PT87236B

PT87236B - Processo para a preparacao de inibidores de agiogenina

Info

Publication number: PT87236B
Application number: PT87236A
Authority: PT
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1987-04-14
Filing date: 1988-04-14
Publication date: 1992-11-30
Also published as: DK201188A; DE3884853T2; JP3475042B2; EP0291686A2; EP0291686A3; IE881115L; CA1341530C; DE3884853D1; EP0291686B1; AU8139591A; PT87236A; DK201188D0; JPH1052282A; AU641261B2; JPH07149654A; JP2694603B2; IE63732B1

Description

Descrição do objecto do invento que

PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COILEGE, associação de caridade norte-americana, com sede em 17 Quincy Street, Cambridge, Massachusetts 02138, Estados Unidos da América, pretende obter em Portugal para, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE INIBIDORES DE ANGIOGENINA”

Esta é uma continuação em parte dos pedidos de paten te anteriores, depositados nos Estados Unidos sob os Nos. de Serie 038.008 e 038.250, cada um deles depositado em 14 de Abril de 1987 e aqui incorporados como referência.

A angiogenina é uma proteína humana que induz a formação de vasos sanguíneos (Fett e outros, 24 Biochemistry 5480, 1985). Esta actividade biológica é expressa por uma quantidade tão baixa como 35 fmol (utilizando um processo de ensaio CAM de embrião de pinto, Id.). Embora originalmente isolada do meio condicionado pelas células de tumor humano, a angiogenina não é um tumor específico e pode ser encontrado numa variedade de outras células e fluídos biológicos, e mais provavelmente desempenha um papel na neovascularização normal e/ou patológica. A mesma tem um peso molecular de cerca de 14.400 e um ponto isoeléctrico maior que cerca de pH 9,5, Id. Strydom e outros, 24 Biochemistry 5486, 1985 também revelam a sequência de amino ácido da angionina.

A angiogenina é conhecida como tendo uma actividade enzimática. Especificamente, a mesma catalisa a clivagem

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Ref: W:MS 038.008 SHAPIRO »

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limitada de 28S e 188 rRNA para produzir um padrão específico de produtos de 100-500 nucleótidos em comprimento (Shapiro e outros, 25 Biochemistry 3727, 1986), mas não tem actividade significativa de ribonuclease em ensaios padrão RNase, Id.

Verificou-se que as substâncias que inibem pelo menos a actividade angiogénica da angiogenina podem ser utilizadas em processos e composições para inibir o desenvolvimento do tumor. Além disso, as substâncias que inibem a actividade enzimática de degradação 18S, 28S rRNA acima descrita da angiogenina são eficazes como impedidores eficazes do tumor.

De acordo com istoj o invento caracteriza um processo para a inibição do crescimento de um tumor num animal, o qual compreende administrar um inibidor da actividade angiogénica de angiogenina em quantidade suficiente para inibir a actividade da angiogenina no tumor.

Num segundo aspecto, o presente invento caracteriza um processo para impedir o crescimento de um tumor num animal, que compreense administrar ao animal um inibidor da seguinte actividade enzimática específica: clivagem de 18S ou 28 rRNA até segmentos com rendimento geralmente de 100 a 500 bases.

As seguintes sao características de formas de realização preferidas dos processos acima indicados: 0 inibidor é susceptível de se ligar à RNaseA ou à angiogenina: o inibidor é a molécula natural completa ou segmento ou derivados do mesmo que têm a capacidade de impedir a actividade enzimática acima descrita, e mais preferivelmente compreende um segmento de uma substância específica conhecida por inidor do placentário humano RNase (PRI) que tem a capacidade

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

Π.Ο?. I??s

de inibir a actividade enzimática acima descrita da angiogenina; outras proteínas análogas ao PRI provenientes de outros tecidos humanos ou de outros mamíferos podem também ser utilizadas; o inibidor é administrado a 10-10.000/ig/kg do peso do corpo do animal, e o animal é um ser humano.

De acordo com um terceiro aspecto, o presente invento caracteriza um inibidor susceptível de inibir a actividade angiogénica da angiogenina, segundo o qual o inibidor é disperso dentro de um meio que é fisiologicamente compatível - isto é, adequado para administração a um animal - a uma concentração adequada e numa quantidade suficiente para impedir a actividade angiogénica da angiogenina que ocorre naturalmente dentro de pelo menos uma área definida do animal, por exemplo, a área que circunda imediatamente o .tumor.

Nas formas de realização preferidas deste aspecto, o inibidor impede a actividade enzimática da angiogenina, e com maior preferência o inibidor compreende um segmento de PRI (ou uma proteína análoga proveniente de outro tecido humano ou de tecido defmamíf ero) que tem a capacidade de inibir a actividade de degradação 18S, 28S rRNA acima descrita.

Segundo um quarto aspecto, o presente invento caracteriza um processo para a inibição de perturbações associadas com a neovascularização. 0 processo compreende a administração a um animal de um initídor da actividade angiogénica da angiogenina em quantidade suficiente para impedir a actividade angiogénica associada com a doença.

De acordo com um quinto aspecto, o presente invento caracteriza uma composição terapêutica que compreende um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácido:

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Ref; RWF:MS 038.008 SHAPIRO

I

B

Val-Asn-Pro-Ala-Le u-Ala-Glu-Leu- (Asn-Leu-Arg) i

Ser-Asn-Glu-Leu-Gly-Asp-Va.l-Gly, ou

Trp ou Val-Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Gln ou Cys)-Asp-(Lys ou Vai). Nas formas de realização preferidas, um segmento do polipéptido tem actividade inibidora da angiogenina.

Num sexto aspecto, o invento caracteriza ácido nucleíco construído que codifica as sequências do aminoácido acima mencionadas. 0 ácido nucleíco construído é definido em seguida; abreviadamente o mesmo refere-se a qualquer ácido nucleíco removido do seu ambiente..natural.

De acordo com um sétimo aspecto, o presente invento caracteriza o ácido nucleíco construído que codifica um segmento de um polipéptido que tem actividade inibidora da angiogenina. De preferência, o ácido nucleíco é obtido por separação de um gene de mamífero liberto com uma sonda que corresponde a um segmento de um polipéptido que tem actividade inibidora da angiogenina; o gene librário compreende genómico ou cDNA; o polipéptido é inibidor da ribonuclease placentária humana; o librário compreende DNA humano, ou cDNA humano, e o segmento é:

Val-Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Glu-Leu-(Asn-Leu-Arg),

Ser-Asn-Glu-Leu-Gly-Asp-Val-Gly, ou (Trp ou Vai) -Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Gln ou Cys)-Asp-(Lys ou Vai).

Num oitavo aspecto, o presente invento caracteriza um processo para produzir um polipéptido que actividade inibidora da angiogenina. 0 processo compreende a expressão do ácido nucleíco construído codificando o polipéptido numa célula hospedeira. De preferência, o polipéptido é um segmento do inibidor da ribunoclease placentária humana.

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Ref: RWP:MS 058.008 SHAPIRO »

presente invento proporciona um meio para evitar ou reduzir o desenvolvimento de tumores. 0 inibidor preferi do, PRI, é activo quando está presente num ligeiro excesso molar sobre a angiogenina e outras proteínas de ligação de PRI nos fluídos humanos, ou dentro de uma área local especificada, tal como aquela área que circunda imediatamente um tumor, e deste modo necessita apenas ser proporcionado a concentrações muito baixas.

Outras caracteristicas e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes pela descrição seguinte das formas de realização preferidas do mesmo e -aypartir das reivindicações.

As Figuras serão primeiramente descritas abrevdadamente:

Fig, 1 e uma representação gráfica do efeito da angiogenina sobre a inibição da actividade RNaseA em relação à uridilil (5’, 5’) adenosina (UpA) por meio de PRI (Blackburn, 254 J. Biol. Chem, 15484, 1979) como um exemplo de um inibidor de angiogenina.

Fig. 2 é uma representação gráfica de eluição de angiogenina (A) ou angiogenina e PRI (B) a partir de uma coluna HPLC.

Fig. 3 mostra a sequência de nucleótido de PRI _ cBNA e a sequência de aminoácido traduzida.

Estrutura

Angiogenina

A angiogenina é uma proteína, que tem propriedades

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Ref: RWFiMS 038.008 SHAPIRO ¹ como as acima descritas, a qual pode ser obtida e purificada como descrito por Fett e outros, supra, e shapiro e outros, supra. Alternativamente, a angiogenina pode ser obtida e purificada utilizando técnicas DNA recombinantes. Kurachi e outros, 24 Biochemistry .5494, 1985, descrevem a cDNA e o gene que codifica para a angiogenina; esta cDNA ou gene pode ser expressa a partir de um vector de expressão padrão e a proteína angiogenina resultante purificada por um processo padrão, por exemplo em mamíferos, germes ou vários 10 sistemas de expressão microbiana. Id a 5498.

»

Inlbidores de Angiogenina

Um inibidor de angiogenina é qualquer composto capaz de inibir a actividade angiogénica da angiogenina. De preferência, o inibidor de angiogenina é uma proteína; com maior preferência a mesma é uma proteína capaz de ligar à angiogenina e de inibir pelo menos a sua actividade angiogénica biológica e de preferência também a sua actividade de degradação enzimática 28S/18/S rRNA. (A actividade enzimática é medida como descrito por Shapiro e outros, supra. Abreviadamente, 15-2(/5de RNA são incubados com cerca de 1,9 /UM angiogenina a 37^SC em quer 30mM Hepes quer 20mm Tris, pH 7,5, contendo 30 mM NaCl num volume total de 13,5 íiL. A reacção é terminada passados cerca de 90 minutos utilizando 48uL de um reagente de formamida/formaldeído, Id.). De preferência, o inibidor é isolado a partir de tecidos de mamífero, com maior preferência de tecido placentário humano.

Um exemplo do inibidor, PRI, pode ser isolado como descrito por Blackbum (254 J. Biol. Chem. 12.484, 1979). Proteínas que sao substancialmente equivalentes ao PRI, isto é que têm composições de aminoácido semelhantes, e têm actividades inibitórias biológicas e enzimáticas seme-659.792

Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO lhantes, podem ser encontradas nao apenas noutros tecidos humanos mas também noutros tecidos de mamífero. Por exemplo os vários inibidores de RNAse A descritos por Burton e outros, (19 Int. J. Peptide Protein Res 372, 1982, aqui incorporados como referencia) podem ser adequados no presente invento. Estas proteínas têm cerca de 70-80% de semelhança na composição de aminoácido para ERI, como representado na Tabela 1 (tomada a partir de Burton e outros, Id.). Tais proteínas são também inibidores de angiogenina para fins do presente invento. Processos para isolar e purificar estas proteínas são indicadas em seguida, utilizando metodologia de cromatografia de afinidade padrão, ou técnicas recombinantes DNA.

B

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Ref: RWFíMS 038.008 SHAPIRO

I

B

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

Alternativamente, o gene que codifica um inibidor pode ser clonado por técnicas padrão. Tais técnicas incluem a purificação do inibidor,determinando parte da sua sequência de aminoácido, criando uma sonda DNA capaz de codificar para a sequência de aminoácido, e utilizando a sonda para detectar os vectores recombinantes num librário cDNA ou genómico criado a partir, por exemplo, dqfcélulas placentárias. 0 gene clonado pode então ser expresso segundo qualquer vector de expressão adequado numa célula hospedeira de expressão adequada, por exemplo, bactérias, germes, ou células de cultura de tecido. A proteína recombinante inibidora produzida por aquelas células pode então ser purificada a partirch cultura sobrenadante ou a partir das células. As sondas de oligonucleótido adequadas para detectar clones que expressam polipéptidos de acordo com o presente invento podem ser geradas a partir da sequência de ácido nucleíco indicada na Fig. 3 utilizando, por exemplo, fragmentos da sequência da Fig.3 (ou a correspondente sequência anti-sentido) que são pelo menos 10, e de preferência pelo menos 16 bases em comprimento. Sondas com modificações menores (por exemplo desvio de menos que 3 de 16 posições) da sequência da Fig. 3 são aceitáveis. Os seguintes fragmentos são proporcionados apenas por meio do exemplo; as fibras anti-sentido correspondentes seriam também operativas:

5'-TGGCTGTGGCTGGCCGACCAGGAGAA-3’

5’-GTGCTCTGGTTGGCCGACTGCGAT-3'

5’-GTGAACCCTGCCCTGGCTGA-3’

5’“GTGAACCCTGGACTGGCAGA-3’

5’-AATGAGCTGGGCGATGTGGG-3’

5’-AACGAGCTGGGCGATGTCGG-3¹

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIR01

Fibras mais generalizadas e fibras anti-sentido correspondentes são:

5’-TGGBTNTGGBTNGCNGABCADGABAA-3’

5’-TTITCBTGITCCGCCAICCACTICCA-3'

II I

5’-AABGADBTNGGNGABGTNGG-3’

5'-CCCACITCCCCCAIBTCITT-3 ’

I II

5'-GTNAABCCNGCNBTNGCNGA-3’

5'-TCCGCCAICGCCGGITTCAC-3’

Em cada uma das sequências acima B é C ou T; I é inosina (que pode fazer par com A, T, ou C) N é A, T, C ou G, e C é C ou I.

I

A inosina é utilizada na sequência de. sonda em vez de A, T e C de modo que o número de sondas a ser sintetizadas como uma mistura pode ser minimizado sem prejudicar a sua capacidade de hibridizaçào para as sequências do gene natural ou cBNA.

Um exemplo de um processo para isolar um clone cBNA do gene que codifica para PRI consiste em utilizar as três sondas de oligonuclease de fibra anti-sentido acima referidas sob condições de hibridização rigorosas, para sondar um cDNA librário do DNA placentário humano./

Outro exemplo do processo para isolar e separar clones cBNA que expressam o PRI é como segue. Anti-corpos

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Ref: RWF:MS 038.0C8 SHAPIRO »

I

são criados em coelhos contra PRI purificado como acima se descreveu. Os anti-corpos são purificados por cromatografia de afinidade, utilizando PRI ligado a uma matriz sólida activada tal como Sepharose (por exemplo activada por CNBr).

Quaisquer clones que hibridizam para uma ou mais sondas, e de preferência hibridizam para todas as três, ou quaisquer clones que expressam proteínas que ligam os anti-corpos anti-PRI, são clones potenciais do gene que codifica PRI, Para determinar se os clones codificam PRI, os mesmos podem seijfpurifiçados, seguindo-se a re-fiscalização de re-hibridização com as sondas ou de expressão de proteínas que ligam os anti-corpos anti-PRI.

Ultimamente, os clones podem ser sequenciados e as sequências comparadas para se ver se as mesmas se relacionam as propriedades conhecidas de PRI, isto é, a sequência de aminoácido, peso molecular e composição de aminoácido. A expressão de PRI pode então ser conseguida por inserção do clone cDNA num vector de expressão e o recombinante PRI que é expresso, isolado e purificado. Todos estes clones contêm DNA construído, isto é, DNA tomado a partir do seu ambiente natural e inserido num vector, ial como um plasmídio ou fage, ou mesmo dentro do génomo de organismo. Assim, o DNA construído não é mais envolvido pelas sequências que ocorrem naturalmente sobre ambos os lados do mesmo. Geralmente, tal DNA é construído utilizando técnicas de DNA recombinantes, e não deve incluir DNA que ocorre naturalmente em que, por exemplo, uma translocação de DNA cromossomática in vivo modificou o ambiente de DNA: contudo o mesmo inclui tais eventos naturais que ocorrem-de o DNA ter sido manipulado de um algum modo pela metodologia DNA recombinante.

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Ref: RWF:MS 058.008 SHAPIRO

I

B

Determinou-se a sequência de nucleótido de PRI cDNA humano e a sequência de aminoácido de PRI humano inferiu daquela sequência de nucleótido. Confirmou-se uma porção daquela sequência de aminoácido pela degradação de Edman de péptidos tripticos PRI.

Fig. 5 mostra a sequência PRI cDNA e traduz a sequência de aminoácido. Uma bactéria, E. coli DH5X, transformada com um-.vector pUC18-PRl(A) contendo a cDNA da Fig. 5 foi depositada na American Type Culture Colection em Maryland sob o número de acesso 67668, em 51 de Março de 1988.

Inibidores de angiogenina podem ser obtidos, utilizando a informação PRI da Fig. 5, por exemplo, produzindo o inibidor PRI recombinante utilizando técnicas padrão para a cultura de células que incluem o PRI cDNA sobre um vector de expressão adequado, e purificando o PRI a partir da cultura sobrenadante.

Fragmentos e variantes do U?RI da sequência da Fig.5' são também adequados. Por exemplo, o PRI pode eer fragmentado (por exemplo por digestão tríptica) e os fragmentos resultantes (purificados por HPLC) podem ser ensaiados como descrito em qualquer parte deste pedido de patente em relação à actividade inibidora do angiogene. Os fragmentos de PRI específicos para utilização são como segue:

Val-Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Glu-Ieu-Asn-Leu-Arg;

Ser-Asn-Glu-Deu-Gly-Asp-Val-Gly;

(Trp ou Val)-Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Cys ou Gln)-Asp-(Val ou lys).

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Ref: RWF:MS 038.008 SHARIRO

I »

PRI proveniente de mamíferos, tais como os indicados na Tabela 1, pode ser obtido e analisado por clonagem dos mesmos a partir de outras mamíferos e proporcionando fragmentos angiogénicos como acima descrito.

Uma vez clonado, o gene que ocorre naturalmente pode também ser modificado pelas técnicas padrão, por exemplo por alteração da sequência de aminoácido do inibidor, na medida em que o inibidor retém a capacidade para inibir a actividade angiogénica biológica de angiogenina. Tais alterações podem ser designadas para aumentar a capacidade de ligação do inibidor para a angiogenina. Além disso, genes inibidores de codificação relacionados podem ser isolados utilizando uma parte do gene clonado acima descrito que codifica um inibidor como uma sonda para librários, construído por meio de técnicas padrão, de outros génomos de animal.

A fim de isolar outros inibidores, um processo possível inclui proteínas de detecção susceptíveis de ligarem angiogenina, por exemplo ligando a angiogenina a uma coluna e passando uma amostra contendo proteínas de inibidor potencial através desta coluna, (RNaseA pode ser utilizada em vez da angiogenina, como descrito por Blackburn 254 J. Biol Chem. 12488, 1979). A proteína de ligação pode então ser eluida, por exemplo, utilizando O,1M de acetato de sódio com o pH 5,0 contendo 3M de NaCl, 15% de glicerol, lmM de EDTA e 5mM de DDT, que é capaz de dissociar o complexo angiogenina/inibidor. A proteína eluída pode então ser purificada e ensaiada, como descrito mais adiante, para ver se as proteínas libertadas inibem a actividade angiogénica de angiogenina, ou alternativamente se as mesmas inibem a sua actividade enzimática. A proteína ou proteínas activas podem então ser purificadas pelo processo padrão.

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Ref: RVíTzMS 038.008 SHAPIRO

Além disso, é possivel utilizar segmentos de inibidores, tais-como segmentos de PRI, que retêm o carácter de inibição biológica do inibidor nativo. Tais segmentos podem ser criados por um processo padrão utilizando prótases para compilar os inibidores naturais para produzir segmentos activos; ou utilizando técnicas DNA recombinantes para remover partes não essenciais do gene estrutural ou cDNA codificando o inibidor, e depois expressando esta DNA construída para produzir um inibidor modificado.

Actividade Inibidora

»

Em seguida dá-se um exemplo de medições in vitro relativas ao efeito inibidor de PRI sobre angiogenina. Este exemplo não se destina a limitar o presente invento e os entendidos na técnica verificarão que estes exemplos são indicativos de se outros inibidores ou segmentos dos mesmos podem ser utilizados nos processos descritos em seguida.

Medição da Inibição da Actividade Enzimática de Angiogenina

Angiogenina e PRI foram purificados de um modo geral como descrito por Fett e outros e Shapiro e outros, citados anteriormente. A actividade enzimática de angiogenina foi medida como descrito por Shapiro e outros, supra. Abreviadamente, a angiogenina cataiiza a clivagem de 28S e 18S rRNA para formar produtos de 100 a 500 nucleótidos de comprimento. Estes produtos sao estáveis e incluem um grande segmento, aproximadamente 500 bases, que é visível num gel de agarose. Numa experiência, 12 de RNA foram incubados com ou sem angiogenina e/ou PRI a 37²C em 33 mM Hepes, e 33 mM de NaCl, pH 7,5. Passados 30 minutos a reacção texminou, como descrito por Shapiro e outros, supra, as amostras passadas sobre um gel de agarose a 1,1% e colo35

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

B ridas com brometo de etídio. 0,96/1M de PRI inibiu completamente a degradação enzimática de rRNA mediante 0,8 uM de angiogenina. PRI isolado não tinha actividade sobre rRNA Assim, o PRI é um potente inibidor da actividade enzimática de angiogenina, sendo activo a apenas precisamente acima de uma proporção 1 : 1 com a angiogenina.

Estabilidade do Complexo Angiogenina/PRI

Para uso terapêutico do inibidor de angiogenina é vantajoso utilizar um inibidor que ligue fortemente a angio genina e reduza a sua actividade biológica. 0 PRI é um desses inibidores.

A RNaseA também se liga ao PRI e compete com a angiogenina para ligar o PRI em solução. A actividade enzimática de RNaseA é também inibida pelo PRI. Estas propriedades podem ser utilizadas para determinar a estabilidade do oomplexo PRI/angiogenina, como segue.

UpA é um excelente substrato para a RNaseA mas não para a angiogenina. Numa experiência, uma quantidade variável de angiogenina foi adicionada a uma mistura de 0,27 nM RNaseA e 0,20 nM PRI, sendo a RNaseA e a angiogenina misturadas juntamente primeiro, seguidas pelo PRI durante 5 minutos a 25²C, e depois o substrato UpA (0,2mM, num tampão de 10 ug/ml de albumina de soro humano (HSA), O,1M de ácido 2-(N-morfolino)-etano-sulfónico, O,1M de NaCl, e lmM de EDTA pH 6,0). Quanto mais angiogenina estiver presente na mistura mais PRI será ligado à mesma, e assim menos PRI será ligado ã RNaseA e capaz de inibir a sua actividade enzimática. Além disso, quanto mais forte for a ligação de PRI à angionina que à RNaseA, maior será a redução em inibição da actividade RNaseA, visto que o PRI se ligará então de preferência à angiogenina. Os resultados estão indicados

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO

O. ΓΕ3

B

B na Fig. 1. A inibição relativa é calculada por (Vo-Va)/ (Vo-Vr) em que Vo significa velocidade da Actividade RNaseA na ausência de PRI, Vr significa a velocidade na presença de PRI sem angiogenina adicionada, e Va é a velocidade na presença de PRI com angiogenina adicionada. A 5,8mM de angionina não existe essencialmente inibição de actividade RNaseA. Assim,, um grande excesso de angiogenina é necessário para impedir todo o PRI de reagir com e inibir a RNaseA

Numa experiência relacionada, o para a angiogeni· na e PRI pode ser estimado utilizando o processo acima e modificando o mesmo de modo que o PRI e a angiogenina são primeiramente pré-incubados durante 10 minutos, seguindo-se a adição de RNaseA e UpA. Este ensaio determina o nível de inibidor livre remanescente após a incubação de PRI e de angiogenina. Assim, se a dissociação de PRI e angiogenina for lenta existirá pequena inibição de actividade RNaseA A uma proporção de angiogenina : PRI de 1 : 1,2 não foi detectado PRI livre. Assim, o PRI e a angiogenina estão estreitamente ligados e mostram ter um menor que 0,lmM.

A força de ligação de PRI e angiogenina foi também demonstrada por permutação de catião HPLC. Este processo pode distinguir angiogenina livre de complexo angiogenina/ PRI. Uma coluna de Synchropak CM 30C (250 x 4,1 mm; Sychrom, Inc.), um sistema de cromatografia líquida da Waters Associates e um integrador Hewlett-Packard 3390A foram utilizados; .os resultados são apresentados na Fig.2. Amostras de 1 ml em O,1M Tris, pH 7, contendo lmM de EDTA e 10 )ug de HSA foram eluídas com um gradiente linear em 10 minutos de 220-620 mM de NaCl em 20 mM de fosfato de sódio, pH 7, com uma proporção de fluxo de 1 ml/minuto; os efluentes foram controlados a 214 nm. No painel A está representada a eluição de 0,64 >ug de angiogenina; no painel B a eluição de 0,64 ug de angiogenina e 12 ,ug de PRI. Não

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

existe nenhuma angiogenina livre detectável representada no painel B. A adição de RNaseA à mistura angiogenina - PRI num excesso de 32 vezes não produziu angiogenina livre, mesmo passadas 17 horas de incubação. Assim, a dissociação de angiogenine/PRI aparece para ter metade de vida de mais que um dia.

Inibição da Actividade Angiogénica

A angiogénese (isto é, a actividade angiogénica) foi determinada por uma modificação da membrana corioalantóica do embrião de pinto (CAM), ensaio de Knighton e outroo 35 Brit. J. Câncer 347 (1977) descrito por Fett e outros, supra. Para este ensaio o PRI foi dessalinizado utilizando um micro-concentrador Centricon-10 para diluir o tampão em pelo menos 500 vezes. Isto remove os componentes de interferência, da solução de PRI, que podem afectar prejudicialmente a experiência ou podem danificar o próprio ovo. Os resultados da adição de PRI ã angiogenina estão indicados na Tabela 2 a seguir.

Os dados das experiências 1 e #2 representam composições dos resultados obtidos em 2 e 3 conjuntos de ensaios, respectivamente. Entre 10 e 20 ovos foram utilizados para cada um dos tres grupos de experiências dentro de cada conjunto. Foram utilizadas as seguintes quantidades de angiogenina e PRI: Experiência #1, 75 ng e 2 jug, respectivamente; Experiência 42, 46 ng e 700 ng, e Experiência 4 3, 25 ng e 180 ng.

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO

Tabela 2 % Positiva (Numero Total de Ovos)

Amostra	Experiência #1		±2		j£3
Angiogenina	58	(24)	52	(54)	62(13
PRI	17	(29)	33	(48)	17(12
Angiogenina + PRI	15	(26)	25	(52)	7(14

A partir destea resultados é evidente que o excesso de PRI diminui a actividade de angiogenina até um nível indistinguível a partir daquele observado aom o tampão e controles isolados de inibidor.

Inibição de Desenvolvimento de Tumor

Para estudos imunoterapêuticos, ratos machos descobertos (nu/nu) (Charles River Laboratories) foram mantidos sob condições de fluxo laminar, e foram emparelhados por idade e gaiola (5 animais por gaiola) antes da experiência. Os animais da experiência (5-10 por grupo) foram injectados subcutaneamente (S.C.) com 5 x 10^ células de adenocarcinoma de cólon humano HT-29 (Pogh e outros, In Human Tumor Cells in Vitro, pp 115-160 ed. Fogh, Plenum Press, Nove Iorque, 1975) no dia 0. Também no dia 0, os animais foram tratados com tampão de controle (o tampão utilizado para armazenar PRI dializado contra salina tamponada com fosfato; 0,2 g/1 de KC1, 0,2 g/1 de KH₂PQ₄, 8 g/1 de NaCl e 2,16 g/1 de Na₂HP0₄,7H₂0, pH 7,4 a 372 c, PBSA 100 ul) ou com inibidor placentário (100 >ul) a várias dosagens por injecção S.C. ou intraperitonial (I.P.). Os regimes de tra-1959.792

Ref; RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

» tamento incluíram injecções diárias (10-11 doses) ou injecções com intervalos de 2-3 dias (5—10 doses) conforme o protoc.olo experimental. A determinação da saúde, peso, tamanho do tumor do animal assim como os registos fotográficos foram registados 2-3 vezes por semana. No fim das experiências as amostras de sangue e de tecido foram reunidas para avaliação imunológica e histológica.

Numa experiência, quarenta ratos machos nu/nu ε , foram injectados S.C. com 5 x 10 células HT-29 no dia 0. Adicionalmente, no dia 0, 1-10 ratos (Grupo 1) receberam 100 /11 de tampão de controle; 11-20 ratos (grupo 2) receberam 10 ug em 100 /11 de inibidor placentário; 21-30 ratos (Grupo 3) receberam 1,0 jug em 100 /11 de inibidor placentário, e 31-40 ratos receberam 0,1 ug em 100/11 de inibidor placentário. Os grupos 1 e 2 receberam ainda injecções de tampão ou 10 ug de inibidor placentário, respectivamente, nos dias 1, 4, 6, 8, 18, 20-e 22. Nos dias 1, 4, 6 e 8, os Grupos 3 6 4 receberam inibidor placentário em dosagens de 1,0 /ig ou 0,1 ug, respectivamente. Todas as injecções de tratamento foram administradas I.P.. Passados 60 dias, apenas os animais 13, 14, 17, 18, 20 e 24 estavam isentos de tumor. Assim, a inoculação com lOjug de PRI evitou a formação de tumor em cerca de 60% dos animais.

A inibição de ambas as actividades biológicas e enzimática-de angiogenina per um inibidor tem importantes aplicações mecânicas, fisiológicas e farmacológicas. Isto é compatível com a hipótese de que estas duas acções da angiogenina estão interreiacionadas, como sugerido anteriormente pela perda simultânea de ambas as actividades por carboximetilação por bromoacetato ao pH 5,5. Shapiro e outros, supra: Por outro lado, cria a possibilidade de tais inibidores poderem desempenhar um papel na regulação in vivo da angiogenina. A interaeção angiogenina/PRI envol35

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Ref; RWF:MS 038.008 SHAPIRO »

» ve analogamente regiões de angiogenina separadas largamente na estrutura tridimensional, muitas delas fora.do centro activo. Assim, a conservação de resíduos necessários para a. actividade enzimática isolada provavelmente não podem contar para a força da interacção.

Isto implica que a capacidade de angiogenina para ligar o PRI foi mantida independente durante a evolução. Aparentemente, a ligação pelo PRI e outros inibidores reflecte um mecanismo de controle fisiologicamente relevante que tem potencial farmacológico e terapêutico. Por exemplo, como acima se mostrou, estes inibidores são acti.vos na prevenção da formação de tumor em ratos. Aparentemente os mesmos sao adequados para injecção em seres humanos e outroíi animais a fim de evitar o desenvolvimento do tumor, e outran doenças associadas com a neovascularização, por exemplo, retinopatia diabética, artrite reumatóide e sarcoma de Kapsi. Isto é, os mesmos são adequados para o tratamento de doenças em que a vascularização desempenha um papel importante na patofisiologia de doenças tais como tumores sólidos, hemangiomata e psoriase.

De preferência, os mesmos são injectados intravascularmente, mas com maior preferência intravenosamente, ou injectados intraperitonealmente num meio fisiologicamente compatível (tal como PBSA, ou aqueles tampões ou agentes descritos por Krakoft, Ca-A Câncer Journal for Clinicians, Março/Abril 1987, Vol. 37; 93), adequado para administração a um animal numa quantidade suficiente, por exemplo cerca de 10-10.000 ;ug/kg de pescjído borpo do animal, para inibií naturalmente a actividade biológica que ocorre de angiogenina dentro do animal. Alternativamente, os mesmos podem ser administrados topicamente a uma área específica, ou injectados subcutaneamente.

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO

I

Verificou-se que estes inibidores são estáveis durante pelo menos 2 semanas mesmo a concentrações tão baixas como 8/iM quandos os mesmos estão numa forma purificada; não há necessidade de incluir DDT.no tampão de armazenagem ou na composição terapêutica que está sendo administrada; contudo, agentes naturais, que são fiBiologicamente compatíveis, por exemplo N-actil cisteína ou cisteína ou cisteamina podem ser utilizadas. Para administração é importante que o fluído tampão não prejudique o paciente. É possível que estesinibidores sejam utilizados profilaticamente a uma concentração baixa. Assim, por exemplo, é apropriado administrar 10-10.00(}ug/kg de peso do corpo do paciente em risco de desenvolvimento de cancro, isto á, doentes que tenham tido um tumor primário removido.

Outras formas de realização estão compreendidas nas reivindicações anexas.

depósito dos correspondentes pedidos para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 14 de Abril de 1987 sob o N² 038.008 e em 5 de Abril de 1988 sob o n?. 177.942.

Claims

1*,- Processo para inibir o desenvolvimento de um tumor num animal, caracterizado por se administrar um inibidor de actividade angiogénica de angiogenina numa quantidade suficiente para inibir a actividade angiogénica no tumor.

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Ref; RWF-.MS 038.008 SHAPIRO

2? - Processo para inibir o desenvolvimento de um tumor num animal, caracterizado por se administrar ao and mal um inibidor de actividade enzimática, sendo tal actividade caracterizada pela clivagem 18S ou 28S rRNA para seg mentos de germes geralmente de 100 a 500 bases.

3? - Processo de acordo com a reivindicação 1, ou 2, caracterizado por o inibidor ser susceptível de se ligar ao RNaseA.

4β - Processo de acordo com a reivindicação 1, ou 2 caracterizado por o referido inibidor ser susceptível de se ligar à angiogenina.

5? - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou

2, caracterizado por o referido inibidor compreender um seg mento inibidor de angiogenina de inibidor de ribonuclease placental humana ou uma proteína análoga de tecido humano não placental ou de tecido de mamífero não humano.

6? - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o inibidor ser PRI ou um segmento do mesmo inibidor de angiogenina.

7- - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido inibidor ser administrado entre 10-10.000 /ig/kg de peso do corpo do referido animal.

8? - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido animal ser um ser humano.

9* - Processo para a preparação de uma composição terapêutica, caracterizado por se dispersar 0,1-10 mg/ /kg de um inibidor capaz de inibir a actividade angiogénica de angiogenina, num meio que é fisiologicamente compatível e adequado para administração a um animal, para inibir a actividade angiogénica ocorrendo naturalmente a angio. genina dentro de pelo menos uma área definida do referido animal.

= 23 =

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Refí RWF : MS 038.008 SHAPIRO

I

10$ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o inibidor inibir a actividade enzimática da angiogenina.

11$ - Processo de acordo com a reivindi^ cação 9, caracterizado por o inibidor compreender um segmen to de inibição angiogénico do inibidor de ribonuclease placental humano ou uma proteína análoga a partir de tecido humano não placental ou de tecido de mamífero não humano.

12$ - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o inibidor ser PRI ou um seg mento inibidor de angiogenina do mesmo.

13- - Processo para inibir doenças associadas com a neovascularização, caracterizado por se admi nistrar a um animal 0,1-10 mg/kg de um inibidor da actividade angiogenica de angiogenina para inibir a actividade angiogénica associada com a doença.

14$ - Processo para a preparação de uma composição terapêutica caracterizado por se incluir 0,005-0,2 mg/kg de um polipéptido com a sequência de aminoácido Val-Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Glu-Leu-(Asn-Leu-Arg);

Ser-Asn-Glu-Leu-Gly-Asp-Val-Gly; ou Trp-Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Gln-Asp-Lys).

15- - Processo para a preparação de uma composição terapêutica, caracterizado por se incluir 0,005-0,2 mg/kg de um polipéptido com uma sequência de aminoácido :

Val-Asn-Pro-Ala-Leu-Ala-Glu-Leu-(Asn-Leu-Arg); Ser-Asn-Glu-Leu-Gly-Asp-Val-Gly;

(Trp ou Val)-Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Cys ou Gln)-Asp-(Val ou Lys).

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO r»10

16?.- Processo para a preparação de ácido nucleico, caracterizado por se codificar um polipéptido que possui uma sequência de pelo menos oito resíduos em comprimento que é igual a ou é convencionalmente substituído, a partir da sequência PRI.

17^ê.- Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se obter um ácido nucleico que compreende a) uma sequência PRI cDNA de pelo menos 24 bases, ou b) uma sequência DNA que codifica a mesma sequência de aminoácido como uma sequência PRI cDNA de pelo menos 24 bases.

183,- Processo para a preparação de ácido nucleico caracterizado por se codificar a seguinte sequência de aminoácido:

Val-Asn-Pro-Ala-Ieu-AIa-Glu-Ieu-(Asn-Leu-Arg);

Ser-Asn-Glu-Leu-Gly-Asp-Val-Gly; ou (Trp ou Val)-Leu-Trp-Leu-Ala-Asp-(Cys ou Gln)-Asp-(Val ou Lys).

19-. Processo para a preparação de ácido nucleico de acordo oom a reivindicação 16, caracterizado por se separar uma cultura de gene de mamífero com uma sonda que corresponde a um segmento de um polipéptido com uma actividade inibidora da angiogenina.

20.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a cultura de gene compreender uma genona ou cDNA.

21?.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o polipéptido ser um inibidor de ribonuclease placental humano.

22?.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a cultura compreende DNA humano, ou cDNA humano.

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Ref:'RWF;MS 038.008 SHAPIRO

23®.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sonda compreender uma sequência escolhi da do grupo que consiste em:

5'-TGGBTNTGGBTNGCNGABCADGABAA-3’í

5’-TTITCBTGITCCGCCAICCACTICCA-3 ^f;

II I

5' -AABGAD3TNGGNGABGTNGG-3 ’ J

5’-CCCACITCCCCCAI3TCITT-3'

I II

5'-GTNAABCCNGCNBTNGCNGA-3’; e

5’-TCCGCCAICGCCGGITTCAC-3*

I em que B é C ou T, I é inosina; N é A, T, C ou G, e C é C ou I.

24®.- Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a sonda compreender uma sequência escolhi da do grupo que consiste em;

5’-TGGCTGTGGCTGGCCGACCAGGAGAA-3’5

5’-GTGCTCTGGTTGGCCGACTGCGAT-3’;

5’-GTGAACCCTGCCCTGGCTGA-3’;

5’-GTGAACCCTGGACTGGCAGA-3’;

5’-AATGAGCTGGGCGATGTGGG-3’; :-e

5’-AACGAGCTGGGCGATGTCGG-3’

25®.- Processo para a preparação de um polipéptido com actividade inibidora da angiogenina, caracterizado por se expressar o ácido nucleíco preparado de acordo com a

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Ref: RWF:MS 038.008 SHAPIRO reivindicação 16 numa célula hospedeira.

26&,- Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o ácido nucleico codificar um segmento de inibidor de ribonuclease placental humano.