CN1030718C - 一种超氧化物歧化酶 - Google Patents

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Abstract

一种原见于细胞外体液的超氧化物歧化酶[并因而被称为细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)]，是通过培养一种最好是哺乳动物来源的、产生EC-SOD的细胞系并回收由该细胞分泌的EC-SOD制得的，或者是将编码EC-SOD的一个DNA序列插入适当载体中，将重组载体引入宿主细胞、培养该细胞并回收所产生的EC-SOD而制得的。
EC-SOD可用于预防或治疗与超氧化物基团的存在或形成有关的疾病或紊乱。

Description

一种超氧化物歧化酶
本发明涉及一种超氧化物歧化酶，产生超氧化物歧化酶的方法和超氧化物歧化酶在治疗处理中的应用。
在氧与身体中的生化物质如蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸等之间的反应时，存在着一种很强的热力学驱动力。如果这些反应进行得很彻底，则形成终产物水、二氧化碳和一些废产物，并同时释放出大量能量。生物物质的氧化是活体生物中能量的来源。值得庆幸的是，由于反应屏障的存在，这类反应自发进行得非常缓慢。中间代谢的酶能克服这些屏障，並且与氧的最终反应发生于线粒体中，在那儿，氧被四个电子还原成水、而不释放出任何中间产物。此反应通过电子传递链中的细胞色素氧化酶复合物的协助而完成的，能量则被形成的ATP所捕获。
然而，氧至水的直接的四步还原几乎是独一无二的，当氧自发地或在酶的催化作用下发生反应时，由于机械原因，它被迫每次进行一步(酶催化的反应有时需要两步)。以下面所表示的次序形成一系列有毒性的反应中间产物，即超氧化物基(O- 2·)、过氧化氢(H2O2)和羟基(OH·)
超氧化物阴离子基            过氧化氢       羟基
其中的两个，即O- 2·和OH·，具有单个未配对的电子，它们因此称为游离基。在身体的氧消耗中，估计有百分之几导致毒性的还原中间产物的形成。氧的毒性效应主要由于这些中间产物的作用所导致。
氧本身与大多数生化物质的反应缓慢。一般说来，毒性反应是由于产生了氧基而引起的，这些氧基本身对生化物质有直接的破坏作用，或者启动涉及氧的一系列反应。
某些化合物与氧自发地发生反应，即它们能进行自身氧化作用。几乎所有的自身氧化都导致有毒的还原中间产物的形成。肾上腺素、邻苯三酚和其它一些化合物的自身氧化导致形成超氧化物基团，从氧合血红蛋白形成高铁血红蛋白时，也释放超氧化物基团，某些氧化酶也形成过氧化物。这些酶中最重要的是将次黄嘌呤和黄嘌呤氧化成尿酸的黄嘌呤氧化酶。线粒体中一小部分氧的还原导致形成超氧化物，并随后形成过氧化氢，微粒体中的细胞色素P450系统也释放出超氧化物。当电离辐射穿过含有氧的水溶液时，所形成的基团中浓度最高的是超氧化物基团。吞噬白细胞(多形核白细胞、单核白细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞等)活化时释放出大量超氧化物。这样形成的毒性氧化还原产物对于这些细胞的杀伤能力来说是至关重要的，但它们也可能导致对周围组织的损害作用。
通过歧化反应途径形成超氧化物时，总有过氧化氢形成。身体中的大多数氧化酶直接将氧还原成过氧化氢。
中间产物中最具有反应活力的是羟基基团。当过氧化氢与Fe2+或Cu+离子进行反应时就能形成羟基基团，此反应即所谓的Fento氏反应
    (Cu+)  (Cu2+)
这些过渡金属离子也可能催化过氧化氢和超氧化物之间形成羟基基团的反应，即所谓的Haber-Weiss氏反应。
Figure C8610677400071
电离辐射分裂水分子产生氢原子和羟基基团，这样形成的羟基基团是电离辐射导致生物损伤的主要原因。
由上可见，在同一时间内，在正常情况下有好几种还原产物形成。例如，在黄嘌呤氧化酶的系统中，直接通过与超氧化物的歧化反应，不仅形成超氧化物，还有过氧化氢形成。然后，这些化合物可以进一步反应形成羟基基团。能够证实黄嘌呤氧化酶系统损伤蛋白质，碳水化合物和核酸，并且杀伤细胞。在生化物质中，多元不饱和脂类对氧的毒性看来是最敏感的。氧的中间产物能启动涉及分子氧的系列反应，即所谓的脂过氧化反应。这样形成的氢过氧化脂及其降解产物不仅破坏细胞膜的功能，还可能损伤其它的细胞组分。
生活在氧环境中的生物机体已被迫发展出了若干抵抗氧的毒性还原代谢物的保护机制。这些保护因素中包括超氧化物歧化酶(SOD)，它能够歧化超氧化物基团，并发现这种酶以相对稳定的含量存在于哺乳动物的细胞和组织中。这些酶中人们最为了解的是CuZnSOD，它是一个分子量为33,000的二聚体，含有两个铜和两个锌原子。发现CuZuSOD存在于胞液和线粒体之间。MnSOD是一个分子量为85,000的四聚体，含有4个Mn原子，主要在线粒体基质中找到，直到最近，人们还认为在胞外液体中没有SOD活性。
然而，本发明者最近证明，在胞外液体(如血浆、淋巴液、滑液和脑脊髓液等)中有超氧化物歧化酶存在，它被称为EC-SOD(胞外超氧化物歧化酶)。在人体中，每毫升血浆的活力小于每克组织SOD总活力的1％，但它似乎受到身体积极的调节(Marklund等人，Clin.Chim.Acta 126，1982，41-51页)。对外源凝集素的亲和力(参见实例12)表明，与CuZuSOD不同，此酶是一种糖蛋白。它似乎是由四个相同的非共价结合的亚基组成，总分子量(四聚体)为135,000，具有每个亚基一个Cu原子和一个Zu原子的金属含量(参见实例14)。此酶与其它含铜的SOD一样，催化超氧化物基团的一级歧化反应。
它的比活很高，这可能是由于分子中四个铜原子的作用所致。在肝素-琼脂糖柱上进行层析后，此酶分成三个组分，组分A没有任何亲和力，组分B具有微弱的亲和力，而组分C具有很强的肝素亲和力。与CuZnSOD和MnSOD不与肝素-琼脂糖结合的表现不同，EC-SOD具有一定的疏水性能，这可以表明它能与细胞膜亲和。对肝素的亲和性通常表明对于细胞表面尤其是在血管内皮上发现的硫酸乙酰肝素有亲和性。因此，可以认为EC-SOD部分位于细胞表面，部分位于胞外液体中(参见下面的实例9-11)。它的氨基酸组成和抗原活性与迄今为止所研究的SOD同功酶很不相同(Marklund，Pro.Nat Acad.Sci.USA79，1982，7634-7638页；Biochem.J.220，1984，269-272页)。编码EC-SOD的信使RNA包含有一个编码信号肽的序列(参见实例8)，这表明EC-SOD是一种分泌蛋白。而另一方面，编码CuZnSOD的mRNA不包含这样一个编码信号肽的序列。而且EC-SOD的氨基酸序列与其它的SOD同功酶的不同，已经表明，与鸟类和鱼类中的情况一样，EC-SOD存在于所测定过的哺乳动物的血浆中(Marklund，J.Chin.Invest.74，1984，1398-1403页；Biochem.J.222，1984，649-655页)。种间的含量差别很大，但种内的差别非常小。啮齿动物血浆含有10-20倍于人类血浆中的EC-SOD，人类血浆中所含的EC-SOD较少。在所有被检测过的不同类型的动物组织中也发现有EC-SOD(Marklund，J.Chin.Invest.74，1984，1398-1403页，Biochem.J.222，1984，649-655页)。组织中的种间差别很小。在人体中，组织中的EC-SOD水平(每克湿组织的单位)比血浆的EC-SOD水平(单位/毫升)要高。在啮齿类中，组织中和血浆中所含的EC-SOD基本相等(Marklund，Biochem.J.222，1984，649-655页)。
SOD的活性使它们成为抗超氧化物和其它氧基团毒性效应的治疗药剂中很诱人的候选物。
由于上述胞外液体中的SOD活性很低，因此，胞外液体中的成分和细胞表面受到的抗超氧化物基团及其它毒性氧还原产物的保护程度、比细胞内部受到的保护程度小得多。所以，对于与胞外超氧化物基的生成相关的治疗应用来说，EC-SOD是一种特别令人关注的物质。
因此，对于治疗目的来说，从一个很容易得到的来源提供实际数量的EC-SOD是很有益处的，主要包括特殊类型细胞的这样的来源在以前还没有人提出过或公开过。
因此，在一个很重要的方面，本发明涉及来源于重组体的EC-SOD。在本申请文本中，术语“重组体”想表示EC-SOD是由一种进行过DNA重组技术的细胞得到的。即在这种细胞中插入了编码EC-SOD的DNA序列，並且随之诱导这种细胞表达EC-SOD。更具体地说，本发明涉及具有下述DNA序列编码的多肽结构的EC-SOD：Trp ThrGlyGluAspSerAlaGluProAsnSerAspSerAlaGluTrpIleArgAspMesTGGACGGCCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATGACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC
                        30                            40TyrAlaLysValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnArgArgAspAspAsp GlyThrTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACGATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC
                        50                            60LeuHisAlaAlaCysGlnValGlnProSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnProArg ValCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTGGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC
                        70                            80ThrGlyValValLeuPheArgGlnLeuAlaProArg AlaLysLeuAspAlaPhePheAlaACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCCTGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG
                        90                           100LeuGluGlyPheProThrGluProAsnSerSerSerArg AlaIleHisValHisGlnPhoCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTCGACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG
                       110                           120GlyAspLeySerGlnGlyCysGluSerThrGlyProHisTyrAsnProSeuAlsValProGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC
                       130                           140HisProGlnHisProGlyAspPheGlyAsnPheAlaVelAr gAspGlySerLeuTrpArgCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGGGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACCTCC
                       150                           160TyrAr gAlaGlyLeuAlaAlaSerLeuAlsGlyProHisSerIleValGlyArgAlaValTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTGATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGCAC
                       170                           180ValValHisAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGluAsnGTCGTCCACGCTGGCGACGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG
                       190                           200GlyAsnAlaGlyArgAr gLeuAlaCysCysValValGlyValCysGlyProGlyLeuTrpGGGAACGCGGGCCGGCGCCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGGCCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC
                       210                           220GluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLysGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAGCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTCAlaAleGCCGCCCGGCGG或任何一种上述的修饰序列，此序列编码了一种具有天然EC-SOD的超氧化物歧化性质的多肽。应当注意到，从这种DNA序列产生的氨基酸序被表示在该DNA序列之上。DNA序列合适的修饰实例包括：不产生该蛋白另一种氨基酸序列、而例如与利用插入该序列的特定生物的密码子是一致的核苷酸替换；产生不同氨基酸序列，因而可能产生不同结构蛋白质，但这种改变並不破坏歧化超氧化物基团基本性质的核苷酸替换；编码保留有天然蛋白的超氧化物歧化性质的多肽的上述序列的子序列；或至少与一部分在上述序列基础上制备的DNA探针杂交的DNA序列，而且该序列编码了一个具有天然蛋白的超氧化物基团歧化的生物学性质的多肽。在这方面，应当注意术语“天然EC-SOD的超氧化物歧化性质”及相关术语应理解为是定性的而不是定量的，也就是说，是指多肽的性质而不是指它的活性水平。
如上述定义的编码EC-SOD或其修饰物或其衍生物的DNA序列可以是来源于互补DNA(cDNA)的，就是说，通过确定的常规方法和载体，以产生EC-SOD细胞的mRNA为基础，通过制备cDNA库而得到。然后，可利用合成寡聚核苷酸作为探针进行杂交实验，以鉴别编码EC-SOD的cDNA序列。另外，DNA序列可来源于基因组，就是说直接从细胞基因组中得到，例如，根据常规方法，与以例如组织中的EC-SOD的全部或部分氨基酸序列为基础制备的DNA探针杂交，从而筛选出基因组序列；实例8对于一般的步骤进行了更为详细的描述。基因组DNA与cDNA不同，例如，它在DNA编码序列中含有转录控制因子和所谓的内含子，这些内含子在DNA序列中是非编码序列，它们存在的意义目前还不了解。cDNA和基因组DNA可以来源于动物，尤其是哺乳类动物。对于涉及人类的治疗目的来说，EC-SOD通常最好是来源于人体的DNA序列编码的EC-SOD，以便基本上避免不期望的不利的免疫反应。
DNA序列也可以来源于合成，即按照已建立的常规方法人工制备。例如按照Mattes等人在EMBO Journal.3，1984，801-805页中描述的方法进行。最后，DNA序列还可以来源于合成片段和基因组的混合物，来源于基因组和cDNA的混合物或来源于cDNA和合成片段的混合物，用常规方法将这些来源于cDNA的基因组的或合成(根据方便)的DNA片段连接起来而制备的，这些DNA片段中包含有部分编码EC-SOD的基因。
尽管本发明中来源于重组体的EC-SOD由于可以很容易地大量得到因而是一种较好的来源，但EC-SOD也可以从其它来源得到。因此，本发明还涉及来源于细胞系的EC-SOD，即从大量生成该蛋白的细胞系中得到EC-SOD，例如从血液、肺、血管、胰腺、子宫、前列腺、胎盘或脐带组织或者还有赘生组织中产生的细胞系。内皮细胞或成纤维细胞目前被认为是EC-SOD的可能来源。
最后，EC-SOD也可以从EC-SOD的含量相对较高的组织中得到。因此，本发明进一步涉及到来源于胎盘或脐带的EC-SOD，因为这些组织与其它类型的组织相比含有较大量的EC-SOD，而且它们比例如肺、子宫或胰腺组织等更容易得到。但是，应当强调的是，即使这些组织含有相对较多的EC-SOD，这些数量比由DNA重组技术得到的仍要少得多，因此，胎盘或脐带EC-SOD是特别为只需少量EC-SOD的特殊用途而提出来的。
另一方面，本发明涉及一种可复制的表达载体，它含有编码EC-SOD的DNA序列。在本申请文本中，术语“可复制的”是指载体在它所导入的一给定类型的宿主细胞中能够进行复制。载体可以是携带有上述DNA序列或上面说明过的任何一个合适的上述序列修饰物的载体。紧靠此序列(EC-SOD的编码序列)的上游，可以有一个编码信号肽的序列，它的存在保证带有此载体的宿主细胞可以将表达的EC-SOD分泌出来。信号序列可以是例如下述的序列：-18                     -10                         -1MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspAlaATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCCTACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTGCGG
                                            120
应当注意，此信号序列(及它所编码的信号肽)本身也组成了本发明的一个方面，而且设想它能够插入编码其它蛋白质或肽类的DNA序列的上游中，以便使所得产物从细胞中分泌出来。
载体可以是任一种容易进行DNA重组技术的载体，载体的选择通常依赖于它所要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自动复制的载体，即存在于染色体外的载体，它的复制不依赖于染色体的复制；这种载体的例子有质粒、噬菌全、柯氏质粒、极微染色体或病毒。另外，这种载体可以是导入宿主细胞后与宿主细胞基因整合的载体，它和整合在一起的染色体共同进行复制。
另一方面，本发明涉及一种能分泌EC-SOD的细胞系。虽然以前曾对从许多组织细胞中产生的各种人类细胞系及肿瘤细胞系进行过EC-SOD的含量分析(参见Marklund，J.Clin Invest.74，October 1984，1398-1403页)，但没有获得结论性的结果。尽管提到了在所研究的细胞系中发现有少量EC-SOD，但该文中表II给出的数据并不显著，还很有可能是分析误差所导致的，当然，本领域的普通专业人员在此文给出数据的基础上不会得出这样的结论，即某些测试过EC-SOD含量的细胞系可能以分泌蛋白的形式产生EC-SOD，因为在该文中并未指出存在这种可能性。
细胞系可以来源于哺乳动物，尤其是人类。最好是大量产生EC-SOD(与其它细胞相比)的细胞系。因此，细胞系可以是从血液或肺、表皮、血管、胰腺、子宫、前列腺、胎盘或脐带组织，或可能还有赘生组织中产生的细胞系。来自成纤维细胞或内皮细胞的细胞系被认为是EC-SOD特别好的来源，因为它们是直接从暴露于胞外空间的细胞中产生，因此可以认为它们需要EC-SOD提供的保护作用，以免受到现存的或从胞外环境中产生的超氧化物基的损伤。
本发明进一步涉及一种含有上面定义的可复制表达载体的细胞。这种细胞原则上可以是任何种类的细胞，即原核细胞如细菌、单细胞真核生物、真菌或酵母、或从多细胞生物如动物或植物中产生的细胞。然而，确信哺乳动物细胞是尤其能够表达EC-SOD的，因为EC-SOD毕竞是一种高度复杂的分子，它也许不能从低等生物的细胞中产生。这种细胞的实列之一是CHO-Kl/pPS3neo-18，它于一九八六年八月二十七日寄存在欧州动物细胞培养物收集中心，寄存号是ECACC86082701。
本发明还涉及编码EC-SOD的DNA片段，该片段具有如下的DNA序列：-18                     -10MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACTACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG
                                            120-1 +1                         10Ala TrpThrGlyGluAspSerAlaGluProAsnSerAspSerAlaGluTrpIleArgAspGCCTGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACCGGACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTG
                                                     18020                            30MetTyrAlaLysValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnArgArgAspAspAsp GlyATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCTACATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCG
                                                     24040                            50ThrLeuHisAlaAlaCysGlnValGlnProSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnProArgACGCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGTGCGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCC
                                                     30060                            70ValThrGlyValValLeuPheArgGlnLeuAlaProAr gAlaLysLeuAspAlaPhePheGTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCCACTGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAG
                                                     36080                            90AlaLeuGluGlyPheProThrGluProAsnSerSerSerAr gAlaIleHisValHisGlnGCCCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGCGGGACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCCGCGCGGTAGGTGCACGTGGTC
                                                     420100                           110PheGlyAspLeuSerGlnGlyCysGluSerThrGlyProHisTyrAsnProLeuAlaValTTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGAAGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCAC
                                                     480120                           130ProHisProGlnHisProGlyAspPheGlyAsnPheAlaValAr gAspGlySerLeuTrpCCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGGGCGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACC
                                                     540120                           150ArgTyrAr gAlaGlyLeuAlaAlaSerLeuAlaGlyProHisSerIleValGlyArgAlaAGGTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCTCCATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGG
                                                     600160                           170ValValValHisAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGluGTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGCACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTC
                                                     660180                           190AsnGlyAsnAlaGlyArgArg LeuAlaCysCysValValGlyValCyaGlyProGlyLeuAACGGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTTGCCCTTGCGCCCGGCCGCCCACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAG
                                                     720200                           210TrpGluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysTGGGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG
                                                     780220LysAlaAla***AAGGCCGCCTGATTCCGGCGGACT
应当注意，此序列包括前面给出的信号肽编码序列，信号序列从氨基酸-18到-1。编码成熟EC-SOD的序列起始于氨基酸+1。
此DNA序列如前所述的那样，可以来源于cDNA、基因组或合成，来源于cDNA和基因组的混合物，cDNA和合成片段的混合物或基因组和合成片段的混合物。
在另一个重要的方面，本发明涉及一种生产EC-SOD的方法，在该方法中，在保证分泌EC-SOD的条件下培养产生EC-SOD的细胞系，细胞系可以从上述的任何来源得到。产生EC-SOD的哺乳动物细胞可通过组织免疫化学的方法、用抗EC-SOD的抗体，或通过分析分泌到培养了特异细胞的培养基中的EC-SOD来鉴别。细胞可以根据本身是已知的方法在适宜该细胞系增殖的传统的培养基中培养。
如上所述，EC-SOD表现出对肝素的亲和性，这表明它对于硫酸乙酰肝素或在细胞表面，尤其是在内皮细胞表面发现的其它类肝素葡萄糖胺葡聚糖的亲和性。因此，设想通过在含有肝素或肝素类似物的基质中培养产生EC-SOD的细胞系的组织细胞，以从细胞表面诱导EC-SOD的释放，并因此保证提高EC-SOD的产率。上述肝素类似物包括，例如硫酸乙酰肝素、或另一种硫酸化的葡糖胺聚糖、硫酸葡聚糖或另一种带有大量负电荷的化合物，並且其数量应足以诱导EC-SOD从细胞表面释放(参见实例9-11)。
在另一个重要的方面，本发明涉及生产EC-SOD的方法，在该方法中，将含有编码EC-SOD的DNA序列的DNA片段插入一种能在特定宿主细胞内进行复制的载体中，将得到的重组载体导入宿主细胞中，该宿主细胞在合适的条件下、在适当的培养基之中或之上进行培养，使EC-SOD进行表达并回收。培养细胞所用的培养基可以是适于此目的的任何一种常规培养基，但也许有必要加进额外的Cu和/或Zn以利于EC-SOD的合成，如果EC-SOD是以逐渐上升的数量生成时则尤其应当这样。合适的载体可以是上述载体中的任何一种，合适的宿主细胞可以是上述细胞类型中的任何一种。用来构建载体和有效地将其导入宿主细胞中的方法可以是DNA重组领域中适于此目的的任何一种已知方法。由细胞表达的EC-SOD可以被分泌出来，即穿透细胞膜进行转运，这与细胞的类型和载体的构成有关。如果EC-SOD是由重组宿主在细胞内产生，就是说细胞不将它分泌出来，则可通过常规程序回收EC-SOD，包括通过机械手段如声处理或匀浆、或通过酶法或化学法使细胞破碎，然后进行纯化(回收程序的实例在实例1，4-6和17中给出)。
为了能分泌出来，编码EC-SOD的DNA序列前面应有一个信号肽的编码序列，它的存在能保证EC-SOD从细胞中分泌出来，使表达的EC-SOD中至少有相当一部分分泌到培养基中并被回收。已通过实验确定了分泌出来的EC-SOD-部分存在于培养基中，而一部分存在于细胞表面。因此，短语“分泌到培养基中”意欲包括EC-SOD穿透细胞膜的任一种转运，无论酶最终是进入培养基中或是在细胞表面(参见实例9-11)。可通过常规方法回收培养基中的EC-SOD，包括泸除细胞、分离分泌蛋白，例如在实例1、4-6和17中概括的那样。为了保证EC-SOD从细胞表面分泌出来从而提高产量，向培养基中如上所述加入肝素或上述一种具有类似效应的物质可能是有益的
还有另一个方面，本发明涉及回收EC-SOD的方法，在该方法中，将含有EC-SOD活性的生物物质提取物吸附于含有EC-SOD或其免疫决定簇的固定化抗体的基质上，从基质上洗脱EC-SOD活性，合并含有EC-SOD活性的组分，然后按需要还可进一步纯化。所用抗体可以是抗EC-SOD的或其免疫决定簇的抗体，该抗体以本身是已知的方法固定于合适的基质材料上。
根据本发明的用于亲和层析的抗体可以是多克隆也可以是单克隆抗体。目前更好的抗体是单克隆抗体，因为发现大多数的单克隆抗体与抗原的结合不及多克隆抗体混合物强，这意味着可以用较弱的洗脱液在较温和的条件下进行解吸附。由于与用强洗脱液进行解吸附相比，EC-SOD的失活程度较小，这因此可能使EC-SOD的产率上升。
而且，由于所有的IgG将是抗EC-SOD的，从作为起始物使用的生物物质中吸附EC-SOD所用的抗体基质数量将要少得多。EC-SOD的解吸附将只需体积小得多的洗脱液，这样可以简化目前由于需要大量洗脱液进行解吸附而不太方便的洗脱方法。
单克隆抗体对EC-SOD的专一性可能比多克隆抗体的强。因此，洗自抗体基质的洗脱物纯度更高，这意味着可以省去一个或更多的进一步的纯化步骤。这意味着将极大地简化生产程序，而且，从等量的起始物中所获得EC-SOD的产率要高得多，这一点提供了重要的经济效益。
通过本身是已知的方法，用EC-SOD或其免疫决定簇对可免疫动物进行免疫，并从该动物中得到抗血清如免疫球蛋白，即可得到多克隆抗体。免疫最好是用EC-SOD的稳定水溶液进行；稳定剂可以是缓冲液如磷酸盐缓冲液或辅助剂(还进一步提高抗原性)，一种合适的辅助剂是Freund氏佐剂或氢氧化铝。对于免疫目的来说，小鼠、兔子、母鸡、山羊和绵羊是较好的动物。对动物抽血和分离抗血清都根据众所周知的方法进行。最好是以基本纯的形式提供抗体，这对于使EC-SOD达到必要的纯度是有益的。
在本发明的方法中使用单克隆抗体时，它可通过杂交瘤技术产生，这是一种产生抗体的众所周知的方法。在使用例如小鼠作为免疫动物的杂交瘤技术中，用所需抗原对小鼠免疫，将取自免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，使融合的杂交瘤细胞进行克隆化，在合适的生长培养基中培养产生抗体的细胞，从培养物中收集抗体。通过杂交瘤技术获得的抗体具有专一性更强的优点，因此具有如上所述的更大的纯化潜力。在进一步可能的步骤中，利用DNA重组技术，将编码抗体的DNA序列从杂交瘤细胞克隆中转移到合适的载体中，再用此杂交载体转化合适的细菌宿主，在合适的培养基中培养宿主，並从培养液中回收生成的抗体。通过此方法可获得更高的抗体产量，宿主可以是通常用于DNA重组技术领域的一种，例如大肠杆菌或枯草杆菌。
在另一种获得单克隆抗体的方法中，通过本身是已知的方法，可将杂交瘤细胞植入小鼠腹腔中让其生长，从产生的腹水中回收生成的抗EC-SOD的抗体。进一步，利用来自例如小鼠的免疫感受态细胞，可以进行离体免疫而得到单克隆抗体。这种方法不必对免疫动物如小鼠注射抗原，尽管这在目前是应用最为普遍的方法。应当注意，单克隆抗体和其制备方法构成了本发明的一个方面。
可从中得到含有EC-SOD活性提取物的生物物质可以是例如哺乳动物的组织。可以利用牛、猪或马的组织，因为通过比较发现牛CuZuSOD在人类中具有相对较小的免疫反应性，过敏反应并不构成任何严重的问题。因此，在此基础上可以推断牛、马或猪的EC-SOD也是同样如此。尽管这样，最好还是利用人体组织以避免不利的免疫反应。目前由于含有相对更多的EC-SOD而更适于此目的的人体组织有肺、胰腺、子宫、前列腺、脐带或胎盘组织、尤其是后两种组织，因为它们更容易得到。可通过常规方法在一合适的缓冲液、如磷酸盐缓冲液中制备提取物。为了提高提取物中EC-SOD的产率，发现在缓冲液中加入助溶盐类如KBr、磷酸铵或硫代氰化钾是有益的。
然而，由于这些组织中的任一种都不产生大量EC-SOD，因此，为了治疗目的生产足够数量的EC-SOD则需要大量组织，最好从产生EC-SOD的动物、尤其是哺乳动物、人的细胞系中得到EC-SOD。因此，含有EC-SOD活性的生物物质也可以是如上述从培养产生EC-SOD的细胞系中得到的物质。为了得到数量很多的EC-SOD，通过本发明方法回收的EC-SOD最好是如上述由DNA重组技术产生的。
在大多数情况下，尤其是利用固定化多克隆抗体纯化EC-SOD时，也可以把合并的抗体基质的洗脱物吸附在一种基质、如离子交换基质上，然后从此基质上洗脱EC-SOD活性，合并含有EC-SOD活性的组分，将合并的洗脱物上到含有肝素或肝素类似物基质的层析柱上进行进一步纯化，肝素类似物有例如硫酸乙酰肝素，或另一种硫酸化的葡糖胺聚糖，硫酸葡聚糖或另一种带有大量负电荷的化合物，合并表现出对所用物质具有亲和性的洗脱组分。
在一个进一步的非常重要的方面，本发明涉及EC-SOD在与超氧化物基和其它与其产生的毒性氧中间产物的存在或形成有关的疾病或机能紊乱的诊断、预防或治疗中的应用。
这类疾病或机能紊乱的实例选自与局部缺血后再灌注有关的病例，例如梗塞，如心脏、肾、脑或小肠梗塞、炎症如类风湿性关节炎、胰腺炎、尤其是急性胰腺炎、肾盂肾炎和其它种类的肾炎、肝炎、自身免疫症、依赖胰岛素的糖尿病、多发性血管内血凝固、脂肪栓塞、成人呼吸窘迫、婴儿呼吸窘迫、新生儿脑出血、灼伤、电离辐射的副作用和癌症发生等。
因此，表明了EC-SOD与CuZaSOD应用基本上是一致的，下述讨论更为详尽地记载了它的治疗活性。
然而，发现EC-SOD具有若干被认为是使它特别适用于治疗应用的特性。CuZuSOD的分子量较低(33,000)，这使它在肾脏中很快通过肾小球过滤而排除，因此，它在人体中的半衰期大约只有20-30分钟。用EC-SOD做的初步实验已令人惊异地确定了EC-SOD的半衰期要长得多(在兔子中)，参见实例10。目前认为这部分是由于EC-SOD具有较高的分子量，135,000，防止它通过肾小球过滤而被排除掉，而部分是由于似乎EC-SOD是像如下所述的那样，与内皮细胞表面结合在一起。在根据本发明的EC-SOD的治疗使用中，该酶因此在人体中具有更长的半衰期，至少4小时，还可能更长。
如上所述，EC-SOD在其天然环境中是一种分泌蛋白，因此它可能是为了胞外空间(在胞外液体中或在细胞表面上)的功能而专门合成的，这使它表现出特别适于保护血浆成分或细胞外表面的性质，防止超氧化物基团或其它氧基团的毒性效应。这种看法得到了下列发现的支持，即EC-SOD具有可以使它趋向于与细胞外表面结合的轻微的疏水性质；及它表现出了对于肝素、在细胞外表面发现的硫酸乙酰肝素具有亲和性，这两种性质都似乎表明它具有特别好的保护组织的能力，参见实例9、10和11，其中的实验结果似乎证实了EC-SOD与血管内皮的结合。
EC-SOD与细胞膜明显结合的重要性进一步得到了下列发现的支持，即与细胞膜结合的用多聚赖氨酸修饰过的CuZuSOD比正常的CuZuSOD具有更好的保护活化的(超氧化基团产生的)多形核白细胞(PMN)免于受到自身钝化作用(细胞死亡)的能力，正常的CuZuSOD具有负电荷，因此倾向于受到细胞膜的排斥作用(M.Salin和J.M.Mccord，“白细胞代谢和炎症中的游离基”见于《超氧化物和超氧化物歧化酶》，A.M.Miehelson.J.M.Mccord和I.Fridovin主编，Academic Press，1977，257-270页)。星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)具有与膜结合的SOD，由于诺卡氏菌细胞受到抗此SOD的抗体处理后对于人多形核白细胞的敏感性显著上升，这种与膜结合的SOD似乎有效地保护了它不受到活化的人多形核白细胞的伤害作用(B.L Beaman等人，Infection and Immunity47，1985，135-141页)，这一事实也表明SOD的细胞膜保护功能是与细胞表面结合在一起的。与EC-SOD不同，CuZuSOD具有胞内功能，由于胞外存在超氧化物基的原因而可能使它不太适应于胞外应用。而且，上面提及的它与EC-SOD相比较短的半衰期使它必须在较短的间隔内使用更大的剂量，这对于EC-SOD来说可能也是如此。
已经证实了SOD对于下列疾病或机能紊乱的潜在的治疗应用的活性。
已经表明非肠道使用的CuZuSOD在一系列炎症动物模型及动物的炎症中具有抗炎症效果(Huber和Saifer，见于《超氧化物和超氧化物歧化酶》，Miehelson等人主编，AcademicPress，1977，517～549页)。在人体中，已经报道过CuZuSOD在类风湿性关节炎和关节中，在膀胱和其它泌尿病例的炎症中(Menander-Huber，见于《超氧化物和超氧化物歧化酶的生物学和临床慨观》，Bannister等人主编，Elsevier/North Holland，1980，408-423页)以及电离辐射治疗的副作用中(Edsmyr等人，Current Therapy.Res.10，1976，198-211页；Cividalli等人，Acta.Radiol Oncol.24，1985，273-277页(在老鼠中))具有阳性效应。在某些国家，牛CuZuSOD已作为药物(Orgotein，Peroxinovm)注册了，主要将组合物用于关节之内以治疗关节炎和关节病(Goebel和Storck，Am.J.Med.74，1983，124-128页)。
非肠道使用的CuZuSOD不被细胞吸收，它必须在胞外空间发挥其活性。脂质体包裹的CuZuSOD被细胞吸收，并有报道指出它具有抵抗节段性迴肠炎、Bechet氏症、疱疹样皮炎、溃疡性结肠炎、Kawasaki氏症和抵抗辐射治疗副作用的效果(Y.Nima等人，Free Rad.Res.Comms.1，1985，137-153页)。CuZuSOD抗炎症活性的机理还不很清楚。有人认为它具有直接保护作用，以避免受到由活化白细胞形成的氧基团的损伤(Halliwell，Cell Biol.Int.Rep.6，1982，529-541页)。另一种可能性是防止形成一种由超氧化物诱导的具有强烈化学毒性的物质(Petrone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，1980，1159-1163页)。
SOD另一种很大的潜在应用领域是作为抵抗由局部缺血后再灌注导致的组织损伤的保护因子使用。如果组织供血被切断，该组织将逐步坏死。典型的损伤在宏观和微观两方面都将在几小时内缓慢发展。如果在例如一小时后对组织再灌注，组织损伤非但得不到改善，反而还要急剧加速。发生这种所谓的再灌注矛盾现象很可能有好几种理由，但在先前局部缺血的组织中作为重新出现氧而形成的氧基的结果似乎是损伤的主要原因。由于这些基团存在的时间极短，因而很难对它们进行直接研究，有从各种脱氧剂的保护作用推测它们的形成和效应。组织保护作用已经在局部缺血或缺氧-再灌注模型中证实了(通过一种保护物质)，这些模型包括肾(SOD〔G.L.Backer等人，Am.Surg.202，1985，628-641页；I.Koyama等人，Transplantation 40，1985，590-595页〕，SOD、过氧化氢酶〔E.Hansson等人，Clin.Sci65，1983，605-610页〕和别嘌呤醇〔G.L.Backer等人，Op.Cit.；I.Koyama等人，Op.Cit.〕)、小肠(SOD〔D.A.Parks等人，Gastroenterology，82，1982，9-15页；M.H.Schoenberg等人，Acta Chim.Scand.150，1984，301-309页；M.C.Dalsing等人，J.Surg.Res.34，1983，589-596页〕和别嘌呤醇〔D.A.Parks等人，Op.Cit.〕)、胰腺(SOD.SOD+过氧化氢酶，过氧化氢酶和别嘌呤醇〔H.Saufey等人，Ann.Surg200，1983，405-413页〕)、肝(SOD和过氧化氢酶〔S.L.Atalla等人，Transplantation 40，1985，584-589页〕)、肺(SOD+过氧化氢酶〔R.S.Stuart等人，Transplant Proc.17，1985，1454-1456〕)、骨骼肌(SOD、过氧化氢酶和别嘌呤醇〔R.V.Korthuis，Cire.Res57，1985，599-609页〕)、表皮(SOD和别嘌呤醇〔M.J.Im等人，Ann.Surg.201，1985，357-359页〕)和脑(SOD和别嘌呤醇〔J.S.Beckman等人，见于《在化学、生物学和医学中的超氧化物和超氧化物歧化酶》，G.Rotilio主编，Elsevier，1986，602-607页〕)。
已经报道过心脏功能在离体灌注的标本中的保留，这些标本来自兔子(过氧化氢酶、别嘌呤醇；SOD没有效果〔C.L.Myers等人，J.Thovac.Cardiovasc.Surg.91，1986，281-289页〕)、猫(SOD+过氧化氢酶〔M.Schlafer等人，Circulation 66，Suppl.1，1982，185-192页〕)和鼠(谷胱甘肽、过氧化氢酶、SOD〔Gandel等人，J.Mol.Cell Cardiol.16，1984，459-470页〕)。在活体的局部缺血-再灌注的模型中，已报道过在狗中梗塞区的减少(SOD〔T.J.Gardner等人，Surgery 94，1983，423-427页；D.E.Chambers等人，J.Mol.CellCardiol.17，1985，145-152页；S.W.Werns等人，Circ.Res.56，1985，895-898页〕)，而别嘌呤醇〔D.E.Chambers等人，Op.Cit.；T.J.Gardner等人，Op.Cit.〕、过氧化氢酶〔S.E.Werns等人，Op.Cit.〕没有效果。还报道过在狗中局部缺血的短时间后(15分钟)注射SOD+过氧化氢酶能维持心脏的机械功能(M.L.Myers等人，Circnlation72，1985，915-921页)；K.Przyklenk和R.Kloner，Circ.Res.58，1986，148-156页)。而且，还报导过SOD能降低局部缺血-再灌注诱导的心律失常的发生率(B.Woodwavd等人，J.Mol.Cell Cardiol.17，1985，485-493页；M.Bernier等人，Circ Res.58，1986，331-340页)。在这种情况下，氧基团的来源不十分清楚，但别嘌呤醇的效应似乎表明，它部分是由于黄嘌呤氧化酶所致，该酶由于局部缺血从花黄素脱氢酶形式(Parks等人，Op.Cit.)转化成产生该基团的氧化酶形式。由于局部缺血引起嘌呤核苷酸的降解而形成了大量次黄嘌呤，它是黄嘌呤氧化酶的底物。超氧化物基团的其它来源可能有吸引到局部缺血性损伤组织上的活化白细胞，前列腺的合成(O2 -是一个副物；Kontos，C rc.Res.57，1985，508-516页)和在局部缺血时积累起来的各种还原形式化合物的自身氧化。有关局部缺血后再灌注的发现在临床应用中有极大的重要性。对与心脏梗塞有关的组织进行再灌注，并同时使用SOD和/或其它保护因子来抵抗氧基团和血栓溶解因子如组织纤维蛋白溶酶原活化因子，有可能得到极好的效果。SOD的实验结果还表明，它可以与心脏外科手术和心脏移植联用。类似地，在肾局部缺血后再灌注中，使用SOD而产生的结果可被运用到肾脏移植和其它器官的移植方面，例如表皮、肺、肝或胰腺移植。脑局部缺血症中也有可能应用。
SOD在其它病理情况中也显示出诱人的保护效应。
因此，在狗胰腺中用三种不同方式诱导出了胰腺炎：油酸输注、排泄管的部分阻塞和局部缺血后再灌注。发现SOD、过氧化氢酶和SOD+过氧化氢酶具有保护效应，联合治疗一般来说是最有效的。然而，在局部缺血模型中，单独SOD的效果就几乎和SOD与过氧化氢酶的结合效果一样(Sanfey等人，Ann.Surg.200，1984，405-413页)。已经报道过SOD+过氧化氢酶在鼠中能改善由天蓝菌诱导的胰腺炎(K.S.Guice等人，Am.J.of Surg 151，1986，163-169页)。结果表明有可能对这种目前还无特殊疗法的疾病进行积极的治疗。
还认为SOD能有效地治疗灼伤。在鼠中，轻度实验烧伤后的局部水肿可通过注射SOD而有所减轻(Bj_rk和Artursson，Burns9，1983，249-256页)。在涉及小鼠严重灼烧损伤的动物模型中，通过SOD达到了显著的保护作用，此处涉及到幸存和局部损伤的问题(Saez等人，Circulatory Shock12，1984，220-239页)。
在例如灼伤、免疫复合物形成和主要组织损伤的情况下，在肺中有嗜中性白细胞累积。补体活化(C5a)似乎通常对此积累起中介作用。白细胞似乎被活化并释放出氧基团，从而导致例如以血管通透性上升和肺水肿为特征(成人呼吸窘迫)的肺损伤。在好几种动物模型中，已表明SOD和其它氧基团消除剂具有抵抗肺损伤的保护效应(Till和Ward.Agents and Actions，Suppl.12，1983，383-396页)。
已经报道了非肠道使用的CuZuSOD能在患有婴儿呼吸窘迫的早产新生儿中防止肺支气管发育异常(W.Rosenfeld等人，J.Pediatr.105，1984，781-785页)。
在小猎兔犬模型中，已经报道了注射SOD能降低血压过低引起的脑腔内出血的发生率(L.R.Ment等人，J.Neurosurg 62，1985，J63-J69)。
在鼠中，SOD能改善由注射一种棒状杆菌(Corynebacterium Parvum)引起的肝炎(M.J.P.Arthur等人，Gastroenterology 89，1985，1114-1122页)。
内皮产生的血管松弛因子对超氧化物非常敏感，使用SOD会增强它的作用(R.J.Gryglewski等人，Nature 320，1986，454-456页；G.M.Rubangi等人，Am.J.Physiol.250，1986，H822-H827页)。在体内，超氧化物基团在许多情况下都可以生成，并可能导致血管收缩和降低组织灌注。相信使用SOD能够缓和这样的血管收缩。
血压的急剧上升导致脑部小动脉功能和形态异常。前列腺素合成抑制剂和超氧化物歧化酶被认为能防止这种异常。能够测定超氧化物的释放(H.A.Kontos，Circ.Res.57，1985，508-516页)。对模型进行严密分析得出了这样的结论：超氧化物基团是在合成前列腺时作为副产物形成的。结果表明，由前列腺素合成期间释放的超氧化物基所导致的组织损伤可能在其它病理情况下发生，而SOD可能起致保护作用。
已经报导了基质中的CuZuSOD+过氧化氢酶能延长离体灌注的兔角膜的存活期(O.N.Lux等人，Curr.Eye Res.4，1985，153-154页)。CuZuSOD+过氧化氢酶保护分离物不受到光过氧化作用的效果较小(S.D.Varma等人，Ophthalmie Res.14，1982，167-175页)。结果表明，SOD在角膜移植和其它外科手术中可能有有益的作用。
已经报道了非肠道使用的SOD在如多发性血管内血凝固(T.Yoshikawa等人，Thromb.Haemostas.50，1983，869-872页)和败血症(H.F.Welter等人，Chirurgisches Forum′85f.experim.u.KlinischerForschung，Springer-Verlag，Berlin，1985)等急性病例动物模型中具有改善作用。
在各种自身免疫疾病中，例如在全身性红斑狼疮(SLE)、全身性硬化和类风湿性关节炎中，已证实了淋巴细胞中染色体断裂率上升(Emerit，“断裂因子的性质和作用机理”，见于《淋巴细胞活素》第8卷，E.Pich主编，Academic Press，1983，413-424页)。成纤维细胞的培养物和骨骼直接制备物有时也表现出断裂率的上升。这种病人的血浆中含有一种使染色体断裂的断裂因子。在某些情况下，在滑液和脑脊髓液中也证实有种类似因子(多发性硬化)。与患有自身免疫症病人的淋巴细胞共同培养的正常淋巴细胞发生断裂，病人的淋巴细胞能使培养基产生染色体断裂。通过紫外辐射能提高全身红斑狼疮血浆的断裂活性。血浆中通过黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤产生的超氧化物导致断裂活性的形成。在上述的所有模型中，在培养基中加入CuZuSOD能够抑制断裂活性(Emerit，出处同上)。这表明超氧化物基团与断裂因子的形成和作用二者都有关系(Emerit，出处同上)。
在全身性红斑狼疮的动物模型中，即具有断裂因子的新西兰黑鼠，重复注射SOD可保护活体骨髓细胞的染色体(Emerit等人，Cytogenet.Cell Genet.30，1982，62-69页)。但在人类自身免疫疾病的主要症状中，断裂因子起了多大的作用和使用SOD是否有治疗效果，目前仍然不清楚。
细胞至肿瘤的转化通常分为两个阶段，即起始阶段和随之而来的促进阶段。在由电离辐射、博莱霉素、甲氧甲基硝基咪唑乙醇和其它硝基咪唑引起起始阶段的离体模型中，培养基中存在的SOD有效地抑制了成瘤转化。在暴露于启动物质时不一定需要有SOD。这似乎表明该酶抑制了后来的促进阶段(Miller等人，Int.J.RadiatOncol.Biol.Phys.8，1982，771-775页；Borek和Troll，Proc Nat.Acad.Sci.U.S.A80，1983，1304-1307页)。非毒性剂量的黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶在生长细胞中导致促进作用。加入SOD或SOD+过氧化氢酶抑制此效应(Zimmeman和Cerutti.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.81，1984，2085-2087页)。佛波醇酯是已知的促进剂。在用苯并蒽然后用佛波醇(TPA)启动诱导表皮瘤的模型中，用具有SOD活性的亲脂性铜复合物进行局部处理显著降低肿瘤形成(Kenzler等人，Science 221，1983，75-77页)。结果表明，至少在某些例子中，超氧化物基对肿瘤形成的促进阶段有作用，而SOD可能抑制这种效应。
有理由相信，氧基团对于若干毒性物质、如博莱霉素、亚德里亚霉素、四氧嘧啶、6-氢化多巴胺、百草枯、二羟基延胡索酸、硝基呋喃妥英和链脲佐霉素等的损伤效应有作用。在那些基团在胞外空间形成的情况下，也许有可能通过注射保护性酶进行保护。这样，SOD可能抑制四氧嘧啶在试管中(Grankvist等人，Biochem.J.182，1979，17-25页)和在体内(Grankvist等人，Nature 294，1981，158-160页)的致糖尿病活性(损伤胰腺中β细胞)。因此，四氧嘧啶的损伤效应似乎是通过超氧化物基或其它由此产生的氧基团而达到的。β细胞对于四氧嘧啶为什么有如此强的敏感性还不清楚，但对于在四氧嘧啶敏感和依赖胰岛素的糖尿病的发生之间是否存在任何联系进行了推测。在糖尿病患者中，通过很可能形成氧基团的炎症细胞，在胰岛中存在浸润作用。因此，设想在糖尿病开始发生时通过注射SOD来保护β细胞。
已经报道过在生长培养基中加入SOD可保护气管细胞抵抗石棉沉着(Mossman和Landesman，Chest 835，1983，50S-51S)。
已经描述过(Roberts等人，J.Urol.128，1982，1394-1400页)非肠道使用的CuZuSOD保护肾脏抵抗实验诱导的肾盂肾炎。在鼠中，SOD和尤其是过氧化氢酶抑制由抗肾小球基底膜抗体诱导的急性肾毒肾炎(A.Rehun等人，Lab.Invest.51，1984，396-403页)。
一般说来，已经如上述在实验中运用了CuZuSOD作为测试物质。但是，EC-SOD被认为可能用于同样的目的，而且如上所述，由于它的特殊性质而具有更高的效率，这些特殊性质可能使它在胞外应用尤其诱人。
本发明进一步涉及一种药物组合物，它含有EC-SOD及药物学上可接受的赋形剂，稀释剂或载体。包含在组合物中的EC-SOD可是上述来源中的任一种，即来源于重组体、细胞系或组织的。
对于合适的即具有治疗活性的全身治疗剂量的估计，是在人体EC-SOD的含量基础上作出的。EC-SOD是人体血浆中的主要SOD，总活性(内组分A、B和C组成，参看实例2)大约为20单位/毫升。每公斤体重注射200国际单位肝素导致EC-SOD的组分C上升大约23单位/毫升，参见实例9。尽管此肝素剂量非常大，但显然还未达到最大的释放速率，参见实例9。假设从血管内皮释放大约两倍之多的EC-SOD组分C，血管中EC-SOD的总含量将达到大约66单位/毫升血浆(20+2×23单位/毫升)。血浆总体积大约为体重的4.7％，相当于一个70公斤重的人有大约3.3升。1单位EC-SOD等于大约8.8毫微克。因此，血管中EC-SOD的总量(血浆及血管内皮)为3300×66×8.8×10-9克＝1.92毫克。上升十倍需要19毫克，上升300倍需575毫克EC-SOD。因此，EC-SOD的合适剂量在大约15～600毫克/天的范围内，这取决于要使用EC-SOD的病例的类型和严重程度。注射例如87毫克EC-SOD(提高50倍)将导致血浆中为26微克/毫升(不考虑与内皮结合的)。此浓度或甚至更低的浓度在离体实验中表现出强烈的保护作用(用CuZuSOD)(参见A.Baret.I Emerit，Mutation Res.121 1983，293-297页；K.Grankvist，S.Marklund，J.O.Sehlin，I.B.T_ljedal，Biochem.J.182，1979，17-25页)。
EC-SOD注射的剂量和定时与该酶在人体血管中的半衰期有关，这一点目前还不了解。在兔子中，人EC-SOD的半衰期大约为18小时(参见实例10)。在人体中的半衰期可能更长些。假设一级动力学的半衰期为36小时，则开始注射87毫克后每天注射35毫克将产生与开始注射后相同的浓度。
实例9表明EC-SODC能够与肝素一起从细胞表面转移到血浆中。可用非肠道肝素、其它硫酸化的葡糖胺聚糖和其它带有大量负电荷的物质调节内源或注射EC-SOD的定位(参见实例9-11)。在某些病理条件下定位于血液相中可能是有利的。
EC-SOD由三种组分组成，A没有、B有微弱的、C有较强的肝素亲和性。目前还不了解具有不同亲和力的理由，但各组分在大多数方面都是非常相似的。在PAGE-SPS凝胶上的电泳没有揭示出差别，氨基酸组成似乎是一致的(S.Marklund，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，1982，7634-7636页)，抗A和C的抗体似乎和所有三种组分的反应都是一样的(S.Marklund，Biochem.J.220，1984，269-272页)，各组分可能是由同一基因产生的，然后进行转译后的修饰。所有三种组分都存在于新鲜血浆中(参见实例9)，并且是上面讨论过其药物动力学的组分。C也是通过DNA重组技术产生的组分(参见实例13)。但是EC-SOD的组分A和B也被认为在病理条件下可能有治疗用处，在这种情况下，溶液中具有较高的SOD活性是很重要的。
对于局部治疗来说，也许只需要比上述少得多的EC-SOD。目前，治疗关节炎在关节内每周一次施用4-8毫克CuZuSOD。分子量高得多的EC-SOD可能在关节内保留的时间更长。相似的治疗方法或也许低一些的剂量可能也将是合适的。
在使用前，含有EC-SOD的组合物应当最好干燥保存，例如以冷冻干燥的形式。对于全身处理和局部注射来说，EC-SOD可以合适地被制成非肠道使用的形式，例如，溶于一种合适的没有毒性的、生理上可接受的溶剂、如等渗盐水中。对于局部应用来说，药物组合物可以是含有EC-SOD的例如软膏、洗液、喷雾剂、乳脂或气溶胶等形式。
在本发明的药物组合物中，进一步设想EC-SOD可以有利地与过氧化氢酶结合在一起，该酶以下述方式使过氧化氢歧化： EC-SOD和过氧化氢酶的是同作用进一步减少羟基基团的形成，该基团如上所述，被认为是氧基团中最具毒性的。如果不用过氧化氢酶，可使用另一种与EC-SOD协同作用的自身氧化剂，以降低氧还原产物的毒性效应。
还设想EC-SOD和其它物质如别嘌呤醇(抑制黄嘌呤氧化酶)、羟基基团的清除剂(如甘露醇或含有羟基的化合物)和过渡金属离子螯合物(如去铁敏)等结合在一起可能是有益的。
而且，对于血浆中已表明有EC-SOD存在的应用来说，为使待治疗的病人存在于细胞表面的EC-SOD转移，从而为血浆提供更大剂量的EC-SOD，在组合物中加入肝素或肝素类似物如硫酸乙酰肝素或另一种硫酸化的葡糖胺聚糖、硫酸葡聚糖或另一种具有大量负电荷的化合物可能是有益的。
本发明还涉及一种防止或治疗与超氧化物基团的存在或形成有关的疾病或机能紊乱的方法，包括给需要这种治疗的病人施用其数量能达到有效治疗或预防目的的EC-SOD。这种疾病和机能紊乱可以是上面讨论过的任何一种。本发明还涉及一种防止或治疗由局部缺血后再灌注导致的损伤的方法，这种损伤涉及器官移植如肾、肺、胰腺、心脏、肝或表皮移植，或涉及心脏外科手术，该方法包括在外科手术之前、手术期间或之后施用其数量能达到有效治疗或预防目的的EC-SOD。在任一种方法中，治疗或预防的活性剂量可以包括大约15-600毫克/天的EC-SOD，取决于待治疗病例的类型和严重程度。在这种方法中，如上所述协同使用肝素或另一种具有大量负电荷的化合物，和/或也是如上所述协同使用过氧化氢酶或一种具有类似效应的自身氧化剂可能是有益的。
本发明参考附图得到进一步说明，在这些图中：
图1是含有EC-SOD的物质免疫吸附于抗EC-SOD琼脂糖后的蛋白质和EC-SOD的洗脱曲线图(参见实例4)。
图2是EC-SOD从DEAE-Sephacel_上洗下的洗脱曲线图(参见实例5)。
图3是EC-SOD从肝素-琼脂糖上洗下的洗脱曲线图(参见实例6)。
图4为一放射自显影图，显示了硝基纤维素滤器之一与48碱基对探针的杂交图，该滤器上约20,000λgtll噬菌斑已被转化。图上黑点代表含有EC-50D的噬菌斑(见实施例8)。
图5a和5b表示从EC-SOD的氨基酸序列推导出的DNA序列(参见实例8)。
图6是质粒pPS3的结构图。白色区域代表SV40DNA，号码指明在SV40中相应的核苷酸位置。SV40PE和SV40起点分别代表SV40早期启动子和SV40复制起点，箭头分别表明转录和DNA复制的方向。SV40多腺苷酸信号位于2770和2533位置之间。阴影区域代表人类EC-SOD的cDNA。黑色区域代表质粒pBR322的β内酰胺酶基团(APR)。细线条代表质粒pBR322的DNA。还标明了pBR322复制起点的位置。
图7表明静脉注射肝素对于血浆EC-SOD的影响。在零时给两个健康男人注射每公斤体重200国际单位的肝素，在注射前和注射后标明的时间处收集血浆。EC-SOD的活性如实例9中所述方法测定。
图8表明EC-SOD的活性释放对于静脉肝素的剂量反应。以标明的剂量将肝素静脉注射到两个健康人体中，在注射前和注射后的10和15分钟时收集血液。在15分钟时注射更大的肝素剂量直达到200国际单位/公斤体重，10分钟后收集血液。如实例9所述方法测定血浆中的EC-SOD。注射肝素前EC-SOD的活性和第二次注射肝素后的活性的差别取作100％的释放。相对于“100％的释放”给出了注射肝素前的活性和第一次注射剂量10分钟后样品的平均活性之间的差值。不同的实验至少间隔4天后进行(参见实例9)。
图9表明血浆在肝素-琼脂糖上的分离情况。静脉注射肝素(200国际单位/公斤体重)前(○)和10分钟后收集的人血浆(△)如实例9所述那样，在肝素-琼脂糖上进行分离。(·)表示用抗EC-SOD琼脂糖进行预处理以除去EC-SOD后的肝素前血浆样品的层析结果。实线代表在280nm处的光吸收，虚线代表NaCl梯度。在图中标明的合并液中测定EC-SOD的组分A、B和C。合并液B和C中的活性仅代表EC-SOD，因为所有活性都被抗EC-SOD琼脂糖吸附了。合并液A中还含有CuZuSOD和抗氰化物的活性。因此，组分A中的EC-SOD活性可按照实例9中所述用于血浆的方法用固定化抗体测定。肝素前血浆中的EC-SOD的组分A、B和C为5.2、4.4和5.1单位/毫升，肝素后的血浆为7.7、5.7和29.4单位/毫升。层析过程中EC-SOD的活性回收率分别为84％和83％。注射肝素前血浆层析中合并液A的SOD总活力较高是由于样品发生溶血作用后，CuZuSOD从红细胞中释放出来所致(参见实例9)。
图10和11表明向兔子注射125I-标记的人EC-SOD后的效果和注射肝素后的效果(参见实例10)。
图12表明来自单克隆EC-SOD琼脂糖的重组EC-SOD的洗脱曲线(参见实例17)。
图13表明来自DEAE-Sephacel的重组EC-SOD的洗脱曲线(参见实例17)。
图14表明来自肝素-琼脂糖的重组EC-SOD的洗脱曲线(参见实例17)。
图15表明天然和重组EC-SOD在梯度聚丙烯酰胺凝胶上有十二烷基磺酸钠存在时的电泳图谱(参见实例19)。实例1  脐带浆物的制备
在鸟梅大学医院(Umea Univevsity Hospital)妇科病房收集人脐带。在病房里将其保存在冰箱中，在实验室里在-80℃下迅速冷冻，然后储存在-30℃下备用。
将脐带解冻后铰碎。然后悬浮在500毫升的PH7.4的磷酸钾缓冲液中，其中含有0.3M KBr，3mM DTPA、100,000千国际单位/升的抑肽酶(aprotinin)和0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)。每公斤脐带使用4升缓冲液。用助溶盐KBr提高EC-SOD从组织中的提取率(大约3倍)。加入DTPA、抑肽酶和PMSF是为了抑制蛋白酶。然后，在韦林氏搅切器中使悬浮液匀浆，最后用声处理器进行处理。然后在4℃下摇动1小时。所得匀浆物进行离心(6000×g，20分钟)，上清液在-80℃下迅速冷冻后保存在-30℃下。实例2  人肺EC-SOD的制备和纯化
在死亡后24小时内，通过九名没有任何明显肺病的病人的尸体解剖得到人肺。将肺切成碎片，残余的血液用0.15M NaCl洗去。在韦林氏搅切器中用5倍体积用冰冷却的PH5.50的50mM乙酸钠使碎片习浆，然后将习浆物进行声处理，让其在4℃下提取30分钟，最后离心(6000×g)20分钟。
上清液分批吸附到用PH5.50的50mM乙酸钠平衡的DEAE-Sephacel_上(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)(每25倍体积匀浆物对1倍体积)。然后用缓冲液洗涤离子交换剂，将其装柱，用在该乙酸缓冲液中的0-200mM NaCl梯度洗脱。梯度液体积10倍于柱体积。
合并来自前述步骤的活性组分，用1.5倍体积的蒸馏水稀释，用1M NaOH滴定到PH8.4。合并液再分批吸附到用PH8.4，175MM Tris-HCl平衡过的DEAE-Sephacel_上(＝每10倍体积的合并液对1倍体积的离子交换剂)。随后用缓冲液洗涤DEAE-Sephacel，将其装柱，然后用10倍体积的在Tris缓冲液中的0-200mM NaCl进行梯度洗脱。
浓缩从前述步骤中得到的合并组分，用PH6.5的150mM磷酸钠进行透析。将样品上到用同一缓冲液平衡的苯基-琼脂糖(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)柱上(样品中每15毫升蛋白对大约1毫升凝胶)。用20倍体积在50mM磷酸钠、PH6.5中的0-0.5M KBr梯度洗脱活性。
合并来自苯基-琼脂糖柱的活性组分，浓缩后用PH6.5的0.15M磷酸钠透析。将样品加到用该磷酸盐缓冲液平衡的ConA-琼脂糖(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)柱上(样品中每2毫克蛋白对1毫升凝胶)，然后用在磷酸盐缓冲液中的50mMα-甲基-D-甘露糖苷进行脉冲洗脱。
合并来自Con A-琼脂糖柱的活性组分，浓缩后上到Ultrogel ACA-34柱上(2.5×83厘米)(从瑞典斯得哥尔摩的LKB公司得到)，然后用PH6.5的50mM磷酸钠洗脱。洗脱速率为5毫升/小时·平方厘米。
合并来自洗脱物的活性组分，浓缩后加到用PH6.5的0.15M磷酸钠平衡的小麦胚芽外源凝集素-琼脂糖柱上(10毫升)(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)。用在磷酸盐缓冲液中的0.45M N-乙酰-D-葡糖胺将酶进行脉冲洗脱。
合并来自上步的活性组分，浓缩后用PH6.5的0.15M磷酸钠透析，然后上到用该磷酸盐缓冲液平衡的蓝色琼脂糖CL-6B(Cibacron Blue F3G-A)柱上(床体积为6毫升)(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)。用缓冲液洗柱后，在缓冲液中加入10mM NAD和10mM NADP的脉冲。用缓冲液将吡啶核苷酸洗走后，用0.9M KBr/50mM磷酸钠，PH6.5对酶进行脉冲洗脱。
合并来自蓝色琼脂糖柱的活性组分，在PH6.5的25mM磷酸钠中透析，然后上到用同一缓冲液平衡的肝素-琼脂柱上(床体积为10毫升)(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)，然后，用140毫升在磷酸盐缓冲液中的0-1M NaCl梯度对柱进行洗脱。活性物被洗脱在三个不同的峰中：A不与肝素结合，B在梯度初期解吸附，C在后来解吸附。
A峰含有也许是从肝素-琼脂糖柱上漏下的紫外吸收物质，将其在Sephacryl_S-300柱上(1.6×90厘米)(从瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司得到)进一步纯化。样品在PH7.5下用25mM Tris-Hcl洗脱。
用PH7.5的25mM Tris-HCl使组分A、B和C进行透析，然后在Amicon UM-10超滤膜上浓缩至约1毫升。如下实例所述，用组分C产生EC-SOD抗体。实例3  兔抗人EC-SOD的制备
如实例2所述制备EC-SOD，组分C。对兔皮下注射30微克在Freund氏完全佐剂中的EC-SOD。然后，以一个月的时间间隔5次注射30微克在Freund氏完全佐剂中的EC-SOD以加强免疫作用。最后一次加强剂量2星期后，将兔子抽血至死并收集血清。在蛋白A-琼脂糖上根据生产厂家的说明(瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司)通过吸附和解吸附作用分离抗血清中的IgG组分。柱的洗脱用PH3.0、0.1M甘氨酸-HCl进行。洗脱后马上将收集的IgG滴定到PH7.0。然后用称为“偶联缓冲液”的0.1M碳酸钠，PH8.3+0.15M NaCl使IgG进行透析。
根据生产厂家的说明(瑞典乌普萨拉的Pharma Cia公司)溶胀并制备CNBr活化的琼脂糖。用“偶联缓冲液”将上述IgG稀释至约5-8毫克/毫升。加入CNBr活化的琼脂糖，使混合物在4℃下摇动保温过夜。每毫升凝胶大约与5毫克IgG偶联。从凝胶中吸走缓冲液并分析剩余的蛋白。偶联率一般达到98％以上。然后使偶联IgG的凝胶通过悬浮在1M乙醇胺中于4℃下过夜而结块。然后用“偶联缓冲液”洗涤凝胶，跟着用0.1M乙酸钠，PH4.0+0.5M NaCl洗涤。然后将凝胶与作为抗菌剂的叠氮化物一起保存在“偶联缓冲液”中。
使固定化抗体与过剩的EC-SOD保温过夜并分析残留的EC-SOD，来测定固定化抗体的最大结合量。离心后将结果与用琼脂糖4B进行空白保温的结果进行比较。
在0.5毫升“偶联缓冲液”的EC-SOD中加入100微升抗EC-SOD琼脂糖的50％的悬浮液。并与100微升琼脂糖4B的50％的悬浮液进行平行的空白保温。使溶液于4℃下摇动过夜后离心。在琼脂糖4B处理溶液中的剩余活力为2080单位/毫升，而在抗EC-SOD琼脂糖处理溶液中为720单位/毫升。利用这些数据可计算出1毫升抗EC-SOD琼脂糖凝胶结合了13500单位的EC-SOD(大约120微克)。用此数据制定从人组织匀浆中吸附EC-SOD的计划。实例4  EC-SOD在抗EC-SOD琼脂糖上的免疫吸附
一次处理大约10升如实例1所述制备的脐带提取物。提取物中的EC-SOD含量约为150单位/毫升。如果凝胶结合13,600单位/毫升(参见实例3)，吸附10升提取物中所有的EC-SOD需要大约110毫升抗EC-SOD琼脂糖。
首先使提取物离心(6000×g，30分钟)以去掉沉淀蛋白。然后在上清液中加入110毫升抗EC-SOD琼脂糖，使混合物于4℃下搅动保温过夜。在玻璃漏斗上将凝胶从提取物中分离出来。然后在漏斗上用大量50mM磷酸钾，(PH7.0)+0.5MNaCl洗涤凝胶。
将凝胶装入直径5厘米的层析柱。用50mM磷酸钾(PH7.0)+0.5M NaCl以50毫升/小时的速率开始洗脱，并记录在280nm处的光吸收。洗脱持续到A280值很低时为止。然后用在50mM磷酸钾(PH7.0中)的0.5-2.5M KSCN的线性梯度洗脱EC-SOD。梯度液总体积为500毫升，洗脱速率为30毫升/小时。EC-SOD的解吸附很慢，不能加快洗脱速率。
用组分收集器收集洗脱液。为保护洗脱的EC-SOD不受高浓度KSCN的影响，在柱的洗脱端的塑料管上接一根T形管，以二倍于柱洗脱的速率向其中注射蒸馏水。
所得蛋白(在A280处)和EC-SOD的洗脱物示于图1中。在2.5M KSCN的梯度终点，EC-SOD的洗脱似乎还不完全，但洗脱不再继续进行，以避免收集到由于高浓度的KSCN而过度变性的EC-SOD。
如图所示合并EC-SOD。梯度中最初的活性不收集，因为其中含有数量颇为可观的非专一性结合的杂蛋白(A280)。梯度中A280值的大部分归结于KSCN，只是在开始时可见到一个比较重要的小的蛋白质峰。为了使凝胶再生，将它在2.5M KSCN中摇动过夜，然后用50mM磷酸钾、(PH6.5)+0.5M NaCl洗涤，然后用完全没有NaCl的缓冲液洗涤。最终加入迭氮化物作为抗菌剂。使用前将凝胶用不含迭氮化物的PH6.5，50mM磷酸钾洗洗涤。实例5  在DEAE-Sephacel_上的吸附及洗脱
在来自抗EC-SOD琼脂糖柱的合并的洗脱物中加入1-氨甲基丙醇，使其最终浓度为10mM。然后用1M NaoH将溶液滴定到PH9.0。用大约五倍体积的蒸馏水稀释该溶液。向得到的溶液中加入40毫升用50mM磷酸钠+0.5M NaCl+175mMTris-HCl PH9.6平衡的DEAE-Sephacel_。
于4℃下搅拌过夜，使EC-SOD吸附在DEAE-Sephacel上。然后在玻璃漏斗上收集DEAE-Sephacel，用PH6.5，50mM磷酸钠洗涤，并装在直径2.5厘米的层析柱中。柱首先用大约4倍体积的上述缓冲液洗脱。然后如图2所示那样，用PH6.5、50mM磷酸钠+0.25M NaCl洗脱EC-SOD。如图2所示合并活性部分，在PH6.5，25mM磷酸钠中透析。最后浓缩主大约2毫升。实例6  EC-SOD在肝素-琼脂糖上的最后纯化
四批如上所述的来自DEAE-Sephacel的洗脱物，在肝素-琼脂糖上一次进行分离。待上柱的酶溶液在PH6.5的25mM磷酸钾中透析。
根据生产厂家(瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司)的说明制备20毫升肝素-琼脂糖凝胶，用PH6.5，含有1M NaCl的25mM磷酸钾洗涤，然后用没有NaCl的缓冲液洗涤。将肝素-琼脂糖装在直径2.5厘米的层析柱中，用PH6.5，25mM磷酸钾以15毫升/小时的速率开始洗脱。然后将EC-SOD溶液(大约10毫升，800,000单位)上柱，在280nm处监测光吸收(参见图3)。当第一峰后的A280值接近基线时，用0-1.2M NaCl梯度洗脱EC-SOD，梯度液体积为400毫升。EC-SOD被洗脱到三个峰中，一个峰对于肝素无亲和力，一个峰具有中等亲和力，一个峰具有高度亲和力。这些峰相应于实例2中所述的组分A、B和C。通过此步骤纯化后，几乎所有活性都是C型的，因此可断定这也许是该酶的天然形式。如图3所示将C峰合并。
合并物的活力为430,000单位(大约4.3毫克)。比活为81100(每毫升单位/A280)。在SDS-PAGE凝胶上发现了大约30,000道尔顿的亚基。未见有杂蛋白的痕迹。合并的活力大约相当于53％的肝素-琼脂耱的上柱活力。实例7  人EC-SOD的氨基端序列
通过常规方法分析如前面实例所述得到的人EC-SOD的(N端)氨基酸序列(Edman等人，Eur.J.Bioehem.1，1967，80-87页)。发现最初33个氨基酸序列是：TRP THR GLY GLU ASP SER ALA GLU PRO ASN SER ASP SERALA GLU TRP ILE ARG ASP MET TYR ALA LYS VAL THR GLU1LE TRP GLN GLU VAL MET GLN此序列或其中适宜的一部分可用来产生合成DNA探针、与编码上述氨基酸序列的DNA序列的编码或非编码链互补的合成脱氧寡聚核苷酸。
正如下面的实例所述，这种探针可用于与产生于生成EC-SOD的细胞或组织的mRNA的cDNA库的杂交实验中，以分离出EC-SOD基团的完整或部分的DNA拷贝。实例8  克隆人EC-SOD及对它测定序列DNA探针的制备
基本上如上面的实例1-6所述那样，从脐带中纯化人EC-SOD，如实例7所述那样测定最初33个N端氨基酸序列。在此氨基酸序列和假定的真核细胞蛋白质密码(Grantham等人，Nacl.Acids Res.9，1981，43-47页)基础上，根据Mattes等人(EMBO Journal3，1984，801-805页)所述方法，合成与EC-SOD基因的编码互补的48聚体的脱氧寡聚核苷酸：5′-CAGGGACATGTATGCCAAGGTGACTGAGATCTGGCAGGAGGTGATGCA-3′人胎盘cDNA库的筛选
从Clontech Laboratories.Inc.，922 IndustrialAvenue.Palo Alto，CA94303，USA得到制备在载体λgt11中的人胎盘cDNA库(产品目录号HL1008，批号1205)。通过将噬菌体在大肠杆菌Y1090指示菌株上进行平板培养，从重组噬菌体中筛选人EC-SOD的cDNA序列。基本上按照Maniatis等人(《分子克隆——实验手册》，ColdSpringer Harbor Laboratories，1982)所述方法，将噬菌斑转移到硝化纤维素滤器(Hybond C，AmershamInc.)上进行处理。将每个滤器上转移了20,000个噬菌斑的八个硝化纤维素滤器在5×SSC中预浸透，然后于41℃下在40毫升的20％甲酰胺、5×Denhartdt氏溶液、50mM磷酸钠PH6.8中与50微克/毫升的声处理变性的小牛胸腺DNA中预杂交一小时。然后将滤器与计数为每毫升每分钟7×105的末端标记32P-r-ATP(参见Maniatis等人，op.Cit.)的上述48聚体探针杂交。杂交于41℃下在加有100μm ATP(最终浓度)的预杂交溶液中进行18小时。在41℃下保温过夜后，于37℃下将滤器用0.2×SSC洗涤一次，然后于37℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤四次，然后让其风干。将滤器在Dupont Cronex 4X-光胶片上曝光过夜。每个滤器大约含有6个阳性噬菌斑。
分离并纯化显示阳性杂交反应的噬菌斑噬菌体，通过Davis等人所述方法(《高级细菌遗传学》，Cold Springer HarborLaboratories，1980)从这些噬菌体中提取DNA，用限制性核酸内切酶EcoRI切割噬菌体DNA后，通过琼脂耱凝胶电泳测定cDNA插段之长度。含有最长cDNA插段的重组噬菌体命名为λSP3，并选来用作进一步的研究。
对来自噬菌体λSP3的cDNA插入子进行限制性核酸内切酶分析，分别亚克隆到pUC18和M13载体mp9中后测定其序列。通过将产生于DNA序列的氨基酸序列与纯化蛋白的肽序列进行比较，和通过它在CHO细胞中的表达产物，该插段被证实是编码人EC-SOD的DNA。从λSP3中分离到的插入子含有1396个碱基对的cDNA，一个编码240氨基酸蛋白质的开放读码系统，一个69碱基对的5′端非转译区域及一个607碱基对的3′端非转译区域(见图5A和B)编码人EC-SOD的cDNA插入子的亚克隆和限制性核酸内切酶分析
用限制性核酸内切酶EcoRI降解大约30微克λPS3的DNA，然后通过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳从λDNA中分离出cDNA插段。通过从凝胶上的电洗脱、苯酚及氯仿提取和乙醇沉淀后(Maniatias等人见上)，分离到大约0.2微克cDNA片段。将0.05微克分离到的cDNA片段与1微克限制性核酸内切酶EcoRI降解及碱性磷酸酯酶处理过的pUC18DNA连接(Norrander等人，Gede26，1983，101-106页)。用连接的DNA转化大肠杆菌HB101菌株(J.Mol.Biol.41，459页)。在含有氨苄青霉素的平板上选择转化株。鉴别出携有cDNA插入子的重组质粒并命名为pLS3。质粒pLS3DNA可进行限制性核酸内切酶分析。编码人EC-SOD的cDNA的DNA序列分析
将cDNA片段克隆到M13载体mp9中的EcoRI位点中后(J.Messing和J.Vieira，Gene 19，1982，269-276页)，根据Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，1977，5463-5464页；F.Sanger和A.R.Coulson，FEBS Letters87，1978，107-110页)和Messing等人(Nucl.Acids Res.9，1981，309-321页；P.H.Schreir和R.Cortese，J.Mol.Biol.129，1977，169-172页)的方法，测定来自噬菌体λPS3编码人EC-SOD的cDNA插段的DNA序列。
根据Dale等人(Plasmids13，1985，31-40页)所述方法，在M13载体mp9中产生cDNA插入子的依次复盖的克隆系列。利用此方法测定cDNA两条DNA链的完整核苷酸序列，并发现它的长度为1396碱基对。
图5中给出了入PS3的cDNA插段的核苷酸序列及推测出的氨基酸序列。cDNA插段有一个240氨基酸的开放读码系统。纯化的成熟蛋白的氨基酸序列始于氨基酸+1，它提示了一个假定的18氨基酸的信号肽。与已知的信号肽一样，此氨基酸序列富含疏水氨基酸，而且，最后一个残基是丙氨酸，它是在已知信号肽的此位置所具有的氨基酸之一(G.Von Heijne，Eur.J.Biochem.133，1983，17-21页)。下面加线的氨基酸序列已通过肽序列分析得到证实。
DNA序列的另一个特征是在转译起始密码处发现的序列-CAGCAGCCAVGC-，与真核细胞起始位点处必要的共同序列-CCGACC-AUG(G)-同源(M.Kozak.Nucl.Acids Res.12，1984，857-872页)。而且，在多腺苷酸末尾上游14碱基对处，发现有一个与必要的共同序列AATAAA同源的序列-ATTAAA-的可能的多腺苷酸信号。在CHO细胞中人EC-SOD的表达
用含有来源于猴肾病毒(SV40)的复制起点，早期和晚期启动子，多腺苷酸和终止序列的表达载体，来产生由上述cDNA编码的人EC-SOD。将1396碱基对长的cDNA插入到限制性核酸内切酶EcoRI的唯一的切割位点中，该位点位于SV40早期启动子和SV40多腺苷酸终止序列之间。从而使人EC-SOD的编码序列的表达受到SV40早期启动子的控制(图6)。这样构建的EC-SOD表达质粒命名为pPS3。
用限制性核酸内切酶PstI切割位于β-内酰胺酶基因中的唯一的PstI位点，从而使20微克pPS3DNA线性化。根据Graham和Vander Eb的方法(Virology 52，1973，456-467页)将线性化的pPS3DNA与0.5微克含有抗Geniticin(G-418 Sulphate，Gibco Ltd)序列的质粒DNA一起转移到CHO-K1细胞(ATCC CCL61)中。在每毫升含有700微克Geniticin(G-418 Sulphate，Gibco Ltd.)的培养基中(加有10％牛胎儿血清，链霉素和青霉素的Ham F12培养基)进行培养以选择转染细胞。分离抗Geniticin的菌落并在同样的培养基中坛殖。不时取出培养基，如下述用ELISA法和酶活测定以检测其中的EC-SOD。
好几个测定的细胞系都表现出类似的人EC-SOD的生产能力，将得到的细胞系之一命名为CHO-K1/pPS3neo-18，并选择出来用作进一步研究。EC-SOD由含有人EC-SOD编码基因的CHO细胞至培养基中的分泌。
在含有10％牛胎儿血清的Ham F-12培养基中，融合培养CHO-K1/pPS3neo-18克隆和其亲本CHO-K1细胞。3天后除去培养基，用磷酸盐缓冲液将细胞洗涤两次。然后通过在含有40mM Tris-Hcl，140mM NaCl和1mM EDTA的溶液中保温，使细胞从培养瓶中脱离。然后离心回收细胞(大约8×106个)，弃掉上清液，细胞则以沉淀形式储存在-80℃下。然后在1.5毫升含有50mM磷酸钾(PH7.4)，0.3M KBr，3mM DTPA，0.5mM PMSF和100KIE/毫升抑肽酶的溶液中将细胞进行声处理使之破碎。离心匀浆物。根据_hman和Marklund描述的方法(Chim.Sci.70，1986，365-369页)，把匀浆物和培养基与抗人EC-SOD的人CuZnSOD的固定化抗体一起保温，对EC-SOD的数量进行特异测定。在亲本CHO-K1细胞或其培养基中没有发现EC-SOD。在此特殊实验中，发现来自CHO-K1/pPS3neo-18克隆细胞的培养基(15毫升)中含有51单位/毫升的EC-SOD，总共为765个单位。细胞匀浆物(1.5毫升)含有71单位SOD活力。其中有20单位是人EC-SOD。因此，CHO-K1/pPS3neo-18培养物中的97.5％的EC-SOD分泌到培养基中了。在CHO细胞中，人EC-SOD的生产
在固体基质上和悬浮液中两种情况下培养细胞，测定该克隆人EC-SOD的产生。
1.在固体基质上培养CHO-K1/pPS3neo-18细胞生产EC-SOD。
a)用4.5×106个细胞为175立方厘米的培养瓶接种，瓶中装有30毫升加有10％牛胎儿血清、2mM L-谷氨酰胺、链霉素和青霉素的Ham F12培养基(Flow Laboratories)。细胞在含有5％CO2的空气中于37℃下保温。每三天换一次培养基，按照下面题为“人EC-SOD表达的检测方法”的部分中所述方法，测定分泌到培养基中的人EC-SOD浓度。根据ELISA测定和EC-SOD酶活测定，人EC-SOD的生产力为1.5微微克/细胞·24小时。
b)在加有5％牛胎儿血清，2mM L-谷氨酰胺、链霉素和青霉素的Ham-F12培养基中(Flow Laboratories)，以7个细胞/微载体的浓度将细胞接种到4毫克/毫升的微载体((Cytodex3，瑞典Pharmacia公司)中。
将细胞在含有5％CO2的空气中于37℃下培养在500毫升的搅拌瓶(Techne)中。在细胞融合生长时，培养物的生长速率为0.088/小时。
人EC-SOD的生产率为0.50微微克/细胞·24小时。
2.悬浮培养CHO-K1/pPS3neo-18细胞生产EC-SOD。
将125毫升培养基(加有10％牛胎儿血清、2mM L-谷氨酰胺、链霉素和青霉素的Ham F12)接种至2×105个细胞/毫升。培养物在含有5％CO2的空气中于37℃下在旋转瓶中(Techne)保温。
培养基每三天换一次。人EC-SOD的生产率为0.65微微克/细胞·24小时。人EC-SOD表达的检测方法
1.酶联免疫吸附测定(ELISA)
微量滴定板(Nunclon，NUNC A/S，丹麦)的每个小孔中加进100微升溶液，该溶液中含有每毫升15微克多克隆兔抗EC-SODIgG抗体(根据实例3所述方法制备)，15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、0.02％NaN3，PH9.6。在室温下保温过夜后，用PBS(10mM磷酸钠，145mM NaCl，PH7.2)洗涤滴定板，在每个小孔中加入含有3％(W/V)牛血清清蛋白PBS的溶液200微升，並将该微量滴定板于37℃保温30分钟，然后用PBS洗涤。在每个小孔中加入100微升稀释的培养基样品，于37℃下保温1小时。用含有5％吐湿20(V/V)的PBS洗涤滴定板，然后在每个小孔中加入100微升溶液于37℃下保温1小时，该溶液为每毫升含有8微克鼠单克隆抗EC-SOD抗体(见实例2)和3％牛血清清蛋白的PBS。用含有5％吐温20的PBS洗涤后，将滴定板与含有过氧化物酶偶联的兔抗鼠抗体(Dokopatts A/S，州麦)及3％牛血清清蛋白的PBS在37℃下保温1小时。用含有5％吐温20的PBS洗涤滴定板，然后在每个小孔中加入100微升底物溶液(50mM柠檬酸钠，100mM磷酸钠，0.04％(W/V)邻苯二胺、0.01％H2O，PH5.0)于室温下和避光保温20分钟。在每个小孔中加入20微升10％SDS以终止反应，测定450nm处的光吸收。
2.EC-SOD酶活力的测定
根据Marklund，J.Biol.Chem.25，1976，7504-7507页所述方法测定SOD酶活，为了达到人EC-SOD的专一性，在处理前后用固定化抗人EC-SOD琼脂糖分析样品(参见实例4)。样品吸附于抗体前后的活性之差作为EC-SOD的活力。实例9  人血浆中EC-SOD的肝素诱导释放
将肝素(得自A B KABL-Vitrum公司，Stockholm，瑞典)依每公斤体重200国际单位，给两名禁食过夜的健康男性〔a)34岁和b)40岁〕作静脉注射。依图7所示，注射肝素前和注射后间隔采血。将血液样品加至含有EDTA作抗凝剂的Terumo Venoject真空管内並离心。离心后将血浆样品保存于-80℃，以备检测用。
此外，采取三名健康人全血20毫升，依上述方法保存于EDTA管内。将血液分成两等份，向一份内加肝素30国际单位/毫升，並向另一份内加入等体积0.15M NaCl、室温下保温30分钟后离心样品並收集血清用于作SOD分析。
使用KO2，按照_hmann和Marklund(Clin.Sic.，70，1980，365-369)改良的直接分光光度法检测SOD活性(S.L.Marklund，J.Biol.Chem.251，1976，7504-7507页)。1单位SOD活性相当8.3毫微克人CuZuSOD，8.8毫微克人EC-SOD和65毫微克牛MnSOD。血浆中同功酶的区分是按_hmann和Marklund(Clin.Sci.，70，1986，365-369页)所述的方法借助于抗人CuZuSOD抗体和固定于Sepharose_4B上的EC-SOD完成的。
图7中所示的结果表明，静脉内注射200国际单位/公斤体重肝素可使血浆EC-SOD活性迅速增高3倍。差不多于5分钟后达到最大增加值。活性于高水平维持15-30分钟，6小时后逐渐减低到原来的水平，静脉注射肝素对血浆CuZuSOD和氰化物抗性SOD活性没有影响。
图8中显示了静脉给药至每公斤体重200国际单位肝素对EC-SOD向血浆释放的影响。由图中看出，随着肝素剂量的增加，EC-SOD的释放增加。显然没有明显的平稳状态，並且似乎在剂量超过每公斤体重200国际单位时会导致更高的EC-SOD释放。但从道德上考虑，而没有进行更高剂量的试验。
与体内试验的结果相反，按所述方法将肝素加到全血中，正如已提过的，对血浆EC-SOD活性没有影响。直接向血浆内加肝素(5国际单位/毫升)，则EC-SOD活性无任何改变。此结果表明，图7中所示的体内血浆EC-SOD活性的增加不是因血细胞内酶的释放引起的，也不是因血浆中EC-SOD的活化引起的。
将采自5名健康人(3名男性，2名女姓)的血浆样品在肝素-Sepharose_(购自瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司)进行柱层析。层析是在室温下，在含有2毫升肝素-Sepharose_的柱中，並以25mM磷酸钾(PH6.5)作洗脱液进行的。以每小时4.2毫升上样(2毫升血浆)，当A280吸光率接近基线，以每小时9毫升速率用在磷酸钾缓冲液(0-1摩尔，总体积50毫升)的线性NaCl梯度洗脱结合的组份(参见图9)。该方法在洗脱液中产生的SOD活性约为95％。
使用前，借助在小Sephadex_G15柱(PD-10)(也购自瑞典乌普萨拉的Pharmacia公司)上层析的方法用洗脱缓冲液平衡血浆样品。经此层析使样品达到三倍稀释。SOD活性的回收率接近100％。
下列表1中给出测定5份正常血浆样品之EC-SODA、B和C部分的结果。结果可见，正常血浆中三个部分大致相等。层析谱中所所产生的EC-SOD活性为95％。因为血浆样品分离的图谱在冰箱中储存3天之前或之后均完全相同，故分离成三部分显然不是由体外次级降解引起的。图9中显示静脉内注射肝素对EC-SOD各部分之组分的影响。结果发现人体内静脉注射肝素只导致C部分的显著增加。A和B部分则基本上没有改变。在第二组分析中(未给出数据)，注射肝素的作用基本相同。C部分由7单位增加到32单位/毫升血浆。
                       表    1
             血浆EC-SOD分离成A、B和C组分
                EC-SOD，单位/毫升血浆
                      部    分年令/性别                 A                 B               C40/男                    5.9               6.2             7.034/男                    5.2               4.4             5.132/男                    2.3               5.2             6.433/女                    2.3               5.9             8.3年令/性别                 A              B             C29/女                    3.3            6.1           7.3均值+标准偏差          3.5±1.5       5.6±0.8      6.8±1.2
上述实验表明，静脉内注射肝素导致促进血浆EC-SOD活性增加。肝素並不能活化EC-SOD，也不能证明由血细胞释放EC-SOD，从而认为内皮细胞表面很可能是释放EC-SOD的来源。许多其它因子对肝素、脂蛋白脂肪酶、肝脂酶、二胺氧化酶有亲合性，而且前面已相似地表明血小板因子4可通过静脉内注射肝素而迅速被释放。对于上述大多数情况，有证据将这样现象解释为肝素诱导内皮细胞表面上硫酸乙酰肝素结合的蛋白质的置换(A.Robinson-White等，J.Clin.Invest.76，1985，93-100页；C.Busch等，Throm.Res.19，1980，129-137页)。很相似的EC-SOD释放可以同样方式来解释。
肝素剂量高达200国际单位/公斤体重，EC-SOD的释放亦没有达到明显的平稳状态，这表明为得到EC-SOD的最大释放，要比脂蛋白脂酶、二胺氧化酶、肝脂酶和血小板因子4需要更多的乙酰肝素。肝素和硫酸乙酰肝素对于EC-SOD的亲合力的比例可能比对其它蛋白质的亲合力低些。
人标准血浆含有几乎等量的EC-SOD的A、B和C部分。静脉注射肝素所释放的只是有高肝素亲合力的C部分，而C部分显然是对内皮细胞表面有亲合力的形式。此外增加达到4-6倍，但这很可能是因较高剂量的肝素会导致一较高比例。对于脂蛋白脂酶、肝脂酶、二胺氧化酶和血小板因子4则达到更高的比例。与这些蛋白质相比较，内皮细胞对EC-SOD的结合显得相当紧密。对于EC-SOD，在血浆和内皮细胞之间可能存在一个平衡。在血管系统中，大多数EC-SOD似乎是位于内皮细胞表面上。
EC-SOD的A、B和C部分之间对肝素亲合力的差异的分子基础仍不清楚。氨基酸和亚单位组分没有明显不同(S.LMarklund.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，1982，7634-7638页)。也没有检测出任何抗原性差异(S.L.Marklund，Biochem.J.，220，1984，269-272页)。因为经离子交换层析未能测出A和C组分之间的差异，而且它们的等电点完全相同(PH4.5)，故对带负电荷的肝素的结合显然是没有通常的离子交换性质。因为将血浆在冷箱内储存了3天並不改变在肝素-Sepharose_上层析的洗脱图形，故这种差异不是由于体外降解所致。虽然有体内降解的可能性，但可以推测A和B部分特异地倾向保持液体成分，而C部分则倾向屏蔽细胞表面。
体内大多数类型细胞的表面上具有硫酸乙酰肝素和其它硫酸化葡糖胺聚糖(M.H__k等，Ann.Rev.Biochem.53，1984，847-869页)。有可能见于组织中的大多数EC-SOD(S.L.Marklund，J.COlin.Invest.74，1984，1398-1403页)定位于细胞膜上的这些物质上，並存在于结缔组织中。EC-SOD结合于细胞表面可能是防止细胞外形成超氧化物基团的一种特别有效的方式。有趣的是已注意到用多聚赖氨酸取代CuZuSOD有利于与带负电荷之细胞膜的结合，大大加强酶保护活化的多形核白细胞抗自身失活的能力(M.L.Salin和J.M.McCord，Seperoxide and Superoxide Dismutases，A.M.Michelson，J.M.Mc.Cord和I.Fridovich主编，Academic Press，1977，257-270页)。星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)的细胞膜相关的SOD可有效地保护细菌抗活化的多形核白细胞(B.L.Beaman等，Infect.Immun.，47，1985，135-140页)，与体内大多数细胞不同，对EC-SOD的C部分缺乏亲合力的微生物不便于通过酶进行保护。
有证据表明，在某些条件下由活化的白细胞及其它类型细胞产生的超氧化物基团能直接或间接地诱发染色体损伤(J.Emerit，Lymphokines，8，1983，413-424页；A.B.Weitherg，S.A.Weitzman，E.P.Clark和T.P.Stossel，J.C.lin.Invest，75，1985，1835-1841页；H.C.Birnbim和M.Kanahus-Kaminska，-Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，1985，6820-6824页)並促进致癌作用(C.Borek和W.Troll.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1983，1304-1307页；Y.Nakamura，N.H.Colburn和T.D.Gindhart，Carcinoqenesis，6，1985，229-235页)。表面相关EC-SOD的C部分是防止体内发生这些变化的有效的保护剂。在大多数体外试验系统中，因结合较弱，故可能会从细胞丢失大部分EC-SOD的C部分。因而在这样的系统的结合，不一定成为体内防止损伤的定量预测。
非肠道使用CuZuSOD表明具有如上面所指出的许多有利的治疗性质。目前的发现提示，使用EC-SOD可能是防止因细胞外空间内超氧化物基团引起的细胞损伤的一种更为有效的方式。实例10  给兔注射125I标记的人EC-SOD
按实例1和4-6所述，使用“Lodogen”技术用125I标记的脐带制取EC-SOD(P.R.P.Salacinski，C.Mclean，J.E.C.Sykes，U.V.Clement-Jones和P.J.Lowry，Anal.Biochem.，117，1981，136-146页)。在Sephacryl_S-300(得自瑞典乌普萨拉的Pharmacial公司)上用凝胶过滤法把被标记的EC-SOD从125I-碘化物中分离出来。其在层析谱上的定位与未标记的EC-SOD为相同位置，这表明其分子大小没有改变。
在肝素-Sepharose_上层析分离所得的标记的EC-SOD(方法同前)。下面的实验只使用有高肝素亲合力的物质(＝C部分)。
将标记的EC-SOD静脉注射到兔(体重约3公斤)体内。之后采集血液样品，以分析在血浆中的所保留的放射活性。用三氯醋酸(其可沉淀蛋白质)沉淀血浆样品，离心后计数蛋白团块内的放射活性。这样可排除血浆中因EC-SOD降解所得的含碘化物氨基酸及放射活性碘化物的计数。在兔的饮水中给兔以碘化物，以防止在体内125I标记蛋白质。
过不同时间后，给兔静脉内注射肝素(2500国际单位)，以研究肝素的作用。结果如图10和图11所示。100％相当于理论上血浆应含有的放射活性，给出注射的量，並假定兔的总血浆体积为其体重的5％(即体重3公斤的兔有150毫升血浆)。
图10显示注射肝素前以及注射125I-EG-SOD2、5、10及20分钟的计数结果。
注射标记的EC-SOD后，在5-10分钟之内活性迅速降低到大约理论最大值的15％。如在EC-SOD前注射肝素，则几乎保留了所有的EC-SOD活性，只有一个缓慢的衰减。如在给予125I-EC-SOD后2、5、10和20分钟注射肝素，则放射活性有一迅速增加，且峰值达到理论上的最大值。
图11显示2小时至72小时后注射肝素的结果，从中可以看出，2小时后活性有一迅速增加，达到理论最大值的50％，而72小时后仍达3％。
这里显示了迅速降低到50％(2小时处)，但此后EC-SOD的排除便慢得多。利用图11中的最大值，可算出半衰期(t1/2)约为18小时。在人体中的半衰期可能要长些，因为体内差不多所有成份的更新小动物要更快。
静脉注射肝素后血浆内EC-SOD迅速增加(2分钟内达到最大值)这一事实表明，释放的125I-EC-SOD是定位于血管内皮上，这就得出如实施例8所得到的相同结论。实例11  人EC-SOD与猪主动脉内皮的结合
在屠宰场收集猪主动脉，运输时存放在冰上，沿长轴切开並放在两块1.5厘米厚的有机玻璃块之间。向定位在主动脉上朝向腔侧的有机玻璃板上钻出10毫米直径的孔。这样，10毫米直径孔的底部即达到主动脉内皮。制备含440,000Cpm125I-EC-SOD(按实例10所述方法标记的)的溶液和远为过量的未标记的EC-SOD的C部分(121微克/毫升)。溶剂是用HEPES缓冲的(PH7.4)、且含有0.5微克/毫升牛血清白蛋白的Eagle氏基本培养基。向三个孔内各加入150微升该溶液，于室温下震荡保温2.5小时。之后吸去溶液。用500微升溶剂将孔洗两次(摇动2分钟)，再用500微升含15国际单位肝素的溶剂洗两次(摇动5分钟)。溶液中的放射活性(三孔的均值，以所加放射活性的％表示)分别为80.4％(保温的起始溶液)、2.1％、0.6％(洗涤溶液)、6.5％、2.2％(含肝素的洗涤溶液)。测定一个孔的溶液内的SOD酶活性，结果发现在保温的初始溶液中被除去的活性为84.2％(82.7％)，而第一次肝素洗涤溶液内被除去的活性为7.1％(7.0％)。由此可见，SOD酶活性和测得的放射活性间十分相符。数据显示，所加EC-SOD的20％被主动脉内皮结合，並且EC-SOD活性可因加入肝素而得以释放。实例12  天然的和重组的EC-SOD与外源凝聚素的结合
将伴刀豆球蛋白A1(ConA)、小扁豆凝集素和麦胚凝集素固定于得自Pharmacia AB公司(Uppsala，瑞典)的Sepharose_上，将每个层析柱内装入2毫升凝胶，以50毫摩尔磷酸钠(PH7.4)+0.25摩尔NaCl作为洗脱液，将200单位(1.7微克)天然的脐带EC-SOD或重组EC-SOD溶解于0.5毫升洗脱缓冲液中並加于凝集素柱上，之后再加3.5毫升洗脱缓冲液。用10毫升洗脱缓冲液洗柱，再用14毫升0.5摩尔α-甲基甘露糖苷(ConA-Sepharose_)和小扁豆凝集素-Sepharose_)或0.5摩尔N-乙酰葡糖胺(麦胚凝集素-Sepharose_)洗脱结合的EC-SOD，测定由柱上洗脱的液体的SOD活性。
有98％的天然EC-SOD和97％的重组EC-SOD结合于ConA-Sepharose_。99％的天然EC-SOD和96％的重组EC-SOD结合于小扁豆凝集素-Sepharose_。61％的天然EC-SOD和95％的重组EC-SOD结合于麦胚凝集素-Sepharose_。
对ConA和小扁豆凝集素的亲合性表明天然的和重组的EC-SOD在其醣部份中均含有糖基和甘露糖基团。对麦胚凝集素的亲合性表明有N-乙酰-葡糖胺基团存在。就与麦胚凝集素的结合来说，天然EC-SOD的异质性可能解释为分离期间存在于脐带内或脐带匀浆内的酶的醣产生部份降解所致。重组酶接触到降解酶的危险则较小。根据用凝集素所作的这些研究的结果推断，天然的和重组EC-SOD的醣部份是相似的。实例13  在肝素-Sepharose_上分析天然脐带EC-SOD和
    重组EC-SOD
将大约500单位(4.4微克)天然EC-SOD和重组EC-SOD加在如实例9所述的肝素-Sepharose_柱上进行层析分析。两种酶都在NaCl梯度为0.52摩尔时洗脱出来，因而，天然和重组EC-SOD具有相同的行为，且结果证实重组EC-SOD是C型的。实例14  EC-SOD分子中铜和锌的含量
在Perkin-Elmer Zeeman 303+HGA仪的石墨坩埚内，用原子吸收光谱法测定天然脐带EC-SOD和重组EC-SOD中铜和锌的含量。比较制剂中EC-SOD蛋白和铜及锌的量。发现1摩尔天然EC-SOD(四聚体)含有3.97摩尔铜和4.50摩尔锌。每摩尔重组EC-SOD酶中含有3.98摩尔铜和4.45摩尔锌。可见这两种制品含有相等量的铜和锌。这些结果进一步证实了以前发现的每摩尔EC-SOD含4摩尔铜的结果(Marklund，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A79，1982，7634-7638页)。该项研究发现约有4个锌原子，但因为材料不足和有锌污染的可能性，所以对酶中存在有锌的问题尚不能肯定。而本实验结果证实了EC-SOD分子中含有四个锌原子。实例15  抗人EC-SOD单克隆抗体的制备
给小鼠注射由脐带制得的EC-SODC(实例4-6)。几个月后小鼠连续注射三天的EC-SOD，第四天分离脾脏並磨碎，依标准技术(St.Groth和Scheidegger，J.Immunol.Methods，35，1980，1-21页)将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，用ELISA技术(Pouillara和Hoffman，Methodsin Enzymology，92，1983，168页)鉴定产生抗EC-SOD抗体的克隆並进一步筛选培养。最后选择出两个克隆：“14，B7”和“6，H6”，通过在小鼠腹腔内培养以进行抗体的大量制备。之后由蛋白A-Sepharose_上按制造者(Pharmacia公司，Uppsala，瑞典)介绍的方法，通过吸附和解吸从腹水液中分离抗体。用0.1摩尔甘氨酸-Hcl(PH3.0)进行洗脱，洗脱后直接将合并的IgG滴定到PH7，对50毫摩尔Tris-Hcl(PH8.0)+0.15摩尔NaCl+0.02％NaN3透析。实例16  抗EC-SOD单克隆抗体在CNBr活化的
    Sepharose_上的固定
因已发现“6，H6”单克隆抗体能很强地结合n-EC-SOD(Kd＜1012M)，故选择“14B7”抗体来纯化EC-SOD。在与CNB活化的Sepharose偶联前，必须除去IgG溶液中的叠氮化物(参见实例15)並将缓冲液改变成“偶联缓冲液”(＝0.1摩尔碳酸钠(PH8.3)+0.5摩尔NaCl)。这一过程是按制造商(Pharmacia公司，Uppsala瑞典)介绍的方法，用PD10柱完成的。CNBr活化的Sepharose_是已胀溶的，並且是按制造商(Pharmacia公司，Uppsala，瑞典)介绍的方法制备的。将CNBr活化的Sepharose_以预计的量加到IgG溶液(于偶联缓冲液内)中，以产生每毫升凝胶约2毫克IgG的偶联密度。在“震荡器”上将混合物于室温保温约2小时。从凝胶中除去缓冲液並分析存留的蛋白质。结果达到97％以上的偶硫。室温下与1摩尔乙醇胺(PH9.3)保温2小时，以封闭IgG偶联凝胶上保留的活性基团。最后用改变的“偶联缓冲液”(见上述)和0.1摩尔醋酸钠(PH4.0)+0.5摩尔NaCl洗四至五次，以洗去过量的乙醇胺和吸附的蛋白质。将凝胶储存于50毫摩尔磷酸钾(PH7.4)+0.5摩尔NaCl+0.02％NaN3 +中，与过量的纯化之EC-SOD(实例4-6)保温3小时，以测定单克隆IgG-Sepharose_的最大结合能力，离心后再分析上清液中保留的EC-SOD活性。此结果与用Sepharose_4B保温的结果差不多。
向溶于“偶联缓冲液”的1毫升EC-SOD溶液中加入10、50、100和1000微升50％的单克隆抗EC-SOD-Sepharose_悬浮液，同时平行地在同一缓冲液内保温80％的Sepharose_HB浮悬液。溶液于室温下保温3小时，离心后测定上清液内留有的EC-SOD的活性。利用得到的数据可计算出凝胶的EC-SOD结合能力是约为每毫升50％凝胶悬液～6000单位EC-SOD(＝～12000单位/毫升凝胶)。这个数字等于理论上最大结合容量的6％，並接近于随机偶联的IgG一般达到的值。实例17  与单克隆抗EC-SOD-Sepharose_结合的重组EC-SOD的分离
整个纯化过程在4℃完成，将得自CHo-K1/pPSneo-18细胞培养物的约5升培养基(每毫升约含300单位EC-SOD活性〔～2.6微克〕)离心，除去细胞碎片和沉淀物。用大约125毫升单克隆抗EC-SOD-Sepharose_(实例16)以结合培养基中的EC-SOD(～1,500,000单位)。将IgG-Sepharose装入层析柱。柱直径5厘米，长约6.5厘米。上样前用50毫摩尔磷酸钠+0.5摩尔NaCl(PH7.0)洗柱。以100毫升/小时的速度加培养基並鉴测280毫微米吸光率。用50毫摩尔磷酸钠(PH6.5)+0.5摩尔NaCl洗脱紧密结合于IgG-Sepharose的蛋白质。继续洗脱直到AD280值很低为止。再用650毫升50毫摩尔AMP(＝1-氨甲基丙醇)-Hcl(PH9.0)洗柱並用约1升的50毫摩尔AMP-Hcl(PH9.0)+1摩尔KSCN洗脱EC-SOD。洗脱速度为100毫升/小时。分析EC-SOD活性和280毫微米吸光率，並对洗脱体积作图(图12)。在出现蛋白峰之后，余留的280毫微米吸光率则源于KSCN。收集EC-SOD活性峰值部份。为降低离子强度和在下一步骤中使酶与离子交换凝胶产生最适结合，用大约14倍体积的蒸馏水稀释合并物，並用2摩尔AMP将其仔细滴定到PH8。IgG亲合步骤的回收率为60％。
用50毫摩尔磷酸钠(PH6.5)洗约10毫升DEAE-Sepharose_，並装入直径为5厘米，高约0.5厘米的层析柱内。通过柱以60毫升/小时的速度抽吸的方法，使从IgG柱得到的稀释的EC-SOD收集物吸附于DEAE-Sepharose_上，再用50毫摩尔磷酸钠(PH8.5)洗柱，直到280毫微米吸光率接近零为止。用50毫摩尔磷酸钠(PH8.5)+0.25M NaCl洗脱酶。分析280毫微米吸光率和EC-SOD活性，並对洗脱体积作图(图13)收集各峰值管，对50mM磷酸钠(PH6.5)进行透析並浓缩到约6毫升，该步骤的回收率约为100％。
用在肝素-Sepharose_柱上吸附/解吸附的方法精细地纯化EC-SOD。按制造商(Pharmaeia公司，Uppsala，瑞典)介绍的方法制备肝素-Sepharose_12毫升，用50mM磷酸钠(PH6.5)+1M NaCl洗，再用50mM磷酸钠(PH6.5)洗。将此肝素Sepharose_凝胶装入直径2.5厘米(高约2.5厘米)的层析柱内，将经过浓缩和透析的经DEAE-Sephacel_柱制备的收集物(6毫升，每毫升含EC-SOD活性约185,000单位)。柱的洗脱速度为10毫升/小时。鉴测280毫微米吸光率。开始洗脱用50毫摩尔磷酸钠(PH6.5)洗脱速度为20毫升/小时。当280毫微米的吸光率接近基线时，即用0至1M NaCl的NaCl梯度洗脱EC-SOD。梯度体积为270毫升。为防止EC-SOD受高浓度NaCl的破坏，须用蒸馏水稀释这个部份(即梯度的开始洗脱部份)。将一T型管插入引自柱之洗脱端的塑料管内，以两倍于洗脱速度的速率将蒸馏水泵入洗脱液内。
EC-SOD活性部份是在一个与实施例6的C峰差不多相同的NaCl浓度时的峰(图14)时洗脱的。收集峰的中心部份(组份1)组份1的比活性(经测定AD280得出的单位数/毫升)为88,400。用同样方法由脐带匀浆制得的天然EC-SOD(参见实例1)的比活性为88200，这些数据几乎是相同的，並且均比以前公开的数值高些(Marklund，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，79，1982，7634-7638页)这两种制备在实施例12-14和18-20中进行了分析。同时收集峰值管的两侧部份(组份II)。把这些组份浓缩，並对50毫摩尔磷酸钠(PH6.6)透析。在此肝素-Sepharose_纯化步骤中，EC-SOD的产率约为60％，收集物总的含600,000单位EC-SOD(约5.3毫克)，此为CHO-K1/pPS3neo-18培养基中原有活性的40％。实例18  凝胶层析法对天然EC-SOD和重组EC-SOD分子
   大小的测定
在Sephacryl S-300_柱上作凝胶过滤以估计得自脐带的天然酶及重组酶的分子量。以10毫摩尔磷酸钾(PH7.4)+0.15M NaCl作洗脱液来洗脱柱(直径1.6厘米，长96厘米)，用铁蛋白(440,000)、IgG(150,000)、牛血清白蛋白(67,000)、卵白蛋白(43,000)、胰凝乳蛋白酶原(25,000)和核糖核酸酶(13,700)(括号内为分子量)等标准品校准层析柱。
从柱上相当于分子量136,000和151,000的位置分别洗脱天然和重组EC-SOD，可见重组EC-SOD的分子略大些，相差的部份可能是由于如下述实验(实例19)中看到的天然酶亚单位的部份降解。实例19  在存有十二烷基磺酸钠的梯度聚丙烯酰胺凝胶中，天然的
    脐带EC-SOD和重组EC-SOD的电泳分析。
用梯度凝胶(10-15％的SDS存在下)比较天然的和重组的EC-SOD亚基的分子量。
将酶(n-EC-SOD和r-EC-SOD)各约25微克冻干之后溶解于含有5％蔗糖、5mM EDTA、5％2-巯基乙醇和2％SDS(溶于PH8.64的由0.4M硼酸和0.41M Tris组成的缓冲液内)的50微升样品混合物中。将样品煮沸5分钟之后，立即用冰冷却。将各为约1微升(约0.2微克)的样品加上Pharmacia Phast System梯度(10-15％)聚丙烯酰胺凝胶上，之后按制造商(Pharmacia公司，Uppsala，瑞典；Phast系统分离技术110号汇订本)介绍的方法，在Pharmacia Phast System电泳仪上进行电泳。电泳所得凝胶用考马氏亮兰染色(参见图15)。由左到右各泳道分别含有重组EC-SOD、天然脐带EC-SOD和分子量标记物(94,000、67,000、43,000、29,000、20,100和14,400)的混合物。迁移率与EC-SOD相似的标记物的分子量是29.000。在EC-SOD的电泳胶中未检测到杂质。重组EC-SOD有一条带，分子量约32,000。天然EC-SOD显示出两条带，较大的一条具有与重组EC-SOD同样的分子量，较小的一条带分子量约28,000。两条带的相对量随天然EC-SOD的制品不同而不同，这种不均一性可能是由于酶的部份降解所致。实例20  天然和重组EC-SOD的氨基酸组成与由编码EC-
    SOD的cDNA序列推测的氨基酸序列的比较
天然脐带EC-SOD和重组EC-SOD的氨基酸组成如表11所示。比较中不包括色氨酸，因为它不容易从氨基酸分析仪测得。由表中看出，天然和重组酶的氨基酸组成几乎完全相同。从cDNA序列推断的氨基酸序列也十分相符。这些结果表明，天然和重组酶实际上完全相同，而且由cDNA序列推断的氨基酸序列是正确的。

Claims (5)

1.一种通过重组技术生产细胞外SOD的方法，它包括用下面的编码具有天然细胞外SOD的超氧化物歧化作用的多肽的DNA序列或不改变其编码的多肽的天然细胞外SOD活性的可能的修饰序列转化动物细胞，包括将包含于一合适表达载体中的编码细胞外SOD的DNA序列插入到哺乳动物宿主细胞中，以使所插入的DNA序列编码细胞外SOD并回收细胞外SOD：TrpThrGlyGluAspSerAlaGluProAsnSerAspSerAlaGluTrpIleArgAspMetTGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATGACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC
                        30                            40TyrAlaLysValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnArgArgAspAspAsp GlyThrTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACGATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC
                        50                            60LeuHisAlaAlaCysGlnValGlnProSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnProArg ValCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTGGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC
                        70                            80ThrGlyValValLeuPheArgGlnLeuAlaProArg AlaLysLeuAspAlaPhePheAlaACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCCTGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG
                        90                           100LeuGluGlyPheProThrGlyProAsnSerSerSerArg AlaIleHisValHisGlnPheCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTCGACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG
                       110                           120GlyAspLeuSerGlnGlyCysGluSerThrGlyProHisTyrAsnProLeuAlaValProGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC
                       130                           140HisProGlnHisProGlyAspPheGlyAsnPheAlaValAr gAspGlySerLeuTrpArgCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGGGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACCTCC
                       150                           160TyrAr gAlaGlyLeuAlaAlaSerLeuAlaGlyProHisSerIleValGlyArgAlaValTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTGATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGCAC
                       170                           180ValValHisAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGluAsnGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG
                       190                           200GlyAsnAlaGlyArgAr gLeuAlaCysCysValValGlyValCysGlyProGlyLeuTrpGGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGGCCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC
                       210                           220GluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLysGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAGCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTCAlaAlaGCCGCCCGGCGG
2.根据权利要求1所述的方法，其中细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中DNA序列包含有一个编码信号肽的信号序列：
  -18                     -10
  MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAsp
  ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC
  TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG
                                                  120-1AlaGCCCGG它的存在确保了细胞外SOD从细胞内分泌，且在其中至少有一定比例被表达的细胞外SOD分泌到培养基中并回收之。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中细胞外SOD的回收方法是将含有细胞外SOD活性的生物学材料吸附于含有抗细胞外SOD或其免疫学决定簇的固定化单克隆抗体的基质上，洗脱细胞外SOD活性，并合并含细胞外SOD的各管，并根据需要通过吸附至含有肝素或肝素类似物或另一种硫酸化有糖氨基聚糖，硫酸葡聚糖或另一种带强负电荷的化合物的基质上而将其进一步纯化。
5.根据权利要求4所述的方法，其中基质包括硫酸乙酰肝素。
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0213628A3 (en) * 1985-09-03 1988-09-21 Yeda Research And Development Company, Ltd. Expression of superoxide dismutase in eukaryotic cells
US6610520B1 (en) 1985-11-22 2003-08-26 Bio-Technology General Corp. Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby
JPS63132820A (ja) * 1986-11-22 1988-06-04 Minoru Nakano 口腔用組成物
US5260204A (en) * 1987-03-14 1993-11-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
DE3854872D1 (de) * 1987-03-14 1996-02-22 Boehringer Ingelheim Int Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD)
ATE130196T1 (de) * 1987-03-27 1995-12-15 Bio Technology General Corp Menschliches mangansuperoxiddismutase und behandlungsverfahren.
DK310788A (da) * 1987-06-09 1988-12-10 Int Cardiovascular Med Inc Praeparat indeholdende superoxid-dismutase, dets fremstilling og anvendelse til behandling af global iskaemi
JPH01238537A (ja) * 1988-03-18 1989-09-22 Toyo Jozo Co Ltd 肝障害治療剤
JPH01246225A (ja) * 1988-03-28 1989-10-02 Toyo Jozo Co Ltd 膵炎治療剤
JPH0262829A (ja) * 1988-05-18 1990-03-02 Nippon Kayaku Co Ltd 虚血に基づく傷害の予防及び治療剤
DK455789D0 (da) * 1989-09-15 1989-09-15 Symbicom Ab Polypeptid
DE4038563A1 (de) * 1990-12-04 1992-06-11 Gruenenthal Gmbh Verwendung von superoxiddismutasen zur prophylaxe und/oder behandlung von organversagen bei risikopatienten mit polytrauma
DE4239877C1 (de) * 1992-11-27 1994-03-17 Boehringer Ingelheim Int Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung
EP0627486A1 (en) * 1993-06-04 1994-12-07 N.V. Innogenetics S.A. New extracellular superoxide dismutase, a process for preparing the same and compositions containing the same
DK75393D0 (da) * 1993-06-24 1993-06-24 Symbicom Ab Production of protein
US5994339A (en) * 1993-10-15 1999-11-30 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Oxidant scavengers
US5747026A (en) * 1993-10-15 1998-05-05 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Antioxidants
US6127356A (en) * 1993-10-15 2000-10-03 Duke University Oxidant scavengers
DE4336641C2 (de) * 1993-10-22 1995-09-07 Deutsches Rheuma Forschungszen Verwendung von Superoxid-Dismutase (SOD) zur Behandlung retroviraler Erkrankungen
AU3758695A (en) * 1994-09-20 1996-04-09 Duke University Oxidoreductase activity of manganic porphyrins
AU690377B2 (en) * 1994-11-04 1998-04-23 Polymun Scientific Immunobiologische Forschung Gmbh Application of superoxide dismutase in liposomes
MY128323A (en) * 1996-09-30 2007-01-31 Otsuka Pharma Co Ltd Thiazole derivatives for inhibition of cytokine production and of cell adhesion
US6171856B1 (en) 1997-07-30 2001-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
AU8671798A (en) * 1997-07-30 1999-02-22 Betagene, Inc. Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
EP1045851B1 (en) 1997-11-03 2003-04-23 Duke University Substituted porphyrins
AU771259B2 (en) 1998-04-24 2004-03-18 Aeolus Sciences, Inc. Substituted porphyrins
ES2385486T3 (es) 1999-01-25 2012-07-25 National Jewish Health Porfirinas sustituidas y su uso terapéutico
DK1392328T3 (da) * 2001-01-19 2009-11-09 Nat Jewish Health Medikament til beskyttelse i radioterapi
FI20010898A0 (fi) * 2001-04-30 2001-04-30 Ylae Herttuala Seppo Ekstrasellulaarinen superoksididismutaasi (EC-SOD) geeniterapia restenoosoin ehkäisemiseksi
CA2449024A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 National Jewish Medical And Research Center Oxidant scavengers for treatment of diabetes or use in transplantation or induction of immune tolerance
JP2006503605A (ja) * 2002-04-30 2006-02-02 フイット バイオテク オーワイジェイ ピーエルシー 医療装置
WO2003103680A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 Duke University Substituted porphyrins
US7740839B2 (en) * 2003-10-31 2010-06-22 Tae-Yoon Kim EC SOD and cell transducing EC SOD and use thereof
CN100345973C (zh) * 2004-11-18 2007-10-31 中国农业大学 超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体
EP2732817B1 (en) 2008-05-23 2016-08-24 National Jewish Health A compound for use in treating injury associated with exposure to phosgene or chlorine gas
US20100098768A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 Clarkson University Method of neuroprotection from oxidant injury using metal oxide nanoparticles
CN102660580A (zh) * 2012-05-18 2012-09-12 深圳市北科生物科技有限公司 Sod基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用
AU2014239600B2 (en) * 2013-03-15 2017-11-02 Baxter Healthcare Sa Immobilization of active agent on a substrate
JP6513643B2 (ja) 2013-06-07 2019-05-15 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ トリヒドロキシフェニル基を含む化合物を使用する基体上の活性剤の固定化
CN104342409B (zh) * 2014-06-17 2018-05-25 吉林金梓源生物科技股份有限公司 重组人参超氧化物歧化酶的制备方法
CN104342408B (zh) * 2014-06-18 2018-05-25 吉林金梓源生物科技股份有限公司 重组蛹虫草超氧化物歧化酶的制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK145950C (da) * 1979-05-17 1983-09-26 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til isolering af cu,zn-superoxid-dismutase fra vandige oploesninger indeholdende dette enzym sammen med ledsagende proteiner
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
JPS56102787A (en) * 1980-01-18 1981-08-17 Mamoru Sugiura Preparation of human placenta superoxide dismutase
JPS5729285A (en) * 1980-07-30 1982-02-17 Takeda Chem Ind Ltd Superoxide dismutase and its preparation
JPS57155991A (en) * 1981-03-23 1982-09-27 Green Cross Corp:The Preparation of superoxide dismutase derived from human placenta
DE3377363D1 (en) * 1982-03-31 1988-08-18 Ajinomoto Kk Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells
IT1150598B (it) * 1982-12-14 1986-12-17 Ines Bianchi Procedimento per la purificazione della superossidodismutasi mediante cromatografia di affinita'
EP0138111B1 (en) * 1983-10-03 1991-11-21 Chiron Corporation Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
JPS61111690A (ja) * 1984-11-06 1986-05-29 Ube Ind Ltd 組換えｄｎａおよびその用途
JPS61139390A (ja) * 1984-12-13 1986-06-26 Nippon Kayaku Co Ltd ひとｓｏｄをコ−ドする新規ｄｎａおよびそれを有する微生物

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Publication number Publication date
DK224587A (da) 1987-05-01
HUT46059A (en) 1988-09-28
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DK224587D0 (da) 1987-05-01
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IL79926A (en) 1994-10-07

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