopem značené anti-fibrinové protilátky. Rovněž byly popsány způsoby detekce míst akumulace krevních destiček, kdy se podávají radioaktivním izotopem značené krevní destičky (například s použitím ^U1ln oxinu) nebo radioaktivním izotopem značené protilátky proti destičkám. Pozdější přístupy byly zaměřeny na radioaktivním izotopem značené peptidy nebo polypeptidy jako je motiv buněčné adhéze RGD (kde R, G a D jsou standardní zkratky aminokyselin argininu, glycinu a aspartové kyseliny); destičkový faktor 4 nebo jejich fragmenty nebo antikoagulační peptidy jako jsou disintegriny.

Faktor XIII je plasmový glykoprotein přítomný v krvi a některých tkáních v katalyticky neaktivní (nebo zymogenové) formě. Faktor XIII převádí na aktivní formu trombin v přítomnosti iontů vápníku. Faktor XIII je také známý jako plasmová transglutaminasa, fibrinoligasa nebo stabilizující faktor fibrinu. Konečným krokem tvorby krevní sraženiny je kovalentní zesítění fibrinu, který vzniká proteolytickým štěpením fibrinogenu trombinem. Molekuly fibrinu se srovnají a enzymový faktor XlIIa katalýzuje kovalentní zesítění NH₂ skupina a CONH₂ skupin lysylových a glutaminylových zbyteků,

čímž vzniká strukturní rigidita krevní sdraženiny. Zesítění stabilizuje strukturu fibrinové sraženiny a způsobuje odolnost vůči fibrinolýze. Zesítění je důležitým aspektem normálního srážení krve a hojení ran i patologických stavů jako je trombosa. Protože je aterotrombotický mozkový infarkt běžným podtypem mozkové mrtvice, může substrát faktoru XlIIa umožnit její diagnózu. Zároveň se může účastnit aterosklerosy, zánětlivých procesů, růstu nádorů a a metastasy. Přihláška WO 91/16931 uvádí, že radioaktivním izotopem značená analoga faktoru XIII (kde bylo aktivní místo inaktivováno záměnou aminokyseliny) jsou vhodná jako trombus zobrazující radiofarmaka.

faktoru XlIIa nízkomolekulárních Podobně faktor nízkomolekulárních je také známo, že katalyzuje aminů do γ-glutaminových míst XlIIa také katalyzuje glutaminových analogů do do zavádění proteinů. zavedení lysylových zbytků. Proto tyto nízkomolekulární aminy (nebo glutaminová analoga) fungují lysyl/glutaminylového XlIIa. Byla popsána jako kompetitivní inhibitory zesítění proteinů vyvolaného faktorem řada syntetických aminů, které jsou kompetitivními inhibitory zabudování značeného putrescinu (1,4-butandiamin) do Ν,N'-dimetylkaseinu katalyzovaného transglutaminasou vepřových jater [L. Lora a další, Biochem. 18, 1756 (1979)].

Přihláška WO 89/00051 (Cytrx Biopool Ltd.) nárokuje způsob zacílení fibrinových usazenin za použití značených sloučenin, které se kovalentně váží na fibrin prostřednictvím faktoru XlIIa. U sloučenin vážících fibrin je uvedeno, že se jedná o „libovolný peptid, který je substrátem krevního enzymu obecně známého jako faktor XlIIa. Jako výhodné peptidy jsou uvedeny látky obsahující tetrapeptidovou sekvenci -Asn-Gln-GluGln- (nebo NQEQ - standardní aminokyselinové zkratky). Také je uveden 12-členná peptidová sekvence z NH₂ konce alfa-2 antiplasminového enzymu: NH₂-Asn-Gln-Glu-G.ln-Val-Ser-Pro-LeuTr-Leu-Tr-Leu-Leu-Lys-OH spolu se syntetickým analogem: NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Tyr-Tr-Leu-Tr-Leu-Leu-Lys-OH, (označené jako NQEQVSPLTLTLK respektive NQEQVSPYTLTLK). Později zmíněná sloučenina byla značena radioaktivním izotopem ¹²⁵I a in vitro se usazuje v trombinových sraženinách.

Podstata vynálezu

Nyní bylo objeveno, že syntetická analoga lysinu a glutaminu značená vhodnými zbytky, které lze detekovat, mohou také sloužit jako substráty enzymu-faktoru XlIIa. Použití vhodných chránících skupiny poskytuje sloučeniny, které méně podléhají in vivo metabolismu zejména vlivu peptidas a jsou proto vhodnějšími činidly pro zacílení, značení resp. diagnózu.

Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny vzorce:

Y- (CR₂)_n-X-NHJ kde:

X je skupina C=0 nebo CR₂;

n je celé číslo od 1 do 6;

Y je skupina L(A)_m- nebo skupina R¹R²CR- kde L je činidlo komplexující kov, A je skupina -CR₂- , skupina -CR=CR-, skupina -C=C-, skupina -NRCO-, skupina -CONR-, skupina -SO₂NR-, skupina -NRSO₂-, skupina -CR₂OCR₂-, skupina -CR₂SCR₂-, skupina -CR₂NRCR₂a Czj-g cykloheteroalkylenová skupina, C4-8 cykloalkylenová skupina, C₅-i₂ arylenová skupina, C3-12 heteroarylenová skupina nebo polyalkylenglykol, polymer mléčné kyseliny nebo zbytek polyglykolové kyseliny;

m je celé číslo od 0 do 10;

kde jeden ze zbytků R¹ a R² je skupina -NHÍBjpZ¹ a druhý je skupina - CCHBjqZ¹ kde

p a q jsou celá čísla od 0 do 45 a každá skupina B je nezávisle vybrána ze skupiny, kterou tvoří možnosti pro skupinu Q nebo aminokyselina, kde Q je cyklický peptid;

Z¹ a Z² jsou chránící skupiny;

J a každá skupina R jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, Ci_₄ alkylová skupina, Ci-₄ alkenylová skupina, Cx_₄ alkinylová skupina, Ci_₄ alkoxyalkylová skupina nebo Ci-₄ hydroxyalkylová skupina; s podmínkou že:

(i) celkový počet aminokyselinových zbytků v R¹ a R² skupinách nepřekročí počet 45;

(ii) pokud X je skupina CR₂, pak Y je skupina -CRR¹R² a Z² je činidlo komplexující kov;

1 2 (iii) pokud je Y skupina -CRR R pak alespoň jeden z R a R nese alespoň jednu detekovatelnou skupinu.

Vynález také poskytuje soupravy pro přípravu výše uvedených sloučenin značených detekovatelným zbytkem, použití těchto a příbuzných sloučenin při diagnóze nebo léčení trombózy, embolie, aterosklerózy, zánětů nebo rakoviny.

Termín „cyklický peptid znamená sekvenci 5 až 15 aminokyselin, kde jsou obě koncové aminokyseliny spolu spojeny kovalentní vazbou, která může být peptidická nebo disulfidická vazba nebo syntetická nepeptidická vazba jako je tioeterová, fosfodiesterová, disiloxanová nebo uretanová vazba.

Termín „aminokyselina znamená L- nebo D-aminokyselina, aminokyselinový analog nebo aminokyselinový motiv, který může být přírodního nebo čistě syntetického původu a může být opticky čistý tj. jeden enantiomer a proto chirální, nebo směs enantiomerů. Preferably te amino kyseliny of te present vynález are opticaly pure. Termín „aminokyselinový motiv znamená syntetický analog přírodní aminokyseliny tzv. isoster, což je sférickou a elektronovou strukturou podobný analog přírodní sloučeniny, tyto isostery jsou odborníkům známé a zahrují (ale nejen) depsipeptidy, retro-inversopeptidy, tioamidy, cykloalkany nebo 1,5-disubstituované tetrazoly [viz. M. Goodman, Biopolymers 24, 137, (1985)].

Termín „chránící skupina znamená biokompatibilní skupinu, která inhibuje nebo brání in vivo metabolismu peptidů nebo aminokyseliny na aminovém nebo karboxylovém konci. Takové skupiny jsou odborníkům známé a pro aminový konec (Z¹) jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: acetyl, Boc (t-butyloxykarbonyl), Fmoc (fluorenylmetoxykarbonyl), benzyloxykarbonyl, trifluoracetyl, allyloxykarbonyl, Dde [1-(4,4-dimetyl-2,6-dioxocyklohexyliden)etyl] , Npys (3nitro-2-pyridinsulfenyl) nebo kov komplexující skupina;

a pro karboxylový konec (Z²): karboxamid, tert-butylester, benzylester, cyklohexylester, aminoalkohol nebo kov komplexující skupina.

Vhodná chránící skupina je kov komplexující skupina, nejvhodnější je kov komplexující skupina vázaná na kov tj. komplex kovu. Karboxylový konec peptidů je zvláště náchylný k in vivo štěpení karboxypeptidasovými enzymy. Proto je kov komplexující skupina nebo komplex kovu vhodně připojen ke karboxylovému konci. Pokud je R¹ skupina -NHÍBJp-iQZ¹ nebo R² je skupina -CO (B) _q_iQZ², pak může být chránící skupinou kovalentní vazba, která uzavírá cyklický peptidový (Q) kruh.

„Detekovatelná skupina je skupina, která emituje signál nebo je vhodná pro diagnostické zobrazení místa v lidském těle a může to být radioizotop pro radiofarmaceutické zobrazení nebo terapii, paramagnetický kov nebo sloučenina pro magnetickou rezonanci (kontrastní zobrazení), radio-neprůsvitná skupina nebo kov pro rentgenové kontrastní zobrazení, plynné mikrobublinkové ultrazvukové kontrastní činidlo nebo vhodné barvivo pro detekci externím světlem. Pro zobrazení je vhodný ion kovu zejména radioaktivního.

Pokud je Y skupina -CRR¹R², pak s výhodou jeden nebo oba zbytky R¹ a R² obsahují jeden nebo několik peptidových fragmentů a2-antiplasminu, fibronektinu nebo β-kaseinu, fibrinogenu nebo trombospondinu. Tyto peptidové fragmenty obsahují alespoň 3 a s výhodou 4-20 aminokyselinových zbytků. Pokud je Y skupina -CRR¹R² a -(CR2)-X-NHJ je skupina -(CH₂)4NH₂ (tj . postranní aminokyselinový řetězec lysinu), pak s výhodou jeden nebo oba zbytky R¹ a R² obsahují jeden nebo několik těchto peptidových fragmentů a₂-antiplasminu, fibronektinu nebo β-kaseinu. Aminokyselinové sekvence a₂-antiplasminu, fibronektinu, β-kaseinu, fibrinogenu a trombospondinu lze nalézt podle následujících odkazů: a₂-antiplasminový prekurzor (M. Tone a další, J. Biochem 102, 1033, 1987); β-kasein [L. Hansson a další, Gene 139, 193, 1994]; fibronektin [A. Gutman a další,

FEBS Lett. 207, 145, (1996)]; prekurzor trombospondinu-1 [V. Dixit a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986)]; R. F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem. 53, 195, (1984).

Aminokyselinová sekvence s výhodou pochází z N-konce:

(i) a₂-antiplasminu, tj. NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-LeuTr-Leu-Tr-Leu-Leu-Lys-OH nebo jeho variant, kde byla jedna nebo několik aminokyselin zaměněno, přidáno nebo odstraněno, např.: NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-TrLeu-Tr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,

NH₂-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Tr-Leu-Tr-Leu-Leu-LysGly-OH,

NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH; nebo (ii) kaseinu, tj. Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly.

• ·

Pokud je sloučenina podle předkládaného vynálezu peptid, tj . Y je skupina R^XR²CR- , je počet aminokyselinových zbytků s výhodou 2 až 30, výhodněji 3 až 20, zejména 3 až 15.

Výhodné sloučeniny mají J stejné jako H, tj. končí skupinou i NH₂.. X je s výhodou skupina C=O, tzn. že výhodné jsou sloučeniny vzorce Y-(CR₂) _n ^_CONH₂. Nej výhodnější jsou sloučeniny vzorce Y-(CR₂) _x-(CH₂) ₂CONH₂ nebo Y- (CR₂) _y- (CH₂) ₄NH₂, kde „x je celé číslo od 0 do 4 a „y je celé číslo od 0 do 3. Zejména výhodné jsou sloučeniny, které mají stejný postranní řetězec jako glutamin tzn. analoga glutaminu vzorce Y- (CR₂) _x- (CH₂) ₂CONH₂ .

Vhodné nekovové radioizotopy pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují (ale nejen): radioizotopy jodu jako ¹²³I, ¹²¹I, ¹³¹I, zejména ¹²³I; zdroje pozitronů jako ¹⁸F, ^UC nebo ⁷⁵Br a izotopy pro léčení např. ²¹¹Ag.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které obsahují činidla komplexující kovy mají s výhodou připojenu lokalizující molekulu pouze jednoho typu, tj. substituent - (CR₂)_n-X^-NHJ. Komplexující činidlo může nést i další substituenty, ale skupina -(CR₂) _n-X-NHJ je ta, od které se očekává primární odpovědnost za biolokalizující vlastnosti. Komplexy kovů podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jeden nebo několik iontů kovů, které mohou být stejné nebo různé. Tak mohou za určitých okolností mít výhodné vlastnosti polynukleární komplexy jako některé klastry kovů, které mají superparamagnetické vlastnosti a jsou proto zejména vhodné jako kontrastní látky pro magnetickou rezonanci. Výhodné komplexy kovů podle předkládaného vynálezu obsahují pouze jeden ion kovu. Pokud je kov v komplexu radioaktivní, může se jednat o buď o zdroj pozitronů (jako ⁶⁸Ga nebo ⁶⁴Cu) nebo o γ-zářič jako ^99mTc, ^11TIn, ^113mIn nebo ⁶⁷Ga. Vhodné ionty kovů pro použití v MR jsou ionty paramagnetických kovů jako je gadolinium (III) nebo mangan (II). Nejvýhodnější radioaktivní kovy pro diagnostické • · · · · zobrazování jsou γ-zářiče, zejména ^99mTc. Jako radiofarmaka mohou být vhodné kovové komplexy některých radionuklidů, a to pro radioterapii různých chorob jako je rakovina nebo léčení trombózy nebo restenózy. Vhodné radioizotopy pro takové radioterapeutické aplikace zahrnují: ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁶⁹Er, ¹⁵³Sm a ¹⁹⁸Au.

188

Re,

Ať už se vybere jakýkoliv komplex kovu, je velmi výhodné, aby byl navázán na substrát faktoru XlIIa tak, že nepodléhá snadno metabolismu v krvi s následným odštěpením komplexu kovu od substrátu faktoru XlIIa ještě před tím, než substrátu faktoru XlIIa dortazí in vivo na místo, které má zobrazit. Proto je substrátu faktoru XlIIa podle předkládaného vynálezu s výhodou na komplex kovu vázán kovalentní vazbou.

Uvedené ionty kovů jsou komplexovány za použití komplexujících činidel nebo výhodněji chelatujících činidel. Chelatující činidla obsahují 2-10 kov-donorních atomů, které jsou spolu kovalentně vázány nekomplexující páteřní částí. Výhodná chelatující činidla obsahují 4-8 kov-donorních atomů, která jsou buď ve uspořádání otevřeného řetězce nebo makrocyklu nebo se jedná o jejich kombinaci. Nejvýhodnější chelatující činidla mají 4-6 kov-donorních atomů a tvoří 5- nebo 6-členné chelátové kruhy (po koordinaci k centru, které tvoří atom kovu). Taková polydentátní a/nebo macrocyklická chelatující činidla tvoří stabilní komplexy kovů, které mohou in vivo přečkat působení endogenních konkurenčních ligandů kovů jako je transferrin nebo plasmové proteiny. Alternativně lze použít monodentátní komplexující činidla, která tvoří stabilní komplexy ionty kovů, i když netvoří kruhové cheláty Příklady známých komplexujících činidel s požadovanými (po koordinaci kovu) tohoto typu, která jsou zejména vhodná pro hydraziny, fosfiny, arsiny nebo isonitrily.

99m,

Tc, jsou

Příklady vhodných chelatujících činidel jsou bidentátní diaminy nebo difosfiny, tridentátní monoaminditioly nebo tetradentátní diamindioximy (US 4615876) nebo ligandy obsahující donory amidů (WO 94/08949 ) ; tetradentátní ligandy podle WO 94/22816; N₂S₂ diaminditioly, diamidditiols nebo amidaminditioly; N₃S tioltriamidy; N₄ ligandy jako tetraaminy, makrocyklické aminy nebo amidové ligandy jako cyklám, oxocyklam (který tvoří neutrální komplex technecia) nebo dioxocyklam; nebo ditiosemikarbazony. Výše uvedené ligandy jsou zejména vhodné pro technecium ale i pro další kovy. Další vhodné ligandy jsou popsané v přihlášce Sandoz WO 91/01144, která zahrnuje ligandy zejména vhodné pro indium, yttrium a gadolinium, zejméan makrocyklické aminokarboxyláty a aminofosfonové kyseliny. Ligandy, které tvoří neiontové (tj . neutrální) komplexy gadolinia jso uznámé a popsané v přihlášce US 4885363. Ligand může obsahovat i krátké sekvence aminokyselin jako je Cys/aminokyselina/Cys tripeptid popsaný v přihlášce WO 92/13572 nebo peptidové ligandy popsané v přihlášce EP 0719790 A2.

Výhodná chelatující činidla mají vzorec

RN [ (CR₂) _aN (CR₂) bCR=NOH] 2 , kde „a je 2 nebo 3;

„b je 1 nebo 2;

jedna skupina R je aminoalkylenová skupina, přes kterou se chelatující činidlo pojí ke zbytku molekuly;

druhá skupina R je nezávisle atom vodíku, Ci_i₀ alkylová skupina, alkoxyskupina, alkoxyalkylová skupina, aminová skupina, amidová skupina, hydroxylová skupina, hydroxyalkylová skupina nebo karboxylát nebo dvě skupiny dohromady s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří karboxylový, heterocyklický nasycený nebo nenasycený kruh.

Výhodné jsou nepeptidová kov-chelatující činidla s lepší kontrolou vazby a uvolnění ionu kovu.

Vynález také fibronektinu, polyglutaminu.

aminokyselinových zbytků činidlo.

zahrnuje β-kaseinu,

Uvedený peptidový tetanu, peptidový a nese fragment a₂ ^_antiplasminu, amyloidu, trappinu nebo fragment obsahuje 3-45 koncové kov-komplexující

Příprava chelatujících činidel, která mají připojené funkční skupiny („bifunkční cheláty), je známá. Funkční skupiny, které byly připojeny k chelatujícím činidlům jsou: amin, karboxylová kyselina, kyanát, tiokyanát, maleimid a aktive ester jako N-hydroxysukcinimid. Příklady chelát-amin konjugátů pro diamindioximové ligandy jsou uvedeny v přihlášce WO 95/19187. Pokud je požadovaná funkční skupina substrátu faktoru XlIIa amin, ligandy podle předkládaného vynálezu lze připravit reakcí bifunkční sloučeniny, která obsahuje aminovou skupinu (vhodně chráněnou za použití vhodné chránící skupiny odborníkům známé) a reaktivní skupinu jako je sulfonylchlorid, chlorid kyseliny, aktivní ester nebo alkyl/benzyl halogenid. Reaktivní skupina pak může být spojena buď s protější amino skupinou bifunkčního chelátu, nebo se použije pro derivatizaci jednoho nebo několika amin-donorních atomů dusíkatého ligandu. Alternativně může reagovat mono-chráněný diamin s bifunkčním chelátem s aktivní esterovou nebo karboxylovou skupinou za získání chráněné aminové skupiny připojené k ligandu amidovou vazbou. V obou výše uvedených syntetických pochodech se výsledný konjugát ligandu a chráněného aminu odehrání za vhodných podmínek za získání požadovaného aminem funkcionaliyovaného ligandu. Pokud je požadovanou funkční skupinou substrátu faktoru XlIIa karboxamidová skupina, lze požadované ligandy připravit například reakcí ω-halogenalkylkarboxamidu s vhodnou délkou řetězce s bifunkčním chelátem s protější aminovou skupinou za získání požadovaného ligandu spojeného s karboxamidem.

Kovové komplexy podle předkládaného vynálezu lze připravit reakcí roztoku kovu v příslušném oxidačním stupni s ligandem při vhodném pH. Roztok může výhodně obsahovat ligand, který slabě komplexuje kov (jako chlorid, glukonát nebo citrát). Tzn. komplex kovu se připraví výměnou ligandu nebo transchelatací. Uvedené podmínky jsou vhodné pro potlačení nežádoucích vedlejších reakcí jako je hydrolýzy ionu kovu. Pokud je ionem kovu ^99mTc, vychází se obvykle z pertechnetátu sodného z ⁹⁹Mo generátoru. Technecium je v ^99mTc-pertechnetátu sedmimocné Tc(VII). V tomto stavu je relativně nereaktivní. Příprava komplexů technecia v nižších oxidačních stavech Tc(I) až Tc(V) proto obvykle vyžaduje pro usnadnění komplexace přidání vhodného redukčního činidla jako jsou cínaté ionty. Další vhodná redukovadla jsou popsána níže.

Komplex kovu by měl také výhodně vykazovat nízké nespecifické pozadí v krvi.

Předkládaný vynález se tak hlavně týká diagnostických činidel pro zobrazení určitého místa v těle savců, kde se aktivuje enzym faktor XIII a kde se ukládají krevní proteiny jako fibrin nebo kolagen. Činidla podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodná pro diagnostické zobrazení určitého místa v těle člověka. Činidla obsahují substráty pro enzym faktor XlIIa, které jsou značeny komplexy kovů vhodnými pro externí zobrazení jako jsou radioaktivní kovy (pro scintilograf ii) nebo ionty paramagnetických kovů (pro MR) . Komplex kovu podle předkládaného vynálezu má protější aminovou nebo karboxamidovou funkční skupinu, která je k dispozici pro kovalentní vazbu k proteinovému glutamylkarboxamidu nebo lysylaminu působením enzymu faktoru XlIIa. Úzká souvislost fibrinu a faktoru XlIIa osvětluje potenciální využití činidel podle předkládaného vynálezu pro diagnózu chorob, kde dochází k ukládání nebo hromadění fibrin a aktivaci faktoru XIII. Ví se, že zvýšené ukládání fibrinu je charakteristické pro choroby jako trombosa, aterosklerosa, fibrosa jater a roztroušená intravaskulární koagulace. Fibrin se rovněž ukládá na místech zánětu tkáně, který souvisí s řadou chorobných procesů jako je infekce, autoimunní poruchy nebo rakovina. Faktor XIII a tkáňová trans12

glutaminasa se aktivují za známých fyziologických podmínek. Ke zvýšení hladiny enzymů dochází během apoptosy a tvorby nových struktur matricových proteinů. Činidla podle předkládaného vynálezu tak lze rovněž použít pro detekci apoptosy a chorob jako je artritida, kdy dochází ke zvýšenému ukládání matricových proteinů. Protože se faktor XIII aktivuje in vivo na místě, které nás zajímá (tj. trombus, embolie apod.), umožňuje to komplexům kovů podle předkládaného vynálezu localizační mechanismus. Kovalentně vázané komplexy kovů lze pak externě zobrazit radionuklidovou scintilografií nebo magnetickou rezonancí (MR), což umožňuje neinvazivní diagnózu místa choroby.

Co se týče terapeutických aspektů tohoto vynálezu, mají autoři k dispozici předběžné in vivo údaje (které zde nejsou detailně uvedeny), které ukazují, že krevní sraženiny vzniklé v přítomnosti značených peptidů podle předkládaného vynálezu (viz. příklad 17 níže) jsou menší než za nepřítomnosti značených peptidů. Proto máme za to, že zde uvedené peptidy typicky obsahující 4-30 a například 10 aminokyselinových zbytků, jsou účinné jako léčiva pro zrychlení rozkladu krevní sraženiny například působením jako inhibitor fibrinového zesítění sraženin. Proto mají sloučeniny podle předkládaného vynálezu farmaceutický potenciál pro použití jako trombolytická nebo antikoagulační léčiva pro terapii.

Předkládaný vynález se rovněž týká souprav pro přípravu komplexů kovů připojených k substrátu faktoru XlIIa. Souprava je navržena pro získání sterilních produktů vhodných pro podávání lidem například injekcemi. Možná provedení jsou diskutována níže. Pokud je detekovatelnou skupinou ^99mTc, představuje sada ampulku obsahující volný ligand nebo chelatující činidlo kovu spolu s farmaceuticky upotřebitelným redukčním činidlem jako je ditionit sodný, bisulfit sodný, kyselina askorbová, formamidinsulfinová kyselina, cínaté ionty, Fe(II) nebo Cu(I), výhodně cínaté soli jako chlorid cínatý nebo

vínan cínatý. Alternativně může prostředek obsahovat komplex kovu, který po přidání radioaktivního nebo paramagnetického kovu podléhá transmetalaci (tj. přenos lgandu) za získání požadovaného produktu. V případě ^99mTc se prostředek výhodně lyofilizuje a umožňuje rekonstituci sterilním ^99mTc-pertechnetátem (TcO₄”) z generátoru radioizotopu ^99mTc za získání roztoku vhodného pro podání člověku bez další manipulace.

Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být i ve formě jednotkové dávky připravené pro injekce a mohou být dodávány například ve sterilních stříkačkách. Pokud je detekovatelnou skupinou radioaktivní izotop jako ^99mTc, byla by stříkačka obsahující jednotkovou dávku dodávána s krytem (k ochraně operátora před potenciálním radioaktivním zářením).

Výše uvedené soupravy nebo stříkačky mohou volitelně obsahovat další složky jako solubilizátory (např. látky jako Pluronic, pufry; farmaceuticky upotřebitelné cyklodextriny nebo povrchově aktivní Tween nebo fosfolipidy); farmaceuticky upotřebitelné stabilizátory nebo antioxidanty (jako askorbová kyselina, gentisová kyselina nebo p-aminobenzoová kyselina) nebo plnidla pro lyofilizací (jako chlorid sodný nebo mannitol) .

Následující příklady ilustrují přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu a jejich použití při lokalizace a zobrazování. Syntézy jednotlivých sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny v příkladech 1-9, jejich značení radioizotopy ¹²³I nebo ^99mTc v příkladech 10-12. Sloučenina 1 (z dosavadního stavu techniky) je uvedena jako srovnávací příklad. Důkaz zvýšené stability v plasmě in vitro je uveden v příkladu 13. Důkaz zabudování do krevní sraženiny in vitro a in vivo je uveden v příkladech 15 a 17. Normální biodistribuce radioaktivním izotopem značené sloučeniny u krys je uvedena v příkladu 16.

Stabilita ¹²³I-sloučeniny 1 in vitro v plasmě je nízká (viz. příklad 13) pravděpodobně kvůli aktivitě proteasy. Zavedení chránící skupiny na karboxylový i aminový konec jako u radioaktivním izotopem značených sloučenin 2-5 a 7-49 způsobí silné zvýšení stability v plasmě.

Většina testovaných sloučenin vykazuje in vitro vysoký stupeň zabudování do sraženiny a tím i afinitu ke sraženině. Ostatní sloučeniny mají menší potenciál. Sloučeniny 14, 16, 18, 31, 34, 36, 46 a 48 vykazují značné snížení zabudování do sraženiny. Odstranění glycinového zbytku z pozice 2 sekvence odvozené od a₂-antiplasminu (jako u sloučeniny 14) způsobí značný pokles zabudování této látky, což silně mluví pro to, že Gln-2 je esenciální aminokyselina v sekvenci tohoto typu.

Detaily o biodistribuci u normálních krys a v modelu čerstvé a starší sraženiny uvádí příklady 16 a 17. Rychlost vymizení z krve je u těchto sloučenin poměrně velká. Biologický poločas života je 1-2 hodiny. Jako reprezentativní příklad biodistribuce je uvedena ^99mTc-sloučenina 3. V tomto případě je ti/₂ přibližně 2 hodiny. Rychlé vymizení ze základních orgánů jako je krev, plíce, srdce a svaly ukazuje, že činidla podle předkládaného vynálezu mají vhodné farmakokinetické vlastnosti pro lokalizaci a zobrazování, což ukazuje na jejich potenciál jako radiodiagnostik. Přestože tyto sloučeniny vykazují určité hepatobiliární vylučování, hlavní cestou vylučování je močová soustava.

Zabudování do čerstvé a starší krevní sraženiny u krysího modelu je u řady radioaktivním izotopem značených sloučenin velmi dobré (relativní koncentrace nebo RC= 5-15), s velmi dobrým poměrem (sraženina/základní orgány) pro zobrazování (>5) . Příklad 18 ukazuje, ^99mTc-sloučenina 5 je vhodná pro zobrazování sraženin o krysího modelu.

• ·· *· « «· 4 ··· * » * · · · ··· ··· ··« · · · • · » 4 · » · · » · 9 f • · » · · · · · ·«· ·· ·· 4·· ·· «44 ^99mTc-Sloučeniny 2-49 mají v porovnání se ¹²³I-sloučeninou 1 zvýšenou stabilitu v plasmě (RC = 1,5), což může být příčinou pozorovaného zlepšeného in vivo zabudování do sraženiny.

Porovnání výsledků zabudování do sraženiny příkladu 17 pro čerstvou a starší sraženinu ukazuje, že činidla podle předkládaného vynálezu vykazují zabudování, které je konstatní a nezávislé na stáří sraženiny. Tato činidla tak mají zlepšenou schopnost zobrazení starších sraženin - např. při plicní embolii.

Příklady provedení vynálezu

V následující tabulce mají zkratky uvedený význam:

Z benzyloxykarbonyl

Fmoc fluorenylmetoxykarbonyl

Ac acetyl

Pn44

Hynic

• * • ·· ·· « ·« • · · · »·«· « · • · * > » 1 ··» • ·*«·· · · 4» · ·

Všechny sloučeniny kromě označených ••bylý*’ átfalyžbváKý ES + hmotnostní spektrometrií. Sloučeniny označené horním indexem „a byly analyzovány pomocí FAB a sloučeniny označené horním indexem „b byly analyzovány pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie.

Peptid, | Slouč.	Teoret. | Nalez.
NQEQVSPYTLLK	1	1419.6	1419.7*
Ac-NQEQVSPYTLLKG-NH,	2	1517.7	1517.7
Ac-NQEQVSPYTLLKG-Pn44	3	1816.1	1816.2
Ac-NQEQVSPYTLLKG-Hynic	4	1709.7	1710.0
Ac-NQEQ VSP YTLLKG-Pn216	5	1845.2	1845.2
NQEQVSPYTLLKG-Pn216	6	1803.1	1803.3
Z-NQEQVSPYTLLKG-Pn44	7	1908.2	1908.1
Z-NQEQ VSPYTLLKG-Pn216	8	1937.2	1937.2
Fmoc-NQEQVSPYTLLKG-Pn216	9	2025.4	2025.4
(CF,),(C6H,)- NQEQVSPYTLLKG-Pn216	10	2044.2	2045.2
Adamantoyl-NQEQ VSPYTLLKG-Pn216	11	1966.0	1966.5
Ac-NQEAVSPYTLLKG-Pn44	12	1759.1	1759.0
Ac-NQEAVSP YTLLKG-Pn216	13	1788.1	1788.0
Ac-N AEAVSPYTLLKG-Pn216	14	1766.1	1765.8
Ac-NQQQVSPYTLLKG-Pn216	15	1844.2	1844.1
Ac-NQG-Pn44	16	656.8	656.6
Ac-NQEQVG-Pn44	17	1908.2	1908.1
Z-NQEQVSPYG-Pn216	18	1481.7	1481.7
Ac-NQEQ VSPLTLLKG-Pn216	19	1795.2	1795.1
Ac-NQEQ VSP-Nal(2)-TLLKG-Pn216	20	1879.3	1879.3
Ac-NQEQ VSP(pBr-F)TLLKG-Pn216	21	1908.1	1908.9
Ac-NQEQ VSP(I-Y)TLLKG-Pn216	22	19712	1972.4
Ac-NQEQVSP(Ij-Y)TLLKG-Pn216	23	20982	2099.5
Z-NQEQVSP(I-Y)TLLKG-Pn216	24	20632	2064.4
Z-NQEQ VSP(I2-Y)TLLKG-Pn216	25	2189.2	2190.5
Fmoc-NQEQVSP(I-Y)TLLKG-Pn216	26	2152.4	2153.4
Fmoc-NQEQ VSP(Ij-Y)TLLKG-Pn216	27	2278.4	2279.3
Ac-NQEQ VSP YTLL(D-K)G-Pn216	28	1845.2	1845.2
Ac-NQEQ VSP(Z)-Y)TLL(D-K)G-Pn216	• 29	1845.2	1845.1
Ac-NQEQV(D-S)P(£>-Y)TLL(D-K)G-Pn216	30	1845.2	18452
Ac-NQEQ(D-V)(£>-S)P(D-Y)TLL(£>-K)G-Pn216	31	1845.2	1845.1
Ac-(£>-N)QEQVSP(£>-Y)TLL(D-K)G-Pn216	32	1845.2	1845.0
Ac-NQEQ VSP(D-Y)TLL(D-K)3 Ala-Pn216	33	18592	1859.0
Ac-N-CH;NHZ-QEQVSP(D-Y)TLL(D-K)G-Pn216	34	18312	1831.1
Ac-NQEQ(D-V)(D-S)(D-P)(D-Y)(£>-T)(D-L)(D-L)(D-K)G-Pn44	35	1816.1	1815.8
Pn21 6-CO(CH2)!CO-G(O-K)(D-L)(D-L)(D-T)(D-Y)(D-P)(D-S)(D-V)NHi	36	1916.2	1916.0
Fmoc-NQQQ(£>-V)S(OMe)PLG-Pn216	37	1532.8	1532.7
Pn44-CO(CHj)3CO-NQEQVSPYTLLKG-NH2	38	1887.7	1887.3
Pn21 ó-COCCHÚjCO-NQEQVSPYTLLKG-NHj	39	•1916.2	1916.3
Ac-NQEQVSPYTLLKG-(PEG)lxk-Pn44	40	5200-5600	5401“
Ac-NQEQVSPYTLLKG-(PEG),0k-Pn216	41	12400-	12630b
Z-NQEQVSPYA AA AG-Pn216	42	1766.0	1765.9
Z-NQEQVSPYG(CH2), ,(CO)-Pn216	43	1677.7	1679.8
Cyclo-[NQEQVSPYTLLKG]	44	1458.6	1458.3
Ac-LGPGQSKVIG-Pn44	45	1294.6	1294.4
p-EAQIVG-Pn44	46	10232	1023.0
Ac-LEFDTQSKNILG-Pn216	47	1733.0	1732.9
Ac-GQDPVKG-Pn216	48	1068.3	1068.0
Ac-YEVHHQKLVFFG-Pn216	49	1872.2	1872.3

• · « · · • · · · · · • · · · »9 · 6· ·· ··· ·· ·

Příklad 1

Syntézy sloučenin 1 a 2

Chráněný peptid Ac-Asn(Trt)-Gin(Trt)-Glu(OtBu)-Gin(Trt)-ValSer(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Tr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH se připraví na 2-chloratritylové pryskyřici zakotvením Fmoc-Lys(Boc) k pryskyřici a následným provedením příslušných cyklů odchránění/připojení za použití příslušných chráněných aminokyselin (viz. P. Loyd-Wiliams, F. Albericio a E. Girald; Chemical Approaches to the Syntesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997). Výše uvedená sloučenina se získá odštěpením pomocí 0,1% TFA v dichlormetanu, odchráněním a čištěním RP-HPLC (Systém A).

Příklad 2

Syntéza sloučenin 3-9, 12-21, 28-33, 35, 37, 42 a 45-49

Příslušné chráněné peptidy se připraví jako v příkladu 1 za použití příslušných chráněných aminokyselin. Chráněný fragment se odštěpí z s pryskyřice a připojí k dioximu 6-aminometyl3,3,6,9,9-pentametyl-4,8-diazaundekan-2,10-dionu (připraví se podle WO 95/19187), dioximu 3,3,11,11 -tetrametyl-7-aminoetyl4,7,10-triazatridekan-2,12-dionu (připraví se podle

WO 98/31399) nebo N-hydroxysukcinimidesteru 6-Boc-hydrazinopyridin-3-karboxylové kyseliny (připraví se podle US patentu 5,206,370) v roztoku. Jako spojovací činidlo se použije BOP. Výše uvedené sloučeniny se získají odchráněním ve směsi TFA/voda/trietylsilan (90/5/5) a čistí se RP-HPLC (Systém A).

Příklad 3

Syntéza sloučenin 22-27

V Eppendorfově zkumavce se smíchá sloučenina 5, 8 nebo 9 (1 mg), octan amonný jako pufr (400 μΐ, 0,2M, pH 4), jodid sodný (0,5 ekvivalentu, 15 mg/10 ml v O,1M NaOH) a peroctová kyselina (1,5 ekvivalentu, 0,1 Mroztok) . Reakčni se 1 minutu důkladně míchá a pak se vždy oddělí mono- a dijodderivát preparativní HPLC. Postup se opakuje za získání dostatečného množství izolovaných produktů.

Příklad 4

Syntézy sloučenin 10 a 11

V bezvodém DMF (2,5 ml) se rozpustí Fmoc-Asn(Trt)-Gin(Trt)Glu(tBu)-Gin(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Tr(tBu)-Leu-LeuLys(Boc)-Gly (200 mg, 0,73 mmol), Pn216 (30 mg, 0,87 mmol) a

HBTU (33 mg, 0,87 mmol). K roztoku se přidá diisopropyletylamin (20 ml, 1,15 mmol) a reakčni směs se míchá 1,75 hodiny při teplotě místnosti. K reakčni směsi se pak přidá piperidin (0,5 ml) a směs se 2 hodiny při teplotě místnosti. Produkt se čistí semi-preparativní HPLC za získání bílé pevné látky (171 mg, 82 %); ES⁺-MS: m/z 952,40 (M+3H⁺) .

V bezvodém DMF (1 ml) se rozpustí 1-adamantankarboxylová nebo 3,5-bis(trifluormetyl)benzoová kyselina (1,5 molárního ekvivalentu), chráněný peptid Asn(Trt)-Gin(Trt)-Glu(tBu)Gin(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Tr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)Gly-Pn216 (1 molární ekvivalent) a HBTU (1,2-1,5 molárního ekvivalentu). Pak se přidá diisopropyletylamin (11 molárních ekvivalentů) a reakčni směs se míchá při teplotě místnosti, dokud nedojde podle HPLC k úplné konverzi. Chráněný peptidový fragment pak reaguje s 95% trifluoroctovou kyselinou v CH₂C1₂. Reakčni směs se míchá při teplotě místnosti 2 až 4 hodiny. Produkt se čistí HPLC na reverzní fázi.

Příklad 5

Syntéza sloučeniny 34

Chráněný peptid se připraví z Fmoc-Asn(Trt)-ψ (CH₂NH)-Gin(Trt)OH klasickým postupem pro syntézu redukovaných peptidů

reduktivní aminací Gln(Trt) pomocí aldehydu odvozeného od Fmoc-

Asn(Trt) (například podle Res. 6(3) , 121, (1993)) . čistí podle příkladu 2.	práce G. Výsledná	Guichard a sloučenina	další, Peptide se připraví a
Příklad 6
Syntézy sloučenin 36	, 38 a	39
Chráněné peptidy se Rinkovy pryskyřice.	připraví podle Po odstranění	příkladu N-ochrany	1 ale za glycinu,	použití reaguje

peptid (stále zakotven na pryskyřici) s glutaranhydridem. Aktivace BOP/HOBt glutarát-karboxylové kyseliny a spojení s dioximem 6-aminometyl-3,3,6,9,9-pentametyl-4,8-diazaundekan2.10- dionu nebo dioximem 3,3,11,ll-tetrametyl-7-aminoetyl4.7.10- triazatridekan-2,12-dionu na pryskyřici poskytne chráněný produkt. Štěpení směsí TFA/voda (95/5) poskytne surový materiál, který se čistí za použití RP-HPLC (Systém A).

Příklad 7

Syntéza sloučenin 40 a 41

V bezvodém tetrahydrofuranu (5 ml) se zahřívá k varu 5 hodin v atmosféře dusíku roztok α-N-(t-butoxykarbonyl)-póly(etylenglykol) amino-co-sukcinimidylkarbonátu požadované molární hmotnosti a jednoho molárního ekvivalentu dioximu 6-aminometyl3,3,6,9,9-pentametyl-4,8-diazaundekan-2,10-dionu nebo dioximu 3,3,11,ll-tetrametyl-7-aminoetyl-4,7,10-triazatridekan-2,12dionu. Reakční směs se odpaří ve vakuu za získání pevné bílé látky, která se chromatograficky čistí ve směsi isopropanol/amoniak/voda 10:1:1 za získání výše uvedené sloučeniny ve formě pevné bílé látky. Chránící Boc skupina se odstraní za použití 37% HCI, která se přidá po kapkách k roztoku v metanolu chlazenému ledovou lázní. Roztok se pak míchá 4 hodiny při teplotě místnosti. pH reakční směsi se upraví na 10 přidáním 4M • ····· ♦ · ·· ^J * • · · · · · » · •·· ·· ·· «»· ·· ···

NaOH (4,18 ml). Produkt se izoluje semi-preparativní HPLC (systém D).

Získaná pevná látka se rozpustí v DMF a přidá se chráněný peptidový fragment. Pak se přidá diisopropyletylamin a HBTU a reakční směs se míchá při teplotě místnosti do úplné konverze. Produkt se chromatograficky čistí HPLC (systém E) za získání bezbarvého medu.

Tento med se rozpustí v dichlormetanu (2 ml) a k roztoku se přidá TFA (0,2 ml) na dobu 5 hodin. Pak se přidá 1,M NaOH (2 ml) a těkavé podíly se odstraní ve vakuu. Pak se ke zbytku přidá MeOH (2,5 ml) a směs se filtruje za požití akrodiskového filtru (LC13 PVDF 0,45 m) . Produkt se z metanolického roztoku izoluje pomocí HPLC (systém E).

Příklad 8

Syntéza sloučeniny 43

Podle výše popsaného postupu se 12-N-Fmoc-aminododekanová kyselina připojí k dioximu 3,11,ll-tetrametyl-7-aminoetyl4,7,10-triazatridekan-2,12-dionu. Chránící skupina Fmoc se odstraní 20% piperidinem v DMF a produkt se čistí HPLC (systém F).

Výše uvedený produkt se spojí s chráněným peptidovým fragmentem a následně se odehrání, jak je popsáno výše. Produkt se čistí HPLC (systém G).

Příklad 9

Syntéza sloučeniny 44

Částečně odchráněný peptid Η-Asn(Trt)-Gin(Trt)-Glu(OtBu)Gin(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr (tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH se připraví na 2-chlortritylchloridové pryskyřici pomocí posrupu založeného na Fmoc - tj . známým krokovým prodlužováním pomocí

BOP/HOBt. Ochrana N-konce se odstraní piperidinem a částečně

chráněný peptid se z pevné fáze odštěpí pomocí 0,5% roztoku TFA v dichlormetanu.

Cyklizace se provádí v roztoku při koncentraci 10 mM v DMF pomocí BOP jako kondenzačního činidla v přítomnosti pevného hydrogenuhličitanu sodného známým postupem (viz. například M. Rodriguez a další, Int. J. Pept. Protein Res. 35, 441,

1990) . Závěrečné odchránění ve směsi TFA/voda/etanditiol (90/5/5) poskytne surovou sloučeninu z nadpisu, která se čistí RP-HPLC (systém A).

Příklad 10

Značení sloučenin 1-2 a sloučeniny 44 pomocí ¹²³I

Octan amonný jako pufr (200 μΐ, 0,2M, pH 4,0) se přidá k roztoku ligandu (20 μΐ, 20 μg) a Na¹²⁷I (10 μΐ, 1,5 μg) v Eppendorfově zkumavce. Roztok se důkladně promíchá a pak se přidá Na¹²³I (5-50 μΐ, 11 MBq) . Roztok se důkladně promíchá a pak se přidá roztok PAA (10 μΐ, 0,01 M) a opět se důkladně promíchá. Pak se změří aktivita prostředku a ve všech případech se pak požadovaný produkt oddělí od vedlejších produktů a neznačeného substrátu pomocí HPLC.

Příklad 11

Značení sloučenin 3, 5-43, 45-49 pomocí ^99mTc

Alikvoty (0,1 ml) všech sloučenin rozpuštěné ve vodě (1 mg/ml) se předloží do dusíkem plněných lOml skleněných viálek spolu s odplyněným salinem (0,9% hmotnost/objem, 1 ml) a 0,035 ml vodného NaOH (0,1 Μ). K tomuto roztoku technecia z generátoru (1 ml, approx. roztok chloridu cínatého (0,1 ml, cca.

9,0-10,0. Viálky se ikubují 30 minut při teplotě místnosti (15-25 °C), kdy probíhá značení. Výsledný prostředek se buď zředí na požadovanou radioaktivní koncentraci nebo se čistí se přidá roztok 0,4 GBq) a pak vodný 10 μg) . Směs měla pH

• · ·

HPLC (Systém B) za odstranění neoznačené výchozí látky a radioaktivních nečistot. Po čištění se organické rozpouštědlo odstraní ve vakuu a vzorek se zpětně rerozpustí v 5 mi O,1M fosfátovém pufru při pH 7,4 za získání pracovní koncentrace 6-9 MBq/ml. Před použitím se stanoví radiochemická čistota tenkovrstvou chromatografií za následujících podmínek:

i) ITLC SG 2 cm x 20 cm; mobilní fáze 0,9 % hmotnost/objem šalinu ii) Whatman č. 1; 2 cm x 20 cm; mobilní fáze 50:50 objemově acetonitril:voda

Značené substráty zůstávají v systému (i) na startu a v systému (ii) postupují s čelem rozpouštědla. Analýza se provádí příslušným detekčním zařízením, radiochemická čistota je typicky nad 85 % (značené sloučeniny).

Příklad 12

Značení sloučeniny 4 pomocí ^99mTc

Alikovotní 0,lml podíl sloučeniny rozpuštěné ve vodě (1 mg/ml) se převede do dusíkem naplněné 10 ml skleněné viálky s tricinem rozpuštěným ve vodě (0,5 ml, 37,5 mg) a fosfindynetris(benzensulfonová kyselina)trissodnou solí rozpuštěnou ve vodě (0,1 ml, 10 mg). K tomuto roztoku se přidá roztok technecia z generetáru (1 ml, 0,4 GBq) a pak roztok chloridu cínatého v 0,lM HCI (0,02 ml, 2 μρ). pH při značení je 4,5-5,5. Viálky se 30 minut inkubují při 60 °C, kdy probíhá značení. Čištění a zjištění radiochemické čistoty se provede jako v příkladu 10.

Příklad 13

In vitro stabilita v plasmě

K podílu sloučeniny (50 μΐ, 10 MBq/ml) se přidá stejný objem plasmy (krysí nebo lidské) nebo šalinu. Směsi se inkubují při

teplotě 37 °C a v časech 0, 30 a 120 minut se měří stabilita (HPLC; systém C) . Salinové směsi slouží jako kontrolní pokus.

Sloučenina	Druh	po 120 min. nedotčeno
iZJI-slouč. 1 (podle literatury)	člověk	0
iZJI-slouč. 2	člověk	98
krysa	99
yymTc-sloučeniny 3,4,5,7,12,16,17	člověk	> 90
krysa	> 90
iZJI-slouč. 44	člověk	> 90
krysa	> 90
yymTc-sloučeniny 8-11,13-15,19-21, 28-36,38,39,45-49	krysa	> 90
yymTc-sloučeniny 22-27	krysa	> 60

Příklad 14

Systémy pro HPLC

Systém A

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

Systém B

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

Systém C

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

Systém D

Kolona

Gradient

Waters C18 250x4,5 mm; velikost částic 4 pm eluční profil 10-60 % B během 25 min.

0,1% vodná TFA

0,1% TFA v acetonitrilu

Waters C18 150x3,9 mm; velikost částic 4 pm eluční profil 0-100 % B během 22 min.

0,1% vodná TFA

0,1% TFA v acetonitrilu

Waters C18 150x3,9 mm; velikost částic 4 pm eluční profil 0-100 % B během 20 min.

50mM NH₄0Ac pufr (pH 5,6) acetonitril

Hamilton PRP-1, 305 mm x 7,0 mm eluční profil 0-65 % B během 10 min.

Eluent A Eluent B

Systém E

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

Systém F

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

Systém G

Kolona Gradient Eluent A Eluent B

5% vodný amoniak acetonitril

Hamilton PRP-1, 150 mm x 4,1 mm eluční profil 0-100 % B během 15 min. 5% vodný amoniak acetonitril

Polymer Laboratories PLRP-S; 150 mm x 2,5 mm eluční profil 0-100 % B během 15 min.

5% vodný amoniak acetonitril

Hamilton PRP-1, 150 mm x 4,1 mm eluční profil 0-65 % B během 10 min. 0,1% vodná TFA

0,1% TFA v acetonitrilu

Příklad 15

Zachycení v lidské plasmové sraženině

Zachycení radioaktivním izotopem značených substrátů do fibrinu se stanoví in vitro expozicí lidské plasmové sraženiny následujícím způsobem. Do silikonizované 5ml skleněné viálky se předloží (a) 800 μΐ tris(hydroxymetyl)aminometanem pufrovaného šalinu (pH 7,5) obsahujícího chlorid vápenatý (50 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, 4 mM chloridu vápenatého), (b) 40 μΐ fyziologického roztoku soli obsahujícího 100 jednotek trombinu na ml, (c) 400 μΐ lidské plasmy obsahující radioaktivním izotopem značený substrát v typické koncentraci 10 kBq/ml.

Za účelem podpory tvorby sraženiny se do reakční viálky vloží zdrsněná skleněná tyčinka. Kontrolní pokus se připraví stejně, ale vynechá se trombin a chlorid vápenatý.

v

Směs se inkubuje 60 minut při teplotě místnosti (20 °C) a pak se rozloží přidáním 400 μΐ chladného roztoku 33,5mM disodné soli etylenediamintetraoctové kyseliny. Sraženina se od séra oddělí vakuovou filtrací na 0,45 pm nitrocelulosových filtrech (nasycených před tím 1,5% BSA/tris(hydroxymetyl)aminoetanem pufrovaným salinem s pH 7,5 obsahujícím 0,1% Tween 20) a promyje dvakrát 10 ml tris(hydroxymetyl)aminometanem pufrovaným salinem s pH 7,5 obsahujícím 0,1% Tween 20 za dosažení konečné koncentrace 0,1 % objemově. Podíl z celkové radioaktivity se vypočítá pomocí vhodného detekčního přístroje.

Podíl radioaktivity zadržený na filtru po odečtení nespecifické vazby určené v kontrolním pokusem je měřítkem zachycení v odfiltrované sraženině.

• · ♦ · · · »

Sloučenina	% zachycení (s trombinem)	% zachycení (bez trombinu)	% specifického zachycení
123l-Cmpd 1	14.6	2.0	12.6
123l-Cmpd 2	38.6	0.2	38.4
Tc-Cmpd 3	39.3	0.3	39.0
S9mTc-Cmpd 4	22.0	0.1	21.0
Tc-Cmpd 5	35.5	0.2	35.3
Tc-Cmpd 6	68.6	4.3	64.3
Tc-Cmpd 7	41.3	0.7	40.6
Tc-Cmpd 8	25.9	1.4	24.5
™Tc-Cmpd 9	44.5	2.7	42.8
Tc-Cmpd 10	65.9	0.2	65.7
Tc-Cmpd 11	68.1	1.2	66.9 )
Tc-Cmpd 12	34.8	0.3	34.5
Tc-Cmpd 13	57.0	0.2	56.8
Tc-Cmpd 14	3.3	0.5	2.8
Tc-Cmpd 15	55.6	0.4	55.2
Tc-Cmpd 16	12.5	0.1	12.4
Tc-Cmpd 17	41.3	0.7	40.6
Tc-Cmpd 18	9.8	0.1	9.7
Tc-Cmpd 19	48.2	0.2	48.0
Tc-Cmpd 20	65.0	2.6	62.4
Tc-Cmpd 21	60.6	0.5	60.1
Tc-Cmpd 22	59.0	0.3	58.7
Tc-Cmpd 23	63.8	0.1	63.7
™Tc-Cmpd 24	56.8	0.4	56.4
Tc-Cmpd 25	68.0	4.3	63.7
Tc-Cmpd 26	63.3	8.2	55.1
Tc-Cmpd 27	Nd	Nd	nd
Tc-Cmpd 28	42.1	0.2 •	41.9
Tc-Cmpd 29	21.1	0.1	21.0
Tc-Cmpd 30	14.9	0.2	14.7
Tc-Cmpd 31	7.7	0.1	7.6

····· * · * * *

·«· » · ·» '	»* · ♦ « · *
Sloučenina	% zachycení (s trombinem)	% zachycení (bez trombinu)	% specifického zachycení
MmTc-Cmpd 32	20.2	0.4	19.8
MmTc-Cmpd 33	63.9	0.1	63.8
99mTc-Cmpd 34	5.5	0.1	5.4
99mTc-Cmpd 35	15.9	0.6	15.3
99mTc-Cmpd 36	8.7	0.1	8.6
Tc-Cmpd 37	13.0	0.2	12.8
99rnTc-Cmpd 38	21.0	0.7	20.3
99nTc-Cmpd 39	23.1	0.1	23.0
'Tc-Cmpd 40	13.3	0.1	13.2
99mTc-Cmpd 41	44.5	7.1	37.4
99mTc-Cmpd 42	14.2	0.2	14.0
S9mTc-Cmpd 43
123l-Cmpd 44	14.1	0.3	13.8
99mTc-Cmpd 45	28.7	0.1	28.6
99mTc-Cmpd 46	6.3	0.2	6.1
'Tc-Cmpd 47	49.9	0.1	49.8
mTc-Cmpd 48	10.6	0.1	10.5
'Tc-Cmpd 49	33.1	1.6	31.5

* % zadržené v testu plasmové sraženiny (s trombinem) - % zadržené v testu plasmové sraženiny (bez trombinu)

Příklad 16

Normální biodistribuce u krys

Rozlišení zobrazení sraženiny je závislé na kombinaci rychlosti zachycení radiofarmaka a jeho rychlosti vymizení z krve/tkáně. Z toho důvodu byla u několika sloučenin stanovena biodistribuce u krys. Samcům Wistarových krys (xOO150 g) se podá injekce 0,1-0,2 ml radioaktivním izotopem značené kontrastní látky (roztok 8 MBq/ml) a v různých časech po injekci se provede pitva. V každé z vybraných tkání se změří podíl ID. Některá zvířata byla držena v metabolických klecích, aby bylo možné změřit podíl ID vyloučená v moči a výkalech. Pitva byla provedena vždy po 15, 30, 60 a 240 min.

Uvedená data jsou ve formě podílu ID (n=3).

^99mTc-Sloučenina 3

	15min	30 min	60 min	240 min
svaly	14,7	10,4	5,1	2,9
krev	5,3	1,8	t—1	0,6
ledviny	7,6	4,9	4,6	3,4
moč	14,9	34,3	37,0	42,0
plíce	0,7	0,4	0,3	0, 3
j átra	6,2	4,1	4,0	3,0
Gl trakt	13,5	15,1	18,0	20,7
srdce	0,2	0,1	0,1	0,04

Příklad 17

Zachycení ve sraženině vyvolané v krysím modelu

Krysí model dolní duté žíly (IVC)

Samci krys (Wistar, 250-350 g) se uvedou do narkózy 15% uretanem. Po otevření břišní dutiny se odkryje dutá žíla a očistí od okolní tukové tkáně. Do dolní duté žíly se vloží platinový drátek (1,5 cm x 0,5 mm) a 5 min po chirurgickém zákroku se do stehenní žíly vstříkne 0,4 ml elagové kyseliny (l,2xl0^-4 M) a nechá se tvořit sraženina. Průměrná hmotnost takto vzniklé sraženiny byla 27 mg, n=32, (rozsah 5-50 mg). Po vyvolání srážení v čase 5 min (čerstvá sraženina) a 60 min (starší sraženina) se vstříkne tetsovaná sloučenina. Po 60 min se zvířata usmrtí, sraženina se vyjme a změří. Zároveň se vyjmou a změří i ostatní tkáně například krev, plíce, srdce. Zachycení kontrastní látky ve sraženině se stanoví jako relativní koncentrace (cpm/g sraženiny na dávku/g zvířete) a sraženiny k základním tkáním.

• 29 • ·

• · ·

Výsledky:

Čerstvá sraženina

Sloučenina	š id/g	Rel. konc.	sraženina /krev	sraženině /plíce	sraženina /srdce	sraženina /játra
123l-Cmpd 1	0.510.1	1.610.4	1	nd	Nd	nd
’23I-Cmpd 2	4.9+0.8	14.5+2.2	7	10	19	21
99mTc-Cmpd 3	1.410.4	5.111.2	10	8	17	6
99niTc-Cmpd 4	2.010.6	6.512.0	6	8	15	20
Tc-Cmpd 5	6.012.1	1615.8	21	23	51	43
99mTc-Cmpd 7	4.811.3	14.5+4.4	15	11	21	6
'Tc-Cmpd 8	6.711.7	21.0+6.8	14	18	41	21
99mTc-Cmpd 9	8.813.6	24.819.6	13	12	32	13
Tc-Cmpd 10	2.910.5	6.511.2	4	5	10	5
99mTc-Cmpd 11	1.110.4	3.311.1	10	11	24	11
99mTc-Cmpd 12	7.314.1	19.8+11.0	20	17	31	8
S9mTc-Cmpd 13	3.410.7	7.9+1.6	7 ·	8	18	18
mTc-Cmpd 14	0.510.1	1.210.2	2	1.5	3	0.7
99mTc-Cmpd 15	3.611.0	8.312.2	4	6 .	12	11
99mTc-Cmpd 16	0.310.1	1.010.2	3	3	8	0.8
99mTc-Cmpd 17	1.210.7	3.712.3	7	12	18	5
99mTc-Cmpd 19	2.5+0.3	7.111.2	3	7	29	17
99mTc-Cmpd 20	2.310.6	6.511.3	12	11	30	18
MmTc-Cmpd 21	2.3+1.3	7.414.0	11	16	28	13
99mTc-Cmpd 22	3.811.6	13.0+5.5	11	13	28	25
99mTc-Cmpd 23	7.611.8	18.214.1	6	6	17	21
'Tc-Cmpd 24	4.012.2	11.116.7	10	10	21	11
mTc-Cmpd 26	14.1+10	41.4128	16	11	38	16
'Tc-Cmpd 28	3.5+2.0	9.715.0	13	19	31 '	35
Tc-Cmpd 29	4.711.9	13.014.9	14	20	44	44
'Tc-Cmpd 31	0.310.2	0.910.6	0.6	1	2	3

9 · ·

9 • · • ·

9

9

Sloučenina	%id/g	Rel. konc.	sraženině /krev	sraženin /plíce	i sraženin /srdce	sraženira /játra
Tc-Cmpd 32	1.7+0.7	4.611.9	10	11	26	27
Tc-Cmpd 33	2.710.2	7.810.6	11	16	32	28
Tc-Cmpd 34	0.510.2	1.810.5	2	3	6	8
™Tc-Cmpd 35	1.2+0.2	3.710.8	2	2	4	2
Tc-Cmpd 36	0.2+0.1	0.710.3	1	1	3	4
Tc-Cmpd 37	0.4+0.2	0.910.4	0.6	0.7	1	1
Tc-Cmpd 38	1.9+0.5	5.411.5	5	6'	15	3
Tc-Cmpd 39	2.5+0.3	9.011.1	9	14	29	31
Tc-Cmpd 41	0.710.1	2.210.3	3	4	6	8
Tc-Cmpd 42	0.310.1	0.310.2	2	0.3	1	63
123l-Cmpd 44	0.410.1	1.110.2	0.9	1.5	1	2
Tc-Cmpd 45	2.010.5	5.511.3	6	5	10	3
Tc-Cmpd 46	0.810.4	2.0+0.7	5	3	6	1
Tc-Cmpd 47	0.810.7	2.212.0	0.8	1	3	1
Tc-Cmpd 48	0.310.2	1.010.5	0.6	0.9	2	3
Tc-Cmpd 49	2.611.1	8.5±3.7	4	6	16	4

relativní koncentrace (RC) = ---^:— % id/g ve zbytku těla

Starší Sraženina

Sloučenina	%id/g	Rel. konc.	sraženin; /krev	sraženina /plíce	sraženin! /srdce I	sraženině /játra
123l-Cmpd 2	5.511.7	14.513.9	24	12	23	20
Tc-Cmpd 3	2.110.8	6.212.2	8	11	23	5
Tc-Cmpd 4	1.211.1	4.114.0	8	10	19	19
Tc-Cmpd 5	3.611.7	1115.1	13	31	33	24
Tc-Cmpd 7	2.110.3	6.511.3	9	7	15	3
Tc-Cmpd 8	5.311.3	16.414.3	10	9	24	16
Tc-Cmpd 9	3.710.4	11.4+1.5	8	7	21	6
Tc-Cmpd 10	2.911.4	6.312.7	6	6	16	5
Tc-Cmpd 11	0.410.3	1.210.8	5	6	13	4
Tc-Cmpd 12	4.111.2	11.213.4	19	15	75	7

* · « «

Sloučenina	%id/g	Rel. konc.	sraženiní /krev	sraženin /plíce	sraženina /srdce I I	sraženin i /játra
Tc-Cmpd 13	4.5+1.5	10.4+3.0	6	9	29	19
Tc-Cmpd 14	0.6+0.4	1.410.8	1.4	1.3	2	0.7
S9fflTc-Cmpd 15	3.4+0.6	7.611.6	3	0.6	1	nd
Tc-Cmpd 17	0.8+0.1	2.710.6	3	5	7	3
Tc-Cmpd 19	3.2+2.3	9.117.1	14	5	13	6
mTc-Cmpd 20	1.7+0.5	4.911.4	10	14	36	23
99mTc-Crnpd21	2.7+2.3	8.516.8	31	13	32	31
mTc-Cmpd 22	6.9+2.5	22.717.4	11	1	3	4
Tc-Cmpd 23	7.5+2.5	17.614.6	13	1	1	1
99nTc-.Cmpd 24	4.1+2.5	11.918.0	15	20	40	37
Tc-Cmpd 26	4.0+0.9	12.9+3.5	7	12	31	54
mTc-Cmpd 28	4.5+1.1	13.1+3.4	17	2	3	1
Tc-Cmpd 29	3.8+0.4	10.011.7	11	30	67	29
99fflTc-Cmpd 31	0.2+0.1	0.610.2	0.6	4	9	2
Tc-Cmpd 32	0.710.1	2.010.4	3	15	43	21
mTc-Cmpd 33	2.2+0.6	6.711.6	16	9	24	16
Tc-Cmpd 34	0.410.1	1.410.4	3	-	-	6
99mTc-Crnpd 35	0.6+0.1	1.510.4	1	0.5	1	2
mTc-Cmpd 36	0.1+0.02	0.210.1	0.6	10	18	4
Tc-Cmpd 37	0.210.03	0.510.1	0.4	1 ·	2	9
-Tc-Cmpd 38	0.810.3	2.410.7	3	0.5	1	2
mTc-Cmpd 39	2.410.3	8.211.1	15	12	43	11
mTc-Crnpd 41	0.410.1	1.110.3	1	6	13	4
Tc-Cmpd 42	0.410.1	1.310.3	5	7	21	6
123l-Cmpd 44	0.5+0.03	1.210.1	0.9	2	1	1
Tc-Cmpd 45	2.010.8	5.712.3	8	5	11	3
'Tc-Cmpd 46	0.510.2	1.310.6	4	3	5	1
Tc-Cmpd 47	0.510.3	1.510.8	1	24	46	44
Tc-Cmpd 48	0.2+0.04	0.810.2	1	109	32	26
Tc-Cmpd 49	1.210.5	3.9H .6	4	9	29	19

Příklad 18

Zobrazení sraženiny vyvolané v krysím modelu

U samců krys (Wistar) se vyvolá sraženina jako v příkladu 17, ale platinový drátek se umístí do krční žíly. 60 min po injekci se vstříkne sloučenina a pořídí se snímky (v čase 15-180 min po injekci). K tomu se použije přístroj Park medical Isocam I gama kamer, 300 K nebo 150 K měření, torax, LEUHR nebo LEF kolimátor. Sraženina se zobrazí od 15 min po injekci, nejvíce je vidět po 180 min po injekci (kvůli rychlému odbourávání sloučeniny).

Zkratky

Ac acetyl

Boc t-butyloxykarbonyl

Cmpd sloučenina

DMF dimetylformamid

ES elektrosprej

FAB ostřelování rychlými atomy

Fmoc fluorenylmetoxykarbonyl

HPLC vysoce účinná kapalinová chromatografie

MALDI-TOF matrix assisted laserová desorpční ionizace za pomoci matrice - čas letu

Nal naftylalanin

RCP radiochemická čistota

RP-HPLC vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi

TFA trifluoroctová kyselina

TLC tenkovrstvá chromatografie fl/WOP' íW

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina vzorce I

   Y- (CR₂)_n-X-NHJ (I) kde:

   X je skupina C=O nebo CR₂;

   n je celé číslo od 1 do 6;

   Y je skupina L(A)_m- nebo skupina R¹R²CR-, kde L je činidlo ' komplexující kov, A je skupina -CR₂- , skupina -CR=CR-, skupina —C=C—, skupina -NRCO-, skupina -CONR-, skupina -SO₂NR-, skupina -NRSO₂-, skupina -CR₂OCR₂-, skupina -CR₂SCR₂-, skupina -CR₂NRCR₂a C₄-₈ cykloheteroalkylenová skupina, Ο₄_₈ cykloalkylenová skupina, C5-12 arylenová skupina, C₃_i₂ heteroarylenová skupina nebo polyalkylenglykolový zbytek, zbytek polymeru mléčné kyseliny nebo zbytek polyglykolové kyseliny;

   m je celé číslo od 0 do 10;

   kde jeden ze zbytků R¹ a R² je skupina -ΝΗ(Β)_ΡΖ^Χ a druhý je skupina -COÍBJqZ¹, kde p a q jsou celá čísla od 0 do 45 a každá skupina B je nezávisle vybrána ze skupiny, kterou tvoří možnosti pro skupinu Q nebo aminokyselinový zbytek, kde Q je cyklický peptid;

   Z¹ a Z² jsou chránící skupiny, které jsou biokompatibilní a inhibují nebo brání in vivo metabolismu peptidu;

   J a každá skupina R jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, C1-4 alkylová skupina, C1-4 alkenylová skupina, C1-4 alkinylová skupina, to · · · · · · ·· · · · · ··

   Ci-4 alkoxyalkylová skupina nebo C1-4 hydroxyalkylová skupina; s podmínkou že:

   (i) celkový počet aminokyselinových zbytků v R¹ a R² skupinách nepřekročí počet 45;

   (ii) pokud X je skupina CR₂, pak Y je skupina -CRR¹R² a Z² je činidlo komplexující kov;

   (iii) pokud je Y skupina -CRR¹R², pak alespoň jeden ze zbytků R¹ a R² nese alespoň jednu detekovatelnou skupinu.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, ve které obsahují zbytky R¹ a R² jeden nebo několik peptidových fragmentů a₂-antiplasminu, fibronektinu, beta-kasein, tetanu, amyloidu, trappinu a polyglutaminových zbytků, a uvedený peptidový fragment obsahuje alespoň tři aminokyselinové zbytky.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, ve které je peptidový fragment z a₂-antiplasminu.
4. 4. Sloučenina podle nároku 3, ve které je aminokyselina v poloze 2 od A-konce peptidu glutamin.
5. 5. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, ve které je skupina J atom vodíku.
6. 6. Sloučenina podle nároku 5 vzorce

   Y-(CR₂) _x-(CH₂) ₂CONH nebo Y-(CR₂) _y-(CH₂) ₄NH₂ ve kterém je x celé číslo od 0 do 4 a .y je celé číslo od 0 do 3.
7. 7. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 6, ve které je skupina Y skupinou -CRR^XR².
8. 8. Sloučenina podle kteréhokoliv nároku 1 až 6, ve kceré alespoň jedna ze skupin Z¹ a Z² činidlem komplexujícím kov.

   • *· ·· « · · ··· · · ··« » ··
9. 9. Sloučenina podle nároku 8, ve které je skupina Z² činidlo komplexující kov a skupina Z¹ není činidlo komplexující kov.
10. 10. Komplex kovu a sloučeniny podle nároku 8 nebo 9.
11. 11. Komplex kovu podle nároku 10, ve kterém je kov radioaktivní.
12. 12. Komplex radioaktivního kovu podle nároku 11, ve kterém je radioaktivním kovem ^99mTc.
13. 13. Prostředek pro podávání lidem vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv nároku 1 až 12.
14. 14. Sada vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv nároku 1 až 9, vhodná pro přípravu komplexů kovů podle kteréhokoliv nároku 10 až 12.
15. 15. Použití sloučeniny vzorce I

    Y- (CR₂)_n-X-NHJ (I) kde: X je skupina C=0 nebo CR₂; n je celé číslo od 1 do 6; Y je skupina L(A)_ra- nebo skupina R¹R²CR-, kde L je činidlo komplexující kov, A je skupina -CR₂- , skupina -CR=CR-, skupina -ChC-, skupina -NRCO-, skupina -CONR-, skupina -SO2NR-, skupina

    -NRSO2-, skupina -CR2OCR2-, skupina -CR2SCR2-, skupina -CR2NRCR2a C4-8 cykloheteroalkylenová skupina, C₄-₈ cykloalkylenová skupina, C₅_i₂ arylenová skupina, C3-12 heteroarylenová skupina nebo polyalkylenglykolový zbytek, zbytek polymeru mléčné kyseliny nebo zbytek polyglykolové kyseliny;

    m je celé číslo od 0 do 10;

    kde jeden ze zbytků R¹ a R² je skupina -NH(B)_PZ¹ a druhý je skupina -(ΖΟ(Β)ςΖ¹, kde p a q jsou celá čísla od 0 do 45 a každá skupina B je nezávisle vybrána ze skupiny, kterou tvoří možnosti pro skupinu Q nebo aminokyselinový zbytek, kde Q je cyklický peptid;

    Z¹ a Z² jsou chránící skupiny;

    J a každá skupina R jsou nezávisle vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, Ci_₄ alkylová skupina, Ci_4 alkenylová skupina, Ci_₄ alkinylová skupina, Ci_4 alkoxyalkylová skupina nebo Ci_₄ hydroxyalkylová skupina; s podmínkou že:

    (i) celkový počet aminokyselinových zbytků v R¹ a R² skupinách nepřekročí počet 45;

    (ii) pokud X je skupina CR₂, pak Y je skupina -CRR¹R²;

    (iii) pokud je Y skupina -CRR^², pak alespoň jeden ze zbytků R¹ a R² nese alespoň jednu detekovatelnou skupinu.
16. 16. Použití komplexu radioaktivního kovu sloučeniny podle nároku 13, ve kterém je alespoň jedna ze skupin Z¹ a Z² činidlo komplexující kov, pro diagnózu místa trombózy nebo embólie.
17. 17. Peptidový fragment a2-antiplasminu, fibronektinu, betakaseinu, tetanu, amyloidu, trappinu nebo polyglutaminu obsahující 3 až 45 aminokyselinových zbytků a nesoucí koncové činidlo komplexující kov.
18. 18. Peptidový fragment podle nároku 17, ve kterém je činidlo komplexující kov na karboxylovém konci.
19. 19. Komplex kovu a peptidového fragmentu podle nároku 17 nebo 18.