JP3475042B2

JP3475042B2 - アンギオゲニンの抑制剤

Info

Publication number: JP3475042B2
Application number: JP11747397A
Authority: JP
Inventors: ロバート・シャピロ; バート・エル・バリー
Original assignee: プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 1987-04-14
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2003-12-08
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: DE3884853T2; AU641261B2; PT87236A; AU8139591A; JP2694603B2; DK201188A; CA1341530C; EP0291686A2; PT87236B; JPH07149654A; IE63732B1; EP0291686A3; JPH1052282A; EP0291686B1; DK201188D0; DE3884853D1; IE881115L

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アンギオゲニンの
抑制剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アンギオゲニンは血管形成を誘発するヒ
ト蛋白質である〔フェット等、バイオケミストリー、第
２４巻、第５４８０頁（１９８５）〕。この生物学的活
性は３５ｆモル程度の少ない量で発現される〔ニワトリ
胚ＣＡＭ分析法を用いる、上記〕。ヒト腫瘍細胞により
状態調節された媒体から最初に単離されたが、アンギオ
ゲニンは腫瘍特異性でなく各種の他の細胞及び生物体液
に見ることができ、殆んどの場合正常及び（又は）病理
学的な脈管新生の役割を演ずる。これは約１４，４００
の分子量を有し、約ｐＨ９．５よりも高い等電点を有す
る〔上記〕。ストリドム等、バイオケミストリー、第２
４巻、第５４８６頁（１９８５）も、アンギオゲニンの
アミノ酸配列を開示している。

【０００３】アンギオゲニンは酵素活性を有することが
知られている。詳細には、これは２８Ｓ及び１８Ｓのｒ
ＲＮＡの限られた開裂を触媒して、長さ１００〜５００
ヌクレオチドの特定パターンの産生物を生成する〔シャ
ピロ等、バイオケミストリー、第２５巻、第３７２７頁
（１９８６）〕。しかしながら、これは標準的ＲＮアー
ゼ分析（上記）において顕著なリボヌクレアーゼ活性を
持たない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】今回、少なくともアンギ
オゲニンの脈管形成活性を抑制する物質を腫瘍成長の抑
制方法及び組成物に使用しうることが突き止められた。
さらに、上記アンギオゲニンの１８Ｓ、２８ＳｒＲＮＡ
−分解酵素活性を抑制する物質は有効な腫瘍抑制剤であ
る。したがって本発明は、アンギオゲニンの脈管形成活
性の抑制剤を、腫瘍における前記脈管形成活性を抑制す
るのに充分な量で投与することを特徴とする動物におけ
る腫瘍成長の抑制方法に関する。

【０００５】第二の面において本発明は、次の特異的酵
素活性の抑制剤を動物へ投与することからなり、前記活
性は１８Ｓ若しくは２８ＳｒＲＮＡを開裂させて一般に
１００〜５００塩基の断片を生成させることを特徴とす
る、動物における腫瘍成長の抑制方法を提供する。次の
ことが上記方法の好適具体例の特徴である：抑制剤はＲ
ＮアーゼＡ又はアンギオゲニンに結合することができ；
抑制剤は上記酵素活性を抑制する能力を持った完全な天
然分子又はそのセグメント若しくは誘導体であり、特に
好ましくはアンギオゲニンの上記酵素活性を抑制する能
力を持ったヒト胎盤ＲＮアーゼ抑制剤（ＰＲＩ）として
知られた特異的物質のセグメントからなり；ヒトの他の
組織又は他の哺乳動物から得られるＰＲＩに同族の他の
蛋白質も使用することができ；抑制剤は動物の体重１ｋ
ｇ当り１０〜１０，０００μｇの量で投与され；かつ動
物はヒトである。

【０００６】第三の面において本発明は、アンギオゲニ
ンの脈管形成活性を抑制しうる抑制剤を提供し、この抑
制剤は薬理学上適合性である（すなわち、動物に投与す
るのに適する）媒体に適当な濃度で分散されかつその量
は少なくとも動物の所定領域（たとえば腫瘍を直ぐ取囲
む領域）にて天然産アンギオゲニンの脈管形成活性を抑
制するのに充分な量である。この面の好適具体例におい
て、抑制剤はアンギオゲニンの酵素活性を抑制し；特に
好ましくは抑制剤は上記１８Ｓ、２８ＳｒＲＮＡ−分解
活性を抑制する能力を持ったＰＲＩのセグメント（又は
他のヒト組織又は哺乳動物組織からの同族蛋白質）から
なっている。

【０００７】第四の面において本発明は、脈管新生に伴
う障害の抑制方法を提供する。この方法は、動物に対し
アンギオゲニンの脈管形成活性の抑制剤を、前記障害に
伴う脈管形成活性を抑制するのに充分な量で投与するこ
とからなっている。

【０００８】第五の面において本発明は、アミノ酸配
列：

【化３】からなるポリペプチドを含む治療組成物を提供する。好
適具体例において、ポリペプチドのセグメントはアンギ
オゲニン抑制活性を有する。

【０００９】第六の面において本発明は、上記アミノ酸
配列をコードする処理された（engineered）核酸を提供
する。処理された核酸については下記に定義するが、要
するにこれはその天然環境から取り出された任意の核酸
を意味する。

【００１０】第七の面において本発明は、アンギオゲニ
ン抑制活性を有するポリペプチドのエグメントをコード
する処理された核酸を提供する。好ましくはこの核酸
は、哺乳動物の遺伝子ライブラリーをアンギオゲニン抑
制活性を有するポリペプチドのセグメントに対応するプ
ローブでスクリーニングすることにより得られ；遺伝子
ライブラリーはゲノム若しくはｃＤＮＡからなり；この
ポリペプチドはヒト胎盤リボヌクレアーゼ抑制剤であ
り；ライブラリーはヒトＤＮＡ若しくはｃＤＮＡからな
り；かつセグメントは配列：

【化４】である。

【００１１】第八の面において本発明は、アンギオゲニ
ン抑制活性を有するポリペプチドの製造方法に関するも
のである。この方法は、前記ポリペプチドをコードする
処理された核酸を宿主細胞で発現させることを特徴とす
る。好ましくは、この前記ポリペプチドはヒト胎盤リボ
ヌクレアーゼ抑制剤のセグメントである。

【００１２】本発明は、腫瘍の成長を防止し或いは減少
させる手段を提供する。好適抑制剤であるＰＲＩは、体
液内或いはたとえば腫瘍を直ぐ取囲む領域のような特定
の局部領域内にアンギオゲニン及びその他のＰＲＩ−結
合蛋白質よりも僅かモル過剰で存在する場合に活性であ
り、したがって極めて低濃度で供給することのみを必要
とする。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、好適実施例を参照して本発
明の他の特徴及び利点を一層詳細に説明する。構造アンギオゲニンアンギオゲニンは上記したような活性を有する蛋白質で
あって、フェット等（上記）及びシャピロ等（上記）に
より記載されたように取得しかつ精製することができ
る。或いは、アンギオゲニンは組換ＤＮＡ技術を用いて
取得しかつ精製することもできる。クラチ等、バイオケ
ミストリー、第２４巻、第５４９４頁（１９８５）はア
ンギオゲニンをコードするｃＤＮＡ及び遺伝子を記載し
ている。このｃＤＮＡ若しくは遺伝子は標準的な発現ベ
クターから発現させることができ、かつ得られたアンギ
オゲニン蛋白は標準的方法によりたとえば哺乳動物、酵
母又は各種の微生物発現系で精製することができる〔上
記、第５４９８頁〕。

【００１４】アンギオゲニン抑制剤アンギオゲニン抑制剤は、アンギオゲニンの脈管形成活
性を抑制しうる任意の化合物である。好ましくは、アン
ギオゲニンの抑制剤は蛋白質であり、特に好ましくはこ
れはアンギオゲニンに結合することができかつ少なくと
もその生物学的脈管形成活性及び好ましくはその酵素２
８Ｓ／１８ＳｒＲＮＡ−分解活性を抑制しうる蛋白質で
ある〔酵素活性はシャピロ等（上記）により記載された
ように測定される。要するに、１５〜２５μｇのＲＮＡ
を、全容積１３．５μl にて３０ｍＭのＮａＣl を含有
する３０ｍＭのＨｅｐｅｓ又は２０ｍＭのトリス（ｐＨ
７．５）において３７℃で約１．９μＭのアンギオゲニ
ンと共に培養する。反応を約９０分間後に４８μl のホ
ルムアミド／ホルムアルデヒド試薬を用いて停止させる
（上記）〕。好ましくは、抑制剤は哺乳動物組織、特に
好ましくはヒト胎盤組織から分離される。

【００１５】抑制剤の１例であるＰＲＩはブラックバー
ンにより記載されたように単離することができる〔ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５４巻、
第１２，４８４頁（１９７９）〕。実質的にＰＲＩに均
等である蛋白質、すなわち同様なアミノ酸組成を有する
と共に同様な生物学的及び酵素学的抑制活性を有するも
のは、他のヒト組織だけでなく他の哺乳動物組織にも見
ることができる。たとえば、バートン等により記載され
たＲＮアーゼＡの各種の抑制剤〔インターナショナル・
ジャーナル・ペプチド・プロテイン・リサーチ、第１９
巻、第３７２頁（１９８２）、これを参考のためここに
引用する〕が本発明に適している。これらの蛋白質は、
第１表〔バートン等（上記）から得た表〕に示されたよ
うに、アミノ酸組成においてＰＲＩに対し約７０〜８０
％の類似性を有する。さらに、この種の蛋白質は本発明
の目的に対しアンギオゲニン抑制剤となる。これらの蛋
白質を分離しかつ精製する方法については、標準的な親
和性クロマトグラフ法又は組換ＤＮＡ技術を用いて下記
に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】或いは、抑制剤をコードする遺伝子は標準
技術によってクローン化することもできる。この種の技
術は抑制剤を精製し、そのアミノ酸配列の１部を決定
し、このアミノ酸配列をコードしうるＤＮＡプローブを
作成しかつこのプローブを用いてたとえば胎盤細胞から
作成されたｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーにて組
換ベクターを検出することを含む。次いで、クローン化
した遺伝子をたとえば細菌、酵母又は組織培養細胞など
の適当な発現宿主細胞における任意適当な発現ベクター
で発現させることができる。次いで、これらの細胞によ
り産生された組換抑制剤蛋白質を培養上澄液から又は細
胞から精製することができる。

【００１８】本発明によるポリペプチドを発現するクロ
ーンを検出するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ
は、たとえば長さ少なくとも１０塩基、好ましくは少な
くとも１６塩基である図３の配列（又は対応の反対方向
配列）の断片を用いて図３に示した核酸配列から生成さ
せることができる。図３の配列における僅かな改変を伴
うプローブ（たとえば１６個の位置のうち３個未満の位
置で変化）も許容することができる。例としてのみ下記
の断片を示す。対応の反対方向ストランドも同様に可能
である：

【化５】

【００１９】より一般化したストランド及び対応の反対
方向ストランドは次の通りである：

【化６】〔上記配列において、ＢはＣ若しくはＴであり、Ｉはイ
ノシン（これはＡ、Ｔ若しくはＣとの塩基対とすること
ができる）であり、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧでありか
つＣの下にＩを記してある箇所はＣ若しくはＩである〕Ａ、Ｔ及びＣの代りにイノシンをプローブ配列に使用し
て、混合物として合成すべきプローブの数を天然遺伝子
若しくはｃＤＮＡ配列に対するそのハイブリッド化能力
の損傷なしに最小化させることができる。

【００２０】ＰＲＩをコードする遺伝子のｃＤＮＡクロ
ーンを単離する方法の１例は、上記３種の反対方向スト
ランドのオリゴヌクレオチドプローブを厳格なハイブリ
ッド化条件下で用いてヒト胎盤ＤＮＡのｃＤＮＡライブ
ラリーを試験することである。ＰＲＩを発現するｃＤＮ
Ａクローンを分離しかつスクリーニングするための方法
の他の例は次の通りである。上記のように精製されたＰ
ＲＩに対する抗体をウサギで生成させる。これらの抗体
を親和性クロマトグラフィーにより精製し、その際たと
えばセファロース（たとえばＣＮＢｒにより活性化）の
ような活性化固体マトリックスに結合したＰＲＩを使用
する。

【００２１】プローブの１種若しくはそれ以上にハイブ
リッド化し、好ましくは３種全てにハイブリッド化する
任意のクローン或いは抗−ＰＲＩ抗体に結合する蛋白質
を発現するような任意のクローンが、ＰＲＩコード化遺
伝子の有力なクローンである。クローンがＰＲＩをコー
ドするかどうかを決定するには、これらを精製し、次い
でプローブに対する再ハイブリッド化又は抗−ＰＲＩ抗
体を結合する蛋白質の発現につき再検査することができ
る。

【００２２】最終的に、これらクローンの配列を決定し
かつこれら配列を比較して、これらがＰＲＩの公知の性
質（すなわちアミノ酸配列、分子量及びアミノ酸組成）
と相関するかどうかを調べることができる。次いで、Ｐ
ＲＩの発現はｃＤＮＡクローンを発現ベクターに挿入し
て達成することができ、発現させた組換ＰＲＩを分離し
かつ精製することができる。これら全てのクローンは処
理されたＤＮＡ（すなわちその天然環境から採取されか
つベクターたとえばプラスミド若しくはファージのよう
なベクター中へ或いは生物ゲノム内にさえ挿入されたＤ
ＮＡ）を包含する。たとえば、処理されたＤＮＡは、も
はや天然配列によりそのいずれの側でも包囲されない。
一般に、この種の処理されたＤＮＡは組換ＤＮＡ技術を
用いて作成され、たとえば生体内の染色体ＤＮＡの転座
がＤＮＡの環境を変化させたような天然ＤＮＡを含まな
い。しかしながら、これは何らかの方法でＤＮＡが組換
ＤＮＡ法によって操作された後に生ずる天然のものを包
含する。

【００２３】今回、ヒトＰＲＩｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を決定し、かつこのヌクレオチド配列からヒトＰＲ
Ｉのアミノ酸配列を推定した。さらに、ＰＲＩトリプシ
ンペプチドのエドマン分解によりアミノ酸配列の１部を
確認した。

【００２４】図３は、ＰＲＩｃＤＮＡ配列及び翻訳アミ
ノ酸配列を示している。図３のｃＤＮＡを含有するベク
ターｐＵＣ１８−ＰＲＩ（Ａ）で形質転換された細菌イ
ー・コリＤＨ５αについては、１９８８年３月３１日付
でメリーランド州のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに受託番号第６７６６８号として寄託し
た。図３におけるＰＲＩ情報を用いて、たとえば適当な
発現ベクターにＰＲＩｃＤＮＡを含む細胞を培養しかつ
ＰＲＩを培養上澄液から精製する標準的技術を用いて組
換ＰＲＩ抑制剤を産生させることにより、アンギオゲニ
ン抑制剤を得ることができる。

【００２５】図３の配列を有するＰＲＩの断片及び変種
も適している。たとえば、ＰＲＩはトリプシン消化によ
って断片化することができ、かつ得られた断片（ＨＰＬ
Ｃにより精製）をアンギオゲニン抑制活性につき本明細
書中に記載したように分析することができる。使用する
特定ＰＲＩ断片は次の通りである：

【化７】

【００２６】たとえば、第１表に示したような他の哺乳
動物からのＰＲＩは、これらを他の哺乳動物からクロー
ン化させかつ上記したようにアンギオゲニン断片を供給
することによって取得しかつ分析することができる。ク
ローン化させた場合、天然遺伝子を標準的技術により、
たとえば抑制剤がアンギオゲニンの生物学的脈管形成活
性を抑制する能力を有する限りこの抑制剤のアミノ酸配
列を変化させて改変することもできる。この種の改変
は、アンギオゲニンに対する抑制剤の結合能力を増大さ
せるべく設計することができる。さらに、関連する抑制
剤コード遺伝子は、標準技術により作成された他の動物
ゲノムのライブラリーに対するプローブとして抑制剤を
コードする上記クローン化遺伝子の１部を用いて単離す
ることもできる。

【００２７】他の抑制剤を分離するには、１つの可能な
方法はアンギオゲニンを結合しうる蛋白質を検出するこ
とであり、たとえばこれはアンギオゲニンをカラムに結
合させかつ有力な抑制剤蛋白質を含有する試料をこのカ
ラムに通過させて行なわれる〔ＲＮアーゼＡをブラック
バーン、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２５４巻、第１２４８８頁（１９７９）に記載された
ようにアンギオゲニンの代りに使用することができ
る〕。次いで結合した蛋白質を、たとえば３ＭＮａＣ
l と１５％グリセリンと１ｍＭＥＤＴＡと５ｍＭＤ
ＤＴとを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
０）を用いることにより溶出させてアンギオゲニン／抑
制剤複合体を解離させることができる。次いで下記する
ように溶出蛋白質を精製しかつ試験して、放出された蛋
白質がアンギオゲニンの脈管形成活性を抑制するかどう
か、或いはこれらがその酵素活性を抑制するかどうかを
調べることができる。次いで、活性蛋白質を標準法で精
製することができる。

【００２８】さらに、天然抑制剤の生物学的抑制特性を
保持する抑制剤のセグメント（たとえばＰＲＩのセグメ
ント）を使用することができる。この種のセグメント
は、天然抑制剤を分解して活性セグメントを生成するプ
ロテアーゼを用いる標準法により、或いは組換ＤＮＡ技
術を用いて抑制剤をコードする構造遺伝子若しくはｃＤ
ＮＡの非必須部分を除去し、次いでこの処理されたＤＮ
Ａを発現させて改変抑制剤を産生させることにより作成
することができる。

【００２９】抑制剤活性下記は、アンギオゲニンに対するＰＲＩの抑制作用に関
するインビドロ測定の例である。この例は本発明を限定
することを意味せず、当業者はこれらの実施例が他の抑
制剤若しくはそのセグメントをも下記の方法に使用しう
るかどうかを示唆していることを認識するであろう。

【００３０】アンギオゲニンの酵素活性における抑制の
測定アンギオゲニン及びＰＲＩを、一般にフェット等及びシ
ャピロ等（上記）により記載されたように精製した。ア
ンギオゲニンの酵素活性はシャピロ等（上記）により記
載されたように測定した。要するに、アンギオゲニンは
２８Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡの開裂を触媒して、長さ１０
０〜５００ヌクレオチドの生成物を形成する。これらの
生成物は安定であって、大きい（約５００塩基）のアガ
ロースゲルで見えるセグメントを有する。１つの実験に
おいて、１２μｇのＲＮＡを３３ｍＭＨｅｐｅｓ及び
３３ｍＭＮａＣl （ｐＨ７．５）中にて３７℃でアン
ギオゲニン及び（又は）ＰＲＩと共に又はそれを用いず
に培養した。３０分間後、反応をシャピロ等（上記）に
より記載されたように停止させ、試料を１．１％アガロ
ースゲルに流し、かつ臭化エチジウムで染色した。０．
９６μＭのＰＲＩは０．８μＭのアンギオゲニンによる
ｒＲＮＡの酵素分解を完全に抑制した。ＰＲＩ単独では
ｒＲＮＡに対し活性を示さなかった。たとえば、ＰＲＩ
はアンギオゲニンの酵素活性の有力な抑制剤であり、ア
ンギオゲニンとの１：１の比より僅か多量にて活性であ
る。

【００３１】アンギオゲニン／ＰＲＩ複合体の安定性アンギオゲニン抑制剤の治療用途には、アンギオゲニン
に対し強力に結合しかつその生物学的活性を低下させる
抑制剤を使用するのが有利である。ＰＲＩはこの種の抑
制剤である。ＲＮアーゼＡもＰＲＩに結合しかつアンギ
オゲニンと競合して溶液中でＰＲＩを結合する。ＲＮア
ーゼＡの酵素活性もＰＲＩにより抑制される。これらの
性質を用いて、下記するようにＰＲＩ／アンギオゲニン
複合体の安定性を決定することができる。

【００３２】ＵｐＡはＲＮアーゼＡに対し優秀な基質で
あるが、アンギオゲニンについては基質とならない。１
つの実験において、種々異なる量のアンギオゲニンを
０．２７ｎＭのＲＮアーゼＡと０．２０ｎＭのＰＲＩと
の混合物に添加し、先ず最初にＲＮアーゼＡとアンギオ
ゲニンとを混合し、次いでＰＲＩを５分間かけて２５℃
にて添加し、次いでＵｐＡ基質〔１０μｇ／mlのヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）と０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホ
リノ）−エタン−スルホン酸と０．１ＭのＮａＣl と１
ｍＭのＥＤＴＡとの緩衝液（ｐＨ６．０）における０．
２ｍＭ〕を添加した。混合物に存在するアンギオゲニン
が多くなる程、これに結合するＰＲＩも多くなり、した
がってＲＮアーゼＡに結合しかつその酵素活性を抑制し
うるＰＲＩが少なくなる。さらに、ＲＮアーゼＡに対す
るよりもアンギオゲニンに対するＰＲＩの結合が強くな
る程、ＲＮアーゼＡ活性の抑制低下も大となる。何故な
ら、この場合ＰＲＩは優先的にアンギオゲニンに結合す
るからである。その結果を図１に示す。相対的抑制は
（Ｖｏ−Ｖａ）／（Ｖｏ−Ｖｒ）〔ここでＶｏはＰＲＩ
の不存在下におけるＲＮアーゼＡ活性の速度を示し、Ｖ
ｒはアンギオゲニンを添加しないＰＲＩの存在下での速
度を示し、かつＶａはアンギオゲニンを添加したＰＲＩ
の存在下での速度を示す〕として計算される。５．８ｎ
Ｍのアンギオゲニンにおいて、実質的にＲＮアーゼＡ活
性の抑制は生じなかった。したがって、全ＰＲＩをＲＮ
アーゼＡとの反応から外しかつ抑制するには、大過剰の
アンギオゲニンが必要とされる。

【００３３】関連した実験において、アンギオゲニン及
びＰＲＩに対するＫ_i を上記方法を用いかつこれを改変
して推定することができ、その際ＰＲＩとアンギオゲニ
ンとを先ず最初に１０分間予備培養し、次いでＲＮアー
ゼＡ及びＵｐＡを添加する。この分析は、ＰＲＩとアン
ギオゲニンとの培養後に残存する遊離抑制剤の量を決定
する。たとえば、ＰＲＩとアンギオゲニンとの解離が遅
ければ、ＲＮアーゼＡ活性の抑制は小さい。１：１．２
のアンギオゲニン：ＰＲＩの比において、遊離ＰＲＩは
検出されなかった。したがって、ＰＲＩとアンギオゲニ
ンとは強力に結合し、かつ０．１ｎＭ未満のＫ_i を有す
ると思われる。

【００３４】さらに、ＰＲＩとアンギオゲニンとの結合
強度をも陽イオン交換ＨＰＬＣによって示した。この方
法は、遊離アンギオゲニンをアンギオゲニン／ＰＲＩ複
合体から区別することができる。シンクロパックＣＭ３
００カラム（２５０×４．１mm；シンクロム・インコー
ポレーション社）とウォータース・アソシエーツ社の液
体クロマトグラフィー系とヒューレット・パッカード３
３９０Ａ型積算器とを使用した。その結果を図２に示
す。１ｍＭのＥＤＴＡと１０μｇのＨＳＡとを含有する
０．１Ｍトリス（ｐＨ７）における１mlの試料を、２０
ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７）における２２０〜６２
０ｍＭＮａＣl の直線濃度勾配により１０分間にわた
り１ml／min の流速で溶出させ、溶出液を２１４ｎｍに
て監視した。パネルＡにおいて、０．６４μｇのアンギ
オゲニンの溶出が示され、パネルＢにおいては０．６４
μｇのアンギオゲニンと１２μｇのＰＲＩとの溶出が示
された。パネルＢにおいては、検出しうる遊離アンギオ
ゲニンのが存在しない。アンギオゲニン−ＰＲＩ混合物
に対するＲＮアーゼＡの３２倍過剰の添加は、１７時間
の培養後でさえ遊離アンギオゲニンを産生しなかった。
かくして、アンギオゲニン／ＰＲＩの解離は、１日以上
の半減期を有すると思われる。

【００３５】脈管形成活性の抑制脈管形成（すなわち脈管形成活性）を、フェット等（上
記）により記載されたナイトン等、ブリティッシュ・ジ
ャーナル・キャンサー、第３５巻、第３４７頁（１９７
７）のニワトリ胚コリオアラントイン膜（ＣＡＭ）分析
の改変により測定した。この分析のため、アミコン・セ
ントリコン−１０型微小濃縮器を用いて脱塩し、緩衝液
を少なくとも５００倍に希釈した。これは、実験に悪影
響を及ぼしたり或いは卵自身を害しうるような阻害成分
をＰＲＩ溶液から除去する。アンギオゲニンに対しＰＲ
Ｉを添加する結果を下記第２表に示す。

【００３６】実験No. １及びNo. ２のデータは、それぞ
れ２群及び３群の分析で得られた結果の総合を示してい
る。１０〜２０個の卵を各組における３実験群のそれぞ
れにつき使用した。下記量のアンギオゲニンとＰＲＩと
を使用した：実験No. １、それぞれ７５ｎｇ及び２μ
ｇ；実験No. ２、４６ｎｇ及び７００ｎｇ；及び実験N
o. ３、２５ｎｇ及び１８０ｎｇ。

【００３７】

【表２】

【００３８】これらの結果から明らかなように、過剰の
ＰＲＩはアンギオゲニン活性を緩衝液単独及び抑制剤単
独の比較で観察されるものと区別しえないレベルまで低
下させる。

【００３９】腫瘍成長の抑制免疫治療研究のため、雄ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス
（チャールス・リバー・ラボラトリース社）を層流条件
下に維持し、実験にかける前に年齢と檻とを調和させた
（檻１個当り５匹の動物）。実験動物（１群当り５〜１
０匹）に５×１０⁵ ＨＴ−２９ヒト結腸腺癌細胞〔フォ
ー等、「インビトロにおけるヒト腫瘍細胞」、フォー
編、第１１５〜１６０頁、プレナム・プレス社、ニュー
ヨーク（１９７５）〕を０日目に皮下注射（Ｓ．Ｃ．）
した。さらに０日目に、動物を緩衝液比較〔燐酸塩緩衝
塩水；（０．２ｇ／l のＫＣl 、０．２ｇ／l のＫＨ₂
ＰＯ₄、８ｇ／l のＮａＣl 及び２．１６ｇ／l のＮａ₂
ＨＰＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ（３７℃にてｐＨ７．４）に対し
透析したＰＲＩを貯蔵するのに使用する緩衝液、ＰＢＳ
Ａ１００μl 〕又はＳ．Ｃ．若しくは腹腔内注射
（Ｉ．Ｐ．）による種々な投与量の胎盤抑制剤（１００
μl ）のいずれかで処理した。処理方式は、実験計画に
応じて毎日の注射（１０〜１１回投与）又は２〜３日間
隔での注射（５〜１０回投与）を含んだ。動物の健康、
体重、腫瘍寸法、並びに写真記録の評価を毎週２〜３回
記録した。実験の終了後、血液及び組織試料を集めて、
免疫学的及び組織学的評価を行なった。

【００４０】１つの実験において、４０匹の雄ｎｕ／ｎ
ｕマウスに５×１０⁵ ＨＴ−２９細胞を０日目に皮下注
射した。さらに、０日目にマウス１〜１０（第１群）に
は１００μl の比較緩衝液を摂取させ、マウス１１〜２
０（第２群）には１００μl中１０μｇの胎盤抑制剤を
摂取させ、マウス２１〜３０（第３群）には１００μl
中１．０μｇの胎盤抑制剤を摂取させ、かつマウス３１
〜４０には１００μl中０．１μｇの胎盤抑制剤を摂取
させた。第１群及び第２群には、さらにそれぞれ第１、
４、６、８、１８、２０及び２２日目に緩衝液又は１０
μｇの胎盤抑制剤を注射した。第１、４、６及び８日目
には、第３群及び第４群にそれぞれ１．０μｇ若しくは
０．１μｇの投与量にて胎盤抑制剤を摂取させた。全処
理の注射は腹腔内で行なった。６０日間後、動物１３、
１４、１７、１８、２０及び２４のみが腫瘍なしに保た
れた。かくして、１０μｇのＰＲＩの接種は、約６０％
の動物において腫瘍形成を防止した。

【００４１】抑制剤によるアンギオゲニンの生物学的及
び酵素学的活性の両者における抑制は重要な物理的、生
理的及び薬理学的意味を有する。これは、アンギオゲニ
ンのこれら２種の作用が相関するという仮説と一致し、
これはｐＨ５．５におけるブロモアセテートによるカル
ボキシメチル化の際の両活性の同時的損失により従来か
ら示唆されている〔シャピロ等、上記〕。さらに、これ
は、この種の抑制剤がアンギオゲニンのインビボ調整に
役割を演じうるという可能性をもたらす。アンギオゲニ
ン／ＰＲＩの相互作用は恐らく三次元構造にて大幅に分
離されたアンギオゲニンの領域に関与すると思われ、そ
の多くは活性中心の外側に存在する。したがって、酵素
活性のみに必要な残基の保持は、恐らく相互作用の強さ
を説明しえないと思われる。

【００４２】このことは、ＰＲＩを結合するアンギオゲ
ニンの能力が発生の際に独立して維持されたことを意味
する。明らかに、ＰＲＩ及びその他の抑制剤による結合
は、薬理学上及び治療上能力を有する生理学上適切な抑
制メカニズムを反映する。たとえば、上記したように、
これらの抑制剤はマウスにおける腫瘍形成の予防に活性
である。明らかに、これらは腫瘍成長並びに脈管新生に
伴うその他の病気、たとえば糖尿病網膜症、関節リウマ
チ症及びカポジ氏肉腫を予防するためにヒト又はその他
の動物に注射するのに適している。すなわち、これらは
脈管形成がたとえば充実性腫瘍、血管腫症及び乾癬のよ
うな病気の病理学において重要な役割を演じている障害
を治療するのに適している。

【００４３】好ましくは、これらは血管内、特に好まし
くは静脈内注射され、或いは薬理学上適当な媒体〔たと
えばＰＢＳＡ又はクラコフトによりＣａ−Ａキャンサー
・ジャーナル・フォー・クリニシャン、１９８７年３月
／４月、第３７巻、第９３頁に記載されたような緩衝剤
及び薬剤〕にて腹腔内注射され、この媒体はたとえば動
物内におけるアンギオゲニンの天然生物学的活性を抑制
するのに充分な量（たとえば動物体重１ｋｇ当り約１０
〜１０，０００μｇ）を動物へ投与するのに適してい
る。或いは、これらは特定領域に局部塗布したり又は皮
下注射することもできる。

【００４４】これらの抑制剤は、精製型であれば８μＭ
程度の低い濃度でさえ少なくとも２週間にわたり安定で
あることが判明した。投与される貯蔵緩衝液又は治療組
成物にＤＴＴを含ませる必要はないが、生理学上適合性
の天然薬剤（たとえばＮ−アセチルシステイン又はシス
テイン若しくはシステアミン）を使用することもでき
る。投与するには、緩衝液が患者に害を与えないことが
重要である。これらの抑制剤は低濃度にて予防的に使用
することもできる。たとえば、癌発生の危険がある患者
（たとえば一次腫瘍が剔出されている患者）に対し、体
重１ｋｇ当り１０〜１０，０００μｇのを投与するのが
適している。

【図面の簡単な説明】

【図１】アンギオゲニン抑制剤の例としてのＰＲＩ〔ブ
ラックバーン、ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５４巻、第１３４８４頁（１９７９）〕によ
るウリジリル（３′，５′）アデノシン（ＵｐＡ）に対
するＲＮアーゼＡ活性の抑制に関するアンギオゲニンの
作用を示す特性曲線図である。

【図２】ＨＰＬＣカラムからのアンギオゲニン（Ａ）又
はアンギオゲニンとＰＲＩ（Ｂ）との溶出を示す特性曲
線図である。

【図３】ＰＲＩｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び翻訳ア
ミノ酸配列を示す配列図である。

フロントページの続き (72)発明者バート・エル・バリーアメリカ合衆国マサチューセッツ州ブルックライン、ブラウン・ストリート56 (56)参考文献特開平１−93537（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68 Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記よりなる群から選択する核酸配列よ
りなる遺伝子【化１】 5'-GTC AAC CCT GCA CTG GCA GAG CTC-3' 5'-GTC AAC CCT GCA CTG GCA GAG CTC AAC CTG CGC-3' 5'-AGC AAC GAG CTG GGC GAT GTC GGC-3' 5'-GTG CTC TGG TTG GCC GAC TGC GAT GTG-3' 又は対応するアンチセンス配列ここに、該遺伝子は、該核酸配列を発現しているクロー
ンを検出するためのプローブとして利用することができ
る。
【請求項２】下記よりなる群から選択する核酸配列よ
りなる遺伝子【化２】 5'-TGGCTGTGGCTGGCCGACCAGGAGAA-3'; 5'-GTGCTCTGGTTGGCCGACTGCGAT-3'; 5'-GTGAACCCTGCCCTGGCTGA-3'; 5'-GTGAACCCTGGACTGGCAGA-3'; 5'-AATGAGCTGGGCGATGTGGG-3';及び 5'-AACGAGCTGGGCGATGTCGG-3' 又は対応するアンチセンス配列ここに、該遺伝子は、該核酸配列を発現しているクロー
ンを検出するためのプローブとして利用することができ
る。