SI8013066A8 - Postopek za pripravo monoklonalnega protitelesa okt6 - Google Patents

Description

! > ·. ν'ώ. *&£

•V« οΛ,ΐί P-5066/80

ORTHO PHAKMCJSUTICAL CORPORATION Kariten, N .J., &AD

2 4 £ Bitenj e O P£/ZAf4A/yO

Pat e ^ ta

Oblast tehnike

Pronalazak Je iz oblasti biohemijskog inženjerstva·

Tehniški problem

Pronalskom se reševa tehnički problem postupka za dobivanje monoklonalnog antitela "0KT6" ko J e se koristi za dijagnozu i lečenje takvih bolesti kao etosu razne vrste leukemije, Hodžkinsova bolest, miastenia praviš, psorijaza i slično.

Predloženo rešenje tehničkog problema Je novo i originalno,de sada nepoznato u literaturi i praksi.

Stan.ie tehnike

Fuzija mišjih mielomskih celiJa za celije slezine iz imuniziranog miša, izvršena od strane Kohler-a i Milstein-a 1975 p. /Nature, 256. 4-95-4-97 (1975)/ prvi put Je pokazala da Je moguče dobiti kontinualni niz celija praveči homogene tkzv. "monoklonalno", antitelo* Od začetnog rada učinjeno Je mnog©; napor u cilju dobivanja različitih hibridnih celija tkzv. Mhibridome" i koriščenja antitela načinjenor od strane ovih hibridoma za nazličita naučna istreživanja. Vidi, na primer, Current Topiča in Miorobiology and Imunolog? «vol 81. ,,Lymphocyte Hibridomas", F. Melchers, M.Potter and N. Warner, izdavač, Springer-Verlag ί <6*· s ί <6*· s

2. 1978 i reference navedene u ovom delu; C·J.Bnrastable et al,

Celi .14. 9-20 (maj, 1978), P.Parham and W.P#Bed*er, Nature 276 397-399 (november, 1978); Handbook ef Erperimental Immunolegv . tre6e iadanje,vol. 2,D.M.Wier, izdavač Blackwell, 1978 ,glava 25; Chemical and Kngineering Neva . 1· januar, 1979» str. 15-17· Ove reference istevremeno ukazuju na predesti i komplikacije pokušaja za dobivanje monoklonalnog antitele is hibridoma· lako je opšta tehnika konceptualno razumljiva, ima mnogo tožkoča koje ae srecu pri primesi i poštoji mnoge varijanti ove tehnike koje trebe primeniti u specifično® slučaju· Ustvari, ne postoji potpuna sigurnost da če se dobiti željama hibridoma, da če ona proizvesti antitelo ako se dobijo, ili da če take proizvedeno antitelo imati Željenu specifičnost· Nastopen uspeha principijelno utiče tip upotrebljenog antigena i tehnika selekcije koja se koristi za izolovanje željene hibridoma·

Pokušaj dobivanja monoklonalnog antitela za čovečj.e antigene celija limfocita opisan je samo u nekoliko slučajeva· Vidi, na primer, Current Tonics in Microbiology and Itamunology, ibid» 66-69 i 164—169. Antigeni, koji su koriščeni u ovim slučajevina, 'kultivisani su ne nizovima čolija humane limfoblaetoidne leukemije i humane hronične limfocitne leukemije· Mnoge od dobivenih hibridoma izgleda da proizvode antitelo za različito antigene kod svih humanih čelija· Nijedna od dobivenih hibridoma nije proizvela antitelo protiv prethodno definisane klase humanih limfocita. ^edavno su ovi prijavioci i drugi autorizovali članke koji opisuju dobivanje i ispitivanje hibridoma koje prave antitelo za neke T-čelijske antigene. Vidi, na primeru, Reinhepz, E.L·- et al., J. Immunology, 12^,1312-1317 (1979); Reinherz E.L. et al., Proč. Natl. Acad. 6ci. £6, 4-061-4065 (1979) i Kung P.C. et al, Science ,206, 347-349 (1979).

Treba shvatiti da postoje dve osnovne klase limfocita koje su ukljucene u imunološki sistem čoveka i Životinja· Prva od ovih klasa (čelija koja potiče od timusa ili Ttfčelija) diferencirana 3. \ je u timusu iz hemopoietičnih osnovnih čelija· Pošto se nalaze unutar timusa, diferencirane celije se nazivaju "timociti". Zrel« «· T-čelija izlaze iz timusa i kruže izmedju tkiva, limfatika i krvotoka. Ove T-celije formira.ju veliki dep rezervoar* recilku* lišučih malih limfocita· Ovi imaju imunološku specifičnost i, direktno su ukijučene u čelije posredovane, imune reakcije (kao šte %e oddbijanje presadjivanja) kao efektereke. čelije. Iak<j T-čelije ne luče hormone antitela, one su ponekad potrebne za lučepje ovih antitela od strane druge klase limfocita, o kojima se dole diskutuje· ^eki tipovi T-celija igraju regulatorsku ulogu u drugim aspektima imunog sistema· Mehanizem ovog ρχοοοβ* saradnje čelija još uvek nije sasvim razumljiv.

Druga klasa limfocita (Relije koje se izvode iz koštane srži ili B-čelije) su one koje luče antitelo. One se takodje razvijaju iz hemopoitetiČnih osnovnih čelija, ali njihova diferencijacija nije odredjena timusom. U pticama, one se diferenciraju u jednora organu, koji je analogen timusu, koji s se naziva Fabricijeva kesa. Medjutim, kod sisara nije pronadjen ekvivalenten organ i smatra se da se ove B-čelije diferneciraju unul^ar koštane srži, 'iV'· / .

Sada'se zna da se TŽčelije dele na bar nekoliko podtipov·., , ko ji se nazivaju "pomagačke", "prigušujuče" i,,ubijajuče“ T-čelije, koje imaju funkciju potpomaganja neke reakcije« zaustavljanja neka reakcije ili ubijanja (razlaganja) stranih čelija, Ove podklase su dobro razumljive za mišje sistene, ali su tek (nedavno opisane za humane sisteme. Vidi, na primer, R.L«£vans etal·. Journal of Experimentel Medicine, vol, 145 221-232,19??* i I>4 Chess and S.F.Schlossman -"Functional Analysiu of Distjinot Human T-Gell Supsets Bearing Unique Differentitaion Antigene", u "Oentemporarv Topics in Immunobiologv1·1 0. Stutnan, iz^nvač, Plenum Press, 1977, vol.7, 363-379· . Sposobnost identifikacije ili prigusivanja klasa ili rodklasa (T-4elije jje značajna za dijagnozu ili locepje, raznih lmunoro-giilaterskih poremečaja ili stanja. - 4 ) · 4·

I

Na primer, neke leukemije i limforne (oboijenja limfej imaju ' različitu prognozu zavisno od toga da li potiču od B-čelija ili T-čellja. Na taj način, davunje prognoze bolesti zavisi od razlikovanja ove dve klase limfocita· Vidi, na primer, A.C· Aisenberg and J.C.Long, The American Journal ef Medicine. 58, 300 (mert, 1975); D.Belpomme et al·, u Immunalogical DiagnoBia ef Leukemias and Lvaphomas”, S« Thierfelder et al·, izd·

Springer,Heidelberg , 1977, 53-45. i D· Belpemme et al.,

British Journal ef Haematology, 1978» j$8» 85·

Neka beleena stanja (npr· juvenilni reumatoidni grtriti:., zločudni i sgamaglobulinemia) u vezi su ea postojanjea rovnoteŽe podklasa T-čelija. Sugerirano je da su autoimune bolesti uopšte u vezi su viškem "pomagačkih" TŽ^elija ili nedostatkom nekih "suzbijajucih" T-čelija, dok je agamaglobulinemia u vezi ea viškom nekih "suzbijajucih" T-čelija ili nedoatatkoa "pomagačkih" T^čelija. Zlocudnosti su uopšte u vezi sa viškom . "suzbijajučih" T-,elija.

Kod nekih leukemija, višek T-celija se proizvodi u zaustavljeno· stanju razvoja. Na taj način dijagnoza može zavisiti od sposobnost da se detektuje ova neuravnoteženost ili višak i odredi koji je razvojni stupanj u višku. Vidi npr. J.Kersey et al., "Surface Markorsm Define Human Lymphoid Kalignancies with Differonig Progneses" u Haoaatology and Blood Transfusion. vol. 20, Springor-Verl&g, 1977» 17-24 i u tom radu date referenpe, i El.L· Reinherz et al., J. Ciin. Invest. 64, 392-397 (1979).

SteČena aga^eglobulinemija, bolesno stenje u kojem se ne proizvodi imuni globulin, o.buhvata najmanje dva različita i tipa, U tipu I nemogučnost proizvodnje imunog globulina izazvaaa je viškom suzbijsjucih T-čelija, dok je u Tipu II prouzrokovana nodpatatkem pomagačkik T-celija. U oba tipa izgloda da nema def kata ili nedostatak kod pacijenta B-čelija, limfocita koji S.u odgokorai za stvarno lučenje antitela; medjutim, ove B-čelije su ili suzbijene ili "nepotpoffioKnute", što rezultuje u smanjpkoj iii nopostoječoj proizvodnji imunog globulina. Tip i * *

stečene agamagoglobulinemije, na baj način nože se odrediti ispi-tivanjem da li postori višak suzbijajučih T-čelija ili odsustvo ’ pomagačkih T-čelija.

Na terapeutskoj strani, poštoji sugestija, iako do sada ni je definitivno dokazana, da davanje antitela protiv podtipa T-čelija u višku može iraati tarapeutsku prednost kod autoimme bolesti ili zlocudnosti. Na primer, rak sa ppmagačkim T-čelijama (neke kožne T-čelijske limf orne i neke T-celijske akutne limfo-blaatoidne leukemije) mogu se lečiti antitelom na antigen pomagačke T-čelije. ^ečen.je autoimune bolesti prouzrokovane viškom pomagačkih čelija može se takodje vršiti na lati način·

Lečenoe bolesti (npr· zlocudnosti ili stečene agamaglobuli-nemiJo tipa 1) protucrokovanih viškom suzbijajučih T-čelija, može i se izvršiti davanjem antitela za antigen euzbijnjučih T-celija*

Saopšteno Je da se antiserumi protiv čitave klase humanih T-čelija (ttv. antihumani timocitni globulin ili ATG) mogu ae terapeutski koris-titi kod pacijenata koji eu primili . presadjeae organe« Pošto čeliJama posredovana redkeiJa (mehaninip ko j im »a, odbijaj» tranap3,aatati) zavisi ed T-čelija, davanje ^ antirela za T-čelije sprečava ili zadržav» ovaj proeee odbijanja. " · , IM »» ♦/<*· i

Vidi ,na primer, Gosimi et al.t "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Kenal Allgraft Reoipients": Importances of T Celi Monitoring ", Surgery«AO . 155-16? (1976) i reference date u ovom radu. ' ' i". ·' » ’

Identifikacija i suzbijanje klasa i podklas»,.humanih T-čelija V . '< ' ranijo je vršena koriščenjem spontanih autoantitela ili selektivnih antiseruma za humane T-čelije dobive»ih imunizacij j09 životinja a« humanim T-čelijama, iepuštanjem krvi živo-tinja da se dobije serum i adeorbovanjem antiseruma ea ,npr« autolognim ali ne i elogenim B čelijama da se udalje antitela neŽeljene reaktivnosti« Dobivanje ovih antiseruma je izrazito

A teško, naročite u stupnjevima absorpcije i prečisčavanja. Čak i adserbovani i prečiščeni antiserumi, pored željenog antitela, iz raznih razloga, sadrže i mnoge ne&isboče. 6. ;

Prvo, serua sadrži mil ione molekula antitela čak i pre imunizacije T-rčelija. "rugo, imunizacija prouzrokuje proizvodnju antitela protiv mnoštva različitih antigena koji eu nadjeni kod. svih ubacenih humanih T-čelija. postoji selektivna proizvodnja antitela protiv jeanog antigena;· Trače, koncentracija specifičnog antitela, ko.je je dobiveno primeno« ovih metoda, cbično je vrlo uiala (npr. neaktivna pri razbla šivanj ima večim od ^:100) i odnos specifičnom prema nospecifičnom

/Z antitolu je manji od 1: 10 .

Vidi,na primer, članek Chess-a i Schloseman-a koji je gore naveden,(na str. 3£>5 i dalje) i članak u Chemical and Enginearing Nevs (koji je naveden napred) u kojima su opisani nedostaci 1 1 »ti rani jih antiseruma i prednosti monoklonalnog antitela·

Opis rešenja tehničkog problema sa primerima izvodjenja

Sada je otkrivena nova hibridoma (označena kao 0KT6) koja je u stanju da proizvodi novo monoklonalno antitelo protiv antigena nadjenog kod približno 70% mormalnih humanih timocita ali ne i kod normalnih humanih perifernih limfoidnih celija (T-celija, B-čelija ili nultih čelija) ili čelija koštane srži*

Tako proizvedeno antitelo je monospecifično za jednu determipa-ntu’·* na oko 70% normalnih humanih timocita i praktično ne sadrži neki drugi anti-humani imuni globulin, na suprot ranijim antiserurima (koji su inherentno kontaminirani sa antjLtelom reaktivnim prema brojnim humanim antijgenima) i ranijim mo^pjclonalnim antitelima (koja nisu mono&peolfAfrM1 za humani · * t timocitmi antigen). Pored toga, ova hibridoma moža se tako kultiviaati da proizvede antitelo bez pottebe imuni^ovanja ' . v. .. . i ubijanja životinja, čemu sledi mukotrpna adsorpcija i prečiščevanja, Što je bilo neophodno da se dobi ju čak i nečisti, antiserumi ranije prakse·

Prema torne, predmet ovog pronalaska je obezbedjivanje hibridoma koje proizvode antitela protiv antigena nadjenog kod oko ?0% normalnih humanih timocita«

U cilju obezbedjiv*nja gore datih ciljeva i prednosti, ovim prdnalskom se daje nova hibridoma koja proizvodi novo antitelo za antigen nadjen kod približno' 70$ normalnih humanih timocita (ali ne i kod normalnih humanih perifernih limfoidnih 6elija ili delija koštane srži), zatim samo antitelo i dijagnostidko i terapeutske metode koje koriste ovo antitelo· Ova hibridoma je dobivena uz opštu primenu metode Mileteinr*a i Kohler-a. wakon imunizacije aiiseva sa normalnim humanim timocitima, dalije slezine imuniziranih miševa su fuzionieane delijama iz jedne vrste mišjih mia.loma i dobivene hibridoma su sortirane radi dobivanja onih koje sadr~e antitelo i koje su dale selektivno vezivanje za normalne E rozete pozitivne humane T delije i/ili timocite. beljene hibrideme eu zatim klonirane i okarakterisane· Kao rezultat ovog, dobivsna je hibridoma koja proizvodi antitelo (označeno kao 0KT6) protiv antigena kod približno 70$ normalnih humanih timocita· Ne same da ove antitelo reaguje sa oko 70$ normalnih humanih timocita, ved ono takodje ne reaguje sa normalnim perifernim krvnim limfoidnim delijama ili delijama koštane srži. tia aspekta teškoca navedenih u ranijoj tehnici i nedoetatka useha vezanih za koriščenje vrsta malignih celija kao antigena, iznenadjujuce je da ova metoda daje željenu hibridomu· Treba naglasiti da nepredvidljiva priroda dobivanja hibridne celijo ne omogucava da se vrši ekstrapolacija od jedneg sistema n^tigena ili čelija do drugog sistema· ^stvari, ovi prijavioci su etkrili da upotreba vrste T celija malignatnih delija ili prečiščenih antigena odvojenih iz površinskih delija kae antigena nije bil« uspešna u principu. Z predmetna hibridoma i iz nje proizvedeno antitelo ovde su identifikovani ozmakom U0KT6", poseben materjal de biti očigledan iz konteksta· Predmentna hibridoma je deponovana 21· novembra 1979. god. kod America Type Culture Collection, 12301 Parklavm Drive, Rockville, Maryland,20852, i dobila je ATCO prijemni broj ORL 8020. t

Dobivanje i karakter!sanje ove hibridoma i rezultuječeg antitola bolje 6e se rezumeti upučivanjem na sledeči opis i primera ilustrovanja·

Postupak za dobivanje hibridom« uopšteno obuhvata sledeče stupnjeve: A. Imuniziranje miševa sa normalnim humani® timocitima· iako je aadjeno da su od prednosti mieeVi ženke CAFj, podrazumeva se da se raogu koristiti i drugi sojevi miševa· Program imunizacije i koncentracija tinooita trebe da su takyi da se proizvodu upotrebljive količine pogodno primarnih spledocita· Nadjeno je da su efikasne tri imunizacije u dozvoljenim intervalima na 2x10^ čelija/miš/injekcija u 0,2ial fosfatom puferisanog slanog rastvora. B. Odstranjevanje slezina iz miševa i pravljenje suspenzzije 'slezine u ©dgovarajučoj sredini. Dovoljno je oko lml sredine na slezinu. Ove eksperimentalne tehnike su dobro poznate· C- Fuzionisanje suspendovanih relija slezine sa mišjim mielomeki® čelijama iz pogodne vrste čeli.vi upotrebom pogodnog podpomagača fuzije· Pogodan odnos je oko 5 clezinskih čelija na jednu mielomsku čeliju· Ukupna zapremina od oko 0,5 -l?o ml eredLine za fuziju odgovara ne oko 10 splenocifca* 'Poznat9 au. i mogu se dobiti mnoge vrste mielomskib čelija miša* uopš$e ©d članova akad makih zajednioa ili razlicitih depozitnihbanaka, kao Sto je $alk Institute Celi Distribution Center,' I<a Jolla, Oa. Upotrebljena vrsta čelija treba poželjno da bude tkzv· tipa “otpornog na lekove", tako da nefuzionieane mielomeke čelije v· ne preživ^ u selektivnoj sredini, dok če hibridi preživeti· j

Naj^običajnija klase je vrsta čelija 8-azagyanina, koja nema I enzim hipoksantin gvanin fosforibozil trenefe^azu i otuda I •;> t' i 1 ’ nece biti podpomognuta od Strane HAT (hipoksantin, aminop- 1 > ter&n i timidin) sredine. 1'akodje je uopšte od prednosti da . upotrebijena vrsta mielomskih čelija bude tkzv· "neizlučujučag t.ipn", što znači da sama ne proizvodi neko an^Ltelo, iako se v·.'1«·.·.· * . 9 mogli koristiti i izlučujuči tioovi. Med.,jut im, u nekim slučaje vima mogu biti od prednosti 1učeče miolomake vrste. Iako je pogodan pomagač fuzije polietilenglikol, koji ima srednju molekulsku masu od oko 1000 do oko 4000 (koji se u premetu dobiva kao PEG 1000, itd,), inogu se koristiti i drugi pospeši-vači fuzije-koji su poznuti u praksi. D« Razblaživanje i kultivisanje u od. voj enim sudovima,smeše ' pefuzionisanih čelija slezine, nefuzionisanih mieloraskib celija, i fuzionisanih celija u selektivnoj sredini koja noče potpomagati nefuzionisane mielomske čelije u toku perioda vremena dovoljnog da se omuguci umiranje nefuzionisanih čelija (oko nedehju dana). Razblaživanje može biti ograničavajučeg . tipa, u kojem je zapremina razblaživača izračunata statističkim putem tako da se izoluje izvestan broj celija (npr· 1-4) u svakom posebnom konte,jneru (npr. svakom udubljenju mikrotita-rskog suda). Sredina je ona (npr. HAT) koja ne potpomaže prema lekovima otpornu (npr. otpornu prema 8-azagvanipu) nefuzioni-sanu vrstu mielomskih čelija. Otuda se gube ove mielomske čelije Rako nefuzionisane colij e slezine nisu malignatne one im&ju samo konačan broj generacija. Na taj način, posle izvesnog perioda (oko medelju dana) ove nefuzionisane čelije slezine prestaju ds se reprodukuju. Sa druge strane, fpzionisane čelije nastavijaju da se reprodukuju jer peseduju aalignatnu osobinu mielomskog pretka i sposobnost preživljayanja u slek-tivnoj sredini celija pretka. E. Procenjivanje supernatanog sloja u svakom sudu koji sadrži hibridomu u odnosu na prisuetvo antitela za E rptetno pozitivne prečiščene humane T čelije ili timocite· F, Selekcija (npr. ograničavanjem razblaženja) i kloniranje hibridoma koje proizvode željeno antitelo.

Kada je jednon slekkcirana i klonirana željena hibridoma, re^lutujiiče antitelo može se dobiti primenom jednpg od dva načini, tfajčistije monoklonirano antitelo se dobiva in vitre > ·· " . v · ·4 M . ·· . :*·/·.· s<; . j Ί "1 λ ' ‘ · · ·> . kultiviranjem žaljene hibridoma u pogodnoj sredini tokom odgova- rajučeg vremenskog intervala, posle čega sledi izdvajanje žeijenog antitela iz supernatnnta. Pogodila sredina 1 pogodn* / vremenski period kultivisanja- su poznati ili se. lako mogu odrediti· Ova in vitro tehnika proizvodi praktično monospeci- fično aeneklonalno antitelo, praktično bez drugog specifičnog antihuoanog imunog globulina, Prisutna je mala količila grugog V . ,· imunog globulina jer sredina sadr£i kseaogeni seru» (npr. \ ' fetalni teleči serum)· ttedjutim, ovaj in vitro postupak nemara ‘ t*‘i i proizvesti dovoljnu kolicinu ili koncentraoiju antitela za / neke a vrhe, jer je koncentracija monoklonalaeg, antitela same ·ί.<" oko 50 yug/ml. > kadi dobivanja mnogo veče koncentracije neštp nanje čistog n\onoklonalnog antitela, željena hibridoma se može injekcijo» . dati miševima, pogodno singenskim ili semi-sipgenskim miševima« Hibridoma 6e prouzrokovati gradjenje tumora koji proizvode antitelo posle dovoljnog perioda inkubacije, sto če rezultmvati u velikoj koncentraciji žeijenog antitela (oko 5-20 mg/ml) u krvntpku i peritonalnom eksudatu (trbušna vodena bolest) miea \ domačina,. lako ovi rniaevi domačini takodje imaju normalna antitela u svojoj krvi i izlučevinama, koncentracija ovih normalnih antitela je samo oko 5$ koncentracije monoklonalnog antitela. Pored toga, pošto ova normalna antitela niau anti-humana po svojoj specifičnosti, monoklonalno antitelo dobiveno 1 iz prikupijenih eksudata ili seruma, praktično je bez prisustva bi}o kog kontaminirajučeg antihumhnog iraupog globulina.

Ovo mohok^pnalno antitelo je visoke koncentrapije (aktivno pri razblaživanjima od 1 ;50.000 ili više) i visokqg donosa spscifi-čnog prema nespecifičnom imunom globulinu (oko 1 : 20). Imuni globulin, koji je pri torne proizveden i ugradjen u lake miloi-rnsjke lance ,je nespecifičen "bezvemi" peptid koji samo razblažuje monoklonalno entitelo ne odužimajuči mu njegovu specifičnost. i · j ' ► *t . ‘‘ i ' -v V». · ' ; ' ! . " .,·{ ·' ’ 1 » , < ·· * I- ' t ' * V , u«

Primer 1

Dobivanje monok]onalnog antitela A. Imunizacija i hibridizacija,somatskih ceii.ia Ženke OAF, miševa (Jackson Laboratories, stare 6-8 nedalja) su imunizirane intraperitonalno sa 2x 10' humanih timooita u 0,2 ml fosfatnog slanog puferisenog rastvora u dvonedeljnira intervalima. ^etiri dana nakon trece imunizacije, iz miševa eu odstranjene slezine i napravljena je prosta celisjka suspenzija presevanjem tkiva kroz sito od nerdjejučeg Čelika· . ’

Fuzija čelija izvršena je rrema postupku Kohler-a i Milstein-a· 1x10 splenocita je fuzionisano u 0,5ml' fuzione sredine koja sadrži 55^ poletilenglikola (PEG 1000) i dimetilsulfoksida u RPMI 1640 sredini (Gibco, Grnad Island, NY) sa 2x 10^ p33t65Ag8UI mieloraskih čelija dobivenih od firme Dr.M· Scharff, Albert Einstein College of riedicine, Bronx, NY, Ove mielomske čelije luče IgGj k lake lance. B, Selekcija i rnzvo.i hibridoma

Posle izvršene fuzije celija. Čelije su kultivisane u HAT sredini (hipoksantin,aminopterin i tioidin) na 37°C ea 5^-aim COg uvlažnoj atmosferi. Nekoliko nedelja kasnije, 40 do 100^,ul supernatantne tečnosti iz kulture, koja sadrži hibridome,

CL dodato je lep idei od 10 perifernih limfocita izdvojenih u E rozstne pozitivne (E+) i 8 rozentne negativne (E") populacije, kojs eu napravljene iz krvi zdravih humanih davalaca kao što / ;· je opisao Menda* ( J.Immunol. 111 . 860 (1973))· ^etekcija mišjih hibridomnih materjala, vezanih za ove čelije, odredjena je indirektnom iraunofluroscencijom. ^elije inkubirane sa supemtatntima kulture obojene su fluorescentnim koza-anti-miš IgG (G/M FITC) (L Meloy Laboratories, Springfield,VA; F/p «2,5) i fluorescentnim entitelom prevučene čelije su zatim analizirane na citofluorografu FG200/48Q0A (Ortho Instrumente, Westwood,MA) kao što je to ppie&no u primeru III. kulture hibridoma koje sadrže antitela koja reaguju specifično sa E+ limfocitima 12. • ». I* (T delije) i/ili timociti su selekcionisani i klonirani dva puta primenom metoda ograničavanja razblaženja u prisustvu hranilackih celija. Nakon toga su ekstrakti preneseni intra-peritonalno davanjem injekcije .od lx 10' de-lija datog ekstrakta (0,2 ml) u CAF^ miševe premirane sa 2,6,10,14—tetrametil-pentadekanom (koji firma Aldrich Chemical Company prodaje pod imenom Prištine). Malignatni eksudati is ovih miševa su zatim upotrebljeni da se okarakterišu limfociti, kao što je dole opisano u primeru 2. Standardnim tehnikama je pokazano da je predominantno hibridno antitelo 0KT6 podklase IgG^.

Primer 2

Karkaterizacija reaktivnosti 0KT6 A. Izolovanje limfooitnih populacija

Humane periferne krvne monoklonarne celije su izolovane iz zdravih dobrovoljnih davalaca (starosti 15-4-0 god.) primenom Ficoll-Hypaque-ovo« centrifugiranja sa gradijentom gustine (Pharmacia Pine Chemicals, Piacataway,N.J.) Ženu sledi tehnika Boyum, Scand. J.Clin.Lab.lnvest.21 (suppl. 97), 77 (1968).

W efrakcionisane monoklonarne delije su razdvojene u površinske Ig* (B) i lg“ (T plus nula) populacije primenom hromatografije na koloni Sephadex G-200 anti-F(ab')p koloni kao sto je opiseo Chess et al., u J. Immunol. 115« 1115 (1974·). T delije su izdvojene ii rozetoranjem Ig“ populacije sa 5^-nim ovčjim eritrocitima (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rozetirana smeša je naslojena preko Ficoll-Hypaque-a i izdvojena E* loptica tretira se sa 0,155M rastvorom NH^Cl (10 ml na 10® delija). Tako dobivena populacija T delija je manja od 25& EAC Λ

rozetno pozitivna i više od 95$ rozetno pozitivna što je odredjeno stamdardnim metodama. Pored toga, nerozetirajuda Ig*~ (nula delije) populacija je požnjevena iz Ficoll-ove medjufaze. Ova poslednja populacija je bila manja od ,(5% E* i manja ili 0ednaka 2$ slg*, Površinska Ig* (B) populacija je dobivena sa kolone Sephadex G-200 eluiranjem sa normalnim humanim gama j globulinom,kao što je opisano nopred. Ova populacija je bila I 13 vige od 95$ površinski Ig* i «nanje od 5$ E+. , rv‘- / ' Čeli je normalne humane koštane srži dobivene su iz posterioroe kraste tsnkog čreva normalnih humanih dobrovpijava ppimenom aspiracije iglom. .. ‘ |» B. Izolacija timocita

Normalna humana tin.usna žlezda je dobivena iz paoAjepata starosti dva meseca do 14 godina, koji su podvrgnuti hirurgiji ; srca· Svete dobiveni delovi timusnc žlezde su odmah stavljeni u 5#-ni fetalni teleci serum u sredini 199 (Gibco), fino iseckani kleštima i «nakazama i potom prevedeni u jednočelijske suspenzije prešovenjem kroz žičano sito· Čelije βμ zatim stavljene na Ficoll-*Hypaque sloj i ispredane i isprane kao Ste je ranijo opisano u odeljku A· Tako dobiveni timociti su bili iznad 95$ plodni i više od 90$ rozetno pozitivni· G- Vrste čelija T soja i T akutnih limfoblastnih leukemi,1skxh 6 ali,ja T čelijeke vrste C l*JM, HSB-2 i MOLT-4 su dat e od strane Dr*H. Lazarus-a (Sidney farbar Cancer Institute,Boston,HA)· Leukemiske celijo su dobivene od 25 pecijenata sa dijagnozom T 6elija ALL· Ovi pojedinačni tumori su ranije bili odredjeni da su soja T celija na osnovu njihovog spontanog rozetnog formiranja sa ovčjim eritroeitima (više od 20$ E+) i reaktivnsoti prema specifičnim antisreumima anti-HTL (B.K.) i A99 za T čelije, kao što je ranije opisano. Tumorske populacije eu konzervisane na niškoj temperaturi od -196°C sa perno$ iazpm tečnog azota pomoču 10$-nog DMSO i 20$-nog AB humanog seruma de mpmenta karakterizacije površine· Sve tumorske populacije, (k^je su pri torne analizirane) bile su više od 90$ blesti što je utvrdjeno » . I , , morfolo^ijom citocentrifugiranih prepereti^ prema Virifch^-Giemsa· ,

Primer 3 v.

Oitcflnorografska analiza i odvajanje čelija

Citofluorografaka analiza monoklonalnib antitel« svih celijskifc populacija izvršena Je pomocu indirektne imunofluoroscencije sa fluorescein-kon.iugovanim koža-anti?mišJim IgG (G/M PITO) (Meloy Laboratories) uz koriščenje Citofluorogrfia FC200/4800A (Ortho Instruments). Ukratko 1x10 celija tretirano Je sa 0,15»1 OKUJS pri 1:500 (razblaženju), inkubirano pri 4°0 u toku $0 minute i dva puta isprano. Čelije su zatim regovale aa 0,15ml G/M ΡΙΦΖ razblaženja 1:40 pri 4°C u toku 30 minuta, oentrifugirane su i tri puta isprane. uelije su gabim analizirane na citofluore-’ grafu i Jačina fluorescencije pe čeliji Je registrovana na pulsnom visinskom analizatoru. Sličan tek reaktivnosti Je nadJen pri razblaženju od 1:10.000, ali Je dalje razblaživanje prounro’..ovalo gubitak rekativnosti. Pon oboj en J a Je dobiven zamenjujuči 0,15ml alikvotni deo eksudata 1:500 iz CAP^ miša koJem Je intraperitonalno data injekcija klona koji ne proizvodi hibrid. U ogledina koJi obuhvataju antitelo i komplementno posredovanu limfol-izu, timociti i periferne '1' celijo su kultivisani preko no6i čemu Je sledilo selektivno liziranje a zatim analiziranje na citofluorografu.

Primer 4

Kaziasanje limfocitnih populacija sa monoklonalnim antitelom 40x 10^ perifernih T celija ili timocita stavljeno Je u plastičn. epruvetu od 15ml (Palcon, 0xnard,CA). Loptice 6elija su inku-birane sa 0,8ml 0KT3t 0KT4, ΟΚΦΘ ili normalnem kontrolora eksudata razblaženim u PBS 1:200, ponovo suspendovane i inkubi- rane 60 minuta nri 20°C. Zatim Je dodato 0,2ml svežeg zečjeg « komplementa u populacije tretirane antiteloa, ponovo supsendo-vano i dalje inkubirano pri 37°C u kupatilu aa vodom koJa se | meša u toku 60 minuta. Ha kraju ovog vremenskog perioda celijo su ispredene dole i plodne 6eliJo su numerisane sa Trypan-o*em plavom, ekskluzijom. Posle brojanja čelije su isprane dva puta u 5#-nom POS i stavljene u krajnju srodinu /RPMI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY( koJA s^drži 15. 15. \ I · J, 2056 AB humanog seruma, 1% penicilinTatreptpmioina, 2Q0ml ',V . L-glutamina, 25mM HJ£?1C3 pufera i 0,5% natri juo~l?ikarbonata, inkubirane su preko aoci u vlaŽnoj atmosferi sa 5% COg na 57 „ *

Slika 1 prikazuje uzorak fluortscencije koji je dobiven na citofluorografu pasle reagovanja normalnih humanih timocita ea 0KT6 i drugim monoklonalnim antitelima pri rapblaženju od 1*5^' i G/MFITC· Fon:'fluoroscentnog obolenja je dobiven inkubiranjea svake populacije sa eksudatnom tecnošcu (razplaženjal*500) iz miša kpjem je injekcijom dat neproizvodni klon. - *' . " . i.

Slika 2 prikazuje stupnjeve intratiraične diferencijacije u čoveku

Dobivanje hibridoma i dobivanje i karakterizacija rezultujučeg antitela izvršeni su kao što ,je opisano u napred da,tim prim er ima o ^ako su velike količine predoetnog antitela dobivene ubacivanje» predmetnog hibridoma intraperitonalnc miševima i ubiranjem malignatnih eksudata, očogledno se podrazumeva da se cve hibridoma mogu kultivisati in vitre primenom dobro poznatih tehnika u ovoj praksi i do 3β antitelo'može ukloniti iz supernatanta· tabela 1 prikazuje reaktivnsot 0KTf>, 0KT8, 0KT9 i OKT 10 prema različitim humanim limfoidnim celijskim populacijama· 0ΚΦ6 monoklonalno antitelo je reaktivno sa približno 70% normalsnih humanih timocita a ne sa bilo kojorn drugam, od ispitivanih lirafoi-dnih helija. Ovaj model reaktivnosti je test kojim se može detektpvati predmetno antitelo 0KT6 i razlikovati od drugih antitela· v" % i '

Slika 1 prikazuje reprezentativni fluoroecentni model koji je· dobiven na citofluorogrefu posle reagovanja suspenzija normalnih humanih timocita sa 1*500 razblaženjeo OKTJ, OKTfc, 0KT5, 0KT6, 0KT8, QKT9, 0KT10 i G/M ?ITC. Slični modeli reaktivneeti su nadjeni sa 12 dodatnih populacija normalnih humanih timooita koje su pri torne sipitivane. ^ao što je pokazano, postoje znatne razlike u procentu reaktivnosti i jačini fluorescencije ‘'v*· * * .< i 16< \ '

Y kod sv&kog od ovih monoklonnlnih antitela* Na primerJ 0KT9 roagnje sa približno 10$ timocita na malo· jačino* fluo»e»cen-cije dok 0ΚΪ5, 0KT6, 0KT8 i 0KT10 reaguju sa približno 70% timocita pri vecoj jačini fluorescencijo. 0ΚΦ4, ko ji reaguje sa 75% timocita je intenpedijer izmedju 0KT9 i pionoklonalnib antitela koja daju model veče~jačine fluorescencijo. Pored togi, sl.l pokazuje da je približno 15% timocita detektovano ea ^ ; 0KT3 primenom indirektne imunofluorescencije. Nijo prikazan 0KT1, čiji je model reaktivnosti praktično identičen sa 0KT3 kodi timocita. Model reaktivnosti na sl.l je drugi test pomoču koga se predmetno antitelo 0KT6 može detektovati i razlikovati od drugih antitela.

Tabela 2 prikazuje raspodelu antigena koja je dofinis&na ^ različitim monoklonalnim antitelima kod humanih perifernih ,. T čelija i limfocita,kao Sto je odredjeno serijama lizirajuciS, (razlažučih) eksperimenata koji su opisani u primeru 4* Pošto," su samo 0KT3,0KT4 iOKT8 bili komplementna fiksirajuča raono-klonalna antitela, oga tri su i koriacena.

Kao šfco je prikazano na tabeli"2A, celokupna populacija 0? čelija reaguje ea 0KT3 dok 0KT4, 0KT5 i 0KT8 reaguju sa 60# odnosno 25% i 34$ T čelija. Liziranje (razlaganje) sa 0KT4 i komplementom smanjilo je ukupan broj za-62# i specifično » f izbaoilo OKT4+populaciju. Pored toga, prooenat pKTJj* i 0KT8+ v čelija je porastao i ni je bilo efekta na apeoliitni; broj 0KT5*> i 0#T8+> T čelija. Ovi eksperimenti sugerišu da se 0KT4+ razlik kuje od 0KT5+ i 0KT8+ populacije, ^alje potvrda za ovaj zaklju-v čak5dobiva se, lizirtnjem (razlaganjem) T čelija sa OKT$ i ···$. komplementom . U ovom slučaju, procenat 0Κφ4* T čelija je po^ff/ stao, a apsolutni broj je ostao isti a OKT8+ i OX!P5+ populacij·, a.y eliminisane. Pored toga, ovi rezultati ppkazujiLda je ΟΚΤβ* populacija recipročna 0KT4+ populaciji i sadrže svu > OKT5+ populaciju T čelija koje su predvidjene. , j . ,..

Slični eksperimenti sa populacijom humanih timocita dali su različite rezultate, kao fito je prikazano u tabeli 2B,približno 75# timocita je bilo 0KT4+ ili 0KT8*. $sim toga, narodno >'-liziranje sa 0KT4 ili 0KT8 ima za posledicu da jo ostalo same 4.. ;· «v '' 2% timocita. Večina preostalih timocita j« rektivna u donosu na 0KT?3, dok je same man ji deo reaktiven prema 0KT6*. Ovi nalazi pokazuju da veči deo populacije humanih timocita nosi 0KT4, j OKT}, OKT6 i OKT8 površinska antigene kod site čelije. Pored,toga» tabela 2 pokazuje da naredno tretiranja sa 0KT8 ili 0KT4, dovoda do znatnog povečanja zrelih timocita koji noše 0KT3 antigen. Na taj način, veči deo ,OKT$ reaktivnih timocita je več ipdvojen u 0ΚΤ4-+ ili 0KT8+ podvrsta, jer ja, veči deo zaostalih čelija, nakon izvršenog 0KT4 ili 0KT8 liziranja, bie 0KT3+*Ako je 0K'T3+ podpopulacija bila 0KT4* i 0KT8*, tada bi liziranja sa bilo kojit* antitelom uklonilo OK.T} reaktivna tia»ocite. 1

Da bi se dalj« odredio odnos OKT3 reaktivna timocitae populacije „ ; · ' '* 'I I - prema drb^irt timocitnim funkcijama, koje su definisane kao monoklonalno telo (antitelo), timociti su tretirani sa OKT3 i komplementom i preostale čelije su zatim poredjene sa netro-tiranim pppulacijama timocita. lvao što je prikazano u tabeli 2B, 0KZ3 i komplement su uklonili 25% timocita. Ogim tofea, nije biloglavnog gubitka OKT4,OKT5,OKT6 ili 0KT8 reaktivnih populacija. Ovi nalazi sugerisu da je ogromna večina timocita koja nosi 0KT6 marker sadržana u 0KT3~ populaciji. Pored toga,oni dalje eugerišd da su timoeiti, koji simultano izražavaju antigene definisan,· sa 0KT4, OKT5, 0KT8, isto tako ograničeni na OKT}*" poipulaciju· ^akodje treba primetiti da 0KT9 reaktivna populacija timoeita nijs smanjena nakon tretiranja nefrakcionisanih timocita ea ,0KT3 i komplementom, čime se pokazuje da je OKT9* populacija uveliko o^raničena na 0KT3*" populeciju timocita· i. N a oanovu ovih rezultata, moguče je opisati stanja intratimičnov razvoja humanih timocita. *-ao što je prikazano na sl.2, praktično svi timociti nošo marker 0KT10. Pored toga, timociti u ranom stadijum ;stiču 0KT9 marker (Thyl odnosno Thyl2). Ovaj stupsnj definiše menji deo timocita i uračunava približno 10% nefrakr- . cionissno populacije. Nakon toga, humani timociti stiČu timocitni jedinetv«|n antigen koji je definisan sa 0KT6 i konkuretno izražavaju Q$j?4,OKT5 i 0KT8(Thyl4). Ova poslednja podpopulacija predstavlja večinu timocita i uračunava do oko 70-80% timično populacijo. ^aljim sazrevanjom timociti gube 0KT6 reaktivnost.stiču V 18. 0KT3 i (0KT1) reaktivnost, i izdvaja,ju se u podvrste QKT4+ i Ϊ OKT5+/OKT8+ (Thy7 i Thy8). Najzad, izgled* da dok se timocit ekspertuje u peroferni odeljak T čelije, on gubi OKT 10 , marker jor ovaj antigen ne poštoji kod praktično svih perifernih T limfocita, ^oguca polazna stanja izmedju" ova tri glavna stupnj timičnog razvoja su ozn ičena sa Thy3, Tby5 i Thy6 na el.2.

..·»·, v pošto se smatra da akutna limfoblastna leukemija Ί) vrste po od ^J^relih timocita, odredjen je odnos izmedju tumorskih čelija iz individua sa T-ALL i onih predloženih stanja intra-timične diferencijacije. tspitivano je 25 populacija tumosrkih čelija iz individua sa T-ALL i tri vrste čelija koje su remije proučevane sa uobičajeniqt reagensima Anti-T čelija i E rozeti-ranjem. Kao što je pokazano u tabeli 3, večina T-AJuL leukemisjki celija je bila reaktivna na samim 0ΚΦ10 ili 0KT9 i 0KT10, i nije reagovala sa drugim monoklonalnim antitelima. (tako je 15 ' od 35 proučevanih slučajeva pokazalo da ima rane ti^ocitne antigene (stupnj I). hasuprot tome, 5 od 25 ispitivanih slučajeva bilo je reaktivno prema 0KT6, što sugeriše izvodjenje iz zreli je timusne populaoije (stupanj II.) · Ova T-ALL grupa j.e sami sebi heterogena u odnosu na 0KT4,0KT8 i 0KT9 reaktivnost, kao što je pokazano ne tabeli 3· Relije iz 2 od 5 pacijenata i imaju največi deo uobičajenih timocitnih antigena uključujuči OKT4-, 0KT6 i 0KT8. Vredi pomenuti da 0KT5 nije prisutan kod bilo kojeg od ovih 5 tumora er stupnjem XX čak iako je pri-mecena 0KT8 reaktivnost. Ovaj poslednji rezultat jasno sugeriše da 0KT8 i 0KT5 definišu različite antigene ili različite determinante kod' istog antigena*-fla^zad 1 od 25 tumoret pacijenata dolazi od zrele populacije timocita (stupanj, ΙΙΧ) kao Što je defirtiaano njegovem reaktivnosšču sa ' 0KT3· Ovaj individualni tumor, pored toga,’bio je reaktivan . ; * 19* ea 0RT5, 0KT8 1 OKT10. od 25 «nallztranlh leukamičnih populi lacija, samo četlri turaora nizu mogla jamo davse kategorišu.

Tri au bila pozitivna ea OKT4 i 0KT8f ali niau iraali OKT3 i OKTC i najverovatnije au pretatavljali prelata od Thy4 1 Thy 7,8. Jedan od 25 alufiajeva i?gleda da ja bio prelat Od Thy3 do Thy4 pošto je poaedovao OKT8 i okt10 reaktivnost. T delijake linija it T-ALL tumornih populacija takodje au »· pratatavljale dalija it apecififinog stanja intratimuana difaranr cijacija. Kao što jo prikazano u Tablici 4, HSB ja bio reaktiven aa OKT9 i OKT10 laključivo i zato de definisati tumornu populaoiju izvedenu is Faza I. Haauprot, CEM ja bio reaktiven aa OKT4, OKT6, OKT8, OKT9 1 OKT10 izgloda da ja itveden it K timoolta Faze XX. Konadno, izgloda da MOLT-4 pretatavlja lauluuBifinu tranaformaciju u fazi lzmadju HSB-2 1 ςΧΜ pošto izražava οκτβ, οκτθ, OKT9 1 OKT10.

Pošto ja pokazano da pacijanti aa kaanijim fazama (n.pr., Fala XI) T dalija akutna limfoblaatna leukemije imaju duža preživija-Vanja od boleetl nago oni aa Fazom X ALL, koriščenja OKT6 anti-tela omoguduje zaključke u vazi aa prognotom datog paoijanta aa T^Šalijakim ALL.

Tablica 5 prikazuje odnoa izmedju nivoa perifernih T dalija i T dalijakih eubeetova raznih bolaanih stanja. Ovl odnosi mogu se koristiti za dljagnostidke avrhe (n.pr., za detekoiju akutne Infektivne mononukleoze) analizom uzorka krvi pojadinca aa kojeg aa odekuje da ima jedno od ovih bolaanih stanja da aa odrede nivol T dalija i aubaatova T dalija. Ovl odnosi

20 se taksije, mogu koristiti za terapeutske 9 vrha taao gdo je /;V uzrok bolesnog stanja povišen nivo podvrste 3? čelija (npr· tip I stečene aganaglobulinemije). Za terapeutske svrhe, daveiijf odgovarajučeg monoklonalnog antitela neko» pacijentu sa1; povi;i>«r šeni» pivoom podvrs te T čelija smanjuje ili eliminiše višek* i|i t Odnosi prikazani na tabelama 2-5 su dalji naši» na koji se 0KT6 entitelo može detektovati i razlikovati' od drugih antitela*

Druga monoklonalna antitela i hibridoiae ko j e ih.proizvode, a koji su dobiveni od strane ovih prijavioca (osnašene sa 0KT1, OKTjJ, 0KT4 i 0KT5) opisane su i zaštičene u sledečim SAD patentnim prijavama: SN 22 152, predata 2Q.marta 1979 gad., SN 53 639» predata 26 aprila 1979 god,; SN 33 669» predata 26.aprila 1979 god i SN ?6 642, predata 18.septembra 1979- go£· i SN 82 515, predata 9*oktobra 1979.god· Druge hibridome, koJe;: proizvode monoklonalno antitelo, a koJe su dobivene ed strane pyiv priJ.aviooa (označena kao 0KT8, 0KT9 i 0KT10) opisoma su i ' » zaštičene u SAD patentni» prijavama predetim istog dana kada je predata i ova prijava, a nazivaju se:

Hibridne celiJe za dobivanje monoklonalnog antitela (fiksira»eg na komplement) za humane suzbijajuče Φ 6elije, samo antitelo i metode njegove primene; V»net hibridne čelije za dobivanje monoklonalnog antitela za humani rani timocitni antigen, samo antitelo i metode njegove primene i Vrsta hibridne čelije za dobivanje monoklonalnog antitela za humani protimocitni antigen, samo antitelo i metode njegovo, primene· . * ‘ ' ·

Ove priajve su ovde date referencom ·

Prema ovom pro^alsku dati je hibridoma,koja je u :eta^j.u da proizvede antitelo protiv antigena nadjenog kod približno 70# normalnih humenih tiraocita, postupak za dobivanje ove hibridoma, monoklonalno antitelo protiv antigena nad3eno8 kod približno 7056 normalnih humanih timocita, poatupci za dobivanje ovog antitela! postupci 'i saeše za tretiranje (lečenje) ili dijagnozt: bolesti ili identifikaciju T čelije ili podklasa timocita uz primerni ovog antitela. * . I. . · . . ' Ί ' ·’ · ‘ ‘ . · ' ·-· ·'* }’v.." ·-..

KeaktlvnoPt aonoklonalnlh antItala kod huecnlh llmfoldnlh populacija * ·/ • · » I * .. -I -i . A'?i • ΓΚ :A ,·*·*. /./ir** , l' ?. t ;-i : aonoklonaluo «e**Wg_ periferna irv (M* koltana Hl-iŽi ltauy (Ž2) sl £l ) 0ΧΤ6 0 % 0% 0 % 70 % οκτβ 50 % 0 % /. 2 ‘A HO % 0ΧΤ9 0 % c % 0 ji <10 % 0KT19 5 * 10 % ^20 > 95 * t * B roj »vi a *&grada;aa predatavljaju broj iepittvanih uaoraka* prooantne vrednosti oanadavaju 'erednj· vrednoati. *, ·< . ·

••t v Λ .i'1 O g 04 I I > w* n t*· λ vo c\ xi cp 4»? O * 1 ’Ί.

JS rt . J3 -*S o ., * ,’β r> rt s *'> t I i

ίϋ Ί) 1Λ W H 2 fii 9>rt xs s o 0 s. o ?! 0 13 σ' ιΛ ιΛ u O C— ΙΛ Cn 8 H •H 1g fl Λ »4 1 VI 0 «41 Ή 4> § H 58 2

H 0 •O

S i|8

O O O

US O O CM P rs 00 ιΛ θ' θ' θ'

ΙΛ O K' N Ό rt H 0Q

rt O« nS O ift O O P c- oo o5 rt ιλ o if' a f- Φ Φ & a s °

0 d rt d « 0 n O X aJ •n

0 O 9 rt,s 3 H B A£ «a Ό o Λ vrv vf O rt

0 « rt ♦*. S’rt 0 B

M rt rt OS 0 * « s s M «S. p XI H rt ΛδI? Ρ»Ό 33 s H * <•0 vo Ό vO \O Ό O O O v> O Q rt rt rt rt rt rt K X M H M X CM CM * * . $.3- Λ 3 ΙΛ «Λ . rt CM os rt S'd m& a)3 so00

A (M «a β) *n « «4 0«sl 0 E»rt 0 rt Vi i-4 &A-4 ·> * O t> ♦ ♦

H

•0* V* M O

8S «ji o o •f» rt

rt o o o d5 * * ♦· 3 5 S BS 3 8 S •r* rt V<art3. 9 —t 0d o »o 9 rt 4> a: M rt O rt4 8 n rt « +» a: rt ♦» • a rt « m «3 8 s n •rt 3 O 0 g rt O >»§ j* 3rt M^ s 8*&s3 o ♦ 33. ) V- , c··': m

Vyi Ή •J.n.ΐ<. \ . ii J i \:

CD

'J 3 t~» *"4 > «i- 'f I < + + I ♦

+> SO SC a

E 11(1

μ o u} · *) © Λ «4 J« O C o u S ί S -3I g, * *» 0 S «·.. • ors j:> λ , *fc, « M ►>

-I .3 V'1.

4» •3s «i 4f o o H y( +» a o •r» 15 0 ja ·*» o e a 7 7 »rv «* M· ·* 3 ►»>>*>> 4*s & e s a a *» 3 n * p «*< M O H ^ Ή 4*

Pobitima (♦) r©aktirno*t j· daiiniaana kao ^ 50 5* epeclfldn* fluoreecen-cije i*naa osnom· kontrolna ^pr©b#t dčkja »•gatiTn» raaktimoat neaogtiSe^raal J kovati od oanomog (icnekog) otrojanjjfc kod knapenzi ja tura o rakih čeli ja. · f τ* " . * - Λ it .V' 1 S ^ ' · -'7 -I/ ....

.1.: ftaa,Rtlvno»t «a valeta 6»lija (HžpS~2 CEf* M01T-4 vV, ·

QUL QEli\!g&· ESS ♦ . . .t ,, : ·ι. Λ JR'

> *f,r * Kriteriju® *a r^e^a , ru -) ilJ j>e»iti<mu (*) jreefctiifnaEt bio Je iatl Kao u ,0 .el.' *. i

1 · . «'V·' Τ*ί 'MT; ' j. f,· 'Λ', ί vr v '· / ‘v : iV^·· / r' ' . * *,* *

*·.'· * ·.· a* p; " ' ·: ’ W • .· > ' *»v‘ Μίϋύί. ήτοι pyrtfwnlh »>*m* vi ;- fAY9li ff. boleeno «tanje βίΙ2* 0W+ 0KT6 primarna iučna oiroaa (2) V N ♦ «v 1 «ultipla eklaroza (napred. bolest) (&) - N - .^yaatenia G ra vi e (rano lečeaa) (3) 0 0 i ' 0 0 C akutni preaad prema domačinu (3) Odo - ·» 0 * . # otečena agaaaglo-bulineutij« tip 1 ♦ tip I 0 biper Igk (4) - N c do - 0 do - - akutna iniekciona mononukleoaa (4)* ♦ 0 do -- ♦ ♦ «·« 0 iiodkina-ova boleet etanja I A II N w N N 0 etanja III Λ IV m · 'N N N 0 peorljazu (3/3) N ♦ do ♦♦ N Ti 0 N - unutar normalnih granica «·♦ · uvellko ienad normalno# 0 ** odeutno - * iepod normalnog ♦ - iznad noruialnog -- <* uveliko iepod normalno# # Ovi niaoi 8· vračaju na normalna nadelju dana pr« neatajenja kliničkih simptoma.

Brojevl u «ogradam* pokaauju broj ruziiatranih paoijenata. 'V. I i "> 'V* · . :;'ψ^νΐ'*. ^:.¾‘>V “ "H;v^^H·. ΐ*\·· ,Γ:'#Η>· : "<' ·’\,. * ( .! ,'<; 11>'.. ·" · J • · » . , 1 ί ^ · Λ ''. ,’; ·*> v· ‘ V ν*·. : ••U ;·’, ’ ·* ! ’jA.« i: lake je opisAna samo jedna, hibridoma koja prfizvodi' jndtoe moneklonalmo antitelo prat£v humaneg timocitueg antigena, ;*amera je da ovaj pronalazak obuhVati sva mo»pkXo;aalnA ant it el a koja pokezuju gore opisane karekter^t-^j(i^edie^^.i predmetno antitelo OKT6 pripada .podkla^i četiri podklese mišjeg IgG. Ive podklaile imu^g elbbUl^na P razlikuju se jedna od druge u iako dat.antitelo za specifični antigen ima^iA^ak9aVani;‘”pr9- ./4¾ 'S * :*' ‘ ' M' ’ ·* · v ... ^ ·· \ » · menljiv" regiom koji je funkcionalno identičen bez obzira na činjehicu ko jo j podjlasi imunog globulina G pripada*!©· zna&L, ':X mcaoklonalne šiiti tel o, ko j e pokazuje karaktejris.tiku, Vkp ja je ©vdovopisana, može biti podklaap IgQlf^ga»^^]^l^i5^ v - · ili5klaea lt?» IgA ili drugih poznatih' Ig klajpa.'BazliSe izmedju ovih klasa ili podklasa nede uticati ne selektivnost reakdonog toka antitela, ali mogu uticati na dal ju reakciju antitela sa drugim materijama, ako Što je npr· moaplpabnt ili i ’' * *, * ’ bjo$iHDišje aatitela· Iako je predmetno antitelo eppcifiČno IgG,, smatra se da antitela,koja imaju ovde ilustrovaU tok reaktivnosti, spadaju u opseg ovog pronalaska, bez\obzira na to kojoj kldsi i]i podklasi imuncg globulina pripadaju· :ί·? i · r i U ovaj pronalazak su dalje uključeni postupci za dobivanje gore opisanih monoklonalnih antitela uz koriščenje sove ilustovant tehnike hibridoma. Iako je ovde dat .samo jedan primer hibridoma, smatra se da stručnja verziren u ovoj oblasti; može pretiti imunizaciju, fpziju i postupke sele^cije,^o^i. eu! ovde ^latl, i dobijo iruge vibridome ko j e mogu pro^veeti-^ntit ela^, kojav. 1 · ·. 4 ’* > «v' e ’ ima ju gore opisane karakteristike reaktivnosti. Pošte ihdividpalpt Ί » ' identif:'kovana, osim upudivenjem na antitelo, proizvedeno ed . ·' » 4 strane ove hibridorne, smatra se da su sva hibridoma, koje proi- ‘ zvode antitelo se gore opisanim karakteristikama, uklju&ene u opseg ovog pronalaska, kao i postupoi za dobivanje ovog antir-.,vi ‘ tela, uz koristenje pomenute hhibridome. hibridoma, koja je dobivena iz poznate vrstne mišje’mielomske * 1 · *» κ.·4Ι> ^ ’ ·. celijo i delija slezine iz poznate vrste m^sa daije ne, može biti’ -halji aspekti ovog pronalaska su metode lečenja ili dijagnozeV ;.t'; bolesti koje koriate monoklonalno antitelo 0KT6 ili neko drugo monoklonalno antitelo, koje pokazuje gore dat mehanizam reaktivnosti. Predmetno antitelo se može koristiti da se .detekiuji* j proučavaju intratimične diferencijacije kao što je eumirane na slioi 2« Nenormalnosti u stupnju III diferncijacije indi-oiraju se odstupanjem od oko ?0$ 0KT6+ timocita. Osim toga, predmetno antitelo može se koristiti za dijagnozu bolesnih stanja kao što je pokazano na tabeli ϊ>. Ova tehnik· se megli < koristiti uz primenu samog 0KT6 antitela ili u kombinaciji sa drugim antitelima (npr. 0KT6 -OKTIO). Mehanizmi reaktivnosti sa panelom antitela za T celi j e i podvrste T čelija omogučuje precizniju detekciju nekih bolesnih stanja nego što je to bile mogu&e primenom ranijih metoda dijagnoze. ^ečenje bolesnih stanja (npr. malignih stanja kae što je stupanj 11 ALL), koja se manifestuju kao višak QKT6+ 6alija može se vršiti davanjem terapeutski efikasne količine 0KT6 antitela individui kojoj treba ovako lečenje. Selektivno« reakcijem sa 0KT6+ antigenom, efikasna količina 0KT6 antitela .če sniziti višak 0KT6+ čelija, cime se popravijaju (poboljšavaju) efekti ovog viška, tj ovaj pronelazak eu uključene i dijagnestičke i terapeutske smeše, koje eadrže efiknene količimo 0KT6 antitela u smeši sa dijagnostički odnosno farmaoeutski prihvatljivim nosačem.

' .., . ι^ουοο/ηυ ,·' - ---/- '.V /· 4-V * !·.·. • i . . · - . j , -.V , , 1 , ' .·, ·>,-j^ NAVOO 0 NAJBOLJEM,PODNO$IpCU PRIJAVE ΐ' P02NAT0M.NAČINU PRI VREDNEUPOTREBE ·*' PRONALASKA V ’ : , i •i/ A. Imuni zeci JSLi.. hi m»tdizat.i ja soma takih čejija Ženka CAF^ miševa (jackeon Laboratories, etape 6*8 nedelja) su imunizirane intraperitonalno aa 2x 10^ humanih timocit« ti 0,2 ml fosfataog slanog puferisanog rastvor« μ dvonedeljnif . iatorvulima. vetiri dana nakon troče imunizacije, iz aiiševa od«tx*anJene slezine i napravljena je prosta čelisjka suspenz j-j* preeovanjem tkiva kroz sito od nerdjnjučeg Čelika«

Fuzija celi ja izvršena je '«roma poetupku Kohler-a i Mileteia-a:* 1x10® splauocita je fuzioniaano u 0,i>ml fuaion« sredin« koJa sadrži. 55* poletilenglikola (PEG 1000) i 5# dimetilsulfoksida' u HPMI 1040 sredini (Giboo, Grnad laland, NY) ea 2x 10^ p$x6^Ag8UI nielamskih celija dobivenih ed firme Dr«M« Scharff, Albert Einstein College of ‘‘edicinti, oron*, NY. Ove mielomake Relije luče IgG^ k lake lance. B. Oelekoija i razvoj hibridoma

Posle izvršene fuzije celija. Čeli je su kultivisane u HAT tre dini (hipoksantin,arainoptei*in i tiraldin) na J7°C ea 5#-aim COg uvlažnoj atmosferi. Nekoliko nedelja kasnije, 4Ό do 100^,ul auperoataatne tečnosti iz kulture, ko.ja sadrži, hibridom«, dodato je loptiči od 10® perifernih limfocita izdvojenih u •fc . * £ rozeta« pozitivne (K) i t rozentne negativne (E ) populacije, koje su napravljene iz krvi zdravih humanih davalaea kao Što je opisao Nande« ( J.lmmunol. 111 „ 660 (1975))· detekcija mišjih hibrfdomnih materjala, vezanih za i>ve čelije, odredjena je indirektnpm imunofluroecenpijom. ^elije inkubirane s« euperntfltntiea kulture obojene su fluoreecentnim koza-aati-aiš Igd (0/M FIDO) (h Meloy Lpboratories, Springfield,VA^ F/p «2*5) i fluorescentnin antitelom prevučene čelije au žetim analizirane »n citoflnprogrefu FC2Q0/n8Q0A (Ortho Instruments, WeatvoddfMn) Aa® što je to »pisano u primeru 111. Kulture hibridoma koje «a^Že antiteza koja reaguju specifično sa E* limfociti*« < <’ Λ). . η '* «·. LVj**» ί.· . ·. ( ' v ,. •Λ : .· ' : Γ .It ·; f ';V. ι» *θ -I 1 "Ι!· -¾ι (Τ dalija) i/ili timociti mu .^elekcioniaani i klomiiOAidva ..pata priaenoa metoda OKraničavnuIn razblaianja u^riauntvu . fcrjuiilačkihdali.la. N ekon toga eu ek s t r oklji ^enadani ppri tonalno da vanje« injakoija od lx 10^ talija da^og atatrai$j|^^ (0.2 ml) u CAF, mifceve pramirane sr 2t6>10A#-rtet.T,aaitll'- ·'* k . ^ " · * *V‘ ι V* S[Vp«tadakano» <kodi. firma Aldvipd ChaaiealjOfQjtyA|igr· prodaj ·ν^ί§? Ptietima). .. ^ f; >atim upotre^ldoni d« ea ok&raktarišu limfeo^fciy/kao iio tJa v]A| m· opiaano u, primeru 2. Standardnim telmiktnA^·. $>olfcpi a»o ' | ^,fJ>,,prad°minantno hibridno, antitalo ΟΚΦ6 podk^aga IgG^, ;:Αϊ· M*.*..· . * ' k 17t *· ·ι'··«^* M ·* · *..*.'··· i/'. ’ Z λ"·; v , 1*·· **. •n**- . Γ·* f» ' Vi *' .Iv*/ * ···' .'· ti ; / i ORTHO PHARMACEMTICAL CORPORATION i SAD *.!'·, S . V Zastupnik: t'y, • l . ·

v* . < ‘ . » *

J tl

,. · *.«‘ί· l! ι'··.·. Λ < » .·"· •-..v

'··*> iV>ίϊ&4·2?’.: ,·“ !|8>W:· irV.®r$lir*5 ,lgv: ·’(. A.

Claims (1)

1. I" v ♦. I , ‘ ti'v latentni zahtev (¾ Po9tup.«k zb dobivanje monoklonalnog antika ΟΚ3Φ,;£ ;' < / klase IgG,p9dklase IgGl kpje reaguje sa normalnim humanim tiaocitom ali no reaguje sa normalnim humanim perifernim T celi jama, B dalijama, nultim celijama Hj, dalijama fcoštane erži, ku^i Vitanjem hibridoma na podloži ko ja 8ad.r£± hippkaantin, aminopterin i timidin u*vijažnoj atmosferi, ",.ψ^ # 'a,at-^e a. ,t im e, jBto se kul ti vida hibridoma ATCC Ofil«,, 8020 na temperaturi od 37eo u atmosferi sa 396 ugljendiok^f ^«ISJk· ·»' f’ » nedelja, 'i. tatim se iz«gerajeg sloja tednoi^lkhl^^^i^va^m../ pomenuto antitelo. . . , ! bk. * 1 . · » ·.*»·· -¾ V ':V ’ M ORTHO PHARMACEUTICAL ΟΟΒΒΟΕΑΦΙΟΝ, SAD i i « · · · s - · -j DRA BEOGRA Zastupnik:

   KAT VRfSTlC Lazara 7 p V . '.y . •j * •' > · * • »»n •i ' 4,i * .: s i * .4· Iv ···'<

   Apatrakt pronalaska ‘ ’ · < U prijavi je dat postupaJc za dobivanje monoklonalnag antitela ,ty 0KT6, klase IgG ,podkl ase IgGl ko je reaguje sanorm^lnim humani1 . **# v· tiraocitom ali ne reaguje e a normalnim humapia» perifernim T ; ialijamai B folijama, nultim delijama ili dalijama koštane srŽi, ✓kultivišanjem hibridoma na podloži koja sadrži hipoksantin, t- v . 1 k r i r 1 ·1'/'φ ' amincpterin i tiraidin u vlažnoj atosferi^/Foatupak·obuhvalja kpltiviaanje hibridoma ATCO CRL 8020 na temperaturi od u u. vlažnoj atmosferi sa 51 ugljen dioksida ttokom nekoliko nedelja, foale. ονοβ iz gornjog sloja točnosti kulture izda vaj a aepoaenute antitelo· ;··, 7 , V1 1 1 1 , < ^ . .·’ 1 1r’ Ί · i::v .. t'4 : . . c i1‘.e , r ’ · • ί «ι:·'ν1'1. “ j · μ --j?:· ·· Λ , i V’ ·»' ‘w:; . » fj S v;· l • . > i v‘ 1 I ’· ‘ / ' *:· v . ^ 4·/ 1 , · / X • 1 , I1 a1 ?; · v 1'