HU215937B - Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz, és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására - Google Patents

Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz, és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215937B
HU215937B HU864441A HU444186A HU215937B HU 215937 B HU215937 B HU 215937B HU 864441 A HU864441 A HU 864441A HU 444186 A HU444186 A HU 444186A HU 215937 B HU215937 B HU 215937B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sod
heparin
cell
producing
dna
Prior art date
Application number
HU864441A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46059A (en
Inventor
Thomas Edlund
Stefan Marklund
Original Assignee
Symbicom Aktiebolag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Symbicom Aktiebolag filed Critical Symbicom Aktiebolag
Publication of HUT46059A publication Critical patent/HUT46059A/hu
Publication of HU215937B publication Critical patent/HU215937B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

Extracellűláris szűperőxid-diszműtázt állítanak elő őly módőn, hőgyegy, az említett enzimet (EC–SOD-t) termelő emlős eredetű sejtvőnalattenyésztenek, és kinyerik a sejtek által kiválasztőt EC–SOD-t; vagyegy, az EC–SOD-t kódőló DNS-szekvenciát ültetnek be egy megfelelővektőrba, a rekőmbináns vektőrt beviszik egy gazdasejtbe, a sejtettenyésztik, és kinyerik a termelt EC–SOD-t. Ismert tnek egy, az EC–SODtisztítására szőlgáló eljárást is. Az EC–SOD a szűperőxidgyökökjelenlétével vagy képződésével összefüggő betegségek vagyrendellenességek megelőzésére vagy kezelésére alkalmazható. ŕ

Description

A találmány extracelluláris szuperoxid-diszmutázra, az előállítására szolgáló eljárásra, hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítményekre, és ezek előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik.
Az oxigén és a szervezetben található biokémiai jellegű vegyületek - így a fehéijék, szénhidrátok, lipidek és nukleinsavak - között végbemenő reakciók termodinamikai hajtóereje igen intenzív. Ha ilyen reakciók végbemennek, víz, szén-dioxid és számos melléktermék képződik végtermékként, és nagy mennyiségű energia szabadul fel. A biológiai vegyületek oxidációja az élő szervezetek energiaforrása. Szerencsés módon az ilyen reakciók spontán, nagyon lassan mennek végbe, a reakciót akadályozó gátló mechanizmusok következtében. Ezeket az akadályokat az átmeneti metabolizmusban részt vevő enzimek küszöbölik ki, és az oxigénnel a végső reakció a mitokondriumokban zajlik le, amelyekben az oxigént négy elektron vízzé redukálja, köztitermékek felszabadulása nélkül. A reakciót az elektronátviteli láncban közreműködő citokróm-oxidáz-komplex hajtja végre, és az energiát az ATP képződése köti meg.
Az oxigén közvetlen, négylépéses redukciója amely víz keletkezésével jár — azonban csaknem egyedi jelenség, és ha a reakció spontán, vagy enzimes katalízis mellett megy végbe, olykor, mechanikai okokból az oxigén kénytelen egy lépésben reagálni (az enzimesen katalizált reakciók olykor két lépést igényelnek). Egy sor reakcióképes és toxikus köztitermék keletkezik, nevezetesen a szuperoxidgyök (O2), a hidrogén-peroxid (H2O2) és a hidroxilgyök (OH ), amint ez az A) reakcióvázlatból kitűnik.
Ezek közül kettő - az O2' és az OH - egy páratlan elektronnal rendelkezik; ezeket ezért szabad gyököknek nevezzük. Becslések szerint néhány százalékos oxigénfogyasztás a szervezetben a toxikus redukciós köztitermékek keletkezéséhez vezet. Az oxigén mérgező hatásai főként ezen köztitermékek hatásának tulajdoníthatók.
Maga az oxigén lassan reagál a legtöbb biokémiai vegyülettel. A mérgező reakciókat általában olyan folyamatok vezetik be, amelyek oxigéngyökök keletkezéséhez vezetnek. Ezek önmagukban közvetlenül károsítják a biokémiai jellegű vegyületeket, vagy oxigént magukban foglaló láncreakciókat indítanak be.
Egyes vegyületek spontán reagálnak az oxigénnel (azaz autooxidáción mennek át). Láthatóan minden autooxidáció toxikus oxigénredukciós köztitermékek keletkezését eredményezi. Az adrenalin, a pirogallol és több más vegyület autooxidációja a szuperoxidgyök keletkezéséhez vezet. Ugyancsak szuperoxidgyök szabadul fel, amikor az oxihemoglobinból methemoglobin keletkezik. Ezenkívül egyes oxidázok is szuperoxidokat képeznek. A legfontosabb ilyen enzim a xantinoxidáz, amely a hipoxantint és a xantint húgysavvá oxidálja. A mitokondriumokban végbemenő oxigénredukció kisebb részben szuperoxid, és ezt követően hidrogén-peroxid keletkezéséhez vezet. A mikroszomális citokróm P450 rendszer ugyancsak szuperoxidot szabadít fel. Ha egy oxigént tartalmazó vizes oldaton ionizáló sugárzás halad át, a legmagasabb koncentrációban keletkező gyök a szuperoxidgyök. A fagocitózisban részt vevő leukociták (polimorfonukleárisak, monociták, makrofágok, eozinofilek) aktiválása nyomán nagy mennyiségű szuperoxid szabadul fel. Az így képződött toxikus oxigénredukciós termékek alapvető fontosságúak a sejtek pusztítóképessége szempontjából, de károsíthatják is a környező szöveteket.
Ha szuperoxid képződik, diszmutációs reakcióval mindig keletkezik hidrogén-peroxid is. A szervezetben jelen lévő legtöbb oxidáz az oxigént közvetlenül hidrogén-peroxiddá redukálja.
A leginkább reakcióképes köztitermék a hidroxilgyök. Ez keletkezhet, amikor a hidrogén-peroxid Fe2+ vagy Cu+ ionokkal reagál (ez az úgynevezett Fentonreakció, B) reakcióvázlat).
Ezek az átmeneti fémionok katalizálhatják a hidrogén-peroxid és a szuperoxid között végbemenő reakciót is, amely hidroxilgyök keletkezéséhez vezet (ez az úgynevezett Haber-Weiss-reakció, C) reakcióvázlat).
Az ionizáló sugárzás hatására a víz elbomlik, hidrogénatomok és hidroxilgyökök keletkezése mellett. Az így keletkezett hidroxilgyökök felelősek az ionizáló sugárzás által okozott biológiai kár nagy részéért.
Az előbbi leírásból kitűnik, hogy az oxigén redukciós termékei közül rendszerint több keletkezik egyidejűleg. A xantinoxidáz-rendszerben például nemcsak szuperoxid képződik, hanem hidrogén-peroxid is, közvetlenül és a szuperoxid diszmutációja révén egyaránt. Ezek a vegyületek azután tovább reagálhatnak, a hidroxilgyök keletkezése mellett. Kimutatható, hogy a xantinoxidáz-rendszer károsítja a fehérjéket, szénhidrátokat és a nukleinsavakat, és sejtölő hatású. Az oxigén toxicitására a biokémiai jelentőségű vegyületek közül a többszörösen telítetlen lipidek látszanak legérzékenyebbnek. Az oxigén köztitermékei molekuláris oxigént magukban foglaló láncreakciókat, az úgynevezett lipidperoxidációt indíthatják meg. Az így keletkező lipidhidroperoxidok és bomlástermékeik nemcsak a sejtmembránok működését gátolhatják, de más sejtkomponenseket is károsíthatnak.
Az oxigén jelenlétében élő szervezetek kénytelenek voltak több védőmechanizmust kifejleszteni az oxigén toxikus redukciós termékeivel szemben. A védőtényezők egyikét képezik a szuperoxid-diszmutázok (SÓD), amelyek a szuperoxidgyököt bontják el, és aránylag állandó mennyiségben vannak jelen az emlőssejtekben és -szövetekben.
A legismertebb ilyen enzim a CuZn SÓD; ez egy 33000 molekulatömegű dimer, amely két réz- és két cinkatomot tartalmaz. A CuZn SÓD a citoplazmában (citoszol) és a mitokondriumok membránközti részében fordul elő. Az Mn SÓD 85 000 molekulasúlyú tetramer, amely 4 Μη-atomot tartalmaz, és főként a mitokondrium-mátrixban található. A legutóbbi időkig feltételezték, hogy az extracelluláris folyadékok nem rendelkeznek SOD-aktivitással.
Újabban azonban kimutattuk, hogy extracelluláris folyadékokban (például a vérplazmában, nyirokban, ízületi nedvben és az agygerincvelő folyadékában) szuperoxid-diszmutáz van jelen, amelyet EC-SOD-nak (extracelluláris szuperoxid-diszmutáz) neveztünk el. Az em2
HU 215 937 Β béri plazma 1 ml-ében jelen levő aktivitás kisebb, mint az 1 g szövetben kimutatható összes SOD-aktivitás I %a, de úgy tűnik, hogy ezt az arányt a test aktívan szabályozza [Markiund et al., Clin. Chim. Acta 126, 41-51 (1982)].
A lektinekkel szemben mutatott affinitás alapján (lásd a 12. példát) az állapítható meg, hogy a CuZn SOD-zal szemben ez az enzim glikoprotein jellegű. Becsülhetően 4 azonos, nemkovalensen összekapcsolódó alegységből áll, a tetramer teljes molekulasúlya 135 000, és fémtartalma 1 Cu-atom és 1 Zn-atom alegységenként (lásd a 14. példát). Az enzim, más Cu-tartalmú SOD-okhoz hasonlóan, a szuperoxidgyök elsőrendű reakcióban való elbontását katalizálja: D) reakcióvázlat.
A fajlagos aktivitás nagyon magas, és ezt valószínűleg a molekulában található 4 Cu-atom közvetíti. Heparin-ScpharoseR hordozón végzett kromatográfia során az enzim 3 frakcióra válik szét: az A frakció nulla, a B frakció gyenge és a C frakció erős affinitást mutat a heparin iránt. Eltérően az EC-SOD viselkedésétől, a CuZn SÓD és a Mn SÓD nem kötődik a heparin-Sepharose-hoz.
Az enzim bizonyos mértékű hidrofób tulajdonságokat mutat; ez arra vallhat, hogy affinitással rendelkezik a sejtmembránok iránt. A heparin iránti affinitás gyakran a heparán-szulfát iránti affinitásra utalhat, amely a sejtek felszínén fordul elő, különösen az érendotéliumban. Ezért feltételezhető, hogy az EC-SOD részben a sejt felszínén, részben pedig az extracelluláris folyadékokban fordul elő (lásd a 9-11. példát). Az aminosav-összetétel és az antigénreaktivitás teljesen eltér az eddig vizsgált SOD-izoenzimekétől [Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 7634-7638 (1982); Biochem. J. 220, 269-272 (1984)].
Az EC-SOD-t kódoló mRNS egy szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz (lásd a 8. példát); ez arra mutat, hogy az EC-SOD a szekréció során keletkező fehérje. A CuZn SOD-t kódoló mRNS viszont nem tartalmaz egy ilyen szignálpeptidet kódoló szekvenciát. Továbbá, az EC-SOD aminosavszekvenciája eltér a többi SOD-izoenzimétől. Kimutatták, hogy az EC-SOD jelen van a vizsgált valamennyi emlősfajta [Markiund, J. Clin. Invest. 74, 1398-1403 (1984); Biochem. J. 222, 649-655 (1984)], valamint a madarak és a halak plazmájában. Koncentrációja tág határok között változik a fajták között, de a fajtán belüli különbségek igen alacsonyak. A rágcsálók plazmája 10-20-szor annyi EC-SOD-t tartalmaz mint az emberi plazma, amelynek EC-SOD-tartalma aránylag alacsony. EC-SOD-t találtak valamennyi vizsgált, különböző típusú állati szövetben is [Markiund, J. Clin. Invest. 74, 1398-1403 (1984); Biochem. J. 222, 649-655 (1984)]. A szövetek esetében a fajták közötti különbségek sokkal kisebbek.
Az EC-SOD koncentrációja a szövetekben (egység/gramm, nedves tömeg - az ember esetében - magasabb, mint a plazma EC-SOD-szintje (egység/ml). A rágcsálókban a szövetek és a plazma körülbelül azonos mennyiségű EC-SOD-t tartalmaz [Markiund, Biochem. J., 222, 649-655 (1984)].
A SOD-ok aktivitása érdekes lehetőségeket nyújt ezek gyógyszerként való alkalmazására, a szuperoxid és más oxigéngyökök toxikus hatásainak ellensúlyozására.
Mivel mint az előzőekben említettük, a SÓD aktivitása az extracelluláris folyadékokban alacsony, az extracelluláris folyadékok komponensei és a sejtek felülete sokkal kevésbé védett a szuperoxidgyökök és az oxigén más toxikus redukciós terméke hatása ellen, mint a sejt belseje. Az EC-SOD ezért különösen érdekes anyagnak tekinthető az extracelluláris szuperoxidgyöktermeléssel kapcsolatos gyógyászati alkalmazás alapján.
Előnyös lenne tehát, ha az EC-SOD-t ésszerű mennyiségben tudnánk előállítani terápiás célokra, könnyen hozzáférhető forrásból. Ilyen forrásokról, amelyek elsődlegesen meghatározott sejttípusok lehetnek, a korábbiakban nem történt említés, és ilyeneket nem írtak le.
Ennélfogva a találmány egyik tárgya eljárás rekombináns eredetű EC-SOD előállítására.
A jelen összefüggésben a „rekombináns” jelzővel arra kívánunk utalni, hogy az EC-SOD olyan sejtből származik, amelyet rekombináns DNS-technikáknak vetettünk alá, azaz amelybe bevittünk egy, az EC-SOD-t kódoló DNS-szekvenciát és amelyet a továbbiakban expresszióra, EC-SOD-termelésre indukáltunk.
Közelebbről a találmány egy olyan EC-SOD-ra vonatkozik, amelynek polipeptidszerkezetét az I képletű DNS-szekvencia, vagy ennek valamely változata kódolja, amely változat egy olyan polipeptidet kódol, amely rendelkezik a natív EC-SOD szuperoxid-diszmutáz tulajdonságával.
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a képletben a DNSszekvenciából leszármaztatható aminosavszekvenciát a DNS-szekvencia fölött mutatjuk be. A DNS-szekvencia megfelelő módosítására példákat szolgáltatnak az olyan nukleotidhelyettesítések, amelyek nem eredményeznek más aminosavszekvenciát a fehérjében, de amelyek például azon szervezet specifikus kódhasználatának felelnek meg, amelybe a szekvenciát bevittük; az olyan nukleotidhelyettesítések, amelyek különböző aminosavszekvenciához - és ezért esetleg egy különböző fehérjeszerkezethez - vezetnek, anélkül azonban, hogy károsan befolyásolnák a kritikus tulajdonságot, a szuperoxidgyök elbontását; az előbbiekben bemutatott szekvencia egy alfajának alkalmazása, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely megőrizte a natív fehéije szuperoxid-diszmutáz tulajdonságát, vagy egy olyan DNSszekvencia, amely legalábbis részben az előbbi szekvencia alapján előállított DNS-minta hibridje, feltéve, hogy egy olyan polipeptidet kódol, amely a natív fehérjének a szuperoxidgyök diszmutációját kiváltó biológiai tulajdonságával rendelkezik.
Ilyen vonatkozásban megjegyezzük, hogy a „natív EC-SOD szuperoxid diszmutáló tulajdonsága” kifejezést és a hasonló kifejezéseket inkább kvalitatív, mint kvantitatív értelemben használjuk, azaz inkább a polipeptid minőségére, mint aktivitásának szintjére kívánunk utalni ezzel.
Az EC-SOD-t kódoló DNS-szekvencia, illetve ennek változatai vagy származékai komplementer DNS
HU 215 937 Β (cDNS) eredetűek lehetnek, azaz oly módon állíthatók elő, hogy a szokásos, kialakult gyakorlat szerinti módszerek és vektorok alkalmazásával egy cDNS-szótárt hozunk létre az EC-SOD-t termelő sejtekből származó mRNS alapján.
Ezt követően hibridizációs kísérleteket végezhetünk mintaként szintetikus oligonukleotidok felhasználásával, az EC-SOD-t kódoló cDNS-szekvencia azonosítására.
Egy másik megoldás szerint a DNS-szekvencia genom eredetű lehet, azaz közvetlenül egy sejtgenomból származtatható le. Ennek érdekében például a szokásos módszerekkel (az általános leírás részletesebb leírását lásd a 8. példában) szűrést végzünk egy DNS-mintának megfelelő hibrid genomszekvenciák kiválasztására, amely mintát például a szövetben talált EC-SOD teljes vagy részleges aminosavszekvenciája alapján állítottuk elő.
A genom eredetű DNS például abban különbözik a cDNS-től, hogy transzkripciós kontrollelemeket és úgynevezett intronokat tartalmaz, amelyek nemkódoló szekvenciák a kódoló DNS-szekvencián belül (ezek jelentősége jelenleg nem ismert).
Mind a cDNS, mind a genom DNS lehet állati különösen emlős - eredetű. Terápiás célokra, a nem kívánt káros immunreakciók veszélyének lényegében való elkerülésére, emberek esetében rendszerint előnyben részesítjük azt az EC-SOD-t, amelyet emberi eredetű DNS-szekvencia kódol.
A DNS-szekvencia lehet szintetikus eredetű is, azaz szintézissel állítható elő, ismert standard módszerekkel. Ilyeneket ír le például Matthes et al. [EMBO Journal 3, 801-805 (1984)].
Végül a DNS-szekvencia lehet vegyes szintetikus és genom eredetű, vegyes genom és cDNS eredetű, vagy vegyes cDNS és szintetikus eredetű; ezeket úgy állítjuk elő, hogy a cDNS (tetszőlegesen genom vagy szintetikus eredetű) DNS-fragmentumait - amely fragmentumok az EC-SOD-t kódoló gén részét alkotják - standard eljárások szerint összekapcsoljuk.
Bár a találmány tárgykörében előnyben részesítjük a rekombináns eredetű EC-SOD-t, mivel nagy mennyiségben hozzáférhető, az EC-SOD más forrásokból is hozzáférhető. így a találmány tárgyát képezi a sejtvonal eredetű EC-SOD is. Ez a fehérjét jelentős mennyiségben termelő sejtvonalból származik, amilyenek például a vérből, tüdőből, véredényekből, hasnyálmirigyből, méhből, prosztatamirigyből, placentából vagy köldökzsinórból, vagy esetleg a rákos eredetű szövetekből származó sejtvonalak.
Jelenleg folyik annak vizsgálata, hogy az endoteliális sejtek vagy a fibroblasztok EC-SOD-forrásként alkalmazhatók-e.
Az EC-SOD származhat olyan szövetből is, amelyet EC-SOD-ban aránylag gazdagnak találunk. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi a placentából vagy köldökzsinórból történő EC-SOD-előállítás is, mivel ezek a szövetek úgy alakulnak ki, hogy fígyelemreméltóan nagy mennyiségű EC-SOD-t tartalmaznak más szövettípusokhoz képest, és könnyebben hozzáférhetők, mint például a tüdő-, méh- vagy hasnyálmirigyszövet.
Hangsúlyoznunk kell azonban, hogy bár ezek a szövetek aránylag nagyobb mennyiségben tartalmazzák az EC-SOD-t, ezek a mennyiségek sokkal kisebbek, mint a rekombináns DNS-technikákkal előállíthatok. Ezért a placenta vagy köldökzsinór EC-SOD-forrásként való alkalmazását különleges célokra ajánljuk, amelyek esetében csak kisebb mennyiségű EC-SOD-ra van szükség.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy replikációra képes expressziós vektor előállítása, amely az ECSOD-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. Ilyen vonatkozásban a „replikációra képes” kifejezés azt jelenti, hogy a vektor replikálható egy adott típusú gazdasejtben, amelybe bevittük. A vektorra jellemző lehet, hogy az előbbiekben bemutatott DNS-szekvenciát vagy annak egy megfelelő változatát - a fent kifejtettek szerint - hordozza. Közvetlenül e szekvencia (az EC-SOD-t kódoló szekvencia) fölött megjelölhetünk egy, a szignálpeptidet kódoló szekvenciát, amelynek jelenléte biztosítja a vektort befogadó gazdasejtekben expresszió folytán az EC-SOD kiválasztását. A szignálszekvencia például a II képlet szerinti lehet.
Megjegyezzük, hogy ez a szignálszekvencia (és az általa kódolt szignálpeptid előállítása) önmagában a találmány egyik tárgyát képezi, és elgondolásunk szerint ez a más fehérjéket vagy peptideket kódoló DNS-szekvenciákon túl iktatható be, annak elérésére, hogy a kapott termékeket a sejt kiválassza.
Vektorként bármely, a rekombináns DNS-technikáknak alávethető megfelelő vektor szolgálhat, és a vektor kiválasztása gyakran attól függ, hogy milyen gazdasejtbe kívánjuk azt bevezetni. így a vektor lehet egy autonóm módon replikálódó vektor, azaz egy olyan vektor, amely extrakromoszomális egységként önállóan létezik, és amelynek replikációja független a kromoszóma replikációjától.
Ilyen vektorokra példa a plazmid, fág, kozmid, minikromoszóma vagy a vírus. Egy másik megoldás szerint olyan vektort választhatunk, amely a gazdasejtbe bekerülve integrálódik a gazdasejt genomjába, és replikációja azon kromoszómá(k)éval együtt megy végbe, amely(ek)be integrálódott.
A találmány tárgya továbbá eljárás az EC-SOD-t kiválasztani képes sejtvonal előállítására. Korábban meghatározták [Markiund, J. Clin. Invest. 74, 1398-1403 (1984. október)] számos különböző szöveti sejtből előállított különböző humánsejtvonalak, valamint tumorsejtvonalak EC-SOD-tartalmát, de nem kaptak következtetések levonására alkalmas eredményeket. Bár megemlítik, hogy egyes vizsgált sejtvonalakban kevesebb EC-SOD-t találtak, az említett cikk II. táblázatában bemutatott adatok nem szignifikánsak, és akár egy elemzési hiba rovására is írhatók. Az említett közleményben bemutatott adatok alapján a szakember bizonyosan nem jutna arra a következtetésre, hogy egyes, az EC-SOD-tartalom vonatkozásában megvizsgált sejtvonalak esetleg EC-SOD-t termelhetnek szekréciós fehérjeként, és erre a lehetőségre a cikkben nem is történik utalás.
HU 215 937 Β
A sejtvonal lehet emlős, különösen humán eredetű. Előnyösen olyan sejtvonalat alkalmazunk, amely - más sejtekhez képest - különösen nagy mennyiségben termel EC-SOD-t. így a sejtvonal származhat vérből vagy tüdő-, bőr-, véredény-, hasnyálmirigy-, méh-, prosztatamirigy-, placenta- vagy köldökzsinórszövetből, vagy esetleg daganatsejtből.
Különösen előnyösnek találtuk EC-SOD-forrásként a fibroblasztokból vagy endoteliális sejtekből leszármaztatott sejtvonalakat, mivel ezek az extracelluláris térnek közvetlenül kitett sejtekből származnak, ezért feltételezhető, hogy szükségük van az EC-SOD által biztosított védelemre a szuperoxidgyökökkel szemben, amelyek az extracelluláris térben jelen lehetnek vagy keletkezhetnek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fent leírt replikálható expressziós vektort befogadó sejt. Ez a sejt elvben bármilyen típusú sejt lehet, így például egy prokarióta sejt, amilyenek a baktériumok; egy egysejtű eukarióta szervezet, egy gomba vagy élesztő; vagy egy soksejtű szervezetből, például egy állatból vagy növényből származó sejt.
Azt gondoljuk azonban, hogy egy emlőssejt különösen képes lehet expresszió során EC-SOD termelésére, amely végül is egy nagyon komplex molekula, amelyet az alacsonyabb rendű organizmusok sejtjei esetleg nem képesek előállítani. Egy példa egy ilyen sejtre a CHO-Kl/pPS3neo-18 jelű sejt, amelyet 1986. augusztus 27-én helyeztünk letétbe - ECACC 86082701 számon - az Állati Sejttenyészetek Európai Gyűjteményében.
A találmány tárgyát képezi az EC-SOD-t kódoló DNS-fragmentum is, amelynek DNS-szekvenciáját a III képlet mutatja be. Megjegyezzük, hogy ez a szekvencia magában foglalja az előbbiekben bemutatott, szignálpeptidet kódoló szekvenciát. A szignálszekvencia a (-18) - (-1) aminosavakra terjed ki. A kész EC-SOD-t kódoló szekvencia a +1 aminosavnál kezdődik.
A DNS-szekvencia lehet cDNS, genom vagy szintetikus eredetű, illetőleg az előbbiekben tárgyalt módon vegyes DNS és genom, vegyes cDNS és szintetikus vagy vegyes cDNS, és szintetikus eredetű.
A találmány egyik tárgya tehát eljárás EC-SOD előállítására, amelynek során egy, az EC-SOD-t termelő sejtvonalat olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek biztosítják az EC-SOD kiválasztását. A sejtvonal bármelyik, az előbbiekben említett forrásból származhat. Az EC-SOD-t termelő emlőssejtek azonosítása történhet immunszövettani úton, az EC-SOD-ra specifikus antitestek segítségével, vagy a közegbe kiválasztott EC-SOD vizsgálatával, amely közegben meghatározott sejteket tenyésztünk. A sejtek a sejtvonalak szaporítására alkalmassá tett szokásos táptalajokban tenyészthetők, ismert módon.
Mint az előbbiekben említettük, az EC-SOD affinitást mutat a heparin iránt, ami azt jelzi, hogy affinitása van a sejtfelületeken, különösen az endotéliumsejtek felületén található heparán-szulfát vagy más heparinszerű glukóz-amino-glukán iránt. Ezért úgy gondoljuk, hogy az EC-SOD-nak a sejtfelületekről való leválasztása oly módon indukálható - és ily módon fokozott EC-SOD-termelés biztosítható -, hogy az EC-SOD-t termelő sejtvonalakat olyan táptalajban tenyésztjük, amely heparint vagy egy heparinanalógot - például heparán-szulfátot, egy másik glukóz-amino-glikánszulfátot, dextrán-szulfátot vagy valamely más, erősen negatív töltésű vegyületet tartalmaz ahhoz elégséges mennyiségben, hogy indukálja az EC-SOD-nak a sejtfelületekről való leválását (lásd a 9 -11. példát).
A találmány tárgya továbbá eljárás EC-SOD oly módon való előállítására, hogy egy DNS-fragmentumot - amely az EC-SOD-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz - beviszünk egy vektorba, amely képes replikálódni egy meghatározott gazdasejtben; a kapott rekombináns vektort bevisszük egy gazdasejtbe, amelyet megfelelő táptalajon vagy táptalajban tenyésztünk az EC-SOD expressziója szempontjából alkalmas körülmények között, és az EC-SOD-t kinyerjük.
A sejtek tenyésztéséhez használt táptalaj az e célra alkalmas táptalajok bármelyike lehet, de szükség lehet Cu és/vagy Zn hozzáadására az EC-SOD szintézisének elősegítésére, különösen akkor, ha ezt nagyobb mennyiségben kívánjuk előállítani.
Megfelelő vektor lehet az előbbiekben leírt vektorok bármelyike, és megfelelő gazdasejtnek tekinthető bármelyik, az előbbiekben említett sejttípus. A vektor összeállításához és a gazdasejtbe való beviteléhez bármelyik módszert alkalmazhatjuk, amely erre a célra a rekombináns DNS-technika területén ismertté vált. Az expresszió során a sejtek által termelt EC-SOD - a sejttípustól és a vektor összetételétől függően - esetleg elválasztható, azaz a sejtmembránon keresztül kikerülhet. Ha az EC-SOD-t a rekombináns gazdaszervezet intracellulárisan termeli - azaz a sejt nem választja ki ezt a szokásos eljárásokkal nyerhető ki, amilyen például a sejt mechanikai úton történő roncsolása (például ultrahanggal történő kezelés vagy homogenizálás), vagy enzimes kezeléssel, illetve kémiai úton, amelyet tisztítás követ (a kinyerési eljárásokra vonatkozóan az 1., 4-6. és 17. példára utalunk).
A kiválasztás biztosítására az EC-SOD-t kódoló DNS-szekvenciát meg kell előznie egy, a szignálpeptidet kódoló szekvenciának. Ennek jelenléte eredményezi, hogy az EC-SOD kiválasztódik a sejtekből úgy, hogy az expresszió során termelt EC-SOD-nak legalább egy jelentős hányada kiválasztódik a táptalajba, és abból kinyerhető.
Kísérleti úton megállapítottuk, hogy a kiválasztódott EC-SOD egy hányada a táptalajban, egy része pedig a sejtfelületeken van jelen. Ennélfogva a „táptalajba kiválasztódott” kifejezést úgy értjük, hogy ez magában foglalja az EC-SOD-nak a sejtmembránon át történő bármilyen átvitelét, függetlenül attól, hogy az enzim végül a táptalajban vagy a sejtfelületeken lesz-e megtalálható (lásd a 9 -11. példát).
A táptalajból az EC-SOD a szokásos eljárásokkal nyerhető ki, például a sejtek szűrésével és a kiválasztódott fehérje elkülönítésével, például az 1., 4-6. és 17. példában vázolt módon. Az EC-SOD-nak a sejtfelüle5
HU 215 937 Β tekről való leválása biztosítására - és így nagyobb kitermelés elérésére - előnyös lehet heparinnak vagy valamelyik hasonló hatású anyagnak a táptalajhoz való hozzáadása, amint ezt az előbbiekben vázoltuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás az EC-SOD kinyerésére, amelynek során egy, az EC-SOD-t tartalmazó biológiai anyag kivonatát adszorbeáltatjuk egy mátrixon, amely az EC-SOD elleni, rögzített antitesteket vagy ezek immunológiai determinánsát tartalmazza; az EC-SOD-aktivitást eluáljuk a mátrixról, és az EC-SODaktivitást tartalmazó frakciókat összeöntjük, majd előnyösen további tisztítást végzünk. Az alkalmazott antitestek olyan antitestek lehetnek, amelyeket az EC-SODzal szemben érzékenyítve tenyésztettünk ki, vagy felhasználhatjuk ezek valamelyik immunológiai determinánsát, és az alkalmas mátrixon való rögzítést ismert módon végezhetjük.
A találmány szerint az affinitáskromatográfiához alkalmazott antitestek poliklonálisak vagy monoklonálisak lehetnek. Jelenleg a monoklonális antitestek alkalmazását tüntetjük ki, mivel azt találtuk, hogy a legtöbb monoklonális antitest kevésbé erősen köti meg az antigént, mint a poliklonálisantitest-keverék. Ez azt jelenti, hogy a deszorpció enyhébb körülmények között, gyengébb eluálószerekkel hajtható végre. Ez nagyobb ECSOD-kitermelést eredményezhet, mivel kisebb mértékű denaturálódás következik be, mintha a deszorpcióhoz erős eluálószereket alkalmaznánk.
Továbbá, mivel az IgG teljes mennyisége az ECSOD elleni aktivitású, sokkal kisebb mennyiségű antitest mátrixot kell alkalmaznunk kiindulási anyagként, amikor az EC-SOD-t a biológiai anyagból adszorbeáltatni kívánjuk. Az EC-SOD deszorpciója sokkal kisebb térfogatú eluálószert igényel, így egyszerűbbé válik az eluálási eljárás, amely jelenleg bonyolult, tekintettel arra, hogy a deszorpcióhoz nagy eluenstérfogatokat kell felhasználni.
Valószínű, hogy a monoklonális antitestek EC-SOD iránti fajlagossága magasabb, mint a poliklonális antitesteké. Az antitest mátrixról kinyert eluátum ezért tisztább lesz, ami azt jelenti, hogy egy vagy több további tisztítási lépés elhagyható lesz. Az előállítási eljárás tehát nagymértékben egyszerűsödik, és sokkal magasabb kitermelés érhető el ugyanolyan mennyiségű kiindulási anyagból. Ez fontos gazdaságossági előnyöket von maga után.
Poliklonális antitesteket úgy állíthatunk elő, hogy egy immunizálható állatot EC-SOD-zal, vagy ennek egy immunológiai determinánsával immunizálunk, és ismert módon elkülönítjük az immunglobulinokat tartalmazó antiszérumot. Az immunizálást előnyösen stabilizált, vizes EC-SOD-oldattal végezhetjük. A stabilizálószer lehet egy puffer - például egy foszfátpufferes sóoldat vagy egy adjuváns (egyben az antigenocitás további növelésére is); megfelelő adjuváns a Freund-f. adjuváns vagy az alumínium-hidroxid. Immunizálás céljából kitüntetett állat az egér, nyúl, baromfi, kecske és a juh. Az állatok elvéreztetését és az antiszérum elkülönítését ismert módon végezzük. Az antitestet előnyösen lényegében tiszta alakban alkalmazzuk; ez előnyös abból a szempontból, hogy az EC-SOD szükséges tisztítása valósítható meg ily módon.
Ha a találmány szerinti eljárás keretében monoklonális antitesteket alkalmazunk, ezek a hibridómatechnikával állíthatók elő (amely módszer jól ismert antitestek előállítására). Ha a hibridómatechnika keretében immunizálandó állatként például egeret veszünk, ezeket immunizáljuk a kérdéses antigénnel, és az immunizált egérből vett lépsejteket mielómasejtekkel egyesítjük. A fuzionált hibridómasejteket ez után klónozzuk, az antitestet termelő sejteket megfelelő táptalajban tenyésztjük, és az antitesteket kinyerjük a tenyészetből.
A hibridómatechnikával előállított antitestek azzal az előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, hogy fajlagosságuk nagyobb, ennélfogva tisztítóhatásuk magasabb, mint erre az előzőkben utaltunk.
Egy esetleges további lépésben, rekombináns DNStechnikák alkalmazásával, az antitestet kódoló DNSszekvenciát a hibridómasejtklónról egy megfelelő vektorra visszük át; a hibrid vektort megfelelő baktérium gazdasejtbe visszük át, a gazdasejtet megfelelő táptalajban tenyésztjük, és a kapott antitesteket kinyerjük a tenyészetből. Ily módon magasabb antitestkítermelés érhető el. A gazdaszervezet egyike lehet azoknak, amelyeket rendszerint alkalmaznak a rekombináns DNS-technológia területén (ilyen például az E. coli vagy a B. subtilis).
Egy másik, a monoklonális antitestek előállítására irányuló eljárás szerint a hibridómasejteket egér hasüregébe ültethetjük be és tenyészthetjük, és a termelt antiEC-SOD antitesteket a képződött aszcitesz folyadékból ismert módon nyerjük ki. A monoklonális antitestek előállítására történő immunizálás ezenkívül in vitro is végrehajtható, például egérből vett immunkompetens sejtek alkalmazásával. Ebben az esetben nem szükséges antigént injektálni a kérdéses állatba - például egy egérbe -, bár jelenleg az a legáltalánosabban alkalmazott eljárás. Megjegyezzük, hogy a monoklonális antitestek előállítására irányuló eljárás a találmány egyik tárgya.
A biológiai anyag, amelyből az EC-SOD-t tartalmazó kivonatot előállítjuk, például emlősszövet lehet. Alkalmazhatunk szarvasmarha-, sertés- vagy lószövetet, mivel - az összehasonlítás céljából végzett kísérletekben - azt találtuk, hogy a szarvasmarha CuZn SÓD aránylag kismértékű immunológiai aktivitást mutat emberben, és az allergiás reakciók nem jelentettek komoly problémát.
Ennek alapján tehát az a következtetés vonható le, hogy ugyanez vonatkozik a szarvasmarha, ló vagy sertés EC-SOD-ra is. Mégis kitüntetetten emberi szövetet használunk fel, az esetleges nem kívánt immunológiai reakciók elkerülésére. Az erre a célra jelenleg kitüntetett emberi szövet — aránylag magas EC-SOD-tartalma miatt - az emberi tüdőszövet, valamint a hasnyálmirigy-, méh-, prosztatamirigy-, köldökzsinór- vagy placentaszövet, különösen a két utóbbi szövettípus, mivel ezek egyben könnyebben hozzáférhetők.
A kivonat a szokásos módon állítható elő, megfelelő pufferrel, például foszfátpufferrel. Előnyösnek találtuk egy kaotrop só - például KBr, ammónium-szulfát vagy
HU 215 937 Β kálium-tiocianát - hozzáadását a pufferhez, annak érdekében, hogy növeljük az extrakció során elérhető ECSOD-kitermelést.
Mivel azonban az EC-SOD nem képződik nagy mennyiségben egyik ilyen szövetben sem - úgy, hogy igen nagy mennyiségű szövetre van szükség megfelelő mennyiségű EC-SOD gyógyászati célokra való előállításához -, előnyösebb lehet az EC-SOD állati - előnyösen emlős, emberi - sejtvonalból való előállítása, amely EC-SOD-t termel. Az EC-SOD-aktivitást tartalmazó biológiai anyag tehát egy olyan anyag is lehet, amelyet egy EC-SOD-t termelő sejtvonal tenyésztésével állítottunk elő, az előbbiekben leírtak szerint. Különösen nagy mennyiségű EC-SOD előállítására a találmány szerinti eljárással előállítandó EC-SOD-t előnyösen rekombináns DNS-technikával termeljük, az előzőkben leírtak szerint.
A legtöbb esetben, különösen akkor, ha az EC-SOD tisztítására rögzített poliklonális antitesteket alkalmazunk, az összeöntött eluátumot - amelyet az antitest mátrixról nyertünk ki - egy másik mátrixra, például egy ioncserélő mátrixra vihetjük fel, majd erről a mátrixról eluáljuk az EC-SOD-aktivitást, és összeöntjük az EC-SOD-aktivitást tartalmazó frakciókat. Az összeöntött eluátum további tisztítása úgy érhető el, hogy azt felvisszük egy kromatográfiás oszlopra, amely mátrixként heparint vagy egy heparinanalógot, például heparán-szulfátot vagy egy másik glukóz-amino-glikánszulfátot, dextrán-szulfátot vagy valamely más, erősen negatív töltésű vegyületet tartalmaz, és elúciót hajtunk végre, amelyet követően összeöntjük a kérdéses anyaghoz affinitást mutató frakciókat.
A találmány szerinti EC-SOD a szuperoxidgyökök és más toxikus, a szuperoxidgyökből levezethető oxigéntartalmú köztitermékek jelenlétével vagy képződésével összefüggő betegségek vagy rendellenességek diagnosztizálására, megelőzésére vagy kezelésére alkalmazható.
Példák az ilyen betegségekre vagy rendellenességekre a következők:
reperfüzió által követett ischemiás állapotok - például infarktus, így szív-, vese-, agy- vagy bélinfarktus -, gyulladásos betegségek - például a reumás ízületi gyulladás -, hasnyálmirigy-gyulladás - különösen az akut hasnyálmirigy-gyulladás -, pielonefritisz és más típusú vesegyulladások, hepatitisz, autoimmun betegségek, inzulinfüggő cukorbetegség (diabetes mellitus), éren belüli multiplex koaguláció, zsirembólia, felnőtt- illetve gyermekkori légzési zavarok, újszülöttek agyvérzése, égések, az ionizáló sugárzás káros hatásai és a karcinogenezis.
így az EC-SOD indikációs területe lényegében azonos a CuZn SOD-éval, amelynek terápiás aktivitását alaposan vizsgálták, mint erre a következőkben rámutatunk.
Azt találtuk azonban, hogy az EC-SOD számos olyan tulajdonsággal rendelkezik, amely ezt feltehetően különösen alkalmassá teszi a terápiás célokra való alkalmazásra. A CuZn SÓD molekulatömege alacsony (33000), ami arra vezet, hogy nagyon gyorsan kiürül a szervezetből a vesékben végbemenő glomerulusszűrés következtében. így emberek esetében az enzim felezési ideje csak körülbelül 20-30 perc. EC-SOD-zal végzett elókísérletek meglepő módon sokkal hosszabb EC-SOD felezési időt mutattak, nyulakban (lásd a 10. példát).
Jelenleg azt tételezzük fel, hogy ez részben az ECSOD magas molekulatömegének - 135 000 - tulajdonítható, amely megakadályozza a glomerulusokban szűrés útján történő eltávolítását, és részben azzal a ténnyel függ össze, hogy az EC-SOD láthatóan az endotélsejtek felületéhez kötődik, amint erre a következőkben rámutatunk. Az EC-SOD-nak a találmány szerinti terápiás felhasználása során ezért az enzim felezési ideje emberben legalább 4 óra, esetleg még hosszabb.
Mint az előbbiekben kifejtettük, az EC-SOD természetes környezetében kiválasztás útján képződő fehérje, és ezért valószínű, hogy specifikusan egy, a sejten kívüli térben (a sejten kívüli nedvekben vagy a sejtek felületén) betöltendő funkcióra szintetizálódik. Ez válthatja ki, hogy az EC-SOD olyan tulajdonságokat mutat, amelyek különösen alkalmasak arra, hogy a plazma komponenseit vagy a sejtek felületének külső részét megvédjék a szuperoxidgyökök vagy más oxigéntartalmú gyökök toxikus hatásától.
Ezt a feltevést támasztja alá az a tapasztalat, hogy az EC-SOD enyhén hidrofób jellegű. Ez hajlamossá teheti arra, hogy a sejtek külső felületéhez kötődjék, és ez tehető felelőssé azért, hogy affinitást mutat heparin iránt. Ez a heparán-szulfát iránti affinitást jelez, amely a sejtek külső felületén található meg. Mindkét említett tulajdonság különösen jó szövetvédő képességre mutat (lásd a 9-11. példát) amelyekben a vizsgálati eredmények azt látszanak igazolni, hogy az EC-SOD a véredény-endotéliumhoz kötődik.
Az EC-SOD és a sejtmembrán nyilvánvaló kapcsolatának jelentőségét támasztja alá továbbá az a megfigyelés, hogy az a CuZn SÓD, amelyet polilizinnel módosítottak a sejtmembránhoz való kötődés érdekében, nagyobb mértékben képes arra, hogy az aktivált (szuperoxidgyököket termelő) polimorfonukleáris leukocitákat (PMN) megvédje az autoinaktiválódástól (a sejt pusztulásától), mint a normál CuZn SÓD, amely negatív töltésű, és ezért tendenciát mutat arra, hogy a sejtmembránról leváljon [M. Salin, J. M. McCord: Szabad gyökök a leukociták anyagcseréjében és a gyulladásokban. Superoxide and Superoxide Dismutases. Kiadó: A. M. Michelson, J. M. McCord, L Fridovich, Acedemic Press 257-270 (1977)].
A Nocardia asteroides rendelkezik egy, a membránhoz tartozó SOD-zal, amely láthatóan hatékony védelmet nyújt aktivált emberi PMN-ekkel szemben; a Nocardia PMN-ekkel szembeni érzékenysége ugyanis jelentősen megnő, ha Nocardia sejteket ezen SOD-zal szembeni antitestekkel kezelünk [B. L. Beaman et al., Infection and Immunity 47, 135-141 (1985)]. Ez a tény ugyancsak a sejtfelülethez kötött SÓD membránvédő funkciójára utal.
Az EC-SOD-tól eltérően a CuZn SÓD egy sejten belüli funkcióval rendelkezik, amely kevésbé alkalmassá teheti ezt a sejten kívüli alkalmazásra (amelyet pél7
HU 215 937 Β dául a szuperoxidgyökök sejten kívüli jelenléte tenne indokolttá). Továbbá az EC-SOD-hoz viszonyított rövid felezési ideje - amelyről az előbbiekben tettünk említést - szükségessé tenné, hogy rövidebb időtartamonként nagyobb dózisokat vigyünk be. Valószínűleg ez a helyzet az EC-SOD esetében.
A SÓD aktivitását - a lehetséges terápiás alkalmazás szempontjából - a következő betegségek vagy rendellenességek esetében igazoltuk.
A parenterálisan bevitt CuZn SOD-ról kimutatták, hogy gyulladásgátló hatást fejt ki több állatmodellben, amelyekben gyulladást idéztünk elő, illetőleg állatok gyulladásos betegségeiben [Huber és Saifer, Superoxide and Superoxide Dismutases, Michelson et al. kiadás, Academic Press 517-549 (1977)].
Emberben a CuZn SÓD pozitív hatását reumás ízületi gyulladás és artrózis, a hólyag gyulladásos megbetegedései és más urológiai betegségek esetében írják le [Menander-Huber, Biological and Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, Bannister et al. kiadás, Elsevier/North Holland 408-423 (1980)], valamint ismert, hogy hatásos az ionizáló sugárzással való kezelés negatív következményei ellen [Edsmyr et al., Current Therapy. Rés. 10, 198-211 (1976); Cividalli et al., Acta Rádiói. Oncol. 24, 273-277 (1985)] (patkányban).
Egyes országokban a szarvasmarha CuZn SOD-t gyógyszerként törzskönyvezték (Orgotein, Peroximorm), és főleg az artritisz és az artrózis kezelésére alkalmazzák, amikor is a készítményt az ízületbe adják be [Goebel és Storck, Am. J. Med. 74, 124-128 (1983)].
A parenterálisan beadott CuZn SOD-t a sejtek nem veszik fel; aktivitását a sejten kívüli térben kell kifejtenie. A liposzómákba beágyazott CuZn SOD-t a sejtek felveszik. Erről a készítményről leírják, hogy hatásos a Crohn-kór, Bechet-kór, a herpeszszerű bőrgyulladás, a fekélyes kolitisz, a Kawasaki-kór és a sugárterápia káros hatásai ellen [Y. Niwa et al., Free Rád. Rés. Comms. 1, 137-153 (1985)].
A CuZn SÓD gyulladásgátló hatásának mechanizmusa nem teljesen tisztázott. Feltételezték, hogy közvetlen védelmet nyújt aktivált leukociták által termelt oxigéngyökökkel szemben [Halliwell, Cell Bioi. Int. Rep. 6, 529-541 (1982)]. Egy másik lehetőség egy, a szuperoxidgyök általi indukcióval képződött erősen kemotoxikus anyag keletkezésének megelőzése [Petrone et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77, 1159-1163 (1980)].
A SÓD másik nagy lehetséges alkalmazási területe a védőfaktorként való felhasználás ischaemia, majd reperfüzió által kiváltott szöveti károsodás esetében. Ha egy szövet vérellátása megszűnik, a szövet lassanként nekrotizálódik. A károsodás makro- és mikroszkóposán jellegzetes esetben lassan, néhány óra alatt fejlődik ki. Ha a szövetet például 1 óra elteltévei reperíundáljuk, javulás helyett a szöveti károsodás erős gyorsulása következik be. Nagyon valószínű, hogy több oka van ennek az úgynevezett reperfuziós paradoxonnak, de az oxigéngyökök - amelyek annak eredményeként képződnek, hogy ismét oxigén jelenik meg az előzőleg ischemiás szövetben - láthatóan hozzájárulnak a károsodáshoz.
Mivel a gyökök rendkívül rövid élettartamúak, közvetlen vizsgálatuk bonyolult, képződésükre és hatásaikra a különböző, ezeket megkötő („söprögető” hatású) anyagok által biztosított védőhatás alapján lehet következtetni. A (védőanyag által kifejtett) szövetvédelmet kimutatták ischaemia- vagy anoxia-reperfüziós modellekben a vesében [SÓD: G. L. Baker et al., Am. Surg. 202, 628-641 (1985); I. Koyama et al., Transplantation 40, 590-595 (1985)]; SÓD, kataláz: E. Hansson et al., Clin. Sci. 65, 605-610 (1983); allopurinol: G. L. Baker et al., op. cit.; I. Koyama et al., op. cit.; a bélben [SÓD: D. A. Parks et al., Gastroenterology 82, 9-15 (1982); Μ. H. Schoenberg et al., Acta Cím. Scand. 150, 301-309 (1984); M. C. Dalsing et al., J. Surg. Rés. 34, 589-595 (1983); allopurinol: D. A. Parks et al., op. cit.], a hasnyálmirigyben [SÓD, SOD+kataláz, kataláz és allopurinol: H. Sanfey et al., Ann. Surg. 200, 405-413 (1983)], a májban [SÓD és kataláz: R. S. Stuart et al., Transplant. Proc. 17, 1454-1456 (1985)], vázizomzatban [SÓD, kataláz és allopurinol: R. V. Korthuis, Circ. Rés. 57, 599-609 (1985)], bőrben [SÓD és allopurinol: M. J. lm et al., Ann. Surg. 201, 357-359 (1985)] és agyban [SÓD és allopurinol: J. S. Beckman et al., Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine, G. Rotilio kiadás, Elsevier, 602-607(1986)].
A szívfunkciók megőrzését írják le izolált, perfundált készítményekben, amelyeket nyúlból [kataláz, allopurinol; a SÓD hatástalan: C. L. Myers et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 91, 281-289 (1986)], macskából [SOD+kataláz: M. Schleferet al., Circulation 66, Suppl. I., 185-192 (1982)] és patkányból [glutation, kataláz, SÓD: Gaudel et al., J. Mól. Cell Cardiol. 16, 459-470 (1984)] állítottak elő.
In vivő helyi ischaemia-reperfüziós modellekben az infarktus mértékének csökkenését írják le kutyában [SÓD: T. J. Gardner et al., Surgery 94, 423-427 (1983);
D. E. Chambers et al., J. Mól. Cell Cardiol. 17, 145-152 (1985); S. W. Wems et al., Circ. Rés. 56, 895-898 (1985); allopurinol: D. E. Chambers et al., op. cit.; T. J. Gardner et al., op. cit.; a kataláz hatástalan: S.
E. Wems et al., op. cit.].
SOD+kataláz injektálásáról ugyancsak leírják, hogy fenntartja a mechanikus szívműködést rövid (15 perces) helyi ischemiában, kutyában [M. L. Myers et al., Circulation 72, 915 -921 (1985); K. Przyklenk és R. A. Kloner, Circ. Rés. 58, 148-156 (1986)]. Továbbá leírják, hogy a SÓD csökkenti az ischaemia és reperfüzió által együttesen indukált aritmiák bekövetkezésének valószínűségét. [B. Woodward et al., J. Mól. Cell. Cardiol. 17, 485-493 (1985); M. Bemier et al., Circ. Rés. 58, 331-340(1986)].
Az oxigéngyökök eredete ebben a helyzetben nem egészen egyértelmű, de az allopurinol hatása arra látszik mutatni, hogy a jelenséget részben a xantinoxidáz váltja ki, amely az ischaemia hatására képződik, a xantin-dehidrogenáz-alak átalakulásával a gyöktermelő oxidáz-alakká (Parks et al., op. cit.). Az ischaemia által indukált purin
HU 215 937 Β nukleotid bomlás következtében nagy mennyiségű hipoxantin keletkezik, amely a xantinoxidáz szubsztrátuma.
Más szuperoxidgyök-forrást jelentenek a következők: az ischaemia által károsított szövethez vándorló aktivált leukociták, a prosztaglandinszintézis [az O2 · egyik melléktermék: Köntös, Circ. Rés. 57, 508-516 (1985)] és különböző vegyületek autooxidációja, amelyek az ischaemia folyamán redukált alakban szaporodnak fel.
A reperfüzió által követett ischemiára vonatkozó megfigyelések nagy jelentőségűek lehetnek a klinikai alkalmazás szempontjából. Esetleg kiváló hatást érhetünk el úgy, hogy a szívinfarktussal összefüggő szövetet reperfundáltatjuk, és egyidejűleg egy SOD-t és/vagy más, oxigéngyökök ellen védő faktorokat és trombolitikus faktorokat, például szövet plazminogén aktivátort adagolunk.
A SOD-zal végzett kísérletek eredményei lehetséges alkalmazhatóságra mutatnak a szívsebészet és a szívátültetés területén is. Hasonló módon azoknak a kísérleteknek az eredményeit, amelyek során SOD-t alkalmaztunk reperfüzió által követett májischaemia esetében, alkalmazhatjuk a veseátültetéssel és más szervátültetésekkel kapcsolatban, amilyen a bőr-, tüdő-, máj- vagy hasnyálmirigy-átültetés. Egy másik lehetséges indikációs terület az ischemiával összefüggő agyi betegségeké.
A SOD-ok érdekes védőhatásokat mutatnak más patológiás körülmények között is.
így például kutyában hasnyálmirigy-gyulladást indukáltak három különböző módon: olajsav infúzióval, a kiválasztóvezetékek részleges elzárásával, és reperfüzió által követett ischemiával. Azt találták, hogy a SÓD, a kataláz, és a SOD+kataláz kombináció védő hatást fejt ki, mi mellett általában a kombinációs kezelés a leginkább hatékony. Az ischaemiamodellben azonban a SÓD önmagában csaknem olyan hatékony volt, mint a SOD+kataláz kombináció [Sanfey et al., Alin. Surg. 200, 405-413 (1984)].
A SOD+kataláz kombinációról leírják, hogy hatásos a cerulein által patkányokban indukált hasnyálmirigy-gyulladás esetében [K. S. Guice et al., Am. J. of Surg. 151, 163—169 (1986)]. Az eredmények arra mutatnak, hogy aktív terápia folytatható ezen betegséggel szemben, amellyel kapcsolatban jelenleg nincs specifikus terápia.
Ugyancsak feltételezik, hogy a SOD-zal végzett kezelés hatékony égések esetében. A helyi ödéma, amelyet kísérletesen idéztünk elő enyhe égetéssel patkányban, bizonyos mértékben csökkenthető volt SÓD injektálásával [Björk és Artursson, Bums 9, 249-256 (1983)}.
Állati modellben - amely egy egér súlyos égési károsodásán alapult - drámai javulást értek el SÓD segítségével, ami a túlélést és a helyi károsodást illeti [Saez et al., Circulatory Schock 12, 220-239 (1984)].
Például az égések, immunkomplex-képződés és súlyosabb szöveti károsodás esetében neurofil leukociták halmozódnak fel a tüdőben. A felhalmozódást gyakran láthatóan a komplementaktiválódás (C5 a) közvetíti. A leukociták láthatóan aktiválódnak és oxigéngyököket bocsátanak ki, ezáltal a tüdő károsodásához vezetnek, amelyet például az jellemez, hogy megnő az érpermeabilitás és tüdőödéma alakul ki (felnőtt légzőszervi megbetegedés). Több állatmodellben kimutatták, hogy a SÓD és más oxigéngyök-elfogók védőhatást fejtenek ki a tüdő károsodása ellen [Till és Ward, Agents and Actions, Suppl. 12, 383-396 (1983)].
Parenterálisan bevitt CuZn SOD-ról leírják, hogy az megelőzi a tüdő-légúti fejlődési rendellenességek kialakulását éretlen újszülöttekben, akik csecsemőkori légúti károsodásban szenvednek. [W. Rosenfeld et al., J. Pediatr. 105, 781-785 (1984)].
Beagle (angol vadászkutya) kölyök modellben azt figyelték meg, hogy SOD-injekció csökkenti a magas vérnyomást követően fellépő intraventrikuláris agyvérzés gyakoriságát [L. R. Ment et al., J. Neurosurg. 62, J63-J69 (1985)] (1985).
A SÓD előnyösen befolyásolja a hepatitiszt - amelyet Corynebacterium parvum injektálásával idéztek elő - patkányban [M. J. P. Arthur et al., Gastroenterology 89, 1114-1122 (1985)].
Az endotéliumból kinyerhető érrelaxáns faktor nagyon érzékeny szuperoxidra, és SÓD injektálása fokozza a relaxáns hatást [R. J. Gryglewski et al., Natúré 320, 454-456 (1986); G. M. Rubányi et al., Am. J. Physiol. 250, H822-H827 (1986)]. Szuperoxidgyök-képződés különböző körülmények között következhet be a szervezetben és érösszehúzódást, valamint csökkent szövetperfüziót válthat ki. Feltételezhető, hogy SÓD bevitele képes az ilyen érösszehúzódás megszüntetésére.
Az akut intenzív vérnyomás-emelkedés funkcionális és morfológiai rendellenességekhez vezet az agyi kisartériákban. Feltehető, hogy a prosztaglandin szintézisét gátló vegyületek és a szuperoxid-diszmutáz véd ezen rendellenességek ellen. Szuperoxid felszabadulása figyelhető meg [H. A. Köntös, Circ. Rés. 57, 508-516(1985)].
A modell közelebbi vizsgálata arra a következtetésre vezet, hogy a szuperoxidgyökök melléktermékként keletkeznek a prosztaglandinszintézis során. Az eredmény arra mutat, hogy a prosztaglandinszintézis közben felszabaduló szuperoxidgyökök által okozott szövetkárosodás más patológiás körülmények között is előfordulhat, és a SÓD védőhatást fejthet ki.
Ha CuZn SOD+kataláz van jelen a táptalajban, ez állítólag meghosszabbítja a perfundált, izolált nyúlszaruhártya élettartamát [Ο. N. Lux et al., Curr. Eye Rés. 4, 153-154 (1985)]. A CuZn+kataláz megvédi az izolált lencséket a fotooxidációtól [S. D. Varma et al., Ophthalmic Rés. 14, 167-175 (1982)]. Az eredmények arra mutatnak, hogy a SÓD előnyös hatást fejthet ki a szaruhártya-átültetésekben és más szemsebészeti eljárásokban.
Parenterálisan bevitt SÓD előnyös hatását írják le olyan akut viszonyokkal jellemezhető állatkísérletekben, mint amilyen a multiplex intravaszkuláris koaguláció [T. Yoshikawa et al., Thromb. Haemostas. 50, 869-872 (1983)], és a vérmérgezés [H. F. Welter et al., Chirurgisches Fórum ‘85 f. experim. u. klinischer Forschung, Springer-Verlag, Berlin, (1985)].
Különböző típusú autoimmun betegségek - például a szisztémás lupus erythematosus (SLE), a szisztémás
HU 215 937 Β szklerózis és a reumás ízületi gyulladás - esetében kimutatták, hogy nagyobb a kromoszómahasadások frekvenciája a limfocitákban [Emerit, Properties and action mechanísms ofclastogenic factors. Lymphokines, Vol. 8., kiadó E. Pick, Academic Press, 413-424 (1983)]. Fibroblaszt tenyészetek és közvetlen csontvelőkészítmények olykor ugyancsak megnövekedett mértékű töredezést mutatnak. Az ilyen betegek plazmája egy, a kromoszóma töredezését előidéző (klasztogén) tényezőt tartalmaz.
Egyes esetekben hasonló faktort mutatnak ki az ízületi nedvben és az agygerincvelő folyadékában (szklerózis multiplex). A töredezés előfordul normál limfocitákban is, amelyeket autoimmun betegségben szenvedőkből vett limfocitákkal együtt tenyésztenek.
Az ilyen betegektől származó limfociták a táptalajokat oly módon alakítják át, hogy kromoszómatörések következzenek be. Az SLE-plazma klasztogén aktivitása UV-besugárzással növelhető. Ha a plazmában xantinoxidáz és xantin bevitelével szuperoxid képződését idézzük elő, ez a klasztogén aktivitás növekedéséhez vezet. Valamennyi, az előbbiekben leírt modellben CuZn SOD-nak a közeghez való hozzáadása véd a klasztogén aktivitás ellen [Emerit, ugyanott]. Ez arra mutat, hogy a szuperoxidgyökök szerepet játszanak mind a klasztogén faktor képződésében, mind annak hatásában [Emerit, ugyanott].
Egy SLE állatmodellben, új-zélandi fekete egérben - amely rendelkezik klasztogén faktorral - a kromoszómákat csöntszövetsejtekben oly módon védjük meg, hogy ismételten SOD-t injektálunk [Emerit et al., Cytogenet. Cell Génét. 30, 65-69 (1982)]. Még nem tisztázott azonban, hogy a klasztogén faktor milyen mértékben járul hozzá a humán autoimmun betegségekben létrejött fontosabb szimptómákhoz, és hogy a SÓD bevitelének van-e valamilyen terápiás hatása.
A sejtek buijánzásos átalakulása rendszerint két fázisra osztható fel, ezek: az iniciálás, amelyet az előrehaladás követ. In vitro modellekben, amelyekben az iniciálást ionizáló sugárzással, bleomicinnel, mizonidazollal és más nitro-imidazolokkal végeztük, az onkogén átalakulást hatékonyan gátolta a SOD-nak a közegben való jelenléte.
Nem szükséges, hogy a SÓD az iniciálóanyagok hatásának való kitétel során jelen legyen; ez láthatóan arra mutat, hogy az enzim az ezt követő promóciós lépést gátolja [Miller et al., Int. J. Radiat. Oncol. Bioi. Phys. 8, 771-775 (1982); Borek és Troli, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 1304-1307 (1983)].
A xantin és a xantinoxidáz együttes jelenléte nemtoxikus dózisban promóciót okoz növekvő sejtekben. SÓD vagy SOD+kataláz hozzáadása gátolja ezt a hatást [Zimmerman és Cerutti, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 2085-2087(1984)].
Ismeretes, hogy a forbol-észterek promoterek. Egy olyan modellben, amelyben bőrtumort indukáltunk benzantracénnel, majd egy forbolésztert (TPA) vittünk be, a helyi kezelés, egy SOD-aktivitással rendelkező lipofil rézkomplexszel, erősen csökkentette a tumorképződést [Kenzler et al., Science 221, 75-77 (1983)]. Az eredmény arra mutat, hogy legalábbis bizonyos esetekben a szuperoxidgyökök hozzájárulnak a tumorképződés előrehaladásához, és hogy a SÓD védelmet nyújthat ezen hatással szemben.
Okkal tételezhető fel, hogy az oxigéngyökök elősegítik számos mérgező anyag hatásának érvényesülését, amilyen például a bleomicin, adriamicin, alloxán, 6hidroxi-dopamin, paraquat, dihidroxi-fumársav, nitrofürantoin és streptozotocin. Azokban az esetekben, amikor a gyökképződés az extracelluláris térben megy végbe, védelem érhető el a védőenzim injektálásával. így a SÓD védelmet nyújthat az alloxán diabetogén aktivitása ellen (a beta-sejtek károsodása a hasnyálmirigyben) in vitro [Grankvist et al., Biochem. J. 182, 17-25 (1979)] és in vivő [Grankvist et al., Natúré 234, 158-160(1981)].
Az alloxán károsítóhatása ezért láthatóan a szuperoxidgyökökkel függ össze, vagy más, ebből származó oxigéngyökökével. A beta-sejtek alloxán iránti nagy érzékenységének oka nem egyértelmű, és meggondolandó, hogy van-e egyáltalán összefüggés az alloxánérzékenység és az inzulinfüggő diabetes mellitus között. A diabetes mellitusban a Langerhans-szigetekben gyulladásos sejtek beszűrődése figyelhető meg, amelyek potenciálisan oxigéngyököket képezhetnek. Ezért előirányozható a beta-sejtek SOD-injekciókkal való védelme a diabetes mellitus első jelentkezésénél.
A táptalajhoz adott SÓD védelmet nyújt a légcső sejtjeinek az azbeszttel szemben [Mossman és Landesman, Chest 835, 50s-51s (1983)].
A parenterálisan bevitt CuZn SÓD védelmet nyújt a vesében a kísérletesen indukált pielonefritisz ellen [Roberts et al., J. Urol. 128, 1394-1400 (1982)].
A SÓD és különösen a kataláz véd az akut nefrotoxikus nefritisz ellen, amelyet patkányban antiglomeruláris alapmembrán antitestekkel indukáltak [A. Rahan et al., Láb. Invest. 57, 396-403 (1984)].
Általában a CuZn SOD-t kísérleti anyagként alkalmazzák az előbbiekben leírt kísérletekben. Feltételezhető azonban, hogy az EC-SOD ugyanezen célokra alkalmazható és - mint erre az előbbiekben rámutattunk nagyobb hatékonysággal, azon különleges tulajdonságai következtében, amelyek az EC-SOD-t különösen alkalmassá teszik az extracelluláris alkalmazásra.
A találmány további tárgya ennek megfelelően gyógyszerkészítmény, amely az EC-SOD-t egy gyógyászati szempontból elfogadható adalékanyaggal, hígítóval vagy hordozóval együtt tartalmazza, valamint eljárás ennek előállítására. A készítménybe bevitt EC-SOD bármely, az előbbiekben említett forrásból származhat, azaz lehet rekombináns, sejtvonal vagy szöveti eredetű.
Annak a meghatározását, hogy mekkora a megfelelő, azaz terápiásán aktív dózis a szisztémás kezeléshez, annak alapján végezzük, hogy mekkora az EC-SOD koncentrációja az emberi testben. Az EC-SOD a humán plazma fő SOD-komponense és az összaktivitás (amely az A, B és C frakcióból tevődik össze, lásd a 2. példát) körülbelül 20 E/ml. 200NE/testtömeg heparin injekcióval történő bevitele az EC-SOD C frakciója mennyiségének körülbelül 23 E/ml-rel való növekedéséhez vezet (lásd a 9. példát).
HU 215 937 Β
Bár ez a heparindózis nagyon magas, az enzim maximális felszabadulását valószínűleg nem értük el ezzel, lásd a 9. példát. Feltételezve, hogy körülbelül kétszer ennyi EC-SOD C frakció szabadulna fel az érendotéliumból, az erek összes EC-SOD-tartalma körülbelül 66 E/ml plazmaértéknek (20+2x23 E/ml) felelne meg.
A teljes plazmatérfogat a testsúlynak körülbelül 4,7%-a, azaz körülbelül 3,3 liter egy 70 kg tömegű emberben. Egy egységnyi EC-SOD körülbelül 8,8 mg-nak felel meg. Az EC-SOD összmennyisége a véredényekben (plazma+érendotélium) ezért 3300χ66χ8,8χ 10 9 g=l,92 mg. Tízszeres növelés 19 mg EC-SOD C-t igényelne, 300-szoros növekedés pedig 575 mg EC-SOD C-t.
A megfelelő EC-SOD-dózis tehát a körülbelül 15-600 mg/nap tartományba eshet, egyebek között annak a betegségnek a természetétől és súlyosságától függően, amelyre az EC-SOD bevitele ajánlott.
Például 87 mg EC-SOD injekcióval való bevitele például (50-szeres növekedés) 26 pg/ml plazmakoncentrációhoz vezetne (eltekintve az endotéliumon való kötődéstől). Ez, vagy még alacsonyabb koncentrációk erős védőhatást mutatnak in vitro kísérletekben (CuZn SOD-zal) [lásd a következőket: A. Berat, I. Emerit, Mutation Rés. 121, 293-297 (1983); K. Grankvist, S. Markiund et al., Biochem. J. 182, 17-25 (1979)].
Az EC-SOD-injekciók adagolása és időzítése függ az enzim emberi véredényben jellemző felezési idejétől, amely még nem ismert. Nyulakban a humán EC-SOD felezési ideje körülbelül 18 óra (lásd a 10. példát). Emberben a felezési idő valószínűleg hosszabb. Elsőrendű kinetikát és 36 órás felezési időt tételezve fel ezért, 87 mg kezdő injekcióval való beadagolása után napi 35 mg injekcióval való bevitele ugyanolyan koncentrációt eredményezne, mint az eredeti injekció után.
A 9. példa arra mutat, hogy az EC-SOD C a sejt felületéről heparinnal a plazmába vihető át. A parenterális heparin, más szulfátéit glukóz-amino-glukánok és más, erősen negatív töltésű anyagok felhasználhatók az endogén vagy injektált EC-SOD C helyének megváltoztatására (lásd a 9-11. példát). Egyes patológiás viszonyok esetében hasznos lehet a plazmafázis helyének módosítása.
Az EC-SOD 3 frakcióból áll: az A frakció nem mutat affinitást a heparinhoz, a B frakció heparinaffinitása gyenge és a C frakcióé erős.
Az eltérő affinitás okai még nem ismeretesek, de a frakciók a legtöbb vonatkozásban nagyon hasonlók.
A PAGE-SDS-gélekkel végzett elektroforázis nem mutat különbségeket, az aminosav-összetétel láthatóan azonos [S. Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 7634-7636 (1982); és az A és C frakció elleni antitestek láthatóan azonosan reagálnak mindhárom frakcióval S. Markiund, Biochem. J. 220, 269-272 (1984)].
A frakciókat ugyanaz a gén termelheti, és a transzláció utáni fázisban módosulhatnak. Mindhárom frakció jelen van a friss plazmában (lásd a 9. példát) és ezeknek a farmakokinetikáját tárgyaltuk az előbbiekben.
A C frakció egyben az a frakció, amelyet rekombináns DNS-technikával állítunk elő (lásd a 13. példát).
Feltételezhető azonban, hogy az A és B EC-SODfrakció is hasznos lehet terápiás körülmények között, amikor lényeges, hogy az oldatban magas SOD-aktivitás álljon rendelkezésre.
Helyi kezeléshez valószínűleg jóval kevesebb EC-SOD-ra lesz szüksége, mint amennyit fentebb jeleztünk. Jelenleg 4-8 mg CuZn SOD-t visznek be intraartikulárisan, hetenként egyszer az ízületi gyulladás kezelésére. Az EC-SOD, amelynek molekulatömege jóval magasabb, valószínűleg hosszabb időn át marad az ízületben. Hasonló kezelési utasítás vagy esetleg valamivel alacsonyabb dózisok eredményesek lesznek.
Felhasználás előtt az EC-SOD-t tartalmazó készítményt előnyösen száraz állapotban kell tárolni, például liofilizált alakban. Szisztémás kezeléshez és helyi injekcióhoz az EC-SOD előnyösen a parenterális bevitel céljainak megfelelően készíthető ki, azaz megfelelő, nemtoxikus, fiziológiailag elfogadható oldószerben, például izotóniás sóoldatban oldható. Helyi alkalmazáshoz a gyógyszerkészítmény például az EC-SOD-t tartalmazó kenőcs, rázókeverék, spray, krém vagy aeroszol alakú lehet.
Feltételezzük továbbá, hogy a találmány szerinti gyógyszerkészítményben az EC-SOD előnyösen katalázzal kombinálható, amely a hidrogén-peroxidot az E) reakcióvázlat szerinti módon bontja el.
Az EC-SOD és a kataláz egyesített hatása ezenkívül tovább csökkenti a hidroxilgyök-képződést, amely gyökről - amint ezt az előbbiekben leírtuk - feltételezzük, hogy a legmérgezőbb oxigéntartalmú gyök. A kataláz helyett egy másik antioxidáns alkalmazható, amely együttműködik az EC-SOD-zal az oxigén redukciós termékei mérgező hatásainak csökkentésében.
Ugyancsak feltételezzük, hogy az EC-SOD és más anyagok - például allopurinol (xantinoxidáz inhibitor), hidroxilgyök-megkötők (például mannit vagy szulfhidrilcsoportot tartalmazó vegyületek) és az átmeneti fémekkel kelátokat képző vegyületek (például dezferrioxamin) - kombinációja előnyös hatású lehet.
Ezenkívül olyan alkalmazás esetében, ahol EC-SOD-nak a plazmában való jelenlétére van szükség, előnyös lehet heparin vagy egy heparinanalóg - például heparán-szulfát vagy egy más glukóz-amino-glikánszulfát, dextrán-szulfát vagy valamely másik, negatív töltésű vegyület - jelenléte a készítményben annak érdekében, hogy mobilizálja a kezelendő betegben a sejt felületén jelenlévő EC-SOD-t, így további EC-SODmennyiséget biztosítson a plazmában.
Az EC-SOD olyan betegségek vagy rendellenességek megelőzésére vagy kezelésére is alkalmazható, amelyek szuperoxidgyökök jelenlétével vagy keletkezésével függnek össze úgy, hogy az ilyen kezelésre szoruló betegnek terápiásán vagy profilaktikusan hatásos mennyiségű EC-SOD-t adagolunk be. A betegség vagy rendellenesség az előbbiekben leírtak bármelyike lehet.
Az EC-SOD továbbá ischaemia, majd reperfüzió által okozott károsodás megelőzésére vagy kezelésére is
HU 215 937 Β alkalmazható szervátültetésekkel kapcsolatban (amilyen a vese-, tüdő-, hasnyálmirigy-, szív-, máj- vagy bőrátültetés) vagy szívsebészettel kapcsolatban úgy, hogy a műtét előtt, alatt, vagy után terápiásán vagy profilaktikusan hatásos mennyiségű EC-SOD-t adagolunk be.
Bármelyik módszer alkalmazása esetén a terápiásán vagy profilaktikusan aktív dózis körülbelül 15-600 mg/nap EC-SOD-t tartalmazhat, egyebek között a kezelendő betegség jellegét és súlyosságát figyelembe véve. Ezen módszer esetében előnyös lehet heparin vagy más, az előbbiekben említett erősen negatív töltésű vegyület, és/vagy kataláz, vagy egy antioxidáns egyidejű bevitele, az ugyancsak az előbbiekben tárgyalt hatással.
A rajzok leírása
A találmányt a következőkben a rajzokra hivatkozva írjuk le, mi mellett
- az 1. ábra a fehérje és az EC-SOD elúcióját mutatja be, egy EC-SOD-t tartalmazó anyag antiEC-SOD-SepharoseR-ra való immunadszorpciója után (lásd a 4. példát);
- a 2. ábra az EC-SOD elúcióját mutatja be DEAESephacelR-ről (lásd az 5. példát);
- a 3. ábra az EC-SOD heparin-SepharoseR-ről való elúcióját mutatja be (lásd a 6. példát);
- a 4. ábra egy autoradiogram, amely az egyik nitrocellulóz szűrő 48-szoros mintájának hibridizációját mutatja be (a szűrőkre körülbelül 20000 lambdagll plakkot vittünk át). Az autoradiogrammon jelen levő sötét foltok humán EC-SOD cDNS tartalmú plakkokat jelentenek (lásd a 8. pédát);
- az 5a. és 5b. ábra az EC-SOD DNS-szekvenciáját és ebből következtethető EC-SOD-szekvenciáját mutatja be (lásd a 8. példát);
- a 6. ábra a pPS3 plazmid szerkezetét mutatja be. A fehér területek az SV40 DNS-t jelölik, a számok pedig az SV40-ben a megfelelő nukleotidhelyzetekre vonatkoznak. Az SV40PE és az SV40 origó a kezdeti SV40 promotort, illetve az SV40 replikációs origót jelöli, a nyilak pedig a transzkripció, illetőleg a DNS-replikáció irányát mutatják. Az SV40 poliadenilezési szignálok a 2770 és a 2533 helyzetek között helyezkednek el. A szaggatott terület a humán EC-SOD cDNS-t jelöli. A fekete terület a pBR322 plazmid beta-laktamáz génjének (APR) felel meg. Ugyancsak feltüntetjük a replikációs origó (pBR322) elhelyezkedését;
- a 7. ábra intravénás heparininjekciónak a plazma EC-SOD-ra kifejtett hatását mutatja be. Nulla időpontban 200 NE/testtömeg-kg heparint injektáltunk két egészséges férfibe, és plazmát vettünk le a bevitel előtt, illetőleg meghatározott időkben azt követően. Az EC-SOD-aktivitást a 9. példa szerinti módon határozzuk meg;
- a 8. ábra az intravénás heparin dózisválasz görbéjét mutatja be az EC-SOD felszabadító aktivitás tekintetében. A heparint intravénásán injektáltuk a megjelölt dózisokban két egészséges férfibe, és vért vettünk le a heparininjekció előtt, majd 10 és 15 perccel az után. A 15. percben egy további heparindózist - maximum 200 NE/testtömeg-kg injektáltunk, és 10 perccel ez után vért vettünk le. A plazmában lévő EC-SOD-t a 9. példában leírt módon határozzuk meg. 100%-os felszabadulásnak tekintettük a heparin előtti EC-SOD-aktivitás és a második heparininjekció utáni aktivitás különbségét. A heparin előtti aktivitás és az első dózis bevitele utáni 10 perces, és további minták átlagos aktivitása közötti különbséget a „100%-os felszabadulással” összefüggésben mutatjuk be. Az egyes kísérleteket úgy hajtottuk végre, hogy közöttük legalább 4 nap telt el (lásd a 9. példát);
- a 9. ábra a plazma szétválasztását mutatja be heparin-SepharoseR-on. Emberi plazmát vettünk le 200 NE/testtömeg-kg heparin i. v. injektálása előtt (0) és után 10 perccel (háromszögű jelek), és a szétválasztást a 9. példában leírt módon heparinSepharoseR-on végezzük. *-gal jelöljük a heparin előtti plazmára vonatkozó kromatográfiás eredményeket, az EC-SOD eltávolítására irányuló, antiEC-SOD-SepharoseR-zal végzett előkezelés után. A folytonos vonal a 280 nm-en mérhető abszorpciót jelzi, a szaggatott vonal pedig a NaCl-grádiensnek felel meg. Mint az ábrán feltüntetjük, az EC-SOD A, B és C frakcióját összeöntve határozzuk meg. A B és a C frakció összeöntésével kapott termék csak az EC-SOD-ra jellemző, mivel az anti-EC-SOD-SepharoseR a teljes aktivitást adszorbeálta. Az A összeöntött tennék CuZn SOD-t és a SÓD hatásával szemben rezisztens cianidot is tartalmaz. Az A frakció EC-SOD-aktivitását ezért immobilizált antitestekkel határoztuk meg, a plazma esetére a 9. példában leírt módon. Az A, B illetve c EC-SOD-frakció aktivitása a heparin előtti plazmában 5,2; 4,4, illetve 5,1 E/ml és 7,7; 5,7 és 29,4 E/ml a heparin utáni plazmában. Az EC-SOD-aktivitás kinyerése a kromatogramokon 84% és 83%. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a nagyobb összes SOD-aktivitás az összeöntött A frakcióban a heparin előtti plazmának megfelelő kromatogramon annak tulajdonítható, hogy a mintában hemolízis megy végbe, és az erítrocitákból CuZn SÓD szabadul fel (lásd a 9. példát);
- a 10. és 11. ábra l25I-dal jelzett emberi EC-SOD nyulakba való injektálásának hatását mutatja be, valamint a heparininjekció hatását (lásd a 10. példát);
- a 12. ábra rekombináns EC-SOD elúcióját mutatja be monoklonális anti-EC-SOD-SepharoseR-ról (lásd a 17. példát);
- a 13. ábra rekombináns EC-SOD elúcióját mutatja be DEAE-SephacclR-ról (lásd a 17. példát);
- a 14. ábra rekombináns EC-SOD eluálását mutatja be heparin-SepharoseR-ról (lásd a 17. példát);
- a 15. ábra natív és rekombináns EC-SOD elektroforézisét mutatja be grádiens módon, poliakrilamid-géleken, nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében (lásd a 19. példát).
HU 215 937 Β
1. példa
Köldökzsinór-homogenizátumok előállítása
Az Umea-i Egyetemi Kórház szülészeti osztályán emberi köldökzsinórokat gyűjtöttünk össze. Ezeket az osztályon hűtőszekrényben tartottuk, és a laboratóriumban gyorsan -80 °C-ra fagyasztottuk le, majd felhasználás előtt -30 °C-on tároltuk.
Felolvadás után a köldökzsinórokat felaprítottuk. A keveréket ez után szuszpendáljuk 50 ml K-foszfátpufferben (pH 7,4), amely 0,3M KBr-t, 3 mM DTPA-t, 100000 kNE/liter TrasylolR-t (aprotinin) és 0,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmaz. 1 kg köldökzsinórra számítva 4 liter puffért veszünk. A kaotrop sót - KBr - annak érdekében használjuk, hogy fokozzuk az EC-SOD extrakcióját a szövetből (a különbség körülbelül 3-szoros). A DTPA-t, TrasylolR-t és a PMSF-t a proteázok gátlására adjuk az elegyhez. A szuszpenziót ez után egy Waring blenderben homogenizáljuk, majd ultrahangos kezelésnek vetjük alá. 1 órán át 4 °C-on rázatjuk ez után. A kapott homogenizátumot centrifugáljuk (6000 g, 20 perc), és a felülúszót gyorsan lefagyasztjuk -80 °C-ra, végül -30 °C-on tároljuk.
2. példa
Humán tüdő EC—SOD előállítása és tisztítása
Az emberi tüdőket 9 egyénből távolítottuk el boncolás során, a halál bekövetkeztétől számított 24 órán belül, akik nem szenvedtek semmiféle látható tüdőbetegségben. A tüdőket feldaraboltuk, és a fölösleges vért L,15 M NaCl-dal mostuk le. A darabokat Waring blenderben homogenizáljuk, 5 térfogatnyi jéghideg, 50 mM, pH 5,50 Na-acetátban. A homogenizátumot ez után ultrahangkezelésnek vetjük alá, 30 percen át 40 °C-on extraháljuk, és végül 20 percen át centrifúgáljuk (6000 g).
A felülúszót szakaszosan adszorbeáltatjuk DEAESephacelR-en (Pharmacia, Uppsala, Svédország), 1 térfogat/25 térfogat homogenizátum arányban, amelyet 50 mM pH 5,50 Na-acetáttal hoztunk egyensúlyba. Az ioncserélőt ez után a pufferrel mossuk, betöltjük egy oszlopba és grádienselúciónak vetjük alá 0-200 mM acetátpufferes NaCl-oldattal. A grádienstérfogat az oszlop térfogatának tízszerese.
Az előző lépésből származó aktív frakciókat egyesítjük, 1,5 térfogatnyi desztillált vízzel hígítjuk, és 1 M NaOH-dal pH 8,4-re titráljuk. Az egyesített anyagot ismét szakaszosan felvisszük DEAE-SephacelR-re, amelyet 175 mM Tris-HCl-lel hoztunk egyensúlyba pH 8,4-n (=1 térfogat ioncserélő/10 térfogat egyesített anyag). A DEAE-SephacelR-t ez után a pufferrel mossuk, oszlopba töltjük, és 10 oszloptérfogatnyi, 0-200 mM NaClgrádienssel eluáljuk Trisz-pufferben.
Az előző lépésből származó, egyesített frakciókat 150 mM, pH 6,5 Na-foszfáttal szemben dializáljuk. A mintát felvisszük egy oszlopra (körülbelül 1 ml gél 15 mg, a mintában lévő fehéijére számítva), amelyet fenil-SepharoseR-zal (Pharmacia, Uppsala, Svédország) töltöttünk meg, miután ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltuk. Az aktivitást 20 oszloptérfogatnyi 0-0,5 M KBr grádienssel eluáljuk, 50 mM, pH 6,5 Na-foszfát-pufferrel.
A fenil-SepharoseR-ról származó aktív frakciókat egyesítjük, betöményítjük, és 0,15 M Na-foszfát-pufferrel szemben dializáljuk pH 6,5-en. A mintát felvisszük egy oszlopra, amely Con A-SepharoseR-t (Pharmacia, Uppsala, Svédország) tartalmaz (1 ml gél 2 mg, a mintában jelen lévő fehérjére számítva), és amelyet ugyanezzel a foszfátpufferrel egyensúlyoztunk ki, majd pulzálva eluáljuk 50 mM alfa-metil-D-mannozidnak a foszfátpufferben való jelenléte mellett.
A Con A-SepharoseR-ról származó aktív frakciókat egyesítjük, betöményítjük, felvisszük egy Ultragel ACA-34 oszlopra (2,5x83 cm) (LKB, Stockholm, Svédország) és 50 mM pH 6,5 Na-foszfáttal eluáljuk. Az elúció sebessége 5 ml/h/cm2.
Az elúcióval kapott aktív frakciókat egyesítjük, betöményítjük, és felvisszük egy búzacsíralektin SepharoseR oszlopra (10 ml) (Pharmacia, Uppsala, Svédország) amelyet 0,15 M pH 6,5 Na-foszfáttal hoztunk egyensúlyba. Az enzimet pulzálva eluáljuk 0,45 M Y-acetil-Dglukózaminnak a foszfátpufferben való jelenléte mellett.
Az előbbi lépésből származó aktív frakciókat egyesítjük, betöményítjük, 0,15 M, pH 6,5 Na-foszfáttal szemben dializáljuk, és felvisszük egy kék SepharoseR CL-6B oszlopra (Cibacron Blue F3G-A) (ágytérfogat 6 ml) (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amelyet a foszfátpufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot pufferrel mossuk, majd 10 mM NAD-t és 10 mM NADP-t vezetünk be lökésszerűen a pufferbe. Miután a puffer kimosta a piridin-nukleotidokat, az enzimet lökésszerűen eluáljuk, pH 6,5 0,9 M KBr/50 mM Na-foszfát-pufferrel.
A kék SepharoseR oszlopról kapott aktív frakciókat egyesítjük, pH 6,5 25 mM Na-foszfát-pufferrel szemben dializáljuk, és felvisszük egy heparin-SepharoseR oszlopra (ágytérfogat 10 ml), amelyet a Pharmacia cégtől (Uppsala, Svédország) szereztünk be, és ugyanezzel a pufferrel egyensúlyozunk ki. Az oszlopot ez után 140 ml, 0,1 M NaCl-grádiens alkalmazásával, ugyanezzel a foszfátpufferrel eluáljuk. Az aktivitás 3 elkülönült csúcs alakjában eluálódik: az A frakció nem kötődik a heparinhoz, a B frakció korábban eluálódik a grádienselúció során, a C frakció pedig később.
Az A csúcs olyan UV-abszorbeáló anyagot tartalmaz, amely valószínűleg a heparin-SepharoseR oszlopról szivárgott ki, és további tisztítását SephacrylR S-300 oszlopon (1,6x90 cm) (Pharmacia, Uppsala, Svédország) végezzük. A mintát 25 mM Tris-HCl-pufferrel, pH 7,5-en eluáljuk.
Az A, B és C frakciót 25 mM, pH 7,5 Tris-HCl-pufferrel szemben dializáljuk, majd körülbelül 1 ml-re tömény ítjük be Amicon UM-10 ultraszűrő membránon. A C frakciót a következő példában leírt módon EC-SOD-antitestek előállítására használjuk fel.
3. példa
Nyúl-anti-humán EC-SOD előállítása
Az EC-SOD C frakcióját a 2. példában leírt módon állítjuk elő. Egy nyulat szubkután injektálunk 30 pg EC-SOD-dal, Freund-f. komplett adjuvánssal. Az immunizálást ez után 1 hónapos időközökben 5 injekcióval - 30 pg EC-SOD Freund-f. inkomplett adjuváns13
HU 215 937 Β bán - megerősítjük. 2 héttel az utolsó erősítődózis után a nyulat elvéreztetjük, és a szérumot összegyűjtjük. Az antiszérum IgG frakcióját Protein-A-SepharoseR-on való adszorpcióval és deszorpcióval különítjük el, a gyártó (Pharmacia, Uppsala, Svédország) által ajánlott módon.
Az oszlopról való elúciót 0,1 M, pH 3,0 glicinHCl-pufferrel hajtjuk végre. Közvetlenül az elúció után az egyesített IgG-t pH 7,0-ig titráljuk. Az IgG-t ez után 0,1 M, pH 8,3 NaCl-ra 0,15 M töménységű Na-karbonát-puferrel szemben - „kapcsolópuffer” dializáljuk.
A CNBr-dal aktivált Sepharose-t a gyártó - Pharmacia, Uppsala, Svédország - által ajánlott módon duzzasztjuk és készítjük elő. Az előbbi módon előállított IgG-t a „kapcsolópufferrel” körülbelül 5-8 mg/ml töménységükre hígítjuk. CNBr-dal aktivált SepharoseR-t adagolunk, és a keveréket egy éjszakán át 4 °C-on való rázatással inkubáljuk. Körülbelül 5 mg/ml gél IgG kapcsolódása érhető el. A puffért leszívatjuk a gélről, és elemezzük a visszamaradó fehérjét. Általában 98%osnál nagyobb mértékű kapcsolás érhető el. Az IgG-vel kapcsolt gélt ez után 1 M etanol-aminnal egy éjszakán át 4 °C-on szuszpendálva blokkoljuk. A gélt a továbbiakban a „kapcsolópufferrel”, majd 0,1 M, pH 4,0 NaCl-ra nézve 0,5 M töménységű Na-acetáttal mossuk. Ez után a „kapcsolópufferben” tároljuk, antibakteriális ágensként, azid alkalmazásával.
Az immobilizált antitestek maximális kötődési kapacitását úgy határozzuk meg, hogy egy éjszakán át fölös mennyiségű EC-SOD-zal inkubáljuk, majd elvégezzük a fennmaradó EC-SOD elemzését. Centrifugálás után az eredményt összehasonlítjuk egy SepharoseR 4B-vel végzett szimulált inkubáció eredményével.
50%-os anti-EC-SOD-Sepharose-ból 100 μΐ-t hozzáadunk 0,5 ml EC-SOD-hoz, „kapcsolópufferben”. Párhuzamosan szimulált inkubációt végzünk 100 ml 50%-os SepharoseR 4B szuszpenzióval. Az oldatokat egy éjszakán át 4 °C-on rázatjuk, majd centrifugáljuk. A SepharoseR 4B-vel kezelt oldatban a visszamaradó aktivitás 2080 E/ml, az anti-EC-SOD-Sepharose-zal kezelt oldatban pedig 720 E/ml. Ezeknek a számadatoknak a felhasználásával kiszámítható volt, hogy 1 ml anti-EC-SOD-Sepharose gél 13 500 E/ml (körülbelül 120 pg) EC-SOD-t köt meg. Ezt az értéket használjuk fel annak megtervezésére, hogy hogyan hajtsuk végre az EC-SOD adszorpcióját humán szövethomogenizátumokból kiindulva.
4. példa
Az EC-SOD immunadszorpciója anti-EC-SODSepharose^-on
Egy alkalommal körülbelül 10 liter köldökzsinórkivonatot kezelünk, amelyet az 1. példában leírt módon állítottunk elő. A kivonat EC-SOD-tartalma körülbelül 150 E/ml. Ha a gél 13 600 E/ml-t köt meg (lásd a 3. példát), a 10 liter kivonatban jelen lévő, teljes mennyiségű EC-SOD adszorpciója körülbelül 110 ml antiEC-SOD-Sepharose-t igényel.
Először centrifugáljuk a kivonatot (6000 g, 30 perc) a kicsapódott fehérje eltávolítására. A felülúszóhoz ez után 110 ml anti-EC-SÓD-Sepharose-t adunk, és a keveréket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltatjuk, kevertetés mellett. A gélt üvegszűrőn távolítjuk el a kivonatból. A szűrőn levő gélt ez után nagy mennyiségű 50 mM, pH 7,0 K-foszfát-oldattal mossuk, amely NaCl-ra nézve 0,5 M töménységű.
A gélt betöltjük egy 3 cm átmérőjű kromatográfiás oszlopba. Az eluálást 50 mM, pH 7,0 K-foszfáttal amely NaCl-ra 0,5 M töménységű - kezdjük, 50 ml/óra sebességgel, és regisztráljuk a 280 nm-en megfigyelhető abszorpciót. Az eluálást addig folytatjuk, amíg nagyon alacsony A280 értéket érünk el. Az EC-SOD-t ez után 0,5-2,5 M lineáris KSCN gradienssel eluáljuk, pH 7,0 50 mM K-foszfát-pufferrel. A grádienselúcióhoz felhasznált mennyiség össztérfogata 500 ml, és az elúciót 30 ml/óra sebességgel végezzük. Az EC-SOD deszorpciója lassú, és nem gyorsítható fel.
Az eluálófolyadékot frakciószedőben gyűjtjük öszsze. Annak érdekében, hogy az eluált EC-SOD-t megvédjük a magas KSCN koncentrációtól, egy T csövet illesztünk be az oszlop eluálóvégéről kinyúló műanyag csőbe, és az oszlop elúciós sebességének kétszeresével desztillált vizet injektálunk.
A fehérje (A280) és az EC-SOD elért elúcióját az 1. ábrán mutatjuk be. Látható, hogy az EC-SOD elúciója nem teljes a 2,5 M KSCN gradiens végén, de az elúciót nem folytatjuk annak elkerülésére, hogy olyan EC-SOD-t nyeljünk ki, amely a magas KSCN koncentráció következtében túlságosan denaturálódott.
Az EC-SOD-t az ábrán bemutatott módon egyesítjük. A gradienssel kapott első aktivitást nem fogjuk fel, mivel ez meglehetősen nagy mennyiségű szennyező, aspecifikus kötött fehérjét (A28O) tartalmaz. A grádienselúcióval kapott anyagban 280 nm-nél megjelenő abszorpció (A280) zömét a KSCN szolgáltatja, és csak a folyamat elején látható egy szignifikáns fehérjecsúcs. Regenerálás céljából ez után a gélt egy éjszakán át 2,5 M KSCN-ben rázatjuk, majd 50 mM K-foszfát0,5 M NaCl-oldattal - pH 6,5 - és ez után NaCl-t nem tartalmazó pufferrel mossuk. Végül antibakteriális szerként azidot adagolunk. Felhasználás előtt a gélt azidmentes, pH 6,5 50 mM K-foszfát-oldattal mossuk.
5. példa
Adszorpció DEAE-SephaceP-re, és elúció
Az anti-EC-SOD-Sepharose oszlopról kapott egyesített eluátumhoz 10 mM végkoncentrációig 1-aminometil-propanolt adunk. Az oldatot azután 1M NaOHdal pH 9,0-ra titráljuk. Az oldatot körülbelül 5 térfogatnyi desztillált vízzel hígítjuk. A kapott oldathoz 40 ml DEAE-SephacelR-t adunk, amelyet 50 mM Na-foszfát0,5 M NaCl-175 mM Tris-HCl-pufferrel - pH 9,6 egyensúlyozunk ki.
Az EC-SOD-nak a DEAE-SephacelR-re való adszorpcióját úgy hajtjuk végre, hogy egy éjszakán át 4 °C-on kevertetjük. A DEAE-SephaceIR-t ez után üvegtölcséren gyűjtjük össze, 50 mM, pH 6,5 Na-foszfát-pufferrel mossuk, és betöltjük egy 2,5 cm átmérőjű kroma14
HU 215 937 Β tográfiás oszlopba. Az oszlopot először körülbelül 4 térfogatnyi előbbi pufferrel eluáljuk. Az EC-SOD elúcióját ez után a 2. ábrán bemutatott módon 50 mM Na-foszfát-0,25 M NaCl-oldattal - pH 6,5 - hajtjuk végre. Az aktivitást a 2. ábrán bemutatott módon egyesítjük, 25 mM pH 6,5 Na-foszfáttal szemben dializáljuk, és végül körülbelül 2 ml-rel töményítjük be.
6. példa
Az EC-SOD végső tisztítása heparinSepharose^-on részletben az előbbiekben leírtak szerint a DEAESephacelR-ről kapott eluátumot egyszerre viszünk fel, szétválasztás céljából, heparin-SepharoseR oszlopra. A felvitelre kerülő enzimoldatokat 25 mM, pH 6,5 Kfoszfát-pufferrel szemben dializáljuk.
ml heparin-SepharoseR gélt készítünk elő a gyártó (Pharmacia, Uppsala, Svédország) által ajánlott módon; ezt 25 ml, pH 6,5 25 mM, K-foszfát-oldattal amely 1 M NaCl-t tartalmaz -, majd NaCl-t nem tartalmazó pufferrel mossuk. A heparin-SepharoseR-t betöltjük egy 2,5 cm átmérőjű kromatográfiás oszlopba, és az eluálást 25 mM, pH 6,5 K-foszfát-pufferrel kezdjük, 15 ml/óra sebességgel. Az EC-SOD-oldatot (körülbelül 10 ml, 800 000 egység) ez után felvisszük az oszlopra és követjük a 280 nm-en (lásd a 3. ábrát) megfigyelhető abszorpciót.
Amikor az első csúcs után az A280 megközelíti az alapvonalat, az EC-SOD-t 0-1,2 M NaCl-grádienssel eluáljuk. A grádiensoldat térfogata 400 ml. Az EC-SOD 3 csúcs alakjában eluálódik; az egyik nem mutat affinitást a heparin iránt, míg a másik közepes, és a harmadik magas affinitással rendelkezik. A csúcsok a 2. példában leírt módon az A, B és C frakciónak felelnek meg. A jelen eljárással való tisztítás esetében az aktivitás csaknem teljesen C típusú, ezért az a követ10 keztetés vonható le, hogy valószínűleg ez az enzim natív alakja. A C csúcsot a 3. ábrán bemutatott módon egyesítjük.
Az egyesített aktivitás 430000 egység (körülbelül 4,3 mg). A fajlagos aktivitás 81100 (egység/ml/A280).
SDS-PAGE gélen körülbelül 30000 D alegységet találunk. Szennyezésnyomokat nem észlelünk. Az egyesített aktivitás körülbelül 53%-át teszi ki a heparin-SepharoseR-ra felvitt aktivitásnak.
7. példa
A humán EC-SOD amino-terminális szekvenciája A szokásos eljárásokkal [Edman et al., Eur. J.
Biochem. 1, 80-87 (1967)] meghatározzuk az előző példák szerint előállított humán EC-SOD (N-terminális) aminosavszekvenciáját. A vizsgálatok szerint az első 33 aminosavszekvenciája a következő:
TRP THR GLY GLU ASP SER ALA GLU PRO ASN SER ASP SER ALA GLU TRP ILE ARG ASP MET TYR ALA LYS VAL THR GLU ILE TRP GLN GLU VAL MET GLN
Ezt a szekvenciát - vagy megfelelő részét - felhasználhatjuk szintetikus DNS-minták, szintetikus dezoxioligonukleotidok előállítására, amelyek komplementerek az előbbiekben bemutatott aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvencia kódoló, illetve nemkódoló ága tekintetében egyaránt.
Ezeket a mintákat felhasználhatjuk cDNS-szótárakkal végzett hibridizációs kísérletekben, amelyeket EC-SOD-t termelő sejtekből vagy szövetekből származó mRNS-ből állítottunk elő, annak érdekében, hogy egy EC-SOD-gén teljes hosszúságú vagy részleges cDNS-kópiáját különíthessük el, amint ezt a következő példában leírjuk.
8. példa
Humán EC—SOD klónozása és szekvenciájának vizsgálata
Egy DNS-minta előállítása
Humán EC-SOD-t állítunk elő köldökzsinórból és tisztítunk, lényegében az előbbi 1 -6. példában leírt mó40 dón, és a 7. példa szerint meghatározzuk az első 33 Nterminális aminosav szekvenciáját. Az aminosavszekvencia alapján és az eukarióta fehérjékre elfogadott kódhasználat [Grantham et al., Nucl. Acids Rés. 9, 43-74 (1981)] mellett szintetikus 48 tagú dezoxi-oligo45 nukleotidot szintetizálunk:
’ -CAGGGAC ATGTATGCCAAGGTGACTGAGATCTGGCAGGAGGTGATGC A-3 ’
- [a Matthes et al. EMBO Journal 3, 801-805 (1984)] által leírt eljárás szerint -, amely az EC-SOD gén kódolóágának komplementere.
A humán placenta cDNS-szótár alapján való tesztelés Egy humán placenta cDNS-szótárt - amelyet a lambdagtll vektorban állítottak elő - a Clontech Laboratories Inc-tól (Palo Alto, Califomia, Amerikai Egyesült Államok; HL 1008 számú Katalógus, 1205 számú tétel) szereztünk be. A rekombináns fágok humán EC-SOD cDNS-szekvencia vonatkozásában való szűrését úgy végezzük, hogy a fágokat az E.coli Y 1090 indikátortörzs tenyészetére szélesztjük. A plakkok nitro-cellulózszűrőkre való átvitelét és ezek kezelését (Hybond
C. Amersham Inc.) lényegében a Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) által leírt módon végeztük.
nitro-cellulóz-szűrőt, amelyekre szűrőként 20000 plakkot viszünk át, 5xSSC-ben előáztatunk, majd 1 órán át 41 °C-on 40 ml 20%-os formamidban előhibridizálunk (a közeg ezen kívül 5 χ Dechardt-f. oldatot, 50 mM, pH 6,8 nátrium-foszfátot és 50 pg/ml denaturált, ultrahanggal kezelt boíjútimusz DNS-t tartalmaz). A szűrőket ez után hibridizációs kísérletekbe visszük be 7 χ 105 db/perc/ml 32P-gamma-ATP végjel15
HU 215 937 Β zett (lásd Maniatis et al., op. cit.) 48 tagú mintával, amelyet az előbbiekben írtunk le. A hibridizációt 100 μΜ ATP-vel (végkoncentráció) kiegészített előhibridizációs oldatban, 18 órán át, 41 °C-on végezzük. Egy éjszakán át 41 °C-on végzett inkubálás után a szűrőket egyszer mossuk 0,2 χ SSC-ben 37 °C-on, majd 4 mosást végzünk 0,2xSSc-0,l% SDS-sel 37 °C-on, és ez után a szűrőket levegőn száradni hagyjuk, majd egy éjszakán át DuPont Cronex 4 X-sugár érzékeny filmmel érintkeztetjük. Az autoradiogramokat a 4. ábrán mutatjuk be. Mindegyik szűrő körülbelül 6 pozitív plakkot tartalmaz.
Pozitív hibridizációs reakciót mutató plakkokból fágokat izolálunk és tisztítunk, és ezeknek a fágoknak a DNS-ét a Davis et al. (Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, 1980) által leírt módszerrel extraháljuk, majd meghatározzuk a beiktatott cDNS-szakaszok hosszúságát agaróz-gélelektroforézissel, miután a fág-DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A leghosszabb cDNS-szakaszt hordozó rekombináns fágot lambdaSP3-mal jelöljük, és ezt választjuk a további vizsgálathoz.
A lambdaSP3-ból származó cDNS-szakaszt restrikciós endonukleázos elemzésnek vetjük alá, és a pUC18, illetve az Μ13 vektor mp9 részébe való további klónozás után meghatározzuk a szekvenciát. A beépült szakaszról kimutattuk, hogy az a humán EC-SOD-t kódoló DNS-szakasszal azonos, oly módon, hogy összehasonlítottuk a DNS-szekvenciából leszármaztatható aminosavszekvenciát a tisztított fehérje peptidszekvenciájával, és annak CHO sejtekben nyert expressziós termékeivel. A lambdaSP3-ból elkülönített, beépült szakasz 1396 bp cDNS-t tartalmaz, valamint egy nyitott leolvashatóságú szakaszt, amely egy 240 aminosavból álló fehéijét kódol, egy 69 bp nagyságú 5’ és egy 607 bp nagyságú 3’ transzlációmentes szakaszon kívül (lásd az 5a. és 5b. ábrát).
A humán EC-SOD-t kódoló cDNS beépült szakaszok továbbklónozása és restrikciós endonukleázzal való elemzése:
Körülbelül 30 pg lambdaSO3 DNS-t bontunk el EcoRI restrikciós endonukleázzal és a beépült cDNS-t elektroforézissel - 6%-os poliakril-amid gélben - választjuk el a lambda-DNS-től. Körülbelül 0,2 pg cDNSfragmentumot különítünk el a gélből elektroelúcióval, fenolos és kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással [Maniatis et al., lásd az előbbi idézetet]. 0,05 pg izolált cDNS-fragmentumot összekapcsolunk 1 pg EcoRI restrikciós endonukleázzal megbontott, lúgos foszfatázzal kezelt PUC18 DNS-sel [Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)]. A ligátumként kapott DNS-t E.coli HB101 törzsbe [J. Mól. Bioi. 41, 459] transzformáltuk. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáltuk. Azonosítottunk egy, a beépített cDNS-szakaszt hordozó rekombináns plazmidot, és ezt pLS3-nak neveztük el. A pLS3 DNS-plazmid DNS-ét restrikciós endonukleázzal elemzésnek vetettük alá.
A humán EC-SOD-t kódoló cDNS DNS-szekvencia elemzése:
A humán EC-SOD-t kódoló, a lambdaSP3 fágból kinyert cDNS beépített szakasz DNS-szekvenciáját
Sanger et al. módszerével határozzuk meg [(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977); F. Sanger és A. R. Coulson, FEBS Letters 87, 107-110 (1978)], valamint Messing et al. eljárását alkalmazva [Nucl. Acids Rés. 9, 309-321 (1981); P. H. Schreir és R. Cortese, J. Mól. Bioi. 129, 169-172 (1979)], miután a cDNS-fragmentumot az M13 vektor mp9 EcoRI helyére klónoztuk [J. Messing és J. Vieira, Gene 19, 269-276 (1982)].
A Dalé et al. által leírt módszerrel [Plasmid 13, 31-40 (1985)] az M13 vektor mp9-ben a cDNS beépített szakaszból átlapoló kiónok szekvenciális sorozatát képezzük. Ennek a módszernek az alkalmazásával meghatározzuk a cDNS mindkét DNS-ága teljes nukleotidszekvenciáját. Azt találjuk, hogy ennek hosszúsága 1396 bp.
A lambdaPS3 cDNS beépült szakaszának nukleotidszekvenciáját és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát az 5. ábrán mutatjuk be. A cDNS beépült szakasz egy 240 aminosav nagyságú, nyitott leolvashatóságú keretszakaszt tartalmaz. A tisztított, érett fehéije aminosavszekvenciája a +1 aminosavnál kezdődik; ez arra mutat, hogy egy feltételezhető szignálpeptid 18 aminosavból áll. Az ismert szignálpeptidekhez hasonlóan ez az aminosavszekvencia feldúsult hidrofób aminosavakban, és ezenkívül az utolsó maradék alanin, amely egyike az ismert szignálpeptidekben ebben a helyzetben talált aminosavaknak [G. Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983)]. Az aláhúzott aminosavszekvenciákat peptidszekvencia meghatározással igazoljuk.
A DNS-szekvencia egy másik jellemzője a transzlációt iniciáló kodonnál (-CaGCCAUGC-) talált DNSszekvencia, amely homológ az eukarióta iniciációs helyekre posztulált egyezményes szekvenciával (-CCqGCC-AUG(G)-) [M. Kozák, Nucl. Acids Rés. 12, 857-872 (1984)]. Ezenkívül egy lehetséges poliadenilezési szignál található 14 bp-ral a poliadenilezési farokrészen túl, amelynek szekvenciája (-ATTAAA-) homológ a posztulált egyezményes AATAAA szekvenciával.
A humán EC-SOD kifejeződése CHO sejtekben
Az előbbiekben leírt, cDNS által kódolt humán EC-SOD előállítására olyan expressziós vektort használunk, amely a replikáció origójaként 40 jelű majomvírust (SV40), kezdeti és későbbi promotereket, poliadenilezési és terminációs szekvenciákat tartalmaz. A 1396 bp hosszúságú cDNS-szakaszt egy egyedi EcoRI restrikciós endonukleázos hasítással nyert helyre illesztettük be, amely az SV40 kezdeti promotere és az SV40 poliadenilezési és terminációs szekvenciája között helyezkedik el, oly módon, hogy a humán EC-SOD kódoló szekvenciájának kifejezését az SV40 kezdeti promotere kontrollálja (6. ábra). Ezt a felépített EC-SOD expressziós plazmidot pPS3-nak neveztük el.
pg pPS3 DNS-t a Pstl restrikciós endonukleázzal, a beta-laktamáz-génben elhelyezkedő egyedi Pstl helyen való elbontással lineárissá alakítottunk. A lineárissá tett pPS3 DNS-t 0,5 pg DNS-sel hoztuk össze; ez utóbbi DNS egy olyan plazmidból származik, amely a Geniticinnel (G-418 szulfát, Gibco Ltd.) szemben rezisztenciát eredményező szakaszokat tartalmaz. Az ele16
HU 215 937 Β gyet transzfekcióval CHO-Kl-be (ATCC CCL61) visszük át, Graham és Van dér Eb módszerével [Virology 52, 456-467 (1973)]. A transzfektált sejteket egy olyan táptalajon való tenyésztéssel szelektáljuk (Ham-f. F12 m közeg, amelyhez 10% boíjúembrió-szérumot, streptomicint és penicillint adunk), amely 700 gg/ml Geniticint (G-418 szulfát, Gibco Ltd.) tartalmaz. A Geniticinre rezisztens telepeket elkülönítjük, és ugyanezen a táptalajon tenyésztjük. A táptalajból időnként mintát veszünk, és ELISA módszerrel megvizsgáljuk, hogy EC-SOD jelen van-e, ezenkívül az alábbiakban leírt módon enzimaktivitás-méréseket végzünk.
Több sejtvonal összehasonlítható humán EC-SODtermelést mutat. A további vizsgálatokhoz az egyik kapott sejtvonalat választjuk ki, amelyet CHO-Kl/pPS3neo18 jelöléssel láttunk el.
Az EC-SOD kiválasztása a táptalajba olyan CHO sejtekből, amelyek a humán EC-SOD-t kódoló gént tartalmazzák.
A CHO-Kl/pPS3neo-18 kiónt és a CHO-K1 szülősejteket addig tenyésztjük Ham-f. F-12 táptalajban amely 10% borjembrió-szérumot tartalmaz -, amíg a tenyészet összefüggővé válik. 3 további nap elteltével a táptalajt eltávolítjuk, és a sejteket kétszer mossuk foszfátpufferes sóoldattal. A sejteket ezután leválasztjuk a tenyészlombikok faláról oly módon, hogy 40 mM TrisHCl-t, 140 mM NaCl-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldattal inkubálást végzünk. A kinyert sejteket (körülbelül 8χ 106) centrifugáljuk, a felülúszót elvetjük, és a sejteket pellet alakban -80 °C-on tároljuk. A sejteket ezután ultrahangos kezeléssel dezintegráljuk egy olyan oldatban, amely 50 mM, pH 7,4 K-foszfátot, 0,3 M KBr-t, 3 mM DTPA-t, 0,5 mM PMSF-t és 100 KIE/ml trazilolt tartalmaz. A homogenizátumokat centrifugáljuk. Az EC-SOD mennyiségének fajlagos meghatározását oly módon végezzük, hogy a homogenizátumokat és a táptalajokat humán EC-SOD és humán CuZn SÓD elleni rögzített antitestekkel inkubáljuk [Öhman és Markiund, Chim. Sci. 70, 465-469 (1986)]. A CHO-K.1 szülősejtekben vagy táptalajukban nem találtunk EC-SOD-t. A CHO-Kl/pPS3neo-18 sejtek táptalajáról (15 ml) ebben a konkrét kísérletben azt állapíthatjuk meg, hogy 51 E/ml EC-SOD-t - összesen 765 E-t - tartalmaz. A sejthomogenizátum (1,45 ml) 71 E SOD-aktivitást tartalmaz, amelyből 20 E származik a humán EC-SOD-ból. így a CHO-Kl/pPS3neo18 tenyészetben jelen levő EC-SOD 97,5%-a a táptalajba választódik ki.
Humán EC-SOD előállítása CHO sejtekben
Ennek a kiónnak a humán EC-SOD termelését mind szilárd táptalajon, mind szuszpenzióban való tenyésztés esetén meghatározzuk.
1. Szilárd táptalajon tenyésztett
CHO-KI/pPS3neo-18 sejtek EC-SOD termelése a) Egy 175 cm3 térfogatú lombikot beoltunk 4,5xlO6 sejttel 30 ml Ham-f. F-12 táptalajban (Flow
Laboratories), amelyet 10% borjúembrió-szérummal, mM L-glutaminnal, streptomicinnel és penicillinnel egészítettünk ki. A sejteket 37 °C-on, 5% CO2-t tartalmazó levegőben inkubáljuk. A táptalajt háromnaponként cseréljük, és a táptalajba kiválasztott humán EC-SOD koncentrációját az alábbiakban a „Vizsgálatok a humán EC-SOD kifejeződésének kimutatására” című részben leírtak szerint határozzuk meg. A humán EC-SOD termelése ELISA módszerrel mérve, és az EC-SOD-enzimaktivitás meghatározása alapján 1,5 pg.sejt ',24 óra '.
b) Mikrohordozókat [Cytodex 3, Pharmacia, Svédország : m.c.] 4 mg/ml töménységben 7 sejt/m.c. koncentrációban sejtekkel inokulálunk, Ham-f. F-12 táptalajban (Flow Laboratories), amelyhez 5% boíjúembriő-szérumot, 2 mM L-glutamint, streptomicint és penicillint adtunk.
A sejteket 500 ml-es kevertetett lombikban (Techne) tenyésztjük, 5% CO2-t tartalmazó levegőben, 37 °Con. Összefüggő sejttenyészet kialakulásakor a tenyészetet 0,088 óra 1 sebességgel perfundáltatjuk.
A humán EC-SOD termelése 0,50 pg.sejt 1 24 óra 1. 2. Az EC-SOD előállítása szuszpenzióban tenyésztett CHO-Kl/pPS3neo-18 sejtekkel
125 ml táptalajt (Ham-f. F-12 táptalaj, amelyet 10% borjúembrió-szérummal, 2 mM L-glutaminnal, streptomicinnel és penicillinnel egészítettünk ki) beoltunk 2xl0-5 sejt/ml-rel. A tenyészetet Erlenmeyer lombikokban (Techne) inkubáljuk 37 °C-on, 5% CO2-ot tartalmazó levegőben.
A táptalajt háromnaponként cseréljük le. A humán EC-SOD-termelőképesség 0,65 pg.sejt *. 24 óra f Vizsgálatok a humán EC—SOD kifejeződésének kimutatására
1. Vizsgálat enzimmel összekapcsolt immunadszorbenssel (ELISA)
Mikrotitrálólemezeket (Nunclon, NUNC A/S, Dánia) bevonunk - 100 μΐ/lyuk töménységben - egy olyan oldattal, amely 15 μg/ml poliklonális nyúl antiEC-SOD IgG antitesteket (a 3. példa szerinti eljárással előállítva) tartalmaz egy pH 9,6 oldatban, 15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0,02% NaN3 mellett. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten, inkubálás után a lemezeket PBS-sel (10 mM Na-foszfát, 145 mM NaCl, pH 7,2) mossuk. A mikrotitrálólemezeket 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk, 200 μΐ/lyuk mennyiségben egy olyan oldattal, amely 3/tömeg/térfogat% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz PBS-ben, és PBSsel mossuk.
Mindegyik lyukba 100 μΐ hígított táptalajmintát adagolunk be, és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket 5% (térfogat/térfogat) TweenR 20-szal - PBSben - mossuk, majd 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk 100 μΐ/lyuk oldattal, amely 8 μg/ml egér monoklonális anti-EC-SOD antitestet (lásd a Z példát) tartalmaz 3% szarvasmarha-szérumalbuminos PBS-ben, 5% TweenR 20-szal - PBS-ben - való mosás után a lemezeket 1 órán át 37 °C-on egy peroxidázzal konjugált nyúl anti-egér antitesttel (Dakopatts A/S, Dánia) inkubáljuk, amelyet 3% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó PBS-sel oldottunk. A lemezeket 5% TweenR 20-szal (PBS-ben) mossuk, és 20 percen át szobahőmérsékleten sötétben inkubáljuk egy szubsztrátoldattal (50 mM nátrium-citrát, 100 mM
HU 215 937 Β nátrium-foszfát, 0,04 tömeg/térfogat% o-fenilén-diamin, 0,01% H2O2, pH 5,0). A reakciót úgy állítjuk le, hogy 25 μΐ 10%-os SDS-t adagolunk - lyukanként -, és 45 nm-en méljük az abszorpciót.
2. Az EC-SOD enzimaktivitás meghatározása A SÓD enzimaktivitást a Markiund által leírt módon [J. Bioi. Chem. 251, 2504-2507 (1976)] határoztuk meg. A humán EC-SOD-ra vonatkozó fajlagosság elérésére a mintákat SepharoseR-on rögzített anti-humán EC-SOD-zal való kezelés előtt és után elemezzük (lásd a 4. példát). Az EC-SOD-aktivitásnak azt a különbséget tekintjük, amely a mintának az antitestre való adszorpciója előtt és után mérhető aktivitása között mutatkozik.
9. példa
Az EC-SOD heparin által indukált felszabadulása a humán vérplazmában 200 NE/testtömeg-kg heparint (amelyet az AB
KABI-Vitrum cégtől, Stockholm, Svédország, szereztünk be) injektálunk i. v. két egészséges férfibe a) 34 éves és b) 40 éves -, akiket egy éjszakán át éheztettünk. Vérmintákat veszünk a heparininjekció előtt és az injekció után különböző időpontokban, a 7. ábrán feltüntetett módon. A vérmintákat Terumo Venoject vákuumkémcsövekbe mérjük be, amelyek antikoagulánsként EDTA-t tartalmaznak, és centrifugáljuk ezeket. Centrifugálás után a mintákat további vizsgálatig -80 °C-on tartjuk.
Továbbá 20-20 ml teljes vért veszünk le 3 egészséges embertől, és a mintákat az előbbiekben leírtak szerint EDTA csövekben tartjuk. A vért 2 egyenlő részre osztjuk, és az egyik részhez 30 NE/ml heparint adunk, a másik részhez pedig azonos térfogatú 0,15 M NaCl-t. 30 percen át szobahőmérsékleten való inkubálás után a mintákat centrifugáljuk, és a plazmát SOD-meghatározásra félretesszük.
A SOD-aktivitást KO2-t alkalmazó közvetlen spektrofotometriás módszerrel határozzuk meg [S. L. Markiund, J. Bioi. Chem. 251, 7504-7507 (1976)], bizonyos módosításokkal [Öhmann és Markiund, Clin. Sci. 70, 365-369 (1986)]. 1 egységnyi SOD-aktivitás 8,3 mg/ng humán CuZn- SOD-nak, 8,8 nm humán EC-SOD-nak és 65 ng szarvasmarha MnSOD-nak felel meg. A plazmában jelen levő izoenzimek megkülönböztetését SepharoseR 4B-n immobilizált humán CuZn SOD-zal és EC-SOD-zal szembeni antitestek segítségével érjük el, az Öhmann és Markiund [Clin. Sci. 70, 365-369 (1986)] által leírt módon.
Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. ezek azt jelzik, hogy 200 NE heparin i. v. injektálása - testtömeg-kg-ra számítva - arra vezet, hogy a plazma EC-SOD aktivitása gyorsan háromszorosára emelkedik. A maximális növekedés megközelítően már 5 perc után fellép. Az aktivitás magas szinten marad 15-30 percen át, majd fokozatosan csökken, és több, mint 6 óra eltelte után fokozatosan a kezdeti szintre csökken, i. v. injektált heparin nem befolyásolja a plazma CuZn SOD-tartalmát és a cianidrezisztens SOD-aktivitásokat.
A 8. ábrán mutatjuk be maximum 200 NE/testtömeg-kg i. v. heparin bevitelének hatását az EC-SODnak a plazmába való kiszabadulására. Az ábrákból látható, hogy növekvő heparindózisok az EC-SOD növekvő felszabadulását idézik elő. Láthatóan nem érünk el egy elkülönült platót, és valószínű, hogy 200 NE/testtömeg-kg feletti dózisok még magasabb EC-SOD felszabadulásra vezetnének. Etikai megfontolások alapján azonban eltekintettünk magasabb dózisok vizsgálatától.
Az in vivő kapott eredményekkel szemben heparinnak a teljes vérhez való hozzáadása - mint leírtuk nem befolyásolja a plazma EC-SOD-aktivitását. Heparinnak (5 NE/ml) közvetlenül a plazmához való hozzáadása sem idéz elő változást az EC-SOD-akti vitásban. Az eredmények arra mutatnak, hogy a plazma EC-SOD aktivitásának növekedését in vivő - amint ezt a 7. ábrán bemutatjuk - nem az okozza, hogy az enzim felszabadul a vérsejtekből, vagy hogy az EC-SOD, amely a plazmában jelen van, aktiválódik.
egészséges személytől (3 férfi, 2 nő) származó plazmamintákat kromatográfiának vetünk alá heparinSepharoseR-on (Pharmacia, Uppsala, Svédország). A kromatografálást szobahőmérsékleten végezzük olyan oszlopokon, amelyek 2 ml heparin-SepharoseR-t tartalmaznak. Eluálószerként pH 6,5 25 mM káliumfoszfát-puffert alkalmazunk. A mintákat (2 ml plazma) 4,2 ml/óra sebességgel visszük fel, és amikor az A280 érték az alapvonalat közelíti meg, a megkötött komponenseket lineáris NaCl-grádienssel eluáljuk a kálium-foszfát-pufferrel (0-1 M, össztérfogat 50 ml), 9 ml/óra sebességgel (lásd a 9. ábrát). A SODaktivitás átlagos kitermelése az eluátumban körülbelül 95%.
Felvitel előtt a plazmamintákat az eluálópufferrel egyensúlyozzuk ki kis SephadexR G 15 (PD-10) oszlopokon végzett kromatográfiával (amelyeket ugyancsak a Pharmacia, Uppsala, Svédország cégtől szerzünk be). A kromatografálás a minták 3-szoros hígítására vezet. A SOD-aktivitás kinyerése közel 100%.
A következő, I. táblázatban mutatjuk be 5 normál plazmamintában az EC-SOD A, B és C frakciója meghatározásának eredményeit. Azt találjuk, hogy a három frakció mennyisége a normál plazmában közel azonos nagyságú. A kromatogram szerint az EC-SOD-aktivitás átlagos kitermelése 95%. 3 frakcióra való szétválást nyilvánvalóan nem szekunder in vitro bomlás idézi elő, mivel a plazmaminta kromatográfiás viselkedése 3 napon át hűtőszekrényben való tárolás előtt és után azonos. A 9. ábrán mutatjuk be az i. v. heparin hatását az EC-SOD-ffakciók összetételére a plazmában. Azt találjuk, hogy heparin injekcióval való bevitele a vizsgálandó személybe csak a C frakció mennyiségének jelentős növekedéséhez vezet; az A és a B frakció mennyisége lényegében változatlan marad.
Egy második vizsgált személy esetében (az adatokat nem mutatjuk be) a heparininjekció hatása lényegében azonos volt. A C frakció mennyisége 7-ről 32 E/ml plazmaértékre emelkedett.
HU 215 937 Β
I. táblázat
A plazma EC-SOD szétválasztása A, B és Cfrakcióra
Kor/ncm EC-SOD, E/ml plazma Frakciók
A B C
40/hím 5,9 6,2 7,0
34/hím 5,2 4,4 5,1
32/hím 2,3 5,2 6,4
33/nó 2,3 5,9 8,3
29/nő 3,3 6,1 7,3
átlag ±SD 3,5±1,5 5,6±0,8 6,8 ±1,2
Az előbbiekben leírt kísérletek arra mutatnak, hogy a heparin i. v. injektálása a plazma EC-SOD aktivitásának azonnali növekedéséhez vezet. A heparin nem aktiválja az EC-SOD-t, és nem mutatható ki a vérsejtekből való kiszabadulás, ami arra mutat, hogy a felszabadult EC-SOD legvalószínűbb fonása az endoteliális sejtfelület.
Korábban hasonlóan kimutatták, hogy számos más, a heparin iránt affinitással rendelkező faktor - például a lipoprotein lipáz, májlipáz, diaminoxidáz, és a 4. lemezkefaktor - i. v. heparin beadására gyorsan felszabadul. A legtöbb ilyen esetben bizonyíték van arra, hogy a jelenség magyarázata abban rejlik, hogy a heparin indukálja a fehérje kiszorulását az endoteliális sejtfelületeken jelen levő heparin-szulfátról [A. Robinson-White et al., J. Clin. Invest 76, 93-100 (1985); C. Busch et al., Throm. Rés. 19, 129-137 (1980)]. Valószínű, hogy az EC-SOD felszabadulása ugyanígy magyarázható.
A felszabadulás során nem érünk el meghatározott platót maximum 200 NE/testtömeg-kg heparindózisokig; ez arra mutat, hogy több heparinra van szükség az EC-SOD felszabadításához, mint a lipoprotein lipáz, a diaminoxidáz, májlipáz és a 4. lemezkefaktor esetében. A heparin és a heparán-szulfát iránti affinitás viszonya az EC-SOD esetében alacsonyabb lehet, mint a többi fehérje esetében.
Alapesetben a humán plazma közel azonos mennyiségű A, B és C frakciót tartalmaz az EC-SOD-ban. Az i. v. heparin csak a nagy heparinaffinitású C frakciót szabadítja fel; nyilván ez az alak, amely affinitással rendelkezik az endoteliális sejtfelület iránt. Az így elért növekedés 4-6-szoros.
Valószínű azonban, hogy magasabb heparindózisok magasabb arányhoz vezetnének. Sokkal magasabb arányok érhetők el a lipoprotein lipáz, májlipáz, diaminoxidáz és a 4. lemezkefaktor esetében. Ezekkel a fehérjékkel összehasonlítva az EC-SOD endoteliális kötődése meglehetősen lazának tűnik. Lehetséges, hogy egyensúly áll fenn az EC-SOD C frakciója esetében a plazmában és az endoteliális sejtfelületeken jelen levő mennyiség között. Az érrendszerben jelen levő EC-SOD zöme láthatóan az endoteliális sejtfelületeken helyezkedik el.
Az EC-SOD A, B és C frakciója heparinaffinitásában megnyilvánuló különbség molekuláris háttere még nem tisztázott. Az aminosav-összetétel és az alegységek összetétele nem tér el lényegesen [S. L. Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 7634-7638 (1982)].
Antigénkülönbségek sem mutathatók ki [S. L. Markiund, Biochem. J. 220, 269-272 (1984)]. A negatív töltésű heparinhoz való kötődés nyilván nem általános ioncsere jellegű, mivel ioncserélő kromatográfiával nem mutatható ki különbség az A, B és C frakció között, és izoelektromos pontjuk azonos (pH 4,5). A különbség nem in vitro bomlással függ össze, mivel a plazma 3 napon át hűtőszekrényben való tárolása nem változtatja meg a heparin-SepharoseR-on megfigyelhető elúciós viselkedést.
Bár az in vivő bomlás egy lehetőség, feltételezhetjük, hogy az A és B frakció rendeltetése alapvetően a folyékony komponensek védelme, a C frakcióé pedig a sejtfelületek védelme.
A testben a legtöbb sejttípus felületén tartalmaz heparán-szulfátot és más glukóz-amino-glikán-szulfátot [M. Höök et al., Ann. Rév. Biochem. 53, 847-869 (1984)]. Lehetséges, hogy a szövetekben talált EC-SOD nagy része [S. L. Markiund, J. Clin. Invest. 74, 1398-1403 (1984)] ilyen anyagokon, a sejtmembránon és a kötőszövetben helyezkedik el. Az EC-SOD-nak a sejtfelületekhez való kötődése különösen hatásos módja lehet annak, hogy a sejteket megvédje az extracellulárisan képződött szuperoxidgyököktől.
Érdekes megjegyeznünk, hogy a CuZnSOD polilizinnel való helyettesítése - a negatív töltésű sejtmembránnal való kapcsolódás megkönnyítésére - nagymértékben fokozta az enzim azon képességét, hogy megvédje az aktivált polimorfonukleáris leukocitákat az autoinaktiválástól [M. L. Salin és J. M. McCord, Superoxide and Superoxide Dismutases, A. M. Michelson et al. kiadás, Academic Press 257-270 (1977)]. A Nocardia asteroides sejtmembránhoz kapcsolódó SOD-a hatásos védelmet nyújt a baktériumnak az aktivált polimorfonukleáris leukocitákkal szemben [B. L. Beaman et al., Infect. Immun. 47, 135-140(1985)].
Az EC-SOD C frakciója iránt affinitással nem rendelkező mikroorganizmusok - eltérően a test legtöbb sejtjétől - nem részesülnek az enzim által nyújtott védelemben.
Bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az aktivált leukociták és bizonyos körülmények között más típusú sejtek által ugyancsak termelt szuperoxidgyökök közvetve vagy közvetlenül kromoszómakárosodást okozhatnak [J. Emerit, Lymphokines 8, 413-424 (1983); A. B. Weitberg, S. A. Weitzman, Ε. P. Clark és T. P. Stossel, J. Clin. Invest 75, 1835-1841 (1985); H. C. Bimbóim és M. Kanabus-Kaminska, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 6820-6824 (1985)] és elősegítik a karcinogenezist [C. Borek és W. Troli, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 1304-1307 (1983); Y. Nakamura, N. H. Colburn és T. D. Gindhart, Carcinogenesis 6, 229-235 (1985)].
A felülethez kapcsolódó EC-SOD C frakciója hatékony védőanyagot képviselne ilyen következmények ellen in vivő. A legtöbb in vitro kísérleti rendszerben az EC-SOD C frakciója zöme valószínűleg nem érvénye19
HU 215 937 Β sítheti hatását, mivel a kötődés láthatóan túl gyenge. Az ilyen rendszerekben kapott adatok ezért nem szükségszerűen kvantitatíve vehetők figyelembe, ami a károsodás elleni in vivő védelem előre becslését illeti.
Parenterálisan bevitt CuZnSOD-ról kimutatták, hogy sok érdekes terápiás tulajdonsággal rendelkezik, amint erre az előbbiekben rámutattunk. A jelenlegi tapasztalatok arra mutatnak, hogy az EC-SOD bevitele még hatékonyabb védelmi módszert jelent a szuperoxidgyökök által az extracelluláris térben okozott sejtkárosodás ellen.
10. példa \-H-dal jelzett humán EC-SOD injektálása nyulakba
Az 1. és a 4-6. példában leírt módon köldökzsinórból EC-SOD-t állítunk elő, és a készítményt 125L-dal jelöljük, a ,jodogén” technika alkalmazásával [P. R. P. Salacinski et al., Anal. Biochem. 117, 136-146 (1981)]. A jelzett EC-SOD-t SepharcylR S-300-οη (Pharmacia, Uppsala, Svédország) végzett gélszűrés segítségével választjuk el a 125I-jodidtól. A kromatogramon az anyag ugyanott helyezkedik el, mint a nem jelzett EC-SOD; ez azt jelzi, hogy a molekula mérete nem változik.
A kapott, jelzett EC-SOD-t heparin-SepharoseR-on kromatografáljuk, az előbbiekben leírt módon. A további kísérletekhez csak magas heparinaffinitású anyagot, azaz a C frakciót használjuk fel.
A jelzett EC-SOD-t i. v. (körülbelül 3 kg tömegű) nyulakba injektáljuk. Vérmintákat veszünk a plazmában maradó radioaktivitás elemzésére. A plazmamintákat triklór-ecetsawal (amely a fehérjéket kicsapja) kezeljük, és centrifugálás után meghatározzuk a fehérjepelletek radioaktivitását. Ez kiküszöböli azt a hibaforrást, hogy meghatározzuk a plazmában lévő, a bomlott EC-SOD-ból származó radioaktív jodidot és jódtartalmú aminosavakat is. A nyulaknak az ivóvízben jódot adunk annak megelőzésére, hogy a fehéijék in vivő l25I-dal újra jelölődjenek.
Különböző időpontokban 2500 NE heparint injektálunk i. v. a nyulakba, a heparin hatásának tanulmányozására. Az eredményeket a 10. és a 11. ábrán mutatjuk be. A 100% annak a radioaktivitásnak felel meg, amelyet a plazmának elméletileg tartalmaznia kellene az adott mennyiség injektálása után, és feltételezve, hogy a teljes plazmatérfogat nyulakban a testtömeg 5%-a (például egy 3 kg -os nyúl 150 ml plazmával rendelkezik).
A 10. ábra mutatja be annak a kísérletnek az eredményeit, amelynek során a heparint a 125L-EC-SOD előtt, illetőleg 2, 5, 10 és 20 perccel utána injektáljuk.
A jelzett EC-SOD injektálása után gyors aktivitáscsökkenés következik be: 5-10 percen belül az elméleti maximum körülbelül 15%-ára. Ha a heparint az EC-SOD előtt injektáljuk, csaknem a teljes EC-SODaktivitás megmarad, és csak lassú csökkenés következik be. Ha a heparint 2, 5,10 és 20 perccel a l25L-EC-SOD után injektáljuk, gyors növekedés következik be a radioaktivitásban, és a csúcs eléri az elméleti maximumot.
All. ábra a heparin 2-72 óra után való injektálása eredményeit mutatja be. Az ábrából látható, hogy gyors aktivitásnövekedés következik be, amely 2 óra eltelte után az elméleti maximum körülbelül 50%-át éri el, és 72 óra eltelte után még mindig 3%-ot ér el.
A 2 óra eltelte utáni időpontban meglehetősen gyors csökkenés következik be - 50%-os -, de ezt követően az EC-SOD sokkal lassabban küszöbölődik ki. A 11. ábrán látható maximumok felhasználásával körülbelül 18 órás felezési idő (t 1/2) számítható. Emberben ez valószínűleg hosszabb, mivel kis állatokban csaknem valamennyi komponens átalakulása gyorsabb a testben.
A plazma EC-SOD gyors növekedése i. v. heparin beadása után (a maximumot 2 percen belül étjük el) arra mutat, hogy a felszabadult 125I-EC-SOD a véredények endotéliumán lokalizálódik; ez ugyanolyan következtetések levonását teszi lehetővé, mint a 8. példával kapcsolatban.
11. példa
A humán EC—SOD kötődése malacaortaendotéliumhoz
Egy vágóhídon malacaortákat gyűjtünk, ezeket szállítás közben jégen tartjuk, hosszirányban felnyitjuk, és két 1,5 cm vastag perspex tömb közé helyezzük. Az aorta felett elhelyezett blokkba, a luminális oldallal szemben 10 mm átmérőjű lyukakat fúrunk. így 10 mm átmérőjű nyílásokat alakítunk ki, amelyek alja aortaendotéliumot tartalmaz. Elkészítünk egy oldatot, amely 440000 cmp l25L-EC-SOD-ffakciót (a jelölést a 10. példában leírt módon hajtjuk végre) és nagy feleslegben nem jelzett EC-SOD C frakciót (121 pg/ml) tartalmaz.
Az oldószer Eagle-f. minimális esszenciális táptalaj, amelyet HEPES-szel pH 7,4-re pufferolunk és amely 0,5 pg/ml szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz. A három nyílás közül mindegyikbe 150 μΐ oldatot mérünk, és a rendszert rázatás közben 2,5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az oldatot leszívatjuk. Az üregeket kétszer mossuk 500 μΐ oldószerrel (2 perces rázatással), majd kétszer 500-500 μΐ olyan oldószerrel, amely 15 NE heparint tartalmaz (5 perces rázatással).
A radioaktivitás az oldatban (a 3 üreg átlaga, a hozzáadott aktivitás%-a) 80,4% (inkubált kezdeti oldat), 2,1% és 0,6% (mosóoldatok) és 6,5%, illetve 2,2% (mosás heparinnal).
Az egyik üregből vett oldatokban meghatározzuk a SÓD enzimaktivitását, és azt találjuk, hogy a 84,2% (82,7%) az eltávolított inkubált kiindulási oldatban és 7,1% (7,0%) az első heparinos mosóoldatban (a zárójelben a radioaktivitási adatok szerepelnek). így igen jó egyezés állapítható meg a SÓD enzimaktivitás és a meghatározott radioaktivitás között. Az adatok arra mutatnak, hogy a hozzáadott EC-SOD körülbelül 20%-a az aortaendotéliumhoz kötődik, és hogy az EC-SODaktivitás heparin hozzáadásával felszabadítható.
12. példa
A natív és a rekombináns EC—SOD kötődése a lektinekhez
Konkanavalin Al-t, lencselektint és búzacsíralektint SepharoseR-on rögzítve szerzünk be a Pharmacia AB (Uppsala, Svédország) cégtől. Mindegyik gélből 2 ml-t
HU 215 937 Β töltünk kromatográfiás oszlopokba. Eluálószerként 50 mM, pH 7,4 nátrium-foszfátot használunk, amely 0,25 M NaCl-t tartalmaz. A lektinoszlopokra 200 egységnyi (1,7 pg) natív köldökzsinór EC-SOD-t vagy rekombináns EC-SOD-t viszünk fel, 0,5 ml eluálópufferben oldva. Ezután 3,5 ml eluálópuffert adagolunk. Az oszlopokat 10 ml elúciós pufferrel mossuk. A megkötött EC-SOD-t ezután 14 ml, 0,5 M alfa-metil-mannoziddal (ConA SepharoseR és lencselektin SepharoseR), illetve 0,5 M Y-acctil-glukóz-aminnal (búzacsíralektin SepharoseR) eluáljuk. A SOD-aktivitást az oszlopokról elfolyó folyadékban határozzuk meg.
A natív EC-SOD 98%-a, és a rekombináns EC-SOD 97%-a kötődik a konkanavalin A-SepharoseR-hoz; a natív EC-SOD 99%-a és a rekombináns EC-SOD 96%-a, kötődik a lencselektin SepharoseR-hoz, míg a natív EC-SOD 61%-a kötődik a búzacsíralektin SepharoseRhoz, a rekombináns EC-SOD kötődése pedig 95%-os.
A konkanavalin A és a lencselektin iránti affinitás arra mutat, hogy mind a natív, mind a rekombináns EC-SOD tartalmaz glukozil- és mannozilmaradékokat a szénhidrátmaradékban. A búzacsíralektin iránti affinitás V-acetil-glukóz-aminil-maradékok jelenlétére utal. A natív EC-SOD heterogenitása - a búzacsíralektinhez való kötődést tekintve - valószínűleg azzal magyarázható, hogy az enzim szénhidrátrészének részleges lebomlása megy végbe, ha az a köldökzsinóron belül, vagy a köldökzsinór homogenizátumon belül van jelen az izolálás során.
Kisebb annak a kockázata, hogy a rekombináns enzim bontóenzimek hatásának van kitéve. Következésképpen mint ezeknek a lektinnel végzett vizsgálatoknak az eredményeiből levonható, a natív és a rekombináns EC-SOD szénhidrátrésze hasonló.
13. példa
A natív köldökzsinór eredetű, illetve a rekombináns EC-SOD elemzése heparin-Sepharose^-on
Körülbelül 500 egység (4,4 pg) natív EC-SOD C frakciót és rekombináns EC-SOD-t kromatografálunk heparin-SepharoseR-on, a 9. példában leírt módon. Azt találjuk, hogy mindkét enzim 0,52 M-nál eluálódik a NaCl-grádiensben. így a natív és a rekombináns EC-SOD azonosan viselkedik, és az eredmények arra mutatnak, hogy a rekombináns EC-SOD C típusú.
14. példa
Az EC-SOD-molekula réz- és cinktartalma
Natív, köldökzsinórból származó, illetve rekombináns eredetű EC-SOD Cu- és Zn-tartalmát atomabszorpciós spektrometriával határozzuk meg grafitkemencében, Perkin-Elmer Zeeman 303+HGA készülékkel. Összehasonlítjuk a készítmények EC-SOD fehérje mennyiségét, valamint Cu- és Zn-tartalmát. Azt találjuk, hogy 1 mól natív EC-SOD (tetramer) 3,97 mól Cu-t és 4,50 mól Zn-t tartalmaz. A rekombináns EC-SOD 3,98 mól rezet és 4,45 mól Zn-t tartalmaz 1 mól enzimre számítva. így tehát a két készítmény azonos mennyiségű Cu-t és Zn-t tartalmaz.
Az eredmények megerősítik azt a korábbi megfigyelést, hogy 4 mól Cu van jelen 1 mól EC-SOD-ban [Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 7634-7638 (1982)]. Annak a vizsgálatnak a során körülbelül 4 Znatomot ugyancsak találtak, de cink jelenléte az enzimben nem volt biztosan kimutatható annak következtében, hogy nem állt rendelkezésre elegendő mennyiségű anyag, és fennállt annak a lehetősége, hogy a Zn szennyezésként van jelen.
A jelen eredmények alapján most megállapítható, hogy az EC-SOD-molekula 4 Zn-atomot tartalmaz.
75. példa
Monoklonális antitestek előállítása humán
EC-SOD-zal szemben
Köldökzsinórból (4-6. példa) előállított EC-SOD C frakcióval egereket injektálunk. Néhány hónap elteltével az egerekbe 3 egymás utáni napon EC-SOD-t injektálunk. A 4. napon eltávolítjuk a lépet és dezintegráljuk. A lépsejteket egérmielóma sejtvonallal egyesítjük, standard fúziós technikák szerint [St. Groth és Scheidegger, J. Immunoi. Methods 35, 1 -21 (1980)].
Az anti-EC-SOD-t termelő ki ónokat ELISA technika segítségével azonosítjuk [Pouillard és Hoffman, Methods in Enzymology 92, 168 (1983)] és tovább klónozzuk. Végül két kiónt - „14,B7” és „6,H6” - választunk ki a nagyobb léptékű antitesttermelésre oly módon, hogy ezeket egér hasüregében tenyésztjük. Az antitesteket ezután az aszcitesz folyadékból adszorpcióval izoláljuk, Protein A-SepharoseR-zal, majd erről való deszorpcióval, a gyártó (Pharmacia, Uppsala, Svédország) által javasolt módon. Az oszlopról az elúciót pH 3,0 0,1 M glicin-HCl-lel végezzük. Az elúció után közvetlenül az egyesített IgG-t pH 7,0-ra titráljuk, majd 50 mM töménységű Tris-HCl-pufferrel - pH 8,0 - szemben dializáljuk, amely 0,15 NaCl-t és 0,02% NaN3-t tartalmaz.
16. példa
A monoklonális anti-EC—SÓD immobilizálása
CNB3-mal aktivált SepharoseR-on
Mivel azt találjuk, hogy a „6,H6” monoklonális antitest nagyon erősen megköti az n-EC-SOD-t (Kd nagyobb, mint 1012 M), az EC-SOD tisztítása céljából a „14B7” antitestet (Kd 106 M) választjuk. A CNBr-dal aktivált Sepharose-hoz való kapcsolás előtt az IgG oldatban (lásd a 15. példát) jelen lévő azidot el kellett távolítani, és a puffért „kapcsolópufferre” kellett kicserélni (=0,1 M Na-karbonát, pH 8,3+0,5 M NaCl). Ezt egy PD10 oszloppal végezzük, a gyártó (Pharmacia, Uppsala, Svédország) által javasolt eljárás szerint.
A CNBr-dal aktivált SepharoseR-t a gyártó által ajánlott módon duzzasztjuk és készítjük elő (Pharmacia, Uppsala, Svédország). A CNBr-dal aktivált SepharoseR-t ezután hozzáadjuk (kapcsolópufferben) az IgG oldathoz, olyan mennyiségben, amely előreláthatóan körülbelül 2 mg IgG/ml gél kapcsolási sűrűséget idéz elő. A keveréket körülbelül 2 órán át „rázógépen” inkubáljuk, szobahőmérsékleten. A puffért ezután eltávolítjuk a gélről, és meghatározzuk a visszamaradt fehérjét. 97% feletti kapcsolást érünk el.
HU 215 937 Β
Az IgG-vel kapcsolt gélen visszamaradó aktív csoportokat ezután blokkoljuk (inkubálás 1 M etanolaminnal pH 9,3-n 2 órán át, szobahőmérsékleten). Az etanol-amin és az adszorbeált fehéije feleslegét négyszer vagy ötször felváltva mossuk ki a „kapcsolópufferrel” (lásd az előbbieket) és pH 4,0 0,1 M Na-acetát+ 0,5 M NaCl oldattal. A gélt egy pH 7,4 oldatban tároljuk, amely 50 mM kálium-foszfátot, 0,5 M NaCl-t és 0,02% NaNj-t tartalmaz.
A monoklonális IgG-SepharoseR maximális kötőkapacitását úgy határozzuk meg, hogy inkubálást végzünk 3 órán át fölös mennyiségű, tisztított EC-SOD-zal (4-6. példa), majd a felülúszóban centrifugálás után meghatározzuk a visszamaradt EC-SOD-aktivitást. Az eredményeket összehasonlítjuk a SepharoseR 4B-vel végzett analóg inkubálás eredményeivel.
ml EC-SOD-hoz a „kapcsolópufferben” hozzáadunk 10, 50, 100 és 1000 μΐ-t egy 50%-os monoklonális anti-EC-SOD-SepharoseR-ból. Párhuzamosan ugyanebben a pufferben inkubálunk egy 80%-os SepharoseR szuszpenziót. Az oldatokat szobahőmérsékleten inkubáljuk 3 órán át. Centrifugálás után meghatározzuk a felülúszóban maradó EC-SOD-akti vitást.
A kapott számértékek felhasználásával kiszámítható, hogy a gél EC-SOD-megkötő kapacitása körülbelül 6000 E EC-SOD/ml 50%-os gélszuszpenzió (azaz 12 000 E/ml gél). Ez az érték az elméleti maximális kötőkapacitás körülbelül 6%-ának felel meg, és közel áll ahhoz, amely statisztikusan kapcsolt IgG-vel általában elérhető.
17. példa
A rekombináns EC-SOD izolálása monoklonális anti-EC-SOD-SepharoseR-ról kiindulva A teljes tisztítási eljárást -4 °C-on végezzük. Körülbelül 5 liter tenyészetet - amelyet CHO-Kl/pPsneo18 sejtekkel állítottunk elő -, körülbelül 300 E EC-SOD/ml (2,6 pg) aktivitással, centrifugálunk a sejthulladék és a kicsapódott anyagok eltávolítására. A közegben lévő EC-SOD megkötéséhez (1 500000 E) körülbelül 125 ml monoklonális anti-EC-SOD-SepharoseR-t használunk fel (16. példa).
Az IgG-Sepharose-t betöltjük egy 5 cm átmérőjű és körülbelül 6,5 cm magas kromatográfiás oszlopba. Az oszlopot a „mintafelvitel” előtt pH 7,0 50 mM nátriumfoszfát - 0,5 M NaCl-oldattal mossuk. A táptalajt 100 ml/óra sebességgel visszük fel, és méijük a 280 nmen megfigyelhető abszorpciót. Az IgG-Sepharose-hoz lazán kötődő fehérjéket pH 6,5 50 mM nátrium-foszfát - 0,5 M NaCl-oldattal eluáljuk. Az eluálást addig folytatjuk, amíg nagyon alacsony AD280 értéket érünk el. Az oszlopot ezután 650 ml, 50 mM AMP-vel (1-amino-metil-propanol) mossuk, amelyet klór-hidrát alakban alkalmazunk, pH 9,0-en, és az EC-SOD-t 1 liter 50 mM, pH 9,0 AMP-HCl-lel eluáljuk, amely KSCN-re 1 M töménységű. Az elúció sebessége 100 ml/óra. Meghatározzuk az EC-SOD-akti vitást, és a 280 nm-en mérhető abszorpciót, és az értékeket felvisszük az elúciós térfogattal szemben (12. ábra). A 280 nm-en a fehérjecsúcs után visszamaradó abszorpció a KSCN-től ered. Az
EC-SOD-akti vitáscsúcshoz tartozó frakciókat ezután összeöntjük. Az ionerősség csökkentésére és az enzim ioncserélő gélhez való kötődésének optimalizálására a következő lépésben az összeöntött anyagot körülbelül 14 térfogatnyi desztillált vízzel hígítjuk, és végül 2 M AMP-vel pH 8,5-re titráljuk.
A kinyerés az IgG affinitási lépésben 60%.
Körülbelül 10 ml DEAE-SephacelR-t 50 mM nátrium-foszfátban - pH 6,5 - mosunk, és betöltünk egy kromatográfiás oszlopba, amelynek átmérője 5 cm, és magassága körülbelül 0,5 cm. Az IgG oszlopról nyert hígított, összeöntött anyagot a DEAE-SephacelR-re adszorbeáltatjuk, oly módon, hogy 60 ml/óra sebességgel átszívatjuk az oszlopon. Az oszlopot ezután 50 mM, pH
8.5 nátrium-foszfát-oldattal mossuk, amíg a 280 nm-en mérhető abszorpció nullához közeli lesz. Az enzimet 50 mM nátrium-foszfátot és 0,25 M NaCl-t tartalmazó, pH 8,5 oldattal eluáljuk. Meghatározzuk a 280 nm-en mérhető abszorpciót és az EC-SOD-akti vitást, és az értékeket felvesszük az elúciós térfogattal szemben (13. ábra). A csúcshoz tartozó frakciókat összeöntjük, 50 mM, pH 6,5 nátrium-foszfáttal szemben dializáljuk és körülbelül 6 ml-re töményítjük be.
A kitermelés eben a lépésben körülbelül 100%.
Az EC-SOD-t végül heparin-SepharoseR-en végzett adszorpció/deszorpció segítségével tisztítjuk. 12 ml heparin-SepharoseR-t készítünk elő a gyártó által megadott módon (Pharmacia, Uppsala, Svédország) és pH
6.5 50 mM nátrium-foszfát 1 M NaCl-pufferrel, majd 50 mM pH 6,5 nátrium-foszfát-pufferrel mossuk. A heparin-SepharoseR gélt 2,5 cm átmérőjű (körülbelül
2.5 cm magasságú) kromatográfiás oszlopba töltjük. A DEAE-SephacelR oszlopról kinyert tömény, dializált összeöntött anyagot (6 ml, EC-SOD aktivitása körülbelül 185 000 E/ml) 10 ml/óra sebességgel visszük fel az oszlopra. Mérjük a 280 nm-en megfigyelhető abszorpciót.
Az elúciót 50 mM, pH 6,5 nátrium-foszfáttal kezdjük, 20 ml/óra elúciós sebességgel. Amikor a 280 nmen megfigyelhető abszorpció megközelíti az alapvonalat, az EC-SOD-t 0-1 M NaCl-grádienssel eluáljuk. A grádienselúcióhoz felhasznált oldat térfogata 270 ml.
Annak érdekében, hogy az EC-SOD-t megvédjük a magas NaCl-koncentrációtól, a frakciót (a gradiens elúció kezdetétől) desztillált vízzel hígítjuk. Az oszlop eluálóvégéről kiinduló műanyag csőbe egy T csövet illesztünk be, és az eluálófolyadékba az oszlop elúciós sebessége kétszeresének megfelelő sebességgel desztillált vizet szívatunk be.
Az EC-SOD-aktivitás 1 csúcsban (14. ábra) eluálódik, körülbelül ugyanolyan NaCl-koncentrácíó mellett, mint a 6. példában a C csúcs. A csúcs közepének megfelelő frakciókat összeöntjük (I. anyag). Az I. anyag fajlagos aktivitása (E/ml osztva AD280-nal) 88400. Az azonos eljárással köldökzsinór-homogenizátumból előállított natív EC-SOD fajlagos aktivitása (lásd az 1. példát) 88 200. Ezek a számértékek tehát csaknem azonosak, és valamivel magasabbak, mint a korábban közzétett értékek [Markiund, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 7634-7638 (1982)].
HU 215 937 Β
Ezt a két készítményt a 12-14. és a 18-20. példában elemezzük. A csúcsok oldalait ugyancsak összeöntjük (II. anyag). Az egyesített anyagokat betöményítjük, és dializáljuk pH 6,6 50 mM nátrium-foszfát-pufferrel szemben. Az EC-SOD kitermelése körülbelül 60% a hcparin-SepharoseR lépésben. Az egyesített anyagok összesen 600000 E-t (körülbelül 5,3 mg) tartalmaznak; ez 40%-a az eredeti aktivitásnak, amely a CHO-Kl/pPS3neo-l 8 tenyészetben jelen van.
18. példa
A natív és a rekombináns EC-SOD molekulaméretének meghatározása gélkromatográfia segítségével A köldökzsinórból nyert natív enzim és a rekombináns enzim molekulatömegét gélszűrés segítségével határozzuk meg Sephacyl S-300R oszlopon. Az oszlopot (1,6 cm átmérő, 96 cm hosszúság) pH 7,4 10 mM kálium-foszfát - 0,15 MNaCl-oldattal eluáljuk.
Az oszlop kalibrálására a következő vegyületeket
használjuk fel:
Név Molekulatömeg
ferritin 440000
IgG 150000
szarvasmarha-szérumalbumin 67 000
ovalbumin 43 000
kimotripszinogén 25 000
ribonukleáz 13 700
A natív, illetve a rekombináns EC-SOD-t a 136 000, illetve 151 000 molekulatömegnek megfelelő helyekről nyerjük ki az oszlopról. A rekombináns EC-SOD így valamivel nagyobbnak látszik. A különbség részben a natív enzim alegységei részleges lebomlásának tulajdonítható, amint ezt az SDS-PAGE kísérletekben a következőkben láthatjuk (19. példa).
A natív EC-SOD heterogén volta a búzacsíralektinen (12. példa) végzett kromatografálás során ugyancsak az enzim szénhidrátrésze részleges elbomlására mutat.
19. példa
A natív, köldökzsinórból származó és a rekombináns EC-SOD elemzése elektroforézissel grádiens poliakril-amid-gélben, nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében
A natív és a rekombináns EC-SOD alegységeinek molekulatömegét elektroforézissel hasonlítjuk össze grádiensgélekben (10-15%), SDS jelenlétében.
Mindegyik enzimből (n-EC-SOD és r-EC-SOD) körülbelül 25 pg-t fagyasztva szárítunk, majd feloldunk 50 pg mintaelegyben, amely 5% szacharózt, 5 mM EDTA-t, 5% 2-merkapto-etanolt és 2% SDS-t tartalmaz egy pufferben, amely 0,4 M bórsavat és 0,41 M Trist tartalmaz, pH 8,64.
A mintákat 5 percen át forraljuk, majd jéggel azonnal lehűtjük. Mindegyik mintából körülbelül 1 pl-t (körülbelül 0,2 pg) felviszünk egy Pharmacia Phast System grádiens (10-15%) poliakril-amid-gélre, majd egy ugyanilyen berendezésben folytatjuk le a futtatást, a gyártó által ajánlott módon (Pharmacia, Uppsala, Svédország, Phast System™ Separation Technique, 110. számú dosszié).
A kapott gélt Coomassie brilliánskékkel festjük meg (lásd a 15. ábrát). A sávok balról jobbra rekombináns EC-SOD-t, natív, köldökzsinór eredetű EC-SOD-t és a molekulatömeg markerek elegyét (94000, 67000, 43 000, 29000, 20100 és 14400) tartalmazzák. Az
EC-SOD-éhoz hasonló marker molekulatömege 29000. Az EC—SOD-okban szennyezések nem mutathatók ki. A rekombináns EC-SOD 1 sávot mutat, molekulatömege körülbelül 32000. A natív EC-SOD 2 sávot mutat; a nagyobbra láthatóan ugyanaz a mole25 kulatömeg jellemző, mint a rekombináns EC-SOD-ra, a kisebb molekulatömege pedig körülbelül 28 000.
A két sáv relatív mennyisége a natív EC-SOD esetében készítményenként változik, és a heterogenitás valószínűleg az enzim részleges lebomlásának tulaj do30 nítható.
20. példa
Összehasonlítás a natív és a rekombináns
EC—SOD aminosav-összetétele és az EC-SOD-t 35 kódoló cDNS-szekvenciából levezetett aminosavszekvencia között
A natív, köldökzsinórból származó EC-SOD és a rekombináns EC-SOD aminosav-összetételét a II. táblázatban mutatjuk be. A triptofánt nem foglaltuk bele az összehasonlításba, mivel ez nem mutatható ki megbízhatóan egy aminosavanalizátorban. A táblázatból látható, hogy a natív és a rekombináns enzim összetétele csaknem azonos.
A cDNS-szekvenciából levont számadatok egyezése ugyancsak jó. Az eredmények arra mutatnak, hogy a natív és a rekombináns enzim láthatóan azonos, és a cDNS-szekvenciából levont aminosavszekvencia korrekt.
II. táblázat
A humán EC-SOD aminosav-összetétele % maradék/összes maradék
Aminosav a DNS-szekvenciából natív enzim rekombináns enzim
Aminosav +Trp -Trp -Trp -Trp
Phe 3,2 3,2 3,2 3,2
Leu 6,3 6,5 6,8 6,7
Ile 1,8 1,8 1,6 1,4
HU 215 937 Β
II. táblázat (folytatás)
Aminosav a DNS-szekvenciából natív enzim rekombináns enzim
Aminosav 'Trp -Trp -Trp -Trp
Met 0,9 0,9 1,2 0,9
Val 7,7 7,8 6,4 6,2
Ser 6,8 6,9 6,8 7,8
Pro 5,9 6,0 6,1 6,2
Thr 3,2 3,2 2,9 3,4
Alá 12,2 12,4 13,1 12,5
Tyr 1,4 1,4 1,5 1,4
His 4,1 4,1 4,2 3,9
Gin 5,0 5,1 - -
Glu 6,8 6,9 - -
Glx 11,7 12,0 11,7 12,1
Asn 3,2 3,2 - -
Asp 5,9 6,0 - -
Asx 9,0 9,2 9,3 9,3
Lys 2,3 2,3 1,9 2,5
Cys 2,7 2,8 2,8 2,8
Trp 2,3 - - -
Arg 9,0 9,2 9,8 9,4
Gly 9,9 10,1 10,5 10,4
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (63)

1. Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz (EC-SOD) előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-t kódoló nukleinsavat rekombináns sejtekben expresszálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű DNS-szekvenciát vagy ennek egy - a natív EC-SOD szuperoxid-diszmutáló tulajdonságával bíró polipeptidet kódoló - változatát expreszszáljuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy komplementer DNS eredetű DNS-szekvenciát expresszálunk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomi eredetű DNS-szekvenciát expresszálunk.
5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állati - előnyösen emlős - eredetű DNSszekvenciát expresszálunk.
6. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy emberi eredetű DNS-szekvenciát expreszszálunk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szintetikus eredetű DNS-szekvenciát expreszszálunk.
8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vegyesen genomi és szintetikus eredetű, vegyesen genomi és komplementer DNS eredetű, vagy vegyesen szintetikus és komplementer DNS eredetű DNS-szekvenciát expresszálunk.
9. Eljárás EC-SOD előállítására, azzal jellemezve, hogy az EC-SOD-t egy sejtvonalból izoláljuk.
10. Eljárás EC-SOD előállítására, azzal jellemezve, hogy az EC-SOD-t placentából vagy köldökzsinórból izoláljuk.
11. Eljárás EC-SOD-t hordozó, replikálható expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-t kódoló DNS-szekvenciát replikálható expressziós vektorba építünk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű DNS-szekvenciát vagy ennek egy - a natív EC-SOD szuperoxid-diszmutáló tulajdonságával bíró polipeptidet kódoló - változatát építjük replikálható expressziós vektorba.
13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autonóm módon replikálódó expressziós vektorba építjük a kódolószekvenciát.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektorként plazmidot, fágot, kozmidot, minikromoszómát vagy vírust alkalmazunk.
15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektorként a gazdasejt genomjába integrálódó vektort alkalmazunk.
16. Eljárás EC-SOD kiválasztására képes sejtvonal előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD kiválasztására képes sejtekből sejtvonalat állítunk elő.
HU 215 937 Β
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős - előnyösen emberi - eredetű sejteket alkalmazunk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emberi vérből, emberi tüdőből, bőrből, véredényből, hasnyálmirigyből, méhből, prosztatamirigyből, placentából, köldökzsinórszövetből vagy burjánzó szövetből származó sejteket alkalmazunk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endoteliális vagy fibroblaszt sejteket alkalmazunk.
20. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy 11-15. igénypontok bármelyike szerint előállított vektort gazdasejtbe juttatunk.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektort prokarióta sejtbe, előnyösen baktériumba, egysejtű eukarióta organizmusba, előnyösen gombába vagy élesztőbe, vagy soksejtű szervezetből - előnyösen állatból vagy növényből - származó sejtbe juttatjuk.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektort emlőssejtbe juttatjuk.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektort CHO-Kl/p PS3neo-18 jelű, ECACC 86082701 számon, az Állati Sejttenyészetek Európai Gyűjteményében (ECACC) letétbe helyezett sejtbe juttatjuk.
24. Eljárás a (ΙΠ) képletnek megfelelő DNS-szekvenciájú - szignálszekvenciát is tartalmazó EC-SOD-t kódoló DNS-fragmentum, vagy ennek natív EC-SOD szuperoxid-diszmutáló tulajdonságával bíró polipeptidet kódoló változata előállítására, azzal jellemezve, hogy a fragmentumot enzimatikus és/vagy kémiai szintézissel előállítjuk.
25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-fragmentumot komplementer DNSszintézissel állítjuk elő.
26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy genomi eredetű DNS-fragmentumot állítunk elő.
27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős eredetű DNS-fragmentumot állítunk elő.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emberi eredetű DNS-fragmentumot állítunk elő.
29. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szintetikus eredetű DNS-fragmentumot állítunk elő.
30. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vegyes genomi és szintetikus eredetű, vegyes genomi és komplementer DNS eredetű, vagy vegyes komplementer DNS és szintetikus eredetű DNS-fragmentumot állítunk elő.
31. Eljárás EC-SOD előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-t termelő emlős sejtvonalat az EC-SOD kiválasztására alkalmas körülmények között tenyésztünk, és a kiválasztott EC-SOD-t kinyerjük.
32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős sejtvonalként humán sejtvonalat alkalmazunk.
33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős sejtvonalként humán vérből, humán tüdőből, bőrből, hasnyálmirigyből, véredényből, méhből, prosztatamirigyből, placentából, köldökzsinórszövetből vagy burjánzó szövetből származtatott sejtvonalat alkalmazunk.
34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtvonalként endoteliális vagy fibroblaszt sejtből származtatott sejtvonalat alkalmazunk.
35. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonalat az EC-SOD-nak a sejtfelületről történő felszabadulását indukáló mennyiségű heparin vagy heparinanalóg, előnyösen heparán-szulfát, glukóz-amino-glikán-szulfát, dextrán-szulfát vagy egyéb, erősen negatív töltésű vegyület jelenlétében tenyésztjük.
36. Eljárás rekombináns EC-SOD előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-fragmentumot beépítünk egy kiválasztott gazdasejtben replikálódni képes vektorba, a kapott rekombináns vektort gazdasejtbe juttatjuk, majd a gazdasejteket alkalmas táptalajban vagy táptalajon, az EC-SOD expresszálódására alkalmas körülmények között tenyésztjük, és az EC-SOD-t kinyerjük.
37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-fragmentumként szignálpeptidet kódoló szignálszekvenciát is tartalmazó DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-fragmentumot alkalmazunk.
38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-fragmentumként komplementer eredetű DNS-fragmentumot alkalmazunk.
39. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket az EC-SOD sejtfelületről való felszabadulását kiváltó mennyiségű heparin vagy egy heparinanalóg, például heparán-szulfát, vagy más glukózamino-glikán-szulfát, dextrán-szulfát vagy egyéb erősen negatív töltésű vegyület jelenlétében tenyésztjük.
40. Eljárás EC-SOD kinyerésére, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-aktivitást tartalmazó biológiai anyagot EC-SOD elleni rögzített antitesteket vagy ezek immunológiai determinánsát tartalmazó mátrixon adszorbeáltatunk, az EC-SOD-aktivitást eluáljuk, majd az EC-SOD-aktivitást tartalmazó frakciókat összeöntjük, és kívánt esetben további tisztítást hajtunk végre.
41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mátrix előállításához az EC-SOD vagy immunológiai determinánsa ellen antitesteket képzünk, és az antitesteket alkalmas mátrixon rögzítjük.
42. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként poliklonális vagy monoklonális antitesteket alkalmazunk.
43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagként egy emlősszövetből származó kivonatot vagy vért alkalmazunk.
44., A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetként emberi, szarvasmarha-, kutya-, sertés- vagy lószövetet, vagy vért alkalmazunk.
45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetként humán tüdő-, hasnyálmirigy-, méh-, prosztatamirigy-, placenta- vagy köldökzsinórszövetet alkalmazunk.
46. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az EC—SÓD extrakcióját olyan pufferrel vé25
HU 215 937 Β gezzük, amely kálium-bromidot vagy más kaotrop sót például ammónium-szulfátot vagy kálium-tiocianátot tartalmaz.
47. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagként a 31. igénypont szerinti eljárás termékét alkalmazzuk.
48. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagként a 36. igénypont szerinti eljárás termékét alkalmazzuk.
49. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyesített eluátumot egy mátrixra adszorbeáltatjuk, és az EC-SOD-aktivitást a mátrixról eluáljuk, majd összeöntjük.
50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heparint vagy heparinanalógot, például heparán-szulfátot, vagy más glükóz-amino-glikán-szulfátot, dextrán-szulfátot vagy más, erősen negatív töltésű vegyületet tartalmazó mátrixot alkalmazunk.
51. Eljárás hatóanyagként EC-SOD-t tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-t és gyógyászati szempontból elfogadható adalékanyagot, hígítót és/vagy vivőanyagot elegyítünk.
52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-ként 1-8., 9. vagy 10. igénypontok bármelyike szerint előállított EC-SOD-t alkalmazunk.
53. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy EC-SOD-ként 40. igénypont szerinti eljárással kinyert EC-SOD-t alkalmazunk.
54. Az 1-53. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további komponensként heparint, heparán-szulfátot, más glükóz-amino-glikánszulfátot, dextrán-szulfátot vagy más, erősen negatív töltésű vegyületet is elegyítünk a készítményhez.
55. Az 51-53. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további komponensként katalázt vagy más antioxidánst is elegyítünk a készítményhez.
56. Eljárás hatóanyagként EC-SOD-t tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy 31. vagy 40. igénypont szerinti eljárással előállított EC-SOD-t a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük, és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
57. Az 56. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40. igénypont szerinti eljárással kinyert EC-SOD-t alkalmazunk.
58. Az 56. vagy 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az EC-SOD-t heparinnal, heparánszulfáttal, egyéb glukóz-amino-glikán-szulfáttal, dextrán-szulfáttal vagy egyéb, erősen negatív töltésű vegyülettel is összekeveijük.
59. Az 56. vagy 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az EC-SOD-t katalázzal vagy más antioxidánssal is összekeverjük.
60. Eljárás EC-SOD vagy immunológiai determinánsa elleni monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD vagy immonológiai determinánsa ellen antitestet termeltetünk.
61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestet megtisztítjuk.
62. Eljárás EC-SOD vagy immunológiai determinánsa ellen termeltetett monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy EC-SOD vagy immunológiai determinánsa elleni antitesteket termelő hibridóma sejtvonalat alkalmas táptalajon tenyésztünk, és az antitesteket a táptalajból kinyerjük.
63. Eljárás (II) képletű, szignálpeptidet kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát enzimatikus és/vagy kémiai szintézis útján előállítjuk.
HU864441A 1985-09-03 1986-09-02 Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz, és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására HU215937B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK402785A DK402785D0 (da) 1985-09-03 1985-09-03 Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym
PCT/DK1986/000098 WO1987001387A1 (en) 1985-09-03 1986-09-02 A superoxide dismutase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46059A HUT46059A (en) 1988-09-28
HU215937B true HU215937B (hu) 1999-03-29

Family

ID=8129425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU864441A HU215937B (hu) 1985-09-03 1986-09-02 Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz, és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5130245A (hu)
EP (1) EP0236385B1 (hu)
JP (2) JP2643934B2 (hu)
KR (1) KR920008738B1 (hu)
CN (1) CN1030718C (hu)
AT (1) ATE69466T1 (hu)
AU (1) AU598756B2 (hu)
CA (1) CA1340329C (hu)
DE (1) DE3682505D1 (hu)
DK (2) DK402785D0 (hu)
FI (1) FI100252B (hu)
HU (1) HU215937B (hu)
IE (1) IE59078B1 (hu)
IL (1) IL79926A (hu)
NO (1) NO301132B1 (hu)
SU (1) SU1779263A3 (hu)
WO (1) WO1987001387A1 (hu)
ZA (1) ZA871267B (hu)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0213628A3 (en) * 1985-09-03 1988-09-21 Yeda Research And Development Company, Ltd. Expression of superoxide dismutase in eukaryotic cells
US6610520B1 (en) 1985-11-22 2003-08-26 Bio-Technology General Corp. Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby
JPS63132820A (ja) * 1986-11-22 1988-06-04 Minoru Nakano 口腔用組成物
EP0676472A1 (de) * 1987-03-14 1995-10-11 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD)
US5260204A (en) * 1987-03-14 1993-11-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
ATE130196T1 (de) * 1987-03-27 1995-12-15 Bio Technology General Corp Menschliches mangansuperoxiddismutase und behandlungsverfahren.
DK310788A (da) * 1987-06-09 1988-12-10 Int Cardiovascular Med Inc Praeparat indeholdende superoxid-dismutase, dets fremstilling og anvendelse til behandling af global iskaemi
JPH01238537A (ja) * 1988-03-18 1989-09-22 Toyo Jozo Co Ltd 肝障害治療剤
JPH01246225A (ja) * 1988-03-28 1989-10-02 Toyo Jozo Co Ltd 膵炎治療剤
JPH0262829A (ja) * 1988-05-18 1990-03-02 Nippon Kayaku Co Ltd 虚血に基づく傷害の予防及び治療剤
DK455789D0 (da) * 1989-09-15 1989-09-15 Symbicom Ab Polypeptid
DE4038563A1 (de) * 1990-12-04 1992-06-11 Gruenenthal Gmbh Verwendung von superoxiddismutasen zur prophylaxe und/oder behandlung von organversagen bei risikopatienten mit polytrauma
DE4239877C1 (de) * 1992-11-27 1994-03-17 Boehringer Ingelheim Int Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung
EP0627486A1 (en) * 1993-06-04 1994-12-07 N.V. Innogenetics S.A. New extracellular superoxide dismutase, a process for preparing the same and compositions containing the same
DK75393D0 (da) * 1993-06-24 1993-06-24 Symbicom Ab Production of protein
US5994339A (en) * 1993-10-15 1999-11-30 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Oxidant scavengers
US6127356A (en) 1993-10-15 2000-10-03 Duke University Oxidant scavengers
US5747026A (en) * 1993-10-15 1998-05-05 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Antioxidants
DE4336641C2 (de) * 1993-10-22 1995-09-07 Deutsches Rheuma Forschungszen Verwendung von Superoxid-Dismutase (SOD) zur Behandlung retroviraler Erkrankungen
WO1996009053A1 (en) * 1994-09-20 1996-03-28 Duke University Oxidoreductase activity of manganic porphyrins
US5942245A (en) 1994-11-04 1999-08-24 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Application of SOD in liposomes
MY128323A (en) * 1996-09-30 2007-01-31 Otsuka Pharma Co Ltd Thiazole derivatives for inhibition of cytokine production and of cell adhesion
AU8671798A (en) * 1997-07-30 1999-02-22 Betagene, Inc. Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
US6171856B1 (en) 1997-07-30 2001-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
DE69813898T2 (de) 1997-11-03 2004-03-11 Duke University Substituierte porphyrinen
WO1999055388A1 (en) 1998-04-24 1999-11-04 Duke University Substituted porphyrins
DE60024588T2 (de) 1999-01-25 2006-08-17 National Jewish Medical And Research Center, Denver Substituierte porphyrine und deren therapeutische verwendungen
JP2004520380A (ja) * 2001-01-19 2004-07-08 ナショナル・ジュウィッシュ・メディカル・アンド・リサーチ・センター 癌治療本出願は、２００１年１月１９日に出願の仮出願番号第６０／２６２，３９０号の優先権を主張し、その全ての内容は、参照により本願明細書に援用したものとする。
FI20010898A0 (fi) * 2001-04-30 2001-04-30 Ylae Herttuala Seppo Ekstrasellulaarinen superoksididismutaasi (EC-SOD) geeniterapia restenoosoin ehkäisemiseksi
WO2002098431A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 National Jewish Medical And Research Center Oxidant scavengers for treatment of diabetes or use in transplantation or induction of immune tolerance
JP2006503605A (ja) * 2002-04-30 2006-02-02 フイット バイオテク オーワイジェイ ピーエルシー 医療装置
WO2003103680A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 Duke University Substituted porphyrins
KR100676502B1 (ko) * 2003-10-31 2007-02-02 김태윤 Ｅｃ ｓｏｄ 및 세포 침투성 ｅｃ ｓｏｄ와 이들의 용도
CN100345973C (zh) * 2004-11-18 2007-10-31 中国农业大学 超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体
MX2010012593A (es) 2008-05-23 2011-03-04 Nat Jewish Health Metodos para el tratamiento de lesion asociada con exposicion a especie alcalina.
US20100098768A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 Clarkson University Method of neuroprotection from oxidant injury using metal oxide nanoparticles
CN102660580A (zh) * 2012-05-18 2012-09-12 深圳市北科生物科技有限公司 Sod基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用
MX363474B (es) * 2013-03-15 2019-03-25 Baxter Int Inmovilizacion de un agente activo en un sustrato.
EP3003413B1 (en) 2013-06-07 2017-12-13 Baxter International Inc. Immobilization of an active agent on a substrate using compounds including trihydroxyphenyl groups
CN104342409B (zh) * 2014-06-17 2018-05-25 吉林金梓源生物科技股份有限公司 重组人参超氧化物歧化酶的制备方法
CN104342408B (zh) * 2014-06-18 2018-05-25 吉林金梓源生物科技股份有限公司 重组蛹虫草超氧化物歧化酶的制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK145950C (da) * 1979-05-17 1983-09-26 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til isolering af cu,zn-superoxid-dismutase fra vandige oploesninger indeholdende dette enzym sammen med ledsagende proteiner
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
JPS56102787A (en) * 1980-01-18 1981-08-17 Mamoru Sugiura Preparation of human placenta superoxide dismutase
JPS5729285A (en) * 1980-07-30 1982-02-17 Takeda Chem Ind Ltd Superoxide dismutase and its preparation
JPS57155991A (en) * 1981-03-23 1982-09-27 Green Cross Corp:The Preparation of superoxide dismutase derived from human placenta
DE3377363D1 (en) * 1982-03-31 1988-08-18 Ajinomoto Kk Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells
IT1150598B (it) * 1982-12-14 1986-12-17 Ines Bianchi Procedimento per la purificazione della superossidodismutasi mediante cromatografia di affinita'
DE3486493T2 (de) * 1983-10-03 2003-05-22 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Klonieren von Superoxiddismutase und Expression in Mikroorganismen
JPS61111690A (ja) * 1984-11-06 1986-05-29 Ube Ind Ltd 組換えｄｎａおよびその用途
JPS61139390A (ja) * 1984-12-13 1986-06-26 Nippon Kayaku Co Ltd ひとｓｏｄをコ−ドする新規ｄｎａおよびそれを有する微生物

Also Published As

Publication number Publication date
US5130245A (en) 1992-07-14
WO1987001387A1 (en) 1987-03-12
EP0236385B1 (en) 1991-11-13
JPS63501473A (ja) 1988-06-09
FI871853A0 (fi) 1987-04-28
AU598756B2 (en) 1990-07-05
DK224587D0 (da) 1987-05-01
CN1030718C (zh) 1996-01-17
NO871816D0 (no) 1987-04-30
HUT46059A (en) 1988-09-28
CA1340329C (en) 1999-01-26
NO301132B1 (no) 1997-09-15
JP2688190B2 (ja) 1997-12-08
KR880700066A (ko) 1988-02-15
DK402785D0 (da) 1985-09-03
IE862342L (en) 1987-03-03
FI871853A (fi) 1987-04-28
JP2643934B2 (ja) 1997-08-25
EP0236385A1 (en) 1987-09-16
DE3682505D1 (de) 1991-12-19
JPH08317793A (ja) 1996-12-03
ZA871267B (en) 1987-10-28
IL79926A0 (en) 1986-12-31
KR920008738B1 (ko) 1992-10-08
NO871816L (no) 1987-07-02
CN86106774A (zh) 1987-07-15
AU6370886A (en) 1987-03-24
SU1779263A3 (ru) 1992-11-30
DK224587A (da) 1987-05-01
IE59078B1 (en) 1994-01-12
IL79926A (en) 1994-10-07
FI100252B (fi) 1997-10-31
ATE69466T1 (de) 1991-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215937B (hu) Eljárás extracelluláris szuperoxid-diszmutáz, és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
US5788961A (en) Superoxide dismutase
EP0593435B1 (en) A polypeptide
CA1339299C (en) Human manganese superoxide dismutase dna; its expression; method of recovering human manganese superoxide dismutase, human manganese superoxide dismutase analogs or human manganese superoxide dismutase mutants; uses;compositions; and methods of treatment
EP0414915A1 (en) New superoxide dismutase
AU671728B2 (en) Methods of production of analogues of human Cu/Zn superoxide dismutase
Åkerström et al. rA1M-035, a Physicochemically improved human recombinant α1-microglobulin, has therapeutic effects in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury
CA1341362C (en) Human manganese superoxide dismutase cdna, its expression in bacteria and method of recovering enzymatically active human manganese superoxide dismutase
EP0173280B1 (en) Plasmids containing lambda pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, hosts containing the plasmids and related methods
EP0594311B1 (en) Process for preparing a metastasis-inhibiting protein and uses thereof.
US7740839B2 (en) EC SOD and cell transducing EC SOD and use thereof
US5246847A (en) Polypeptide analogs of human manganese superoxide dismutase and compositions and complexes thereof
US5084390A (en) Superoxide dismutase polymers
NZ219393A (en) Extracellular superoxide dismutase and its production by genetic engineering
PT84387B (pt) Processo para a preparacao de superoxido-dismutase e de vectores e linhas de celulas que a segregam

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee