DE69733263T2

DE69733263T2 - Markierte elastase-inhibitoren

Info

Publication number: DE69733263T2
Application number: DE69733263T
Authority: DE
Inventors: Karen Jane Chesham BARNES; Gary Robert Aylesbury BOWER; Alan Michael Amersham FORSTER; Peter Chalfont St. Giles KNOX; Marivi Amersham MENDIZABAL; Anthony Eamon Amersham STOREY
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1996-09-16
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: EP0927049B1; WO1998010800A2; DE69733263D1; ES2242230T3; CA2265945A1; WO1998010800A3; EP0927049A2; US6375926B1; AU4214897A; JP2001500152A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die bei der Diagnose oder Radiotherapie von Infektionen, Entzündungen oder Thromben nützlich ist, pharmazeutische Formulierungen, die diese enthalten, ihre Verwendung bei der Diagnose von Krankheiten und Verfahren für ihre Herstellung.
Die diagnostische Bildgebung von Infektionen oder Entzündungen in der klinischen Praxis setzt typischerweise entweder das Radiopharmazeutikum ⁶⁷Ga-Citrat oder radioaktiv markierte weiße Blutzellen (Leukozyten) ein, da sich Leukozyten bekanntermaßen an Infektions-/Entzündungsstellen sammeln, ¹¹¹In oder ^99mTc sind die radioaktiven Isotope, die normalerweise zur Markierung von Leukozyten verwendet werden.
Markierte Leukozyten sind in der derzeitigen klinischen Praxis das Wahlverfahren für die diagnostische Bildgebung von Infektions-/Entzündungsstellen geworden. Mit den günstigen Bildgebungsmerkmalen von ^99mTc, der Spezifität markierter Leukozyten und der guten Hintergrundclearance, eignet sich dieser Ansatz selbst für die Diagnose von Darmläsionen wie entzündlicher Darmerkrankungen oder Appendizitis. Solche Krankheiten können mit nichtspezifischen Mitteln aufgrund der hohen Darmhintergrundniveaus nicht diagnostiziert werden.
Das Problem mit dem ex-vivo markierten Leukozytenansatz ist, daß die derzeit verwendeten Zellmarkierungsmittel nicht spezifisch sind. Das bedeutet, daß die Leukozyten zuerst von dem Überschuß an roten Blutzellen im Blut, das dem abzubildenden Patienten entnommen wurde, abgetrennt werden müssen. Die Zellabtrennung ist eine arbeitsintensive Operation, die ein Fachmann benötigt, damit eine effiziente Trennung ohne Gefährdung der Integrität der weißen Zellen erreicht werden kann. Es besteht ebenso die innewohnende Gefahr, die mit der Manipulation von Blutproben in Verbindung steht. Es gab daher ein bemerkenswertes Interesse an der Entwicklung eines Mittels zur Verwendung bei der Bildgebung von Infektionsstellen, das diese lästige Zellabtrennung vor der Markierung und Verabreichung an den Patienten nicht erfordert.
Die humane Leukozytenelastase (HLE) ist ein starkes Endopeptidaseenzym, das Amidbindungen in einer Vielzahl von Proteinen und Peptiden hydrolysieren kann, einschließlich der strukturellen Proteine Elastin, Kollagen und Fibronectin [R L Stein et al, Ann. Rep. Med. Chem., 20, 237 (1985); P. D. Edwards und P. R. Bernstein, Med. Chem. Rev., 14, 127 (1994)]. An Infektions- oder Entzündungsstellen wird HLE durch die aktivierten Leukozyten freigesetzt und verursacht Gewebezerstörung. Auch bekannt ist, daß sich Leukozyten in Thromben ansammeln und daß Elastase während der Blutkoagulation freigesetzt wird. Es ist gezeigt worden, daß die freigesetzte Elastase bei der Fibrinogenlyse wichtig ist [E. F. Plow, J. Clin. Invest., 69, 564 bis 572 (1982)].
EP 0595557A1 (Merck) offenbart, daß die folgenden Verbindungen als HLE-Inhibitoren für die Behandlung von Entzündungspathologien wie Emphysem oder rheumatische Arthritis nützlich sind:
worin: R C_1-6-Alkyl ist;
R¹ C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl ist;
M H, C_1-6-Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Halogenalkyl oder C_2-6-Alkenyl ist;
R^a und R^b H, Halogen, OH, Ph, COOH oder C_1-6-Alkyl, Alkoxy oder Ester sind;
R² und R³ H, Halogen, COOH, Ph, OH, CN, Amino, C_1-6-Alkyl, Alkoxy oder Ester oder Amid sind,
R⁴ Amid oder Ester mit einer optionalen Alkylspacergruppe ist.
Radioaktiv markierte HLE-Inhibitoren sind nur wenig studiert worden. Moser et al., [Am. J. med., 84 (Suppl. 6A), 70 (1988)] berichten, daß sich ¹³¹I-markiertes α₁-Antitrypsin in der menschlichen Lunge bis zu eine Woche nach der Injektion mit nur wenig oder keiner Aufnahme in die Leber oder die Milz hält. Das Dokument erörtert jedoch keine potentiellen Anwendungen von radioaktiv markiertem α₁-Antitrypsin. Ein Tritium-markierter synthetischer HLE-Inhibitor ist für das Studium der Pharmakokinetiken des HLE-Inhibitors in Ratten und Affen verwendet worden [J. B. Doherty et. al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 8727 bis 31 (1993)]. Ein ¹³C-markierter synthetischer HLE-Inhibitor ist für das Studium der Wechselwirkung des Inhibitors mit HLE in vitro hergestellt worden [B. G. Green et. al., Biochem. 34, 14331 bis 14355 (1995)]. Keine der beiden Veröffentlichungen offenbart die Verwendung der markierten HLE-Inhibitoren für die diagnostische Bildgebung von Infektionen, Entzündungen oder Thromben, noch sind ³H oder ¹³C geeignete Markierungsreste für die externe diagnostische Bildgebung. Rusckowski et. al., [J. Nucl. Med., Abstract P667 (1996)] berichten, daß ein genetisch veränderter Proteininhibitor von HLE mit dem Namen EPI-hNE-2 (Molekulargewicht 6759) mit ^99mTc mittels eines bifunktionellen Chelats radioaktiv markiert werden kann. Das radioaktiv markierte Protein zeigt in einem Mausinfektionsmodell etwas Aufnahme. EPI-hNE-2 ist ein Oligopeptid und kann unter den gleichen immunogenen Problemen leiden wie Fab' oder größere Fragmente von Antikörpern. Ferner schränkt die Größe des Moleküls die Migration durch die Zellmembranen ein (z. B. die von Granulozyten), wodurch das intrazelluläre HLE unter Verwendung dieses Ansatzes nicht targetiert werden würde.
Blaszczak et. al., [J. Lab. Comp. Radiopharm., 27, 401 bis 406 (1989)] haben die Herstellung von ¹²⁵I-radioaktiv markiertem Penicillin V (d. h., einem bicyclischen β-Lactam) zur Verwendung in dem in-vitro-Assay des Penicillinbindungsproteins beschrieben. In dem Dokument wird kein Vorschlag für in vivo-Bildgebungsanwendungen gemacht und ¹²⁵I würde kein bevorzugtes Radioisotop für die externe Bildgebung sein.
Es ist nunmehr entdeckt worden, daß markierte synthetische HLE-Inhibitoren bei der Detektion von Infektions- oder Entzündungsstellen nützlich sind. Die Verwendung eines synthetischen anstelle eines Protein- oder Polypeptid-Inhibitors hat die signifikanten Vorteile, daß das chemische Wesen des Mittels vollständig definiert werden kann und potentielle Bedenken im Hinblick auf die Immunogenität vermieden werden können. Außerdem ist die Position der Markierung eindeutig bekannt, und anders als chemotaktische Peptide oder Interleukine, muß der markierte Elastaseinhibitor keine hohe spezifische Aktivität haben, weil es einen Überschuß an Elastase sowohl in Granulozyten als auch an Infektions-/Entzündungsstellen gibt. Die markierten HLE-Inhibitoren sind auch bei der Detektion von Thromben nützlich.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf diagnostische Mittel für den Nachweis von Infektions- oder Entzündungsstellen oder Thromben im menschlichen Körper. Die Mittel umfassen einen synthetischen humanen Leukozytenelastase(HLE)-Inhibitor der ein Molekulargewicht von weniger als 2000 Dalton hat und mit einem nachweisbaren Rest markiert ist, der für die externe Bildgebung geeignet ist (z. B. durch Szintigraphie oder MRI), wie ein Radionuklid oder ein paramagnetisches Metallion.
Das Mittel agiert durch das Targetieren von HLE entweder in Leukozyten (in vivo oder in vitro), oder an Stellen der HLE-Freisetzung, wie Stellen von Infektionen, Entzündungen oder Thromben. Es ist gezeigt worden, daß radioaktiv markierte HLE-Inhibitoren menschliche Granulozyten in vitro selektiv markieren und Infektions-/Entzündungsstellen in vivo in einem Tiermodell dieser Pathologie targetieren.
Der „nachweisbare Rest" ist eine Substanz, die für die externe Bildgebung nach der Verabreichung an einen Menschen geeignet ist, wie ein Radionuklid, das Strahlung, die weiches Gewebe durchdringen kann, emittiert; ein paramagnetischer Rest als ein Kontrastmittel für MRI (z. B. bestimmte Metallionen wie Gadolinium(III) oder Mangan(II)); ein radiopaquer Rest wie Iopamidol für die Röntgenstrahlenkontrastbildgebung (computergestützte Tomographie) oder ein Ultraschallkontrastmittel. Bevorzugt ist der nachweisbare Rest ein Radionuklid, das entweder ein Positronenstrahler (wie ¹⁸F, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, ⁶⁸Ga oder ⁶⁴Cu) oder ein γ-Strahler wie ¹²³I, ^99mTc, ^111mIn, ^113mIn oder ⁶⁷Ga ist. Am stärksten bevorzugte Radionuklide sind γ-Strahler, insbesondere ¹²³I und ^99mTc. ³H und ¹⁴C haben keine radioaktiven Emissionen, die für die externe Bildgebung geeignet sind, und liegen daher außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Es wird auch in Betracht gezogen, daß bestimmte Radionuklide nützliche radiotherapeutische Eigenschaften an die markierten HLE-Inhibitoren übertragen. Daher können beispielsweise ⁹⁰Y-, ⁸⁹Sr-,¹⁸⁶Re-,¹⁸⁸Re-,¹²⁵I- oder ¹³¹I-markierte HLE-Inhibitoren bei der Behandlung von rheumatischer Arthritis und anderer Knocheninfektionen/-entzündungen verwendet werden. In solchen Anwendungen ist die therapeutische Wirkung der lokal targetierten radioaktiven Dosis, die an spezielle Zellen abgegeben wird, zuzuschreiben, im Gegensatz zu jeglicher pharmakologischen Wirkung aufgrund des Inhibitors. Welcher nachweisbare Rest auch immer ausgewählt wird, sollte er überaus bevorzugt so an den synthetischen HLE-Inhibitor binden, daß er im Blut keinem leichten Metabolismus unterliegt (in vivo oder in vitro), mit dem Ergebnis, daß die Bioverteilung des nachweisbaren Restes die des HLE-Inhibitors nicht länger reflektiert.
Die hierin dargestellten Daten demonstrieren, daß radioktiv markierte synthetische HLE-Inhibitoren ein neues und bequemes Verfahren zum Targetieren von Injektions-/Entzündungsstellen oder Thrombosen bieten. Es wird angenommen, daß der Mechanismus das Binden von HLE, die in den zirkulierenden Granulozyten im Blutstrom vorhanden ist (die sich dann an der Pathologiestelle konzentriert), oder das Binden von freier, extrazellulärer HLE, die an Pathologiestellen freigesetzt wird, umfaßt. Eine solche direkt injizierbare Infektions-/Entzündungs-Bildgebungsverbindung bietet signifikante Vorteile gegebenüber existierenden und vorgeschlagenen Radiopharmazeutika. Spezifität für HLE bedeutet, daß die Mittel wie ex vivo markiere Leukozyten Läsionen, die mit Leukozyteninfiltration in Verbindung stehen, wie Appendizitis oder entzündliche Darmerkrankung, abbilden können sollten. Die Verwendung eines relativ kleinen synthetischen Moleküls bedeutet, daß die Hintergrundclearanceprobleme in Verbindung mit Makromolekülen vermieden werden, und Substituenten leicht in kontrollierter Weise variiert werden können, um die Lipophilie, die Plasmaproteinbindung und die Clearancerate einzustellen.
Die folgenden Klassen synthetischer HLE-Inhibitoren mit einem Molekulargewicht von weniger als 2000 sind für die vorliegende Erfindung geeignet:

– kurzkettige (3- bis 5-mer) Peptide und Peptidanaloga (z. B. Trifluoracetylpeptide), hydrophobe Inhibitoren (z. B. Elasnin und synthetische Analoga).
– Inhibitoren gegen das Histidin mit aktivem Zentrum (z. B. Peptidchlormethylketone).
– kovalente Inhibitoren (z. B. Peptidaldehyde, Peptidketone, Halogenmethylketone, Peptidborsäuren) und Acylierungsmittel (Sulphonylfluoride, Aminoalkylphosphonofluoridate, Azapeptidnitrophenylester, aktivierte Carbamate und latente Isocyanate, Benzoxazin-4-one, 3-Alkoxyl-4-chlorisocoumarine, isatoische Anhydride, Acylsaccharine).
– Mechanismus-basierende Inhibitoren (z. B. Chloropyrone und Chloroisocoumarine, 7-Amino-4-chloroisocournacine, Ynenollactone und β-Lactame).

Bevorzugte HLE-Inhibitoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Mechanismus-basierenden Inhibitoren, insbesondere β-Lactame, die monocyclisch sein können (d. h. Azetidinone) oder mehr als einen anellierten Ring aufweisen können (wie Penicilline, Zephalosporine oder Clavulansäureanaloga) und Ynenollactone. Am stärksten bevorzugt sind β-Lactame, insbesondere monocyclische β-Lactam (d. h., Azetidinone).
Bevorzugte β-Lactame haben die Formel:
worin R¹ R⁸, XR⁸, (CRR)_n(C=X)R⁸ oder (C=X)NR⁸ ₂ ist;
X O oder S ist;
n 0 bis 3 ist;
R⁸ H, OH, ein substituierter oder unsubstituierter C_3-12 carbocyclischer oder heterocyclischer Ring, der gesättigt oder ungesättigt sein kann, C_1-10-Alkyl, C_3-12-Aryl, C_4-12-Alkylaryl, C_2-10-Alkenyl, C_2-10-Alkinyl, C_1-10-Alkoxy, C_1-10-Alkoxyalkyl, C_1-10-Hydroxyalkyl, C_1-10-Aminoalkyl, C_1-10-Perfluoralkyl, C_1-10-Haloalkyl, C_1-10-Carboxyalkyl, C_1-10-Amidoalkyl oder C_1-10-Ketoalkyl ist;
R², R³ gleich oder verschieden sind und jeweils H, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl, C_2-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, C_1-4-Aminoalkyl, C_1-4-Perfluoralkyl, C_1-4-Haloalkyl, Halogen, C_1-4-Carboxyalkyl, OR, SR, NRR, (CH₂)_nCONRR, NR(CO)R oder (CH₂)_nCO₂R sind;
R⁴ eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist unter Halogen, XR⁸, X(C=X)R⁸, OSOR⁸, OSO₂R⁸OSO₂Hal, SOR⁸SO₂R⁸, SO₂NR⁸ ₂NRSO₂R, (C=X)R⁸, (C=X)NR⁸ ₂, (C=X)R⁸, NO₂, CN, PO_nR⁸ ₂ oder XC₆H_4-nY_n;
Y gleich oder verschieden ist und R, NO₂, Halogen, CONR⁸ ₂, SO₂NR⁸ ₂ oder CO₂R ist.
R⁵ R oder R⁴ ist;
R gleich oder verschieden ist und H, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl, C_2-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkoxyalkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, C_1-4-Aminoalkyl, C_1-4-Perfluoralkyl, C_1-4-Haloalkyl oder C_1-4-Carboxyalkyl ist;
wobei zwei oder mehrere der Gruppen R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ verknüpft sein können, um einen substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen oder heterocyclischen Ring zu bilden, der gesättigt oder ungesättigt sein kann,
dadurch gekennzeichnet, daß das β-Lactam mindestens einen nachweisbaren Rest enthält oder daran kovalent gebunden aufweist, und mit der Maßgabe, daß wenn R⁴ XR⁸ ist, X S und R¹ und R⁴ verknüpft sind, um eine cyclische Carboxyalkylgruppe zu bilden, dann der nachweisbare Rest nicht ¹²⁵I ist.
Bevorzugte Azetidinone weisen die Formel:
auf, worin
R¹ R⁸, XR⁸, (CRR)_n(C=X)R⁸ oder (C=X)NR⁸ ₂ ist;
X O oder S ist;
n 0 bis 3 ist;
R⁸ H, OH, ein substituierter oder unsubstituierter C_3-12 carbocyclischer oder heterocyclischer Ring, der gesättigt oder ungesättigt sein kann, C_1-10-Alkyl, C_3-12-Aryl, C_4-12-Alkylaryl, C_2-10-Alkenyl, C_2-10-Alkinyl, C_1-10-Alkoxy, C_1-10-Alkoxyalkyl, C_1-10-Hydroxyalkyl, C_1-10-Aminoalkyl, C_1-10-Perfluoralkyl, C_1-10-Haloalkyl, C_1-10-Carboxyalkyl, C_1-10-Amidoalkyl oder C_1-10-Ketoalkyl ist;
R², R³ gleich oder verschieden sind und jeweils H, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl, C_2-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, C_1-4-Aminoalkyl, C_1-4-Perfluoralkyl, C_1-4-Haloalkyl, Halogen, C_1-4-Carboxyalkyl, OR, SR, NRR, (CH₂)_nCONRR, NR(CO)R oder (CH₂)_nCO₂R sind;
R⁴ eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist unter Halogen, XR⁸, X(C=X)R⁸, OSOR⁸, OSO₂R⁸OSO₂Hal, SOR⁸SO₂R⁸, SO₂NR⁸ ₂NRSO₂R, (C=X)R⁸, (C=X)NR⁸ ₂, (C=X)R⁸, NO₂, CN, PO_nR⁸ ₂ oder XC₆H_4-nY_n;
Y gleich oder verschieden ist und R, NO₂, Halogen, CONR⁸ ₂, SO₂NR⁸ ₂ oder CO₂R ist; R⁵ R oder R⁴ ist;
R gleich oder verschieden ist und H, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl, C_2-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkoxyalkyl, C_1-4-Hydroxyalkyl, C_1-4-Aminoalkyl, C_1-4-Perfluoralkyl, C_1-4-Haloalkyl oder C_1-4-Carboxyalkyl ist;
dadurch gekennzeichnet, daß das Azetidinon mindestens einen nachweisbaren Rest enthält oder kovalent daran gebunden aufweist.
Die Anhaftung des nachweisbaren Restes an die R4-Position ist am wenigsten bevorzugt, da angenommen wird, daß diese Gruppe aus dem β-Lactam in Folge einer kovalenten Bindung an die aktive Stelle des Elastaseenzyms verloren geht. Die Gruppen R² und R³ an dem β-Lactam sind für die Bindung an die S₁-Stelle an dem Enzym verantwortlich, und ein Literaturnachweis schlägt vor, daß diese Gruppen relativ klein sein sollten (z. B. die Größe eines Ethylrestes). Daher ist es wahrscheinlich, daß nur ein eingeschränkter Bereich nachweisbarer Reste erfolgreich an die R²/R³-Positionen angehaftet werden könnte. Der nachweisbare Rest wird daher stärker bevorzugt an die R¹-Position des β-Lactams oder Azetidinons angehaftet.
Bevorzugte R¹-Gruppen sind die der Formel:
worin R⁶ eine gegebenenfalls substituierte Alkyl- oder Phenylgruppe ist, an die der nachweisbare Rest angehaftet ist, und R⁷ H oder eine C_1-6-Alkylgruppe ist.
Wenn der nachweisbare Rest ein radioaktives oder paramagnetisches Metall ist, ist das Metall immer chelatisiert, das heißt, es wird ein Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugat verwendet. Metallkomplexe aus dem HLE-Inhibitor allein (d. h., HLE-Inhibitoren ohne mindestens einen Substituenten, der die Metallatome koordinieren soll) sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Der Ausdruck Chelat-HLE-Konjugat deckt die Situationen, wo das chelatisierende Mittel als eine diskrete chemische Einheit angehaftet wird (d. h. als ein einzelner Substituent an den HLE-Inhibitor), und wenn zwei oder mehr Metalldonatoratome als Substituenten an verschiedenen Positionen an das HLE-Molekül angehaftet werden, ab. Das Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugat wird mit Metallionen komplexiert (wie Technetium, Gadolinium oder Yttrium), was den Metallkomplex aus dem chelatisierenden Mittel ergibt, der an den synthetischen HLE-Inhibitor geknüpft wird. Das chelatisierende Mittel ist bevorzugt mehrzählig und/oder makrocyclisch, so daß ein stabiler Metallkomplex gebildet wird, der die Reizsetzung endogener Konkurrenzliganden für das Metall in vivo überleben kann wie Transferrin- oder Plasmaproteine. Ist intrazelluläre HLE das Target ist der Metallkomplex bevorzugt neutral, da so der Transport des markierten Inhibitorkonjugats über Zellmembranen wie die von Granulozyten erleichtert wird. Ist extrazelluläre HLE, freigesetzt an Infektions-/Entzündungsstellen oder Thromben, das Target, ist die Membranpermeabilität von geringe rem Interesse, und es kann ein geladener Metallkomplex wünschenswert sein, um so die Hintergrundclearance zu erleichtern. Der Metallkomplex sollte auch eine geringe Lipophilie haben (da eine hohe Lipophilie oftmals mit einer nicht spezifischen Aufnahme verbunden ist), und eine geringe Plasmaproteinbindung (PPB) zeigen, da auch eine Plasma-gebundene Markierung zu einem unerwünscht hohen, nicht spezifischen Bluthintergrund für das Bildgebungsmittel beiträgt.
Beispiele für geeignete chelatisierende Mittel für Technetium sind Diamindioxime ( US 4615876 ) oder Liganden, die Amiddonatoren enthalten (WO 94/08949); die vierzähligen Liganden aus WO 94/22816; Diamindithiole, Tetraamine oder Dithiosemicarbazone. Stabile Technetiumkomplexe werden auch mit makrocyclischen Amin- oder Amidliganden gebildet, wie Cyclam, Oxocyclam (die einen neutralen Technetiumkomplex bilden) oder Dioxocyclam. Geeignete Liganden für Indium, Yttrium und Gadolinium werden in Sandoz WO 91/01144 beschrieben, bevorzugt sind makrocyclische Aminocarboxylat- und Aminophosphonsäureliganden. Nicht-ionische (d. h. neutrale) Metallkomplexe aus Gadolinium sind bekannt und Beispiele werden in US 4885363 beschrieben.
Wenn der nachweisbare Rest ein radioaktives Isotop von Iod ist, wird das Radioiodatom bevorzugt mittels einer direkten kovalenten Bindung an einen aromatischen Ring wie einen Benzolring, oder eine Vinylgruppe angehaftet, da Iodatome, die an gesättigte aliphatische Systeme gebunden sind, bekanntermaßen für einen in vivo-Metabolismus und daher den Verlust des nachweisbaren Restes anfällig sind.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können wie folgt hergestellt werden:
Ist der nachweisbare Rest radioaktives Iod , wird die R^1-5-Gruppe so ausgewählt, daß sie entweder ein nicht-radioaktives Halogenatom (um den Radioiodaustausch zu ermöglichen), einen aktivierten Arylring (z. B. eine Phenolgruppe) oder eine organometallische Präkursorverbindung wie einen Trialkylzinn-, Trialkylsilyl- oder einen anderen Rest, der einem Fachmann bekannt ist, umfaßt. Beispiele für geeignete R^1-5-Gruppen, an die radioaktives Iod angehaftet werden kann, werden nachstehend angegeben:
Beide enthalten Substituenten, die eine leichte Radioiodsubstitution an den aromatischen Ring ermöglichen. Alternative Substituenten, die radioaktives Iod enthalten, können durch direkte Iodierung mittels Radiohalogenaustausch synthetisiert werden, z. B.
Wenn der nachweisbare Rest ein radioaktives oder paramagnetisches Metallion ist, wird das Metall bevorzugt als ein Metallkomplex angehaftet, d. h. ein chelatisierendes Mittel wird an den synthetischen HLE-Inhibitor angehaftet, wodurch ein Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugat erhalten wird. Solche Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugate können unter Verwendung des bifunktionellen Chelatansatzes hergestellt werden. So werden bekanntermaßen chelatisierende Mittel hergestellt, die eine funktionelle Gruppe daran angehaftet aufweisen („bifunktionelle Chelate"). Funktionelle Gruppen, die an chelatisierende Mittel angehaftet worden sind, umfassen: Amin-, Thiocyanat-, Maleimid- und aktive Ester wie N-Hydroxysuccinimid. Solche bifunktionellen Chelate können mit geeigneten funktionellen Gruppen an dem HLE-Inhibitor umgesetzt werden, um das gewünschte Konjugat zu bilden. Beispiele für Chelat-Amin-Konjugate für Diamindioximliganden werden in WO 95/19187 angegeben. In dem speziellen Fall von β-Lactamen kann ein chelatisierendes Mittel an der R¹-Position wie folgt angehaftet werden. Zuerst wird ein Chelat-Amin-Konjugat in ein Chelat-Isocyanat-Konjugat unter Verwendung von Phosgen, Trichlormethylchlorformiat oder ähnlichem umgewandelt. Das chelatisierende Mittel kann gegebenenfalls mit Schutzgruppen, die einem Fachmann bekannt sind, geschützt werden. Das resultierende Chelat-NCO (Isocyanat) Konjugat kann dann mit dem Amin-NH von einem Azetidinonring-Sekundäramin umgesetzt werden, wodurch ein chelatisierendes Mittel mittels einer Harnstoffverknüpfung an R¹ angehaftet wird. Dem ähnlich kann ein Chelat-Amin-Konjugat in ein chelatisierendes Mittel mit einer anhängenden Isothiocyanatgruppe umgewandelt werden (wie z. B. in US 5006643 oder WO 91/01144 beschrieben) und dann mit einem Azetidinon umgesetzt werden, um ein chelatisierendes Mittel-Azetidinon-Konjugat zu erhalten, das mittels einer Thioharnstoffbindung verknüpft ist. Alternativ wird die Umsetzung eines Chelat-aktiver Ester-Konjugats mit dem Amin-NH eines A zetidinonrings ein Chelat-Azetidinon-Konjugat ergeben, das mittels einer Amidbindung verknüpft ist. Ein weiterer Ansatz für ein Amid-verknüpftes Konjugat wird die Kopplung der Amingruppe eines Chelat-Amin-Konjugats an die anhängende Carboxylgruppe eines Carboxyl-funktionalisierten Azetidinons sein. Ein Fachmann wird erkennen, daß viele alternative Synthesen von Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugaten, basierend auf dieser Offenbarung, möglich sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Kits zur Herstellung synthetischer HLE-Inhibitoren, die mit einem nachweisbaren Rest markiert sind. Die Kits sind so gestaltet, daß sterile Produkte, die zur Verabreichung an einen Menschen, zum Beispiel über Injektion in den Blutstrom, geeignet sind, erhalten werden. Mögliche Ausführungsformen werden nachstehend erörtert. Ist der nachweisbare Rest ^99mTc, wird der Kit ein Glasgefäß, enthaltend das Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugat zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Reduktionsmittel wie Natriumdithionit, Natriumbisulphit, Ascorbinsäure, Formamidinsulphonsäure, Zinnion, Fe(II) oder Cu(I), bevorzugt ein Zinnsalz wie Zinn(II)chlorid oder Zinntartrat, umfassen. Alternativ könnte das Chelat-HLE-Inhibitor-Konjugat als ein Metallkomplex vorliegen, der bei Zugabe des radioaktiven Metalls einer Transmetallierung (das heißt, einem Ligandenaustausch) unterliegt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wird. Der Kit ist bevorzugt lyophilisiert und so gestaltet, daß er mit sterilem ^99mTc-Pertechnetat (TcO₄ ^–) aus einem ^99mTc-Radioisotopengenerator rekonstituiert wird, wodurch eine Lösung erhalten wird, die für die Verabreichung an einen Menschen ohne weitere Manipulation geeignet ist.
Die Mittel der vorliegenden Erfindung können auch in einer Einzeldosierform, die für die Injektion in einen Menschen bereit ist, geliefert werden, und können beispielsweise in einer vorgefüllten sterilen Spritze geliefert werden. Wenn der nachweisbare Rest ein radioaktives Isotop wie ^99mTc ist, wird die Spritze, die die Einzeldosis enthält, in einem Spritzengehäuse geliefert (um den Bediener vor einer möglichen radioaktiven Dosis zu schützen).
Die obigen Kits oder vorgefüllten Spritzen können gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Puffer; pharmazeutisch akzeptable Löslichmacher (z. B. Cyclodextrine oder oberflächenaktive Mittel wie Pluronic, Tween oder Phospholipide); pharmazeutisch akzeptable Stabilisatoren/Antioxidationsmittel (wie Askorbinsäure, Gentisinsäure oder para-Aminobenzoesäure) oder Füllstoffe für die Lyophilisierung (wie Natriumchlorid oder Mannitol) enthalten.
Die Strukturen bestimmter Verbindungen 1 bis 52 werden nachstehend angegeben. Die Herstellung dieser Verbindungen wird in den Beispielen 1 bis 12 beschrieben. Die NMR-Daten für die Verbindungen werden in den Tabellen 1 bis 19 angegeben. Die biologischen Eigenschaften der Verbindungen 4, 4a, 4b, 16, 17, 24, 28, 38, 42, 48, 49, 51 und 52 werden in den Beispielen 13 bis 17 und in den Tabellen 20 bis 25 gezeigt.
Strukturen der Verbindungen
Verbindung 25
Verbindung 34
Verbindung 39
Verbindung 50
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung soll das gewünschte Mittel menschliche Granulozyten selektiv im Vollblut markieren (entweder in vitro oder in vivo). In normalem menschlichen Blut sind Erythrozyten Granulozyten zahlenmäßig um einen Faktor von mindestens 1000 : 1 überlegen, Erythrozyten sammeln sich jedoch nicht an Infektions-/Entzündungsstellen an, so daß die markierte Verbindung eine hohe Selektivität für Granulozyten zeigen muß. Studien an der menschlichen in vitro-Blutzellaufnahme von ¹²³I-markierten und ^99mTc-markierten β-Lactam-HLE-Inhibitoren haben selektive Aufnahme in menschlichen Granulozyten gezeigt (siehe Beispiel 14 und Tabelle 23). Tabelle 23 zeigt, daß die Verbindungen 4, 4a, 4b, 16, 17, 24, 28, 38, 42, 48, 49, 51 und 52 alle einen gewissen Grad an Selektivität für Granulozyten über ein Gemisch aus Monozyten/Lymphozyten, wenn ungefähr gleiche Mengen an Monozyten/Lymphozyten und Granulozyten vorliegen, zeigen. Da menschliche Granulozyten signifikante Niveaus an HLE enthalten, während Erythrozyten (rote Blutzellen), Monozyten und Lymphozyten (Teilmengen der Leukozytenzellpopulation) im wesentlichen keine HLE enthalten, ist diese Selektivität eine starke Indikation dafür, daß die Affinität für HLE involviert ist. Ferner zeigt Tabelle 23, daß es zwischen der in vitro-Potenz (gemessen für die nicht radioaktiven, Iod-markierten Verbindungen und für die nicht markierten Chelatkonjugate, Verbindungen 38, 42, 48, 49, 51 und 52) und der Selektivität für Granulozyten eine Korrelation gibt. Die Folgerung ist, daß die Retention in dem Granulozyt der Bindung an intrazelluläre Elastase zuzuschreiben ist. Bevorzugte synthetische HLE-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind daher die mit einer in vitro-Potenz (k_inakt./K_i) von größer als 10.000 M/s.
Vollblut enthält auch Plasmaproteine, die an einen breiten Bereich an Substanzen binden können, und daher effektiv um die Verbindung konkurrieren, wenn sie erst einmal in das Blut eingebracht wurden. Daher sollte das bevorzugte Mittel auch eine geringe Plasmaproteinbin dung (PPB) zeigen. Bevorzugte Verbindungen haben eine PPB von weniger als 95 %. Die am stärksten bevorzugten haben eine PPB von weniger als 60 %. Da lipophile Verbindungen besonders für eine nicht spezifische Plasmaproteinbindung anfällig sind, haben bevorzugte Verbindungen einen Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (LogP) von ≤ 2. Ist intrazelluläre HLE das Target und muß demzufolge das Mittel Zellmembranen vernetzten können, sind Verbindungen mit einem minimalen Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (P) von 0,3 bevorzugt. Tabelle 23 zeigt, daß in menschlichem Vollblut die Verbindungen 4, 16 und 24 eine äquivalente Aufnahme in Granulozyten und Erythrozyten zeigen. Dies impliziert einen Selektivitätsfaktor für Granulozyten gegenüber Erythrozyten von mindestens 1000 : 1 und zeigt, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Granulozyten in menschlichem Vollblut trotz der Kompetition aus dem Überschuß an Erythrozyten und Plasmaproteinen erfolgreich markieren. Es wird angenommen, daß die hervorragende Granulozytenselektivität von Verbindung 4 einer Kombination aus HLE-Potenz und verringerter nicht spezifischer Bindung an rote Blutzellen oder Plasmaproteine zugeschrieben werden kann. Es wird postuliert, daß der Aminsubstituent die selektive Retention in Granulozyten aufgrund der Diffusion des nicht geladenen Inhibitors in die Zelle und das anschließende Abfangen mittels Protonierung des basischen Piperazinamins in dem eher sauren Milieu des Azurophilgranulats des Granulozyts erleichtert. Der protonierte Inhibitor kann nicht ohne weiteres durch die Granulozytmembran zurück diffundieren. Solche eher sauren Umgebungen sind in Erythrozyten, Monozyten oder Lymphozyten nicht vorhanden.
Aufgrund des einzelnen Substituenten an der 4-Position des Azetidinonringes hat Verbindung 4 ein chirales Zentrum. Die Enantiomere wurden wieder gelöst (Beispiel 1, Schritt F) und eines (4a) zeigte eindeutig hervorragende in vitro-Potenz und Granulozytenselektivität (Tabelle 23), verglichen mit dem anderen (4b). Daher ist die Wirksamkeit gegenüber stereochemischer Wirkungen, das heißt, Chiralität, sehr empfindlich. Daher sind auch chirale Verbindungen in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Weitere Verbesserungen hinsichtlich der Potenz sind durch die Einführung von Alkylsubstituenten an der homochiralen Benzyl-R¹-Position, dargestellt durch Verbindungen 24 und 28, erreicht worden, da diese bekanntermaßen potentere HLE-Inhibitoren ergeben ( EP 0595557 A1 ) z. B.:
Die radioaktiv markierten β-Lactam-HLE-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind auch in vivo in einem Rattenmodell hinsichtlich Entzündungen/Injektionen studiert worden. Die Ergebnisse aus diesen Studien werden in Tabelle 24 angegeben. Das bekannte Entzündungs-/Infektionsmittel ^99mTc-HMPAO ex-vivo markierter humaner Leukozyten lokalisierte sich an der Infektionsstelle in dem verwendeten Modell. ^99mTc-rote Blutzellen wurden als das negative Kontrollvergleichsmittel verwendet. Es ist ersichtlich, das ¹²³I-markierte Verbindungen 4/4a signifikant bessere Aufnahme in den infizierten Bereich zeigen, als die ^99mTc-rBz-Kontrolle, und Merkmale zeigen, die mehr dem bewährten Infektionsmittel ^99mTc-wBz ähneln. Wenn ¹²³I-Verbindung 4 zur Markierung humaner Leukozyten ex-vivo verwendet wird, ist das infiziert/normal-Verhältnis höher als das, das durch direkte Injektion erhalten wird. Es wird angenommen, daß die Target-zu-Hintergrund-Verhältnisse, die in dem Rattenmodell von Infektion/Entzündung erhalten wurden, fast immer die menschliche Situation unterbewerten, da die Potenz ähnlicher β-Lactaminhibitoren für Rattenelastase bekanntermaßen bis zu 2 Ordnungen von einer Größe kleiner als die für humane Leukozytenelastase beträgt.
Experimente mit menschlichen Plasmagerinnseln in vitro sind wie in Beispiel 17 beschrieben durchgeführt worden. In Gerinnseln, die mit Granulozyten auf eine Endkonzentration von 10⁶/ml angereichert waren, gab es eine nahezu 7- bis 9-fache Steigerung der Aufnahme eines potenten Elastaseinhibitors, verglichen mit den Gerinnseln, die ohne zugegebene Zellen gebildet wurden. Diese Beobachtung zeigt das Potential, daß radioaktiv markierte β-Lactam-HLE-Inhibitoren spezifisch in Thromben und andere Läsionen, wo die Granulozytenakkumulation aktiv ist, aufgenommen werden können.
Tabelle 25 vergleicht die Thyroidaufnahme der Radioiodverbindungen der vorliegenden Erfindung mit der eines freien ¹²³I-Iodions. Der Mangel an Thyroidaufnahme ist der Beweis dafür, daß die Verbindungen in vivo keiner metabolischen Deiodierung unterliegen. Es gab keinen Beweis für die Freisetzung von Pertechnetat in Tieren, denen ^99mTc-markierte HLE- Inhibitoren gegeben wurden. Dies impliziert, daß das Technetium in vivo nicht aus dem Chelatkonjugat freigesetzt wird.
Abkürzungen

HLE: = humane Leukozytenelastase
PPB: = Plasmaproteinbindung
rBz: = rote Blutzelle
wBz: = weiße Blutzelle
ACD: = Säurecitratdextrose
HBSS: = Hanks-Mineralsalzmedium
RCP: = radiochemische Reinheit
Me: = Methyl
Et: = Ethyl
t-Bu: = tertiär-Butyl
Ph: = Phenyl
Bn: = Benzyl
Ac: = Acetyl
Ts: = Tosyl, d. h., para-Toluolsulphonyl
Ar: = Aryl
DMF: = N,N-Dimethylformamid
DMSO: = Dimethylsulphoxid
THF: = Tetrahydrofuran
LDA: = Lithiumdiisopropylamid
PAA: = Peressigsäure
TFA: = Trifluoressigsäure
BOC: = tertiär-Butoxycarbonyl
HBTU: = O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
DMAP: = 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin
MCPBA: = meta-Chlorperbenzoesäure

Experimenteller Teil
Beispiel 1
4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxyl-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 4)
Schritt A 4-Iodbenzylisocyanat (Verbindung 1)
Zu einer Lösung aus Triphosgen (1,27 g, 4,28 mmol) in rückflußkochendem Ethylacetat (20 ml) unter Stickstoff wurde tropfenweise über 2 Stunden eine Lösung aus 4-Iodbenzylamin (1,0 g, 4,29 mmol) in Dichlormethan (40 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluß weitere 3 Stunden erhitzt, während es noch heiß war filtriert, und das Filtrat in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (1,10 g, 99 %) als ein gelbes Öl erhalten wurde.
Schritt B 4-[4-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 2)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et al (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben 4-Iodbenzylisocyanat (1,10 g, 4,25 mmol) und 4-[4[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) (0,62 g, 1,96 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient aus Benzin zu EtOAc/Benzin, 1 : 3) die Titelverbindung (0,72 g, 64 %) als einen Feststoff.
Schritt C 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-3,3-diethyl-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-2-azetidinon (Verbindung 3)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et al(J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergab 4-[4-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,72 g, 1,2 mmol) nach der Umkristallisation (Et₂O/EtOAc) die Titelverbindung (0,44 g, 68 %) als einen Feststoff.
Schritt D 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 4)
Gemäß dem Verfahren von Doherty et. al., ( EP 0 595 557 A1 ) ergab 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-3,3-diethyl-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-2-azetidinon (0,44 g, 0,84 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient EtOAc zu MeOH/EtOAc, 1 : 4) die Titelverbindung (0,31 g, 79 %) als ein gelbes Öl.
Schritt E 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[[4-tri-(n-butyl)stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 5)
4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,02 g, 0,033 mmol) wurde in trockenem Toluol (5 ml) unter Argon gelöst und unter Rückfluß erhitzt. Eine katalytische Menge Pd(PPh₃)₄ (20 mg) und Bis(tributyl)zinn (100 ml, 0,198 mmol) wurden zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde unter Rückfluß 5,5 Stunden erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und durch ein Celite-Kissen filtriert. Das Filtrat wurde in Vakuum konzentriert und das Produkt durch Flashsäulenchromatographie (MeOH/Et₃N/EtOAc, 10 : 1 : 89) gereinigt, wodurch die Titelverbindung (5 mg, 20 %) erhalten wurde.
Schritt F Wiederauflösung der Enantiomere von 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 4)
Verbindung 4 wurde in seine zwei Enantiomere, 4a und 4b, durch chirale HPLC unter Verwendung des HPLC-Systems G, Beispiel 12, getrennt, was Isomer 4a aus der Fraktion, die zwischen 14 und 15 Minuten gesammelt wurde, und Isomer 4b zwischen 18 und 19 Minuten ergab. Die Lösungsmittel wurden in Vakuum entfernt, jedes Produkt aus dem resultierenden Rückstand in Dichlormethan (4 × 20 ml) extrahiert, getrocknet (MgSO₄) und in Vakuum konzentriert, wodurch jedes Enantiomer als ein Feststoff erhalten wurde. Beide Produkte wurden wieder durch chirale HPLC analysiert. Die enantiomeren Reinheiten waren größer als 75 %.
Schritt G Synthese von ¹²³I-markiertem 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 4) (Racemat) 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[[4-tri-(n-butyl)stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon in MeOH (50 μg, 0,6 × 10^–7 mol, 50 μl) wurde zu einem Ammoniumacetatpuffer (pH 4. 0,2M, 200 μl) in ein 1 ml Eppendorf-Gefäß gegeben, gefolgt von wässerigem Na¹²⁷I in 0,01M NaOH (7,5 μg, 0,5 × 10^–7 mol, 10 μl) und Na¹²³I (50 μl, trägerfrei, 50 bis 100 MBq). Die Lösung wurde kräftig gemischt und PAA (0,01M, ca. 1 × 10^–7 mol, 10 μl) zugegeben. Die Lösung wurde wieder kräftig gemischt und bei Laborumgebungstemperatur für mindestens 5 Minuten inkubiert und das gewünschte Produkt unter Verwendung von Systems B HPLC-gereinigt, Beispiel 12. Die organische Elutionskomponente in der gerinigten Probe wurde entfernt, und die Probe mit Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, Volumen variabel) verdünnt, um sicher zu stellen, daß die gereinigte Verbindung in einem für das Testen biologisch akzeptablen Medium vorlag. Die radiochemische Reinheit der gereinigten Verbindung 4 (Racemat) wurde unter Verwendung des HPLC-Systems B, Beispiel 12, vor und nach dem in vitro- oder in vivo-Test gemessen. Die Ergebnisse der RCP-Messeung werden in Tabelle 20 dargestellt. Die Identität der ¹²³I-Spezies wurde durch HPLC-Co-Elution mit dem chemisch charakterisierten ¹²⁷I-Analogon (Beispiel 1, Schritt D) bestätigt. Die Verweilzeiten für die ¹²³I- und ¹²⁷I-Spezies werden in Tabelle 21 dargestellt.
Schritt H Synthese der ¹²³I-markierten Verbindungen 4a und 4b
Eine Probe des ¹²³I-Verbindung 4-Racemats wurde gemäß dem HPLC-Verfahren, daß in System C, Beispiel 12 ausführlich dargelegt wird, synthetisiert und gereinigt. Dies geschah, um sicher zustellen, daß der pH der gereinigten racemischen Verbindung mit dem HPLC-Säulenmaterial, das für die Reinigung optischer Isomere (unten) verwendet wird, kompatibel ist. Der organische HPLC-Eluent wurde in Vakuum bei Laborumgebungstemperatur entfernt und die Probe wurde dann mit Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) verdünnt, um ein Gesamtvolumen von ca. 1 ml zu erreichen. Das Racemat wurde in die beiden optischen Isomere unter Verwendung des HPLC-Systems D, Beispiel 12, gereinigt. Die beiden Enantiomere, 4a und 4b, wurden gesammelt, und der organische HPLC-Eluent in Vakuum entfernt und die radiochemische (chirale) Reinheit wurde nach dem Test unter Verwendung des HPLC-Systems D, Beispiel 12, gemessen. Die Ergebnisse des RCP-Tests werden in Tabelle 20 dargestellt.
Beispiel 2
4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)3-iod)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 16) und 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(3,5-diiod)(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 17)
Schritt A N-t-Butoxycarbonyl(4-hydroxy)-2-phenylethylamin (Verbindung 6)
Tyramin (0,20 g, 1,46 mmol) wurde in Methanol (5 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoff gelöst. Eine Lösung aus di-tert-Butyldicarbonat (0,318 g, 1,46 mmol) in Methanol (1 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Triethylamin (200 ml, 1,46 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde 4,5 Stunden gerührt, und das Lösungsmittel wurde dann in Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und Wasser partitioniert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde. Die Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Benzin/EtOAc, 1 : 1) ergab die Titelverbindung (0,34 g, 98 %) als ein gelbes Öl.
Schritt B N-t-Butoxycarbonyl(4-benzyloxy)-2-phenylethylamin (Verbindung 7)
Natriumhydrid (0,046 g, 1,14 mmol) wurde in trockenem THF (5 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoff suspendiert. Eine Lösung aus N-t-Butoxycarbonyl(4-hydroxy)-2-phenylethylamin (0,27 g, 1,14 mmol) in trockenem THF (5 ml) wurde tropfenweise zu dem Reaktionsgemisch über 20 Minuten zugegeben. Benzylbromid (135 μl, 1,14 mmol) wurde als ein einzelnes Aliquot zugegeben und das resultierende Gemisch 24 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch Giessen in Wasser (50 ml) abgeschreckt und die wässerige Schicht wurde mit Diethylether (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und in Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt (Benzin/Et₂O, 8 : 1), wodurch die Titelverbindung (0,217 g, 58 %) als ein Feststoff erhalten wurde.
Schritt C (4-Benzyloxy)-2-phenylethylaminhydrochloridsalz (Verbindung 8)
N-t-Butoxycarbonyl(4-benzyloxy)-2-phenylethylamin (0,199 g, 0,608 mmol) wurde in einer 3M-Lösung aus Salzsäure in Ethylacetat (10 ml) gelöst und das Gemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration isoliert, wodurch ein weißer Feststoff (0,056 g) erhalten wurde, und das Filtrat wurde in Vakuum konzentriert, wodurch ein hellgelber Feststoff (0,079 g) erhalten wurde. Beide Produkte wurden vereinigt, wodurch eine Gesamtprobe der Titelverbindung (0,135 g, 84 %) als ein hellgelber Feststoff erhalten wurde.
Schritt D (4-Benzyloxy)-2-phenylethylisocyanat (Verbindung 9)
(4-Benzyloxy)-2-phenylethylaminhydrochloridsalz (1,413 g, 5,35 mmol) wurde in Ethylacetat (15 ml) und 2M wässeriges Natriumhydroxid (3 ml) aufgenommen und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Die wässerige Schicht wurde abgetrennt und mit Dichlormethan (3 x 20 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und in Vakuum konzentriert, wodurch das freie Amin erhalten wurde (1,32 g, 97 %). Gemäß dem Verfahren in Beispiel 1, Schritt A, ergab ein Teil dieses Amins (0,19 g, 0,84 mmol) die Titelverbindung (0,187 g, 88 %) als einen Feststoff.
Schritt E Ethylenglykolmethylethertosylat (Verbindung 10)
Zu Tosylchlorid (50,0 g, 0,263 mol) bei 0 °C und unter Stickstoff wurden wasserfreies Dichlormethan (80 ml), wasserfreies Pyridin (23 ml, 24,3 g, 0,29 mol), 2-Methoxyethanol (21,0 ml, 20,0 g, 0,263 mol) und eine katalytische Menge DMAP gegeben. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt, bei der es 16 Stunden gerührt wurde. Dichlormethan (100 ml) und 1M wässerige Salzsäure (50 ml) wurden zugegeben. Die organische Schicht wurde isoliert und mit 1M wässeriger Salzsäure (4 × 30 ml) und Wasser (4 × 30 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (51,68 g, 85 %) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt F S-Triphenylmethyl-2-methoxyethanthiol (Verbindung 11)
Zu Natriumhydrid (2,17 g, 0,09 mol) unter Stickstoff wurde wasserfreies THF (50 ml) gegeben. Das Gemisch wurde auf 0 °C abgekühlt und Triphenylmethylmercaptan (24,88 g, 0,09 mol) in wasserfreiem THF (50 ml) wurde tropfenweise über 15 Minuten zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten bei 0 °C wurde das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt, bei der es eine Stunde gerührt wurde. Das Gemisch wurde dann wieder auf 0 °C abgekühlt, und Ethylenglykolmethylethertosylat (20,72 g, 0,09 mol) in trockenem THF (50 ml) wurde tropfenweise über 15 Minuten zugegeben. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch 16 Stunden weiter gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und der Niederschlag wurde mit Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden in Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst, mit Wasser (3 × 50 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient 100 % Benzin zu 100 % EtOAc) und Umkristallisation (Benzin) ergab die Titelverbindung (12,39 g, 41 %) als einen hellbraunen Feststoff.
Schritt G 4-[2-Methoxyethylthio]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 12)
Zu S-Triphenylmethyl-2-methoxyethanthiol (1,37 g, 4,1 mmol) in Dichlormethan (30 ml) unter Stickstoff wurden Triethylsilan (0,953 g, 1,31 ml, 8,2 mmol) und Trifluoressigsäure (0,632 ml, 0,935 g, 8,2 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Aceton (50 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch mit 2M wässerigem Natriumhydroxid neutralisiert. 1M wässeriges Natriumhydroxid (24 ml, 24 mmol), 4-Acetoxy-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) (0,690 g, 6,00 mmol) und Aceton (10 ml) wurden dann zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 23 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden in Vakuum entfernt, und zu dem Rückstand wurden Wasser (50 ml) und Dichlormethan (50 ml) gegeben. Die organische Schicht wurde isoliert und die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan (3 × 30 ml) weiter extrahiert. Die 4 organischen Schichten wurden vereinigt und mit Wasser (30 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Benzin/EtOAc, 9 : 1 zu EtOAc) ergab die Titelverbindung (0,51 g, 63 %) als ein Öl.
Schritt H 4-[2-Methoxyethylthio]-(4- benzyloxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidnon (Verbindung 13)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben 4-[2-Methoxyethylthio]-3,3-diethyl-2-azetidinon (550 mg, 2,53 mmol) und (4-Benzyloxy)-2-phenylethylisocyanat, hergestellt in Beispiel 2, Schritt D, (1,366 g, 5,39 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (EtOAc/Benzin, 7 : 3) die Titelverbindung (391 mg, 33 %) als ein Öl.
Schritt I 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-(benzyloxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 14)
Zu 4-[2-Methoxyethylthio]-1-[(4-benzyloxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidnon (358 mg, 0,76 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde ein Überschuß Metachlorperoxybenzoesäure (MCPBA) (ungfähr 50 % rein, 525 mg) gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde in eine wässerige Lösung, enthaltend 8 % (Gew./V.) Natriumbicarbonat und 8 % (Gew./V.) Natriumsulphit (50 ml) gegossen und bei Raumtemperatur 30 Minuten kräftig grührt. Die organische Schicht wurde isolier und mit gesättigter Kochsalzlösung (5 ml) und Wasser (5 ml) gewaschen. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan (20 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden ver einigt, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Benzin/EtOAc, 7 : 3) ergab die Titelverbindung (314 mg, 82 %) als ein Öl.
Schritt J 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 15)
Cyclohexen (400 μl, 3,95 mmol) wurde zu einer Lösung aus 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-(4-benzyloxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (195 mg, 0,39 mmol) in trockenem Ethanol (7 ml) bei Raumtemperatur unter Argon gegeben. 10%iges Palladium auf Aktivkohle (202 mg) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch bei Rückfluß 4 Stunden erwärmt. Das Reaktionsgemisch konnte dann auf Raumtemperatur abkühlen, es wurde durch ein Celitekissen filtriert, mit Ethanol (15 ml) gewaschen und das Filtrat in Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie (Benzin/EtOAc, 1 : 1) gereinigt, wodurch die Titelverbindung (127 mg, 79 %) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt K 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)(3-iod)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 16)
Zu 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (52 mg, 1,3 × 10^–4 mol), glöst in MeOH (10 ml), wurden NaI (19 mg, 1,3 × 10^–4 mol) und wässeriges PAA (0,1 M, 1,3 × 10^–4 mol, 1,27 ml) gegeben. Die Lösung wurde bei Laborumgebungstemperatur gerührt, und weitere Moläquivalente von PAA wurden ungefähr 1 und 2 Stunden nach der Zugabe des ersten Aliquots von PAA zugegeben. Das gelöste Produkt wurde unter Verwendung von System E, Beispiel 12, HPLC-gereinigt. Die gereinigten HPLC-Fraktionen wurden in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (21 mg, 30 %) erhalten wurde.
Schritt L 4-(2-Methoxyethylsulfonyl)-1-[(3,5-diiod)(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 17)
Zu 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (13 mg, 3,1 × 10^–5 mol) wurden NaI (5 mg, 3,1 × 10^–5 mol) und wässeriges PAA (0,3 ml, 0,1 M, 3,1 × 10^–5 mol) gegeben. Die Lösung wurde unmittelbar bei der Zugabe von Peressigsäure orange/braun und bei Laborumgebungstemperatur gerührt. Weitere Aliquote von NaI (3,1 × 10^–5 mol) und PAA (0,3 ml, 3,1 × 10^–5 mol) wurden ungefähr 2 1/2 Stunden und 4 Stunden nach der Reaktionsinitiierung zugegeben. Das gelöste Produkt wurde unter Verwendung des Systems E, Beispiel 12, HPLC-gereinigt. Die gereinigten Fraktionen wurden in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (4,4 mg, 21 %) erhalten wurde.
Schritt M Synthese von ¹²³I-markiertem 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)(3-iod)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 16) 4-[2-Methoxyethylsulfonyl]-1-[(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon in MeOH (50 μg, 1 × 10^–7 mol, 50 μl) wurde gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 1, Schritt G beschrieben wird, iodiert. Das Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung des Systems A, Beispiel 12, gereingit und mit Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) auf identische Art und Weise wie in Beispiel 1, Schritt G, ausgeführt, verdünnt. Die RCP-Messungen werden in Tabelle 20 ausgeführ. Die Identität der ¹²³I-Spezies wurde durch HPLC-Co-Elution mit dem chemisch charakterisierten ¹²⁷I-Analogon (Beispiel 2, Schritt K) bestätigt. Die Verweilzeiten der ¹²³I- und ¹²⁷I-Spezies werden in Tabelle 21 dargelegt.
Schritt N Synthese von ¹²³I-markiertem 4-(2-Methoxyethylsulfonyl)-1-[(3,5-diiod)(4-hydroxy)phenylethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 17) Die Synthese der Titelverbindung war mit dem in Beispiel 1, Schritt G verwendeten Verfahren identisch. Dieses Verfahren erzeugt ein Gemisch (ungefähr 50 : 50) aus mono-Iod- und di-Iodspezies. Das gewünschte Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung des Systems A, Beispiel 12, gereingit, der organische Eluent entfernt und die Probe mit wässerigem Natriumphosphatpuffer vor dem Test, wie in Beispiel 1, Schritt G ausgeführ, verdünnt. Die radiochemische Reinheit der gereinigten Verbindung wurde vor und nach dem Screening unter Verwendung des HPLC-Systems A, Beispiel 12, gemessen. Die Ergebnisse der RCP-Messung werden in Tabelle 20 ausgeführt. Die Identität der ¹²³I-Spezies wurde durch HPLC-Coelution mit dem chemisch charakterisierten ¹²⁷I-Analogon (Beispiel 2, Schritt L) bestätigt. Die Verweilzeiten der ¹²³I- und ¹²⁷I-Spezies werden in Tabelle 21 dargestellt.
Beispiel 3
4S-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy-1-[(R-α-n-propyl)-(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 24)
Schritt A R-α-n-Propyl-(4-brom)phenylessigsäure (Verbindung 18)
Gemäß dem Verfahren von Finke et. al., (UK Patentanmeldung GB 2 280 673 A) ergaben 4-Bromphenylessigsäure (17,24 g, 0,08 mol) und 1-Brompropan (14,5 ml, 0,16 mol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Benzin/Essigsäure, 99 : 1 zu Benzin/EtOAc/Essigsäure, 64 : 33 : 1) α-n-Propyl-(4-brom)phenylessigsäure (15,49 g, 75 %). Zu der racemischen Säure wurde R-(+)-α-Methylbenzylamin gegeben und das resultierende Salz dreimal aus Ethylacetat umkristallisiert. Das Salz wurde in 2M wässerige HCl (100 ml) aufgenommen und in Dichlormethan (100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konznetriert, wodurch die Titelverbindung (3,72 g) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt B R-α-n-Propyl-(4-brom)phenylmethylisocyanat (Verbindung 19)
Gemäß dem Verfahren von Finke et. al., (UK Patentanmeldung GB 2 280 673) ergab R-α-n-Propyl-(4-brom)phenylessigsäure (2,00 g, 7,78 mmol) die Titelverbindung (1,90 g, 96 %) als ein Öl.
Schritt C 4S-[4-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 20)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben R-α-n-Propyl-(4-brom)phenylmethylisocyanat (1,9 g, 7,48 mmol) und 4-[4-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy]-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) (1,28 g, 4,0 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient 100 % Benzin zu Benzin/EtOAc, 1 : 1) die Titelverbindung (0,73 g, 32 %) als ein Öl.
Schritt D 4S-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 21)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergab 4S-[4-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,73 g, 1,27 mmol) die Titelverbindung (0,66 g, 100 %) als ein Feststoff.
Schritt E 4S-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 22)
Gemäß dem Verfahren von Doherty et. al., ( EP 0 595 557 A1 ) ergab 4S-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,66 g, 1,27 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Hexan zu EtOAc/Hexan, 1 : 1 zu MeOH/EtOAc, 1 : 9) und Umkristallisation (Diethylether/Benzin) die Titelverbindung (0,37 g, 60 %) als weiße Kristalle.
Schritt F 4S-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-[4-tri-(n-butyl)-stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 23)
Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt E, beschriebenen Verfahren ergab 4S-[4[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (80 mg, 0,13 mmol) nach der Reinigung durch HPLC unter Verwendung des Systems J, Beispiel 12, die Titelverbindung (15,5 mg, 15 %) als ein Öl.
Schritt G Synthese von ¹²³I-markiertem 4S-[4-[[(4-methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 24)
Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt G, beschriebenen Verfahren ergab 4S-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(R-α-n-propyl)-[4-tri-(n-butyl)-stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (50 μg, 6,18 × 10^–8 mol) die Titelverbindung.
Beispiel 4
4S-(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propel)-(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 28)
Schritt A 4-(Pyridyl-3-oxy)-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 25) Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992) ergaben 3-Hydroxypyridin (0,598 g, 6,291 mol) und 4-Acetoxy-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) (1,00 g, 5,40 mol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (MeOH/EtOAc, 1 : 4) die Titelverbindung (900 mg, 76 %) als ein Öl.
Schritt B 4S-(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 26)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben R-α-n-Propyl-(4-brom)phenylmethylisocyanat, hergestellt wie in Beispiel 3, Schritt B (1,32 g, 5,19 mmol) und 4-(Pyridyl-3-oxy)-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,573 mg, 2,60 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Diethylether/Benzin, 1 : 1 zu Diethyleter/Benzin, 7 : 1 zu Diethylether/Benzin, 9 : 1) die Titelverbindung (0,35 g, 28 %) als ein Öl.
Schritt C 4S-(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propyl)-[[4-tri-(n-butyl)-stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 27)
Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt E, beschriebenen Verfahren ergab 4S-(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propyl)-(4-brom)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (90 mg, 0,19 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient EtOAc/Benzin, 1 : 4 zu EtOAc/Benzin, 1 : 1 zu EtOAc/Benzin, 7 : 3) die Titelverbindung (29 mg, 22 %) als ein Öl.
Schritt D Synthese von ¹²³I-markiertem 4S-(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propyl)-(4-iod)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 28)
Gemäß dem in Beispiel 1, Schritt G, beschriebenen Verfahren ergab 4(Pyridyl-3-oxy)-1-[(R-α-n-propyl)-[[4-tri-(n-butyl)-stannyl]benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (50 μg, 7,31 × 10⁸ mol) die Titelverbindung.
Beispiel 5
Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-carboxy)benz aminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 38)
Schritt A 4-(N-Boc-aminomethyl)benzoesäure (Verbindung 29)
Zu einer Lösung aus 4-(Aminomethyl)benzoesäure (1 g, 6,62 mmol) in 4M NaOH (21 ml) bei Raumtemperatur wurde Di-tert-butyldicarbonat (1,67 ml, 7,28 mmol) zugegeben und das Gemisch 19 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde auf pH 2,0 mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (1,136 g, 68 %) als ein Feststoff erhalten wurde.
Schritt B 4-(N-Boc-aminomethyl)benzoesäure, Benzylester (Verbindung 30)
Zu einem Gemisch aus 4-(N-Boc-aminomethyl)benzoesäure (500 mg, 1,99 mmol), DMAP (katalytische Menge), Benzylalkohol (226 μl, 2,19 mmol) und Dichlormethan (20 ml) wurde Dicyclohexylcarbodiimid (1M Lösung in Dichlormethan, 2,19 ml, 2,19 mmol) gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 60 Stunden gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat in Vakuum konzentriert. Diethylether (50 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben, der resultierende Niederschlag durch Filtration entfernt und das Filtrat in Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Benzin/EtOAc, 3 : 1) ergab die Titelverbindung (412 mg, 61 %) als ein Feststoff.
Schritt C 4-(Aminomethyl)benzoesäure, Benzylester, Hydrochloridsalz (Verbindung 31) Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt C, beschriebenen Verfahren ergab 4-(N-Boc-Aminomethyl)benzoesäure, Benzylester (398 mg, 1,17 mmol) die Titelverbindung (288 mg, 93 %) als ein Feststoff.
Schritt D 4-Benzyloxy-(1-N-methylpiperazin)benzamid (Verbindung 32)
Gemäß dem Verfahren von Doherty et. al., ( EP 0 595 557 A1 ) ergab Benzyloxybenzoesäure (15,22 g, 0,06 mol) die Titelverbindung (18,93 g, 99 %) als einen hellgelben Feststoff.
Schritt E 4-Hydroxy-(1-N-methylpiperazin)benzamid (Verbindung 33) Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergab 4-Benzyloxy-(1-N-methylpiperazin)benzamid (4,555 g, 0,015 mol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (MeOH/EtOAc, 1 : 9) die Titelverbindung (2,41 g, 73 %) als ein Feststoff.
Schritt F 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 34)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben 4-Hydroxy-(1-N-methylpiperazin)benzamid (2,41 g, 0,011 mol) und 4-Acetoxy-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992), 3,04 g, 0,017 mol), gefolgt von einer weiteren Zugabe nach 60 Stunden von 4-Acetoxy-3,3-diethyl-2-azetidinon (0,95 g, 5,31 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Benzin/EtOAc, 1 : 1 zu MeOH/EtOAc, 1 : 9 zu MeOH/EtOAc, 9 : 1) die Titelverbindung (1,60 g, 42 %) als ein Öl.
Schritt G 4-(Benzyloxycarbonyl)benzylisocyanat (Verbindung 35)
Zu 4-(Aminomethyl)benzoesäure, Benzylester, Hydrochloridsalz, hergestellt wie in Beispiel 5, Schritt C (288 mg, 1,04 mmol) bei 0 °C wurden gesättigtes wässeriges NaHCO₃ (15 ml) und Dichlormethan (20 ml) gegeben. Nach 20 Minuten wurde das Rühren gestoppt und die beiden Schichten konnten sich abtrennen. Phosgen (20%ige Lösung in Toluol, 1,1 ml, 2,18 mmol) wurde schnell zu der unteren Schicht gegeben und das Rühren unmittelbar wiederaufgenommen. Nach einer Stunde wurde die organische Schicht isoliert. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan (3 × 20 ml) extrahiert. Die vier organischen Schichten wurden vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄) und in Vakuum konzentriert, wodurch die Titelverbindung (261 mg, 94 %) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt H 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[4(benzyloxycarbonyl)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 36)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754(1992)) ergaben 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-3,3-diethyl-2-azetidinon (160 mg, 0,463 mmol) und 4-(Benzyloxycarbonyl)benzylisocyanat (261 mg, 0,98 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (MeOH/EtOAc, 1 : 4) die Titelverbindung (171 mg, 60 %) als ein Öl.
Schritt I 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(carboxy)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 37)
Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergab 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[4-(benzyloxycarbonyl)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (159 mg, 0,26 mmol) die Titelverbindung (107 mg, 79 %) als ein Feststoff.
Schritt J Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-carboxy)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 38)
Zu 4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(4-carboxy)benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (30 mg, 0,057 mmol), DMAP (katalytische Menge) und N-Hydroxysuccinimid (7 mg, 0,063 mmol) in einem Gemisch aus Dichlormethan (1 ml) und Acetonitril (1 ml) wurde Dicyclohexylcarbodiimid (1M Lösung in Dichlormethan, 0,63 ml, 0,063 mmol) gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur unter Stickstoff 19 Stunden gerührt. Eine Lösung aus 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (WO 95/19187, 27 mg, 0,086 mmol) in Acetonitril (1 ml) wurde zugegeben und das Gemisch weitere 5 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, mit Acetonitril (1 ml) verdünnt und durch HPLC unter Verwendung des Systems H, Beispiel 12, gereinigt, wodurch die Titelverbindung (2 mg, 4 %) als ein Feststoff erhalten wurde.
Beispiel 6
Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 42)
Schritt A 2-(Benzyloxycarbonyl)ethylisocyanat (Verbindung 39) Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt G, beschriebenen Verfahren ergab β-Alaninbenzylester-p-toluolsulfonat (3 g, 8,53 mmol) die Titelverbindung (1,44 g, 94 %) als eine Flüssigkeit.
Schritt B 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-ylcarbonyl]phenoxy]-1-[2(benzyloxycarbonyl)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 40)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992)) ergaben 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-3,3-diethyl-2-azetidinon, hergestellt wie in Beispiel 5, Schritt F, (0,68g, 1,97 mmol) und 2-(Benzyloxycarbonyl)ethylisocyanat (0,705 g, 3,94 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Gradient Benzin/EtOAc, 1 : 1 zu MeOH/EtOAc, 1 : 9 zu MeOH/EtOAc, 1 : 1) die Titelverbindung (840 mg, 78 %) als ein Öl.
Schritt C 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 41)
Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergab 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[2-(benzyloxycarbonyl)ethylaminocarbonyl)-3,3-diethyl-2-azetidinon (420 mg, 0,76 mmol) die Titelverbindung (280 mg, 80 %) als einen Feststoff.
Schritt D Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 42)
Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergaben 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (100 mg, 0,22 mmol) und 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (WO 95/19187, 82 mg, 0,26 mmol) nach der Reinigung durch HPLC unter Verwendung des Systems H, Beispiel 12, die Titelverbindung (4 mg, 3 %) als ein Öl.
Beispiel 7
Koniugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(5-carb- ^` oxy]pentylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 48)
Schritt A N-Boc-Aminohexansäure, Benzylester (Verbindung 43) Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt B, beschriebenen Verfahren ergab N-Boc-Aminohexansäure (1,0 g, 4,32 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (Benzin/EtOAc, 4 : 1) die Titelverbindung (1,34 g, 96 %) als eine Flüssigkeit.
Schritt B Aminohexansäure, Benzylester (Verbindung 44)
Zu N-Boc-Aminohexansäure, Benzylester (1,125 g, 3,50 mmol) in Dichlormethan (4 ml) wurde Trifluoressigsäure (8 ml) gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt. Die Lösungsmittel wurden in Vakuum entfernt, wodurch die Titelverbindung (1,17 g, 100 %) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt C 5-(Benzyloxycarbonyl)pentylisocyanat (Verbindung 45) Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt G, beschriebenen Verfahren ergab Aminohexansäure, Benzylester (1,17 g, 3,50 mmol) die Titelverbindung (0,922 g, 100 %) als ein Öl.
Schritt D 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[5-(benzyloxycarbonyl)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 46)
Gemäß dem Verfahren von Shrenik et. al., (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992) ergaben 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-3,3-diethyl-2-azetidinon, hergestellt wie in Beispiel 5, Schritt F, (316 mg, 0,91 mmol) und 5-(Benzyloxycarbonyl)pentylisocyanat (922 mg, 3,50 mmol) nach der Reinigung durch Flashsäulenchromatographie (MeOH/EtOAc, 1 : 3) die Titelverbindung (0,53 g, 98 %) als ein hellgelbes Öl.
Schritt E 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[5(carboxy)pentylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 47)
Gemäß dem in Beispiel 2, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergab 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[5-(benzyloxycarbonyl)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (421 mg, 0,71 mmol) die Titelverbindung (320 mg, 90 %) als ein Feststoff.
Schritt F Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(5-carboxy)pentylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 48) Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergaben 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[5-(carboxy)pentylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (98 mg, 0,20 mmol) und 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (WO 95/19187, 76 mg, 0,24 mmol) nach der Reinigung durch HPLC unter Verwendung des Systems H, Beispiel 12, die Titelverbindung (19,7 mg, 12 %) als ein Öl.
Beispiel 8
Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 49)
Schritt A Konjugat zwischen Chelat, 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim und 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 49)
Gemäß dem in Beispiel 5, Schritt J, beschriebenen Verfahren ergaben 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992), 100 mg, 0,25 mmol) und 3,3,6,9,9-Pentamethyl-6-aminomethyl-4,8-diazaundecan- 2,10-diondioxim (WO 95/19187, 95 mg, 0,30 mmol) nach der Reinigung durch HPLC unter Verwendung des Systems H, Beispiel 12, die Titelverbindung (18 mg, 10 %) als ein Öl.
Beispiel 9
Konjugat zwischen Chelat, 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 51)
Schritt A 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (Verbindung 50)
Zu Tris(2-aminoethyl)amin (4 ml, 0,027 mol), Acetonitril (70 ml) und NaHCO₃ (7,4 g, 0,088 mol) wurde 3-Chlor-3-methyl-2-nitrosobutan (europäische Patentanmeldung 0 179 608 A2, 2,5 g, 0,019 mol) in Acetonitril (50 ml) tropfenweise über 20 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt, filtriert und in Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch HPLC unter Verwendung des Systems I, Beispiel 12, gereinigt, wodurch die Titelverbindung (700 mg, 8 %) als ein Öl erhalten wurde.
Schritt B Konjugat zwischen Chelat, 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-tri-azatridecan-2,12-diondioxim und 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (Verbindung 51)
Zu einem Gemisch aus 4-[4-[[(4-Methyl)piperazin-1-yl]carbonyl]phenoxy]-1-[(2-carboxy)ethylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon, hergestellt wie in Beispiel 6, Schritt C, (100 mg, 0,22 mmol), 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (75 mg, 0,22 mmol) und HBTU (82 mg, 0,22 mmol) unter Stickstoff wurde wasserfreies DMF (1 ml) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt und Diisopropylethylamin (100 μl, 1,09 mmol) zugegeben und das Rühren wurde 40 Stunden fortgesetzt. Nach der Verdünnung mit MeOH/H₂O, 1 : 1 (4 ml) wurde das Gemisch durch HPLC unter Verwendung des Systems H, Beispiel 12, gereinigt, wodurch die Titelverbindung (54,2 mg, 32 %) als ein Öl erhalten wurde.
Beispiel 10
Konjugat zwischen Chelat, 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim und 4-((4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidnon (Verbindung 52)
Schritt A Konjugat zwischen Chelat, 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim und 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidnon (Verbindung 52)
Gemäß dem in Beispiel 9, Schritt B, beschriebenen Verfahren ergaben 4-[(4-Carboxy)phenoxy]-1-[benzylaminocarbonyl]-3,3-diethyl-2-azetidinon (J. Med. Chem., 35, 3745 bis 3754 (1992), 100 mg, 0,253 mmol) und 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminomethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim, hergestellt wie in Beispiel 9, Schritt A, (87 mg, 0,253 mmol) nach der HPLC-Reinigung unter Verwendung des Systems K, Beispiel 12, die Titelverbindung (110 mg, 60 %) als einen Feststoff.
Beispiel 11
^99mTc-Markierung der Verbindungen 38, 42, 48, 51 und 52
Eine Lösung der Verbindung zur Markierung in Methanol (250 μg in 50 μl) wurde zu einem mit N₂ gefüllten 10 ml-P6-Gefäß übertragen, gefolgt von Methanol (1 ml), desoxidierter Kochsalzlösung (0,9 % Gew./V., 1 ml) und wässerigem Natriumhydroxid (0,1M, 18 μl). Zu dieser Lösung wurde Technetium-99m-Generatoreluat (1 ml, ungef. 0,5 GBq) gegeben und dann wässeriges SnCl₂ (0,1 ml, 10 mg). Der Markierungs-pH betrug 8,0 bis 8,5. Die Gefäße wurden bei Umgebungstemperatur 1 bis 2 Stunden inkubiert und das ^99mTc-markierte Produkt durch HPLC unter Verwendung des Systems A, Beispiel 12, gereinigt, wodurch das Produkt in einem Plasma-beschichteten Schott-Gefäß, das eine nicht markiere Verbindung (200 μg in 250 μl Methanol) enthält, gesammelt wurde. Das organische Elutionsmittel wurde in Vakuum entfernt und die Probe wurde mit Puffer, wie in Beispiel 1, Schritt G beschrieben, verdünnt. Die radiochemische Reinheit der gereinigten Verbindungen wurde unter Verwendung des HPLC-Systems A, Beispiel 12, (Ergebnisse in Tabelle 22) und die Dünnschichtchromatographie-Systeme (DC), die nachstehend beschrieben werden, gemessen.
DC

i) IDC SG 2 cm × 20 cm, eluiert mit 0,9 % Gew./V. Kochsalzlösung
ii) IDC SG 2 cm × 20 cm, eluiert mit Butan-2-on
iii) Whatman Nr. 1 2 cm × 20 cm, eluiert mit 50 : 50 V./V. Acetonitril : H₂O worin IDC SG = sofortige Dünnschichtchromatographie, Kieselgel-imprägnierte Schichten, gelie fert von Gelman.

Die Verbindungen 38, 42, 48, 49, 51 und 52 bleiben in oder nahe ihrem Ursprung in DC-System (i), zwischen ihrem Ursprung und der Lösungsmittelfront in System (ii) und nahe an der Lösungsmittelfront in System (iii).
Beispiel 12 HPLC-Details
Tabelle 1: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 2, 3, 4 und 5.
Tabelle 2: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 1, 6, 7, 8 und 9
Tabelle 3: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 10 und 11
Tabelle 4: ¹H-NMR-Daten für Verbindung 12
Tabelle 5: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 18 und 19
Tabelle 6: ¹-H-NMR-Daten für die Verbindungen 13, 14, 15, 16 und 17
Tabelle 7: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 20, 21, 22 und 23
Tabelle 8: ¹H-NMR-Daten für Verbindung 25
Tabelle 9: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 29, 30, 31 und 35
Tabelle 10: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 26 und 27
Tabelle 11: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 32 und 33
Tabelle 12: ¹H-NMR-Daten für Verbindung 34
Tabelle 13: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 36, 37 und 38
Tabelle 14: ¹H-NMR-Daten für Verbindung 39.
Tabelle 15: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 43, 44 und 45
Tabelle 16: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 40, 41, 42 und 51
Tabelle 17: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 46, 47 und 48
Tabelle 18: ¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 49 und 52
Tabelle 19: ¹H-NMR-Daten für Verbindung 50
Tabelle 20
Tabelle 21
Tabelle 22
Beispiel 13
Messung der HLE-Inhibierungspotenz
Die Inhibitorpotenz gegen HLE wird durch den Parameter k_inakt./K_i wie zuvor angegeben [Knight et. al., Biochem., 8160 bis 8170, (1992)] beschrieben. Lyophilisiertes Enzym wurde mit TrisHCl-Puffer, 100 mM, 0,5M NaCl bei 0,05 Einheiten/ml (ungef. nanomolare Konzentration) in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 1 ml, zu dem Methoxysucc-ala-ala-proval-pNA-Substrat (1 mM) und der Elastaseinhibitor, gelöst in DMSO, gegeben wurde, rekonstituiert. Die Reaktion wurde durch Detektion der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm (Hydrolyse des Substrat-freisetzenden p-Nitroanilins) über eine Zeitskala von 25 Minuten aufgezeichnet. Die Werte für k_inakt./K_i wurden gemäß dem Verfahren von Knight et. al., bewertet. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 23 und 24 abgegeben.
Beispiel 14
Messung der Menschenzellselektivität in vitro in isolierten weißen Blutzellen in gemischten weißen und roten Zellen und in Vollblut
Isolierte menschliche weiße Zellen
Frisches Blut (30 bis 120 ml) wurde mit 1,5%iger ACD-Lösung antikoaguliert und durch Zugabe von 2 ml Hespan pro 10 ml Blut 90 Minuten bei Raumtemperatur sedimentiert. Der Leukozyten-reiche, Plättchen-reiche Plasmaüberstand wurde entfernt und bei 150 g 5 Minuten zentrifugiert, was ein Leukozyten-reiches Pellet und Plättchen-reiches Plasma (PRP) ergibt. Das PRP wurde bei 4000g zentrifugiert, um die Plättchen zu pelletieren, wodurch ein zellfreies Plasma (CFP) zurückbleibt. Das Leukozytenpellet wurde in einem 50 : 50-Gemisch aus HBSS und CFP wieder suspendiert und mit der radioaktiven Verbindung 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das freie radioaktive Material wurde dann aus den Zellen durch die Zugabe eines Überschusses an HBSS:CFP und Zentrifugation der Leukozyten bei 150 g für 7 Minuten entfernt. Der Überstand und das Zellpellet wurden für die radioaktive Zählung zur Berechnung der prozentualen Zellaufnahme genommen. Die Verteilung der Radioaktivität in dem Zellpellet wurde druch Trennung der Zellarten unter Verwendung der Percoll-Dichtegradientenzentrifugation (38 %, 55 % und 73 % Percoll in HBSS-Schrittgradienten) bestimmt. Die restliche Plasma- und freie Aktivität wurden von der Oberseite des Gradienten rückgewonnen, die mononuklearen Zellen (Lymphozyten und Monozyten) aus der Grenzfläche zwischen 38 % und 55 % und die Granulozyten wurden aus der Grenzfläche zwischen 55 % und 73 % Percoll rückgewonnen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 23 gezeigt.
Gemischte menschliche rote/weiße Zellen
Die radioaktive Verbindung wurde auch mit einem isolierten Leukozytpräparat inkubiert, in das eine Erythrozytfraktion zurückgegeben worden ist. Die gepackten Erythrozyten, die nach der Blutsedimentation erhalten wurden, wurden zweimal mit HBSS gewaschen und dann wieder in ihr ursprüngliches Blutvolumen mit HBSS suspendiert. Leukozyten, die aus 30 ml Blut erhalten wurden, wurden wieder in 0,5 ml Erythrozytensuspension und 0,5 ml CFP suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit der Verbindung wie oben inkubiert. Die Analyse der Verteilung der Aktivität in dem Zellpellet in Gegenwart von roten Blutzellen wurde unter Verwendung von diskontinuierlichen Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten (Dichten 1,04, 1,077 und 1,119 g/ml Histopaque-Schritte) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 23 angegeben.
Menschliches Vollblut
Die radioaktive Verbindung wurde zu 1 ml Vollblut, das mit ACD antikoaguliert war, gegeben, und bei 37 °C eine Stunde inkubiert. Das Blut wurde mit HBSS verdünnt und die Zellkomponente durch Zentrifugation abgetrennt. Die Verteilung der Aktivität in dem Zellpellet wurde durch Abtrennung der Zellfraktionen auf Ficoll-Hypaque-Gradienten wie oben bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 23 angegeben. Tabelle 23
worin:
Mon. = Monozyten + Lymphozyten
Gran. = Granulozyten
Eryth. = Erythrozyten
die Zahlen sind die %-Aufnahme in jeder Zellfraktion
Beispiel 15
In vivo Bioverteilung radioaktiv markierter Elastaseinhibitoren bei Ratten die experimentelle Abszesse tragen
Das Modell: in den rechten Schlankmuskel (Schenkel) männlicher Wistar-Ratten (250 bis 325 g) wurde 1 ml/kg einer E.coli-Suspension injiziert, die 5 × 10⁸/ml Organismen enthält. Über die nächsten 24 Stunden entwickelte sich ein Pustelabszess an der Stelle des Schlagader-Lymphknotens, wobei der umgebende Muskel auch Anzeichen von Entzündung zeigt. Diese sichtbaren Beobachtungn wurden durch Histologie bestätigt.
Die Bewertung: Das Modell wurde zur Verwendung bei der Entwicklung diagnostischer Bildgebungsmittel für Infektionen/Entzündungen durch die intravenöse Injektion von ^99mTc-HMPAO ex-vivo markierter menschlicher wBz oder ⁶⁷Ga-Citrat bewertet, als die Abszesse 24 Stunden alt waren. Die Tiere wurden zwischen 4 und 24 Stunden nach der Injektion disseziert. ^99mTc-markierte rote Blutzellen wurden als eine negative Kontrolle verwendet.
Screening in E. coli-infizierten Ratten: 0,2 bis 10 MBq ¹²³I- oder ^99mTc-markierte Elastaseinhibitoren, verdünnt in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4) wurden intravenös in die Schwanzvene von Ratten, die seit 24 Stunden einen Abszess tragen, injizier. Die Tiere wurden 4 oder 24 Stunden nach der Injektion getötet und das relevante Gewebe disseziert.
Screening ex vivo markierter humaner Leukozyten in E.coli-infizieren Ratten
Eine gemischte Population humaner Leukozyten wurde mit Elastaseinhibitor 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann heruntergeschleudert und in einem bekannten Volumen an Rattenplasma für die intravenöse Injektion in Ratten, die einen 24 Stunden alten Abszess tragen, wieder suspendiert. Die Tiere wurden 4 und 24 Stunden nach der Injektion disseziert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 24 gezeigt.
Beispiel 16
In vivo-Stabilität iodierter HLE-Inhibitoren
Die in vivo-Stabilität radioiodierter HLE-Inhibitoren wurde durch die Bestimmung der prozentualen Aufnahme in das Thyroid als eine Funktion der Zeit nach der Verabreichung aufgezeichnet. So wurden radioiodierte Verbindungen und ¹²³I-freies Iodid in männliche Wistar-Ratten injiziert. Der Pozentsatz an injizierter Dosis, die sich in dem Thyroid verteilt, wurde durch Dissektion 4 und 24 Stunden nach der Injektion und Zählen berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 25 angegeben.
Beispiel 17
In-vitro-Bildungs-Plasmagerinnsel-Assay
1 μM eines potenten (k_inakt./K_i > 3000000 M/s) β-Lactamelastaseinhibitors wurde zu Aliquoten menschlichen Plasmas, gesammelt von 6 Freiwilligen, gegeben. Die Testprobe enthielt Plasma mit Granulozyten (siehe Beispiel 14 Isolationsverfahren) bei einer Endkonzentration von 10⁶/ml und 2 Volumen 50mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 15 mM Calciumchlo rid enthält. Die Kontrollprobe bestand aus Plasma und Trispuffer ohne Calcium. Es konnten sich für 60 Minuten nach der Zugabe von 4 Einheiten Rinderthrombin und eines angerauhten Glasstabes zur Induzierung der Gerinnselbildung Gerinnsel bilden. Nach der Inkubation (ca. 20 °C) wurde die Reaktion durch Zugabe von ~ 400 μl kaltem 33,5mM Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz eingestellt. Die Lösungen wurden durch die Verwendung eines Vakuumverteilers auf 0,45 μm Nitrocellulosefilter (in 1,5%igem Rinderserum albumin/Trisgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, die 0,1 % Tween 20 enthält, vorgetränkt) filtriert und mit demselben Puffer ohne BSA gewaschen.
Die Fraktion der Radioaktivität, die auf dem Filter verblieb, nach Abzug nicht spezifischer Bindung, ist ein Maß der prozentualen Einführung in die filtrierten Gerinnsel.
Tabelle 24
Die Parameter werden wie folgt definiert:

1) Infiziert/normal-Verhältnis: Das Verhältnis der % injizierten Dosis, identifiziert (id) pro Gramm Gewebe in der infizierten Fläche, bezogen auf das in einer Kontrollfläche, die aus dem Schenkel der kontralateralen Extrimität genommen wurde.
2) Infiziert/Blut-Verhältnis: Das Verhältnis %/g in der infizierten Fläche, bezogen auf die Aktivität in Blut. Ein niedriges Verhältnis zeigt an, daß die Akkumulation in der infizierten Fläche durch die Aktivtät in dem Blutpool maskiert werden konnte.
3) Die relative Konzentration an Mittel in der infizierten Fläche. Diese kann als % der injizierten Dosis in einem %-Körpergewicht definiert werden. Zum Beispiel würde 1 % der injizierten Dosis in einem Gewebe, das 1 % des Körpergewichtes ist, eine relative Konzentration von 1 haben.

Tabelle 25

Claims

Humaner Leukozytenelastase(HLE)-Inhibitor, der mit einem nachweisbaren Rest markiert ist, wobei der Inhibitor synthetisch ist und ein Molekulargewicht von weniger als 2000 aufweist und der nachweisbare Rest eine Substanz ist, die für externe Bildgebung nach humaner Verabreichung geeignet ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 1, bei dem der nachweisbare Rest ein radioaktives Isotop ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 1, bei dem der nachweisbare Rest ein paramagnetisches Ion ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 1, bei dem der nachweisbare Rest eine radiopaque Verbindung ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 2, bei dem das radioaktive Isotop ein Gammastrahler ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 5, bei dem das radioaktive Isotop ¹²³I, ^99mTc, ¹¹¹In oder ⁶⁷Ga ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 6, wobei der Inhibitor ein β-Lactam ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 6, wobei der Inhibitor ein Ynenollacton ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 6, wobei der Inhibitor ein Trifluoracetylpeptid ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 6, wobei der Inhibitor ein Peptidketon ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 6, wobei der Inhibitor ein Benzoxazin-4-on ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 7, wobei das β-Lactam die allgemeine Formel aufweist:
in der: wenn R¹ R⁸, XR⁸, (CRR)_n(C=X)R⁸ oder (C=X)NR⁸ ₂ ist, X O oder S ist, n 0 - 3 ist, R⁸ H, OH, ein substituierter oder unsubstituierter C_3-12 carbocyclischer oder heterocyclischer Ring, der gesättigt oder ungesättigt sein kann, C_1-10 Alkyl, C_3-12 Aryl, C_4-12Alkylaryl, C_2-10 Alkenyl, C_2-10 Alkinyl, C_1-10 Alkoxy, C_1-10 Alkoxyalkyl, C_1-10 Hydroxyalkyl, C_1-10 Aminoalkyl, C_1-10 Perfluoralkyl, C_1-10 Haloalkyl, C_1-10 Carboxyalkyl, C_1-10 Amidoalkyl oder C_1-10 Ketoalkyl ist, R², R³ gleich oder verschieden sind und jeweils H, C_1-4 Alkyl, C_2-4 Alkenyl, C_2-4 Alkinyl, C_1-4 Alkoxyalkyl, C_1-4 Hydroxyalkyl, C_1-4 Aminoalkyl, C_1-4 Perfluoralkyl, C_1-4 Haloalkyl, Hal, C_1-4 Carboxyalkyl, OR, SR, NRR, (CH₂)_nCONRR, NR(CO)R oder (CH₂)_nCO₂R sind, R⁴ eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist unter Hal, XR⁸, X(C=X)R⁸, OSOR⁸, OSO₂R⁸ OSO₂Hal, SOR⁸ SO₂R⁸, SO₂NR⁸ ₂ NRSO₂R, (C=X)R⁸, (C=X)NR⁸ ₂, (C=X)R⁸, NO₂, CN, PO_nR⁸ ₂ oder XC₆H_4-nY_n, Y gleich oder verschieden ist und R, NO₂, Hal, CONR⁸ ₂, SO₂NR⁸ ₂ oder CO₂R ist, R⁵ R oder R⁴ ist, R gleich oder verschieden ist und H, C_1-4 Alkyl, C_2-4 Alkenyl, C_2-4 Alkinyl, C_1- ₄ Alkoxy, C_1-4 Alkoxyalkyl, C_1-4 Hydroxyalkyl, C_1-4 Aminoalkyl, C_1-4 Perfluoralkyl, C_1-4 Haloalkyl oder C_1-4 Carboxyalkyl ist, wobei zwei oder mehrere der Gruppen R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ verknüpft sein können, um einen substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen oder heterocyclischen Ring zu bilden, der gesättigt oder ungesättigt sein kann, dadurch gekennzeichnet, dass das β-Lactam mindestens einen nachweisbaren Rest enthält oder daran kovalent gebunden aufweist, und mit der Maßgabe, dass, wenn R⁴ XR⁸ ist, X S ist und R¹ und R⁴ verknüpft sind, um eine cyclische Carboxyalkylgruppe zu bilden, dann der nachweisbare Rest nicht ¹²⁵I ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 7, wobei der Inhibitor ein Azetidinon ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 10, wobei das Azetidinon die Formel aufweist:
in der: wenn R¹ R⁸, XR⁸, (CRR)_n(C=X)R⁸ oder (C=X)NR⁸ ₂ ist, X O oder S ist, n 0 – 3 ist, R⁸ H, OH, ein substituierter oder unsubstituierter C_3-12 carbocyclischer oder heterocyclischer Ring, der gesättigt oder ungesättigt sein kann, C_1-10 Alkyl, C_3-12 Aryl, C_4-12 Alkylaryl, C_2-10 Alkenyl, C_2-10 Alkinyl, C_1-10 Alkoxy, C_1-10 Alko xyalkyl, C_1-10 Hydroxyalkyl, C_1-10 Aminoalkyl, C_1-10 Perfluoralkyl, C_1-10 Haloalkyl, C_1-10 Carboxyalkyl, C_1-10 Amidoalkyl oder C_1-10 Ketoalkyl ist, R², R³ gleich oder verschieden sind und jeweils H, C_1-4 Alkyl, C_2-4 Alkenyl, C_2-4 Alkinyl, C_1-4 Alkoxyalkyl, C_1-4 Hydroxyalkyl, C_1-4 Aminoalkyl, C_1-4 Perfluoralkyl, C_1-4 Haloalkyl, Hal, C_1-4 Carboxyalkyl, OR, SR, NRR, (CH₂)_nCONRR, NR(CO)R oder (CH₂)_nCO₂R sind, R⁴ eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist unter Hal, XR⁸, X(C=X)R⁸, OSOR⁸, OSO₂R⁸ OSO₂Hal, SOR⁸ SO₂R⁸, SO₂NR⁸ ₂ NRSO₂R, (C=X)R⁸, (C=X)NR⁸ ₂, (C=X)R⁸, NO₂, CN, PO_nR⁸ ₂ oder XC₆H_4-nY_n, Y gleich oder verschieden ist und R, NO₂, Hal, CONR⁸ ₂, SO₂NR⁸ ₂ oder CO₂R ist, R⁵ R oder R⁴ ist, R gleich oder verschieden ist und H, C_1-4 Alkyl, C_2-4 Alkenyl, C_2-4 Alkinyl, C_1- ₄ Alkoxy, C_1-4 Alkoxyalkyl, C_1-4 Hydroxyalkyl, C_1-4 Aminoalkyl, C_1-4 Perfluoralkyl, C_1-4 Haloalkyl oder C_1-4 Carboxyalkyl ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Azetidinon mindestens einen nachweisbaren Rest enthält oder kovalent daran gebunden aufweist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 11, bei dem der nachweisbare Rest an der R₁-Position angeheftet ist.
Markierter HLE-Inhibitor nach Anspruch 11, bei dem mindestens eine der Gruppen R_1-5 einen Aminsubstituenten trägt.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 13 zur Verwendung in der diagnostischen Bildgebung von Entzündungs- oder Infektionsstellen in vivo.
Verwendung des markierten HLE-Inhibitors nach den Ansprüchen 1 – 13 zum Markieren von Leukozyten in vitro.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 1 – 13 zur Verwendung in der diagnostischen Bildgebung von Thrombi in vivo.
Markierter HLE-Inhibitor nach den Ansprüchen 2 und 5 – 13 zur Verwendung in der Röntgentherapie von Arthritis oder Knocheninfektion oder anderer hyperproliferativer Erkrankung.