JPH07501795A

JPH07501795A - 活性化血小板表面に発現する活性化依存タンパク質とその抗体

Info

Publication number: JPH07501795A
Application number: JP5507000A
Authority: JP
Inventors: リード，ギー・エル; マツエダ，ゲイリー・アール
Original assignee: ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
Priority date: 1991-10-01
Filing date: 1992-10-01
Publication date: 1995-02-23
Also published as: WO1993007174A1; EP0673391A1; CA2120622A1; EP0673391A4; US5773228A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】活性化血小板表面に発現する活性化依存タンパク質とその抗体発明の政府の権利に対する声明本発明の開発途上になされた研究実験の一部はアメリカ合衆国基金を用いて行われた。よって、アメリカ合衆国は本発明に権利を有するものである。

関連出願の前後参照本発明は１９９２年１０月１日で出願され、現在出願中であるＵ、Ｓ、出願第０７／７６８，０４３号の部分継続出願である。

産業上の利用分野本発明は心筋梗塞、深部静脈瘤、肺塞栓症、脳血栓、その他患者におこるいかなる塞栓症状の診断および治療に関する。

発明の背景技術血小板は休止状態あるいは活性化状態で血中を循環する無核細胞である。血小板は血管損傷に伴う出血を最初に阻止する止血の形成に関与する。刺激と脱顆粒化により、活性化血小板は生長トロンビンに活性化されるか、または血流から速やかに除かれる。生長トロンビン形成中に、血小板は血小板粘着と言われる工程における内皮下マトリックスに接触しその上に広がる。かくして生成した粘着した血小板層は止血の基礎となる。

血小板の活性化、分泌および凝集に関するメカニズムについてはますます理解されてきている。しかしながら、これらの工程に伴う、あるいは媒介する血小板膜に対する分子変化に関する確実なデータは依然として少ない。活性化血小板の表面に選択的に発現するタンパク質、あるいは血小板活性化中に機能的に変化するタンパク質の同定および定性により、これらの工程に関与する各反応を明確にする。しかしながら、血小板活性化に伴う血小板膜上の変化は部分的には同定されている。安定な血小板粘着のためには、血小板膜糖タンパク質１ｂ／ＩＸ複合体と内皮下マトリックスに存在するマルチマータンパク質フォンビレブランド因子との相互反応が必要である。

活性化血小板の表面に特異的に発現するとみなされているタンパク質を同定するためにモノクローナル抗体が用いられている（ツーリンら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９：９１２１−９１２６（１９８４）　；マックエバーとマーチン、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９：９７９９−９８０４（１９８４）：ニューペンハウスら、Ｂｌｏｏｄ　７０：８３８−８４５（１９８７）　：グラルニックら、Ｂｌｏｏｋ　７６（Ｓｕｐｐｌｅ、　Ｉ）　：４５７＾（１９９０）　：ヘイヮードら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　２６６：７１１４ −７１２０（１９９P））。これらのタンパク質のうち最も良好に特性化されているＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ、ＣＤ６２）もまた、活性化内皮上細胞の表面上に明確に発現する（ジョンソンら、Ｃｅ１ｌ　５６：１０３３−１０４４（１９８９））　、　ＧＭＰ−１４０ｃ　ＤＮＡ配列の分析により、該タンパク質カルクチン様細胞粘着分子の一つのファミリーに属することが示唆される（ジョンソンら、Ｃｅ１ｌ　５６：１０３３−１０４４（１９８９））　。ＧＭ　Ｐ−１４０もまた、活性化血小板と好中球または単球との間の相互反応に関与することは明らかである（ラーセンら、Ｃｅ１１５９：３０５−３１２（１９８９））、このように、血小板内の細胞性、活性化依存抗体の同定により、他の細胞例えばリンパ球、内皮細胞、好中球、単球での活性化中に発生する変化が解明される。これらの抗原の同定により、異なる細胞間あるいは細胞と特殊な機能的リガンド間の活性化依存相互反応が明確にされる。

活性化血小板表面上に特異的に発現する他の抗原の同定により、血小板活性化中におこる分子変化、特に血小板を休止細胞から完全粘着血小板に変化させるのに関与する分子変化がいくらか明確にされる。多分、血小板表面タンパク質の研究により得られる情報の最良の例としては、糖タンパク質１１ｂ／ｌ１ｌａに対する研究がある。特異なりガントとモノクローナル抗体を用いたＧＰＩｌｂ／１１１ａ糖タンパク質の研究により、ＧＰＩｌｂ／１ｌｌａ複合体に起こる分子再配列を、構造、密度など、血小板凝集を媒介する完全に応答能力のある”受容体” に転換するのに必要な点に関して明確にされ始めている（ヘネット、Ｊ、Ｓ、　、　Ｓｅｗｉｎ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　２７：１８６−２０４（１９９０））、これらの研究は血小板凝集のメカニズムの我々の理解を有意に支持するけれども、他の血小板反応に対する我々の理解は依然不完全なものである。

多くの心筋梗塞（心臓発作）の最初の出来事は、動脈硬化プラークへの出血である。そのような出血はしばしば梗塞部位（つまり血流障害から生じる凝固壊死の部分）を作る冠動脈に血栓（あるいは血餅）を形成する。この血栓はフィブリンと血小板でできている。トロンビン−血餅の形成は重大な臨床的結果をまねく。

フィブリン−血餅により生じる閉塞の程度と期間は梗塞部位の広さと損傷程度を決定する。

心筋梗塞の現在の治療方法の第一のゴールは、閉塞血栓の速やかな溶解と血流の回復（再潅流）である。成功する治療は持続した効果を示すことにあり、投薬中止後も血餅が再生成されないことである。フィブリン−血餅が再形成することができるなら、冒された動脈が再び閉塞し得る。

血栓溶解剤も用いた治療はしばしば冠動脈血流を心筋梗塞を阻止するのに十分に迅速に回復させる。しかしながら、不幸なことに、溶解したフィブリン−血餅はそのような血栓溶解剤での治療中止後多くの患者に再形成されることが知られている。この再形成は冒された血管の再閉塞をおこし、そのため重大な問題とされている。

血栓溶解剤はフィブリン−血小板性血栓を溶解し、そのため血液が冒された血管から再び流出するのを阻止する薬剤である。そのような薬剤として、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、および組織型プラスミノーゲンアクチベーターなどがある（例えば、ガングら、Ｊ、＾ｍｅｒ、　Ｃｏ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、　１　：１２４７−１２５３（１９８３）　；レントロツブら、Ａａａｅｒ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　５４　：２９Ｅ−３１Ｅ（１９８４）　；およびゴールドら、＾ｍｅｒ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　５３：１２２Ｃ −１２５Ｃ（１９８４））。

血餅溶解はプラスミンＶＶに媒介される。自然な条件下では、プラスミノーゲンは組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）によりプラスミンに転換される。活性化はフィブリン表面で起こり、蛋白分解活性を適当な部位に制限する。プラスミンは循環系に遊離された後、天然阻害剤と急速に結合する。プラスミンの活性化は、望ましくない蛋白分解を阻止する工程における最終的かつ必須の工程である。そのようなプラスミン阻害剤としては、α−アンチプラスミン、α −２マイクログロブリンおよびα−１アンチトリプシンなどすべての糖タンパク質がある。α−２アンチプラスミンはα−２マイクログロブリンよりプラスミンに体に対してずっと高い親和性を示し、特異的に１＝１の割合でプラスミンと結合する。したがって、ｔ−ＰＡ投与による血餅溶解はプラスミン阻害剤により急速でかつ取り消せない不活性化より限定される。

すべての市販の血栓溶解剤は依然重大な欠点があり、たとえば治療効果のために大きな投与量の必要性、制限されたフィブリン−特異性、出血合併症などの残留毒性などである。冠静脈障害は依然無適合の主な原因である。すべての現在の薬剤は治療の間あるいは治療中止後血管の血栓再閉塞を伴っている。したがって、単独で使用でき、あるいは既知の治療薬と一緒に使用できる追加の薬剤がめられている。血餅溶解を促進し、または血栓溶解剤を血餅に命中させる血栓溶解治療における改善がめられている。

関連技術血小板膜タンパク質の分子生化学はＳｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２７：１８６−２０４（１９９０）に示されている。ツーリンら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９：９１２１−９１２６（１９８６）には血小板活性化と分泌中には発現する血小板膜タンパク質を開示している。血小板タンパク質を開示している他の参考文献は、サベージら、Ｂｌｏｏｄ　７４：１００７ −１０１４（１９８９）　；ヘイワード、　Ｂｌｏｏｄ　７６（ｓｕｐ吐１）：４５８＾（１９９０）　；グラルニソクら、Ｂｌｏｏｄ　７６（ｓｕｐ吐工）、４５７＾（１９９０）　：およびラーセンら、Ｃｅ１ｌ　５９：３０５−３１２（１９８９）などである。ＧＭＰ−１４０のクローニングはンヨンソンら、Ｃｅ１１５６：１０３３−１０４４（１９８９）に開示されている。

発明の概要本発明はトロンビン活性化血小板タンパク質（ＴＡ　Ｐ　Ｐ）およびその使用を目的とする。２つのそのようなタンパク質が本発明で供される。ＴＡＰＰ−１およびＴＡＰＰ−２である。タンパク質は選択的にトロンビン活性化血小板の表面上に発現する。本発明の他の目的は、トロンビン活性化血小板タンパク質に特異的に結合する抗体である。これらの組成物は、活性化血小板、血餅、心筋梗塞、深部静脈瘤、肺塞栓症、脳血栓、播種住血管内凝固症、あるいは他の血栓症の診断および治療にインビトロおよびインビボいづれでも利用できる。

図面の簡単な説明第１図は、ＭＡｂ　８Ｂ６　Ｆａｂの休止およびトロンビン活性化ヒト血小板への比較結合を示す。貯蔵ヒト血小板を血漿からゲルクロマトグラフィー（溶媒ニ一部修正チロード緩衝液（カルシウムとマグネシウムを除いた））で分離し、計数した。計数後、血小板を分け、一方の血小板にトロンビン（０，１５Ｕ／ｍｌ）とカルシウム（４ｍＭ）を加えて凝固させた。トロンビン活性化あるいは休止血小板をカルシウムとマグネシウムを含んだ、あるいはＥＤＴＡを含んだ一部修正したチロード緩衝液、２００μｌに希釈した。放射性ヨウ素標識ＭＡｂ　８Ｂ６　Ｆａｂ２０μｌ　（１８０，０００ｃｐｍ）を各試験官に加えて、室温で１時間インキュベートした。対応する一部修正チロード緩衝液３ｍｌで洗浄後、遠心分離し、吸引して、結合した抗体をガンマシンチレーションカウンターで測定した。

第２図は、ＭＡｂ　８Ｂ６　Ｆａｂのトロンビン活性化および休止血小板への飽和結合実験の結果を示す。貯蔵したトロンビン活性化ヒト血小板（５Ｘ１０’）を放射性標識したＭＡｂ　８Ｂ６　Ｆａｂ　（０，７ｎＭ）と、種々の量の冷ＭＡｂ　８Ｂ６　Ｆａｂ　（ｉｎＭ　〜０．９μＭ）と室温で３０分間インキュベートした。冷たい一部修正チロード緩衝液で洗浄し遠心分離後、結合した抗体量をガンマシンチレーションカウンターにて測定した。挿入は、特異的に結合した抗体量を加えた抗体総量の関数として示している。リガンドプログラムで測定した時の結合データのスキャソチャード変換を生グラフに示す。８Ｂ６　Ｆａｂ　はＫｄ５、Ｏ２Ｘ１０−８Ｍで単一クラスの受容体（血小板当たり１２，０００ ±）に結合した。

第３図はＩ”ｌ−ＭＡｂ　１２Ａ７の休止およびトロンビン活性化血小板への比較結合を示す。血小板は血漿からゲルクロマトグラフィーで分離し、計数した。

血小板を分け、一方の血小板をトロンビンで活性化した。トロンビン活性化血小板（５Ｘ　１０’細胞）と休止血小板（３，６Ｘ１０〜細胞）を”１−ＭＡｂ　１２Ａ７と室温で４５分間インキュベートした。非特異的結合は非放射性ＭＡｂ１２Ａ７のモル過剰量（＞１００倍）を阻害剤として添加し計算した。対応する一部修正チロード緩衝液（２価カチオンを存在下あるいは非存在下）２ｍｌで洗浄後、非結合抗体を遠心分離と吸引で除いた。結合した抗体を、血小板ペレットをガンマシンチレーションカウンターで測定することにより検出した。２重観察による平均値およびＳＥを示す。

第４図は、異なる作動薬にて刺激された血小板上に発現したＴＡＰＰ−２を示す。血小板を種々の作動薬と、Ｃａ”あるいはＥＤＴＡの存在下または非存在下インキュベートし、ついでバラホルムアミドで固定した。固定した血小板を洗浄し、”’Ｔ−ＭＡｂ　１２Ａ７　（５０，０００ｃｐｍ）と、非特異的結合を測定するための阻害剤として添加した非標識ＭＡｔ＋　１２Ａ７　（０，５μｇ）の存在下または非存在下でインキュベートした。４５分後、血小板試料を再び洗浄し、遠心分離し、吸引した。血小板ペレットを計数して結合したＭＡｂ　１２Ａ７量を決定した。３重観察の平均値およびＳＥＭを示す。

第５図は、ＭＡｂ　１２Ａ７のトロンビン活性化および休止血小板への飽和結合実験の結果を示す。貯蔵したトロンビン活性化血小板（５Ｘ　１０’細胞）あるいは休止血小板（１，２９Ｘ１０’細胞）を１２５１−ＭＡｂ　１２Ａ７と４５分間室温でインキュベートした。冷たい一部修正チロード緩衝液で洗浄し、遠心分離後、結合した抗体量をガンマシンチレーションカウンターで測定した。リガンドプログラムで測定した時の結合データのスキャッチャード変換を示す。ＭＡｂ１２Ａ７は活性化血小板あたり１４．２００±１１００コピー（ｒ＝０．９５）と休止血小板あたり２９０±３０コピー（ｒ＝０．９０）で単一クラスの分子と結合した。

発明の詳細な説明本発明はトロンビン活性化血小板を提供するものである。タンパク質は選択的にトロンビン活性化血小板表面に発現する。タンパク質は血小板の活性化、粘着、凝集の工程に関与する各反応を明確にするのに有用である。

本発明はそのようなトロンビン活性化血小板タンパク質２つ、ＴＡＰＰ−１およびＴＡＰＰ−２を開示する。ＴＡＰＰ−１は約２５０キロダルトン（ｋ　ｄ）の分子量が特徴である。精製したタンパク質のＮ末端配列により、アミノ酸配列は他の既知タンパク質と比較してユニークであることが判明した。アミノ酸配列の残りは本分野既知の技術により決定できる。つまり、タンパク質に対する抗体はタンパク質を単離するために有用であり、タンパク質は標準技術により配列できる。

ＴＡＰＰ−２は熱変性および非変性ゲル両者で測定して、約１２０ｋｄの分子量が特徴である。

ＴＡＰＰ−１はモノクローナル抗体８Ｂ６の結合特異性を一部分もつ抗体又はモノクローナル抗体により特異的に結合される。ＴＡＰＰ−２はモノクローナル抗体１２Ａ７の結合特異性を部分的に有する抗体又はモノクローナル抗体により結合される。これらのモノクローナル抗体は共に、トロンビン活性化血小板で免疫して調製した。血小板特異的抗体を産生ずるハイブリドーマはラジオイムノアッセイにて同定した。次いて、特異的に活性化血小板に結合するこれらの抗体を選択する。続いて、モノクローナル抗体をＴＡＰＲ−１に対して生成させ、ＭＡｂ８Ｂ６−親和性クロマトグラフィーを用いて親和性的に精製した。ＴＡＰＰ−２はＭＡｂｌ、２Ａ７−親和性クロマトグラフィーを用いて親和性的に精製した。

免疫学の一般的原理を示す標準的関連研究としては、フレイン、Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｈｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ−Ｎｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、ジョン　ウィリー　アンドサンズ、ニューヨーク（１９８２）；ケネスら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、プレナン　プレス、ニューヨーク（１９８０）；キャンベル、＾、、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ″、　Ｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１３．バートン逡■A エルスビャー、アムステルダム（１９８４）　：およびアイゼン、　Ｈ，Ｎ、　：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３ｒｄｅｄ、、ディビスら編、ハーバ−アンド　ロー、フィラデルフィア（１９８０）らである。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体両者共本発明に用いられる。本発明の特別重要な点として、ヒトに生成されるあるいは組換または他の技術で擬人化（つまり、ヒトでは非免疫性）された抗体とその機能的誘導体がある。擬人化された抗体は例えば、抗体の免疫原性部分を対応する、しかし非免疫原性部分（っまりキメラ抗体）で置き換えて生成される。ロビンスら、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９号ニアキラら、欧州特許公開第１８４，１８７号、タニグチ１Ｍ、ら、欧州特許公開第１７１，４９６号；モリソンら、欧州特許公開第１７３．４９４：ニュバーガー、国際特許公開筒ＷＯ３６１０１５３３；カギリーら、欧州特許出願筒１２５．０２３；バッターら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；リュウら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８４：３４３９−３４４３（１９８７）　；リュウら、Ｊ、　Ｉ高■ ｕｎｏｌ、　１３９：３５２１−３５２６（１９６８７）　；サンら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４　：２P４−２１８（１９８７）、ミンムラら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７：９９９−１００５（１９８７）　：ウッドら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６−４４９（１９８５）　；およびショーら、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　８０：１５５３−１５５９（１９８ｇ）ら参照のこと。擬人化されたキメラ抗体の一般的参照文献として、モリソン、　Ｓ、Ｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７（１９８５）とオオイら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９８６）がある。

上述のように、本発明の抗体分子はモノクローナル抗体およびそのフラグメントの両方を含む。ある状況では、そのような抗体のＦａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ（ａｂ） ’２あるいはＦｖフラグメントを免疫グロブリンのＦｃ部分により起こるいかなる免疫学的反応を最小にするために用いた方が良い場合がある。

本発明の他の目的は、ここで述べるトロンビン活性化血小板タンパク質の遺伝子にある。この遺伝子領域はプロモーター、コードする配列、翻訳されない配列、およびターミネータ−領域を含む。タンパク質のアミノ酸配列の一部が一旦判明すれば、ＤＮＡライブラリーにおいて対応する遺伝子をハイブリッド形成できるＤＮＡプローブを構築する方法は可能である。トロンビン活性化血小板タンパク質をコードする遺伝子を単離するために、ＤＮＡプローブ配列はタンパク質のＮ末端アミノ酸配列から構築できる。ＤＮＡプローブの構築と遺伝子のクローニングの方法は、この分野で一般的である。同様に、ＴＡＰＰ　（ＴＡＰＰ−１およびＴＡＰＰ−２を含む）をコードするＤＮＡ配列は発現ライブラリーで組換えタンパク質を検出する抗体を用いて同定できる。たとえば、サムロックら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄ、、　１〜３巻、コールドスプリング　ハーバ−、ラボレイトリー　ブレス（１９８９）などがある。

本発明のタンパク質はトロンビン活性化血小板の表面に選択的に発現し、休止血小板上には発現しないので、タンパク質と選択的にそれに結合する抗体は活性化血小板の存在を検知するのに有用である。つまり、ＴＡＰＰの存在を検知することにより、患者内の血餅の存在を検知できる。こうして、本発明の抗体またはそのフラグメントは特にイムノアッセイに有用である。パラブリ力ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６：ｌ０３６−１０４［１（１９８９）を参照のこと。

抗体およびそのフラグメントは種々の標識および標識方法を用いて標識できる。

本発明に使用できる標識の例としては、特に限定はされないが、酵素標識、放射性同位体標識、非放射能同位体標識、蛍光標識、毒素標識、およびケミルミネッセンス標識がある。

適当な酵素標識の例としては、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、スタフイロコツカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコール脱水素酵素、アルファグリセロールリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトノダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、などがある。

適当な放射性同位体標識としては、３Ｈ，１２５■、＋３１１．３２Ｐ、３８Ｓ、１４Ｃ１５’　Ｃｒ　ｓ　”Ｔ　ｏ−、”Ｃｏ　ｓ　”　Ｆ　ｅ　Ｎ　”　Ｓ　ｅ　ｓ　１５２Ｅ　ｕ　％　９０Ｙ１　”　Ｃｕ、　Ｈ？Ｃｉ、２＋１Ａｊ、２１２ｐｂ、ｔ７ＳＣおよび＋０９ｐｄがある。

インビボでの診断目的のための常磁性アイソトープもまた本発明の方法に使用できる。特に磁気共鳴エルネギ−技術に有用な元素の例としては、＋５７にｄ、５５Ｍｎ、””Ｄｙ、”Ｃｒ、”Ｆｅ、　１２３１などがある。インビボ核磁気共鳴像を論じるにあたり、例えば、ンエフア−ら、ＪＡＣＣ１４：４７２−４８０（１９８９）　：ンユリーブら、Ｍａｇｎ、　ＲｅｓｏｎｌＭｅｄ、　３：３３６−３４０（１９８６）　：ウォルフ、　Ｇ、　Ｌ、、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐ■凾刀A　Ｍｅｄ、　ＮＭＲ１６：９３−９５（１９８４）　；ウェスベイら、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｍｅｄ、　ＮＭＲ１６：１４５−１５５（P９８４）二ラングら、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｒａｄｉｏｌ、　１９：４０８−４１５（］９８４）を参照のこと。

適当な蛍光標識の例としては、Ｉｆｉ２Ｅｕ標識、蛍光標識、イソチオシアネ− １・標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコンアニン標識、アロフィコンアニン標識、０−フタルアルデヒド標識、フルオレスキャミン標識等がある。

適当な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リジン、およびコレラ毒素がある。ケミルミネッセンス標識の例としては、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェリン標識、エクオリン標識等がある。

本分野の常の技術者は本発明で用いることのできる他の適当な標識を知っているであろう。これらの標識の抗体あるいはそのフラグメントに対する結合は、本分野の技術者に一般的に知られている標準技術で実施てきる。具体的な技術としては、ケネディら、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　７０：］−３１（１９７６）とシュア−ら、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　８１：１−４０（１９７７）に開示されている。後述のカンブリング技術としては、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ツマレイミド法、ｍ−マレイミドベンンルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法、およびここで参照するこれらすべての方法がある。

本発明はまた、免疫診断剤または菟疫治療剤を血餅に向けるためのＴＡＰＰに対するモノクローナル抗体の使用にも関する。方法は、抗体を他の分子に結合させる技術分野で利用できる。たとえば、フィブリン特異的抗体へのウロキナーゼの共有結合を教示するボード（Ｂｏｄｅ）らの５ｃｉｅｎｃｅ　２２９　：　７６５〜７６７　（１９８５）を参照。

キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、組換えＤＮＡ法により調製することができる。そのようなキメラ抗体分子は、治療剤を含む第二のタンパク質に結合させたＴＡＰＰ特異的抗原結合部位を有する。キメラ抗体の調製法は、オイ（Ｏｌ）およびモリソン（Ｍｏｒｒｊｓｏｎ）　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４　：　２１４　（１９８６）　：モリラン５ｃｉｅｎｃｅ　２２９　：１２０２　（１９８５）：ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：２６８　（１９８５）：Ｅ　−ロツパ特許出願第１２０，６９４号：ヨーロッパ特許出願第１２５，０２３号、ＰＣＴ出願第ＷＯ３３１０３９７１号、ＰＣＴ出願第ＷＰ８３１０１２３３号；ブリアンヌ（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３　（１９８４）；モリソンら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８１　：　６８５１　（１９８４）：　ン＋ロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：６０４　（１９８４）；ノイベルカーら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４　（１９８４）：ロビン７．　（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　：　３６０３〜３６１１　（１９８６）、スタンプ（Ｓｔｕｍｐ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６　：１７１２０〜１７１２６（１９８６）：ネレス（Ｎｅｌｌｅｓ）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２　＋１０８５５〜１０８６２　（１９８７）；およびネレスら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２　＋　５６８２〜５６８９　（１９８７）に記載されている。

このようにして、ＴＡＰＰ特異的な抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）または抗体断片（抗体フラグメント）を治療剤または血栓溶解剤と結合させることができる。「血栓溶解剤」とは、フィブリン−血小板血塊を溶解し得る薬剤、またはそのような血塊の生成を抑制し得る薬剤を意味する。血栓溶解剤の例としては、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターが挙げられる。天然のアクチベーター（活性化因子）または組換えアクチベーターを用いることができる。

本発明ではさらに、一本鎖つロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ＳＣＵ−ＰＡ）およびその活性断片を含む、上記血栓溶解剤のハイブリッド、生理学的に活性な断片、変異体またはキメラ体をも用いる。本明細書において用いる「プラスミノーゲンアクチベーター」なる語は、そのようなハイブリッド、断片および変異体並びに天然由来および組換え由来の両方のプラスミノーケンアクチベーターを包含する。たとえば、スタンプら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　：　１７１２０（１９８６）およびネレスら、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２　：１０８５５　（１９８７）を参照。他の利用可能な治療剤としては、トロンビン阻害剤（およびその誘導体）、活性化プロティンＣ１因子Ｘａ阻害剤、および他の抗血栓症剤が挙げられる。

これら治療剤は単独または組み合わせて用いることができる。

この発明はまた、インビボでの血餅の検出にも関する。この出願において、抗体を放射性同位元素、酵素、コントラスト物質（ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔ）などで標識することができる。

本発明の抗体／治療剤は、薬理学的に許容し得る担体ビヒクルと混合することによるなど、薬理学的に有用な組成物を調製するための公知法に従って調合することがてきる。適当なビヒクルおよびその調合は、たとえば、レミングトンのファーマシューテイカルサイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　（１６版、オソル（Ｏｓｏｌ、　Ａ、　）　ｉｉ、マック・イーストン（Ｍａｃｋ　Ｅａｓｔｏｎ　ＰＡ）　（１９８０））に記載されている。有効な投与に適した薬理学的に許容し得る組成物を製造するため、そのような組成物は有効量のハブテン−結合分子または血栓溶解剤を単独かまたは適量の担体ビヒクルとともに含有するであろう。

作用持続時間を制御するために別の製薬法を用いることができる。徐放製剤は、本発明の抗体または抗体断片／治療剤と複合体を形成したまたは吸着したポリマーを使用することによって達成することができる。制御放出は、適当な巨大分子（たとえば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルホキジメチルセルロース、または硫酸プロタミン）を選択することによって行うことができる。薬剤の放出速度はまた、そのような巨大分子の濃度を変えることによって制御することができる。作用持続時間を制御するための他の可能な方法は、治療剤をポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー性物質の粒子中に組み込むことからなる。別法として、たとえばコアセルベーション法によってまたは界面重合法によって、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはセラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルを用いることによって、またはコロイド薬剤放出系において、たとえばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセルで調製したマイクロカプセル中、またはマクロエマルジョン中に治療剤を捕捉することも可能である。そのような教示はレミングトンのファーマシューティカルサイエンス（１９８０）に記載されている。

本発明の治療用または診断用組成物は個体に治療学的有効量で投与されるであろうことが考えられる。すなわち、血栓の位置を定めおよび／または溶解するのに充分な量にて。組成物の有効量は、個体の体重、性別、年齢および病歴によって変わるであろう。有効量に影響を与える他の因子としては、患者の状態の重篤度、特定個体または標的組織中の血栓のサイズおよび程度、標的タンパク質と治療組成物との間の相互作用の力学が挙げられるが、これらに限られるものではない。一般に、本発明の組成物は約１０１〜約１ピコモル／ｍｌ、好ましくは約１〜１０ピコモル／ｍｌ、さらに一般的には約０．００１ピコモル／ｍ１〜５０ピコモル／ｍｌの範囲の投与量で投与されるであろう。

本発明の製薬的に調製した組成物は、当該技術分野でよく知られた手段により患者に提供することができる。そのような導入手段としては、経口手段、鼻腔内手段、皮下手段、筋肉内手段、静脈内手段、動脈内手段、または非経口手段が挙げられる。

本発明の抗体／治療剤分子は、注射可能なポーラス（ｂｏｌｕ５）を調製するために生理学的に許容し得る液体中に溶解することができる。そのようなポーラスの調製は、該分子を生理食塩水中に溶解することにより行うのが好ましい。

上記で指摘したように、本発明の抗体分子はモノクローナル抗体およびその断片の両方を包含する。ある種の状況においては、免疫グロブリンのＦｃ部分によって引き起こされる免疫反応を最小にするため、そのような抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）ｚまたはＦｖ断片を用いるのが好ましい。

本発明の方法に従って処置できる血餅としては、肺血栓塞栓症、深静脈血栓症、脳塞栓症、腎静脈および末梢動脈血栓症などが挙げられるが、これらに限られるものではない。

本発明の組成物は、キットを調製するのに典型的に適している。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１または２以上の容器手段を密に詰め込んで収容すべ（区画された担体手段からなり、該容器手段のそれぞれは使用する診断剤または治療剤の別々の要素を含有していてよい。

この発明を一般的に記載したので、ある種の特定の実施例を参照することにより一層よく理解されるであろう。これら実施例は説明の目的のためにのみ本明細書に含まれるものであって、特に断らない限り本発明を限定することを意図するものではない。

害應男トロンビン活性化により血小板膜に生じる分子配列の幾つかをさらに解明するため、本発明者らは活性化血小板に特異的に結合する抗体を調製した。この研究で、本発明者らは、トロンビン活性化血小板の表面に選択的に発現されるタンパク質に結合したモノクローナル抗体を特徴付けた。２つのそのようなタンパク質：ＴＡＰＰ−１（モノクローナル抗体８Ｂ６による）およびＴＡＰＰ−２（モノクローナル抗体１２Ａ７による）が同定された。

方法材料を下記提供者から入手した：アフィニティー精製ヤギ抗（マウスＦａｂ’）（ＧＡＭＦａｂ）　、カッペル・ラボラトリーズ（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（？ルバーン、ペンンルベニア）；セファロース２ＢＳＰＤ− １０カラム、高分子量および低分子量タンパク質標準、ファルマシア（ウプサラ、スウェーデン）；前染色タンパク質標準およびＤＥＡＥアフィゲルブルー、バイオラド（リッチセント、カリフォルニア）：Ｂａ１ｂ／Ｃマウスおよびニューシーラント白ウサギ、チャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）　（ウィルミントン、マサチューセッツ）、ラントロンビン、パーク−デービス（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）　（モリスブレーンズ、ニューシャーシー）、フロイントのアジュバント、ジフコ（デトロイト、ミシガン）、ＮａＩ２５１、アマ−ジャム（アーリントンハイツ、イリノイ）：ポリビニリデンジフルオライド移動膜、ミリポア（ベッドフォード、マサチューセッツ）ニトリプシン（ＴＰＣＫ−処理）、メクリバパイン、トリトンＸ１００およびＲＴＡグレードウン血清血清アルブミンマグマントルイス、ミズーリ）　、ＤＥ５２樹脂、ファツトマン（ケント、英国）：マグネチックヤギ抗マウス免疫グロブリン粒子、コラボラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　（ベッドフォード、マサチューセッツ）。他のすべての化学薬品は試薬グレードかまたはそれ以上のものであった。

モノクローナル抗体の産生免疫のための血小板を得るため、ウサギ血を１０％クエン酸（３，８％）中に回収し、２５０ｘｇで１５分間回転させて赤血球（ｒｂｃｓ）を除去した。この血小板に富んだ血漿を取り、ついで１５００Ｘｇで２００分間回転せて血漿から血小板を分離させた。血小板をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）　、２ｍＭ　ＣａＣｌ２中に再懸濁させ、ついで１５分間再び遠心分離した。緩衝液を吸引した後、血小板を再び２ｍＭＣａＣ］２およびトロンビン０．１５単位を含有するＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（１，０ｍ１）中に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。雌Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（〜８週齢）を、フロイントのアジュバント中に乳濁した凝集血小板（２０μｌ）で免疫した。マスクに３力月の間隔で２回ブースター投与した。融合する直前の３日間に、マウスを１００μｍのトロンビン活性化血小板で腹腔内にて高度免疫した。

体細胞融合をすでに記載されたようにして行った（リード（Ｒｅｅｄ　）ら、Ｔ　ｒａｎｓ、Ａｓ５ｏｃ、Ａｍ、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　Ｃ１：　２５０〜２５６　（１９８８）　）、融合の頻度は９０％であった。血小板特異的抗体を産生ずるハイブリドーマをラジオイムノアッセイにより同定した。このアッセイにおいて、血小板は上記のように５０ｍ１のウサギ血液から得られた。２ｍＭＣａＣ＋２を含有するＨＢＳ　（１ｍｌ）中に再懸濁した後、血小板を０，１５単位のトロンビンで活性化した。ついで、血小板を５０ｍ１のＨＢＳ中に再懸濁し、１１０００Ｘで２０分間遠心分離し、上澄み液を除いた；この工程を繰り返した。

ついで、凝集した血小板を６ｍｌのＴＢＳＡ中に希釈した。ハイブリドーマのスクリーニングのため、５０μｍのハイブリドーマ上澄み液を２５μｍの凝集血小板と混合し、１２ｘ６５ｍｍチューブ中、室温にて１時間インキュベートした。

その後、血小板をＴＢＳＡ中の１％ウマ血清（３ｍｌ）で洗浄し、２５００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離した。

この上澄み液を除いた。ついて、＋２５１−ＧＡＭＦ　ａ　ｂ　（２５μｍ）を該血小板ベレットとともに１時間インキュベートした。血小板を２ｍｌの１％ＴＳ−ＴＢＳＡで再び洗浄し、上記と同様にして遠心分離した。上澄み液を吸引した後、血小板に結合した抗体をガンマーンンチレー／ＥＩンカウントにより測定した。活性化ウサギ血小板に特異的な抗体は、ハイブリドーマの５．４％で検出された。ハイブリドーマを限界希釈によりクローニングした。

抗体の精製および断片化クローニングしたハイブリドーマを、０．５ｍｌのブリスタンで初回抗原刺激したマウスの腹水中に拡張した。腹水を４０％硫酸アンモニウムで沈殿させることにより分画した。１７．０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離することにより沈殿を単離した。このベレットを、初期容量の約２０％の０．９％食塩水中に再懸濁し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中に透析した。透析後、１７．ＯＯＯｒｐｍ、４°Ｃでの３０分間の遠心分離を繰り返すことにより溶液を清澄化した。ついで、上澄み液を約５０〜７５ｍ１／時にて１００ｍ１　ＤＥＡＥアフィゲル−ブルーカラムに通した。結合した抗体を１０ｍＭリン酸中の０〜１００ｍＭＮａＣｌのＮａＣ１勾配により溶出した。抗体を含有するフラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、アミコン濃縮器を用いて圧縮窒素下で濃縮した。

完全モノクローナル抗体を制限パパイン消化することによりＦａｂ断片を調製した。完全モノクローナル抗体を０　、１　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　０４．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０中に透析した。システィンＨＣＩおよびパパインをそれぞれ０．１Ｍおよび１％（モノクローナル抗体の濃度）の最終濃度で加えた。実験によって３７℃でのパパイン消化の最適時間が明らかになった後、調製的消化を行った。ヨードアセトアミドを最終濃度１ｍｇ／ｍ＋で加えることにより消化を停止させ、消化物を５ｍＭリン酸ナトリウム、０．０２％ＮａＮ、に対して透析した。消化物を、同緩衝液で前辺て平衡化しておいたＤＥ５２カラム上に通した。Ｆａｂはフォールスルー（ｆａｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に回収され、完全１ｇＧおよびＦｃはリン酸ナトリウムの濃度を増加させることによって溶出した。消化およびその後の精製の結果を５ＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

精製したモノクローナル抗体およびＦａｂをヨードゲン（１ｏｄｏｇｅｎ）法により放射性ヨウ素化した（フレーカ−（Ｆ　ｒａｋｅｒ）ら、Ｂ　１ｏｃｈｅＩ１．　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｍｕｎ、８０：８４９〜８５７　（１９７８））。各ヨウ素化について、５０％エタノール−水混合物中のペーパークロマトグラフィーにより３つずつで比放射能を決ａ、休止およびトロンビン活性化血小板に対するモノクローナル抗体８Ｂ６の結合性の比較変性チロード緩衝液（Ｔｙｒｏｄｅ’　ｓ　ｂｕｆｆｅｒ）　（カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まない）を用いたセファロース２Ｂ上のゲルクロマトグラフィーにより、プールしたヒト血小板を血漿から分離しくチモンズ（Ｔ　ｉａｍｏｎｓ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１６９　：　１１〜２１　（１９８９））　、カウントした。カウント後、血小板を分け、一方の部分にトロンビン（０，１５単位／＋＊１）および２ｍＭＣａＣ！２および１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を加えて凝集させた。トロンビン活性化血小板を、カルシウム（１ｍＭ）およびマグネシウム（２ｍＭ）を含有する変性チロード緩衝液（２００μｌ）中に希釈し：残りの血小板を、２価カチオンを含有せずＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する変性チロード緩衝液中に希釈した。放射性ヨウ素化モノクローナル抗体８Ｂ６Ｆａｂ　（２０μｌ、１８０，０００ｃｐｍ）をトロンビン活性化血小板または休止血小板に２つずつにて加え、室温にて１時間インキュベートした。対応変性チロード緩衝液（３ｍｌ）での洗浄、遠心分離および吸引後、結合した抗体をガンマンンチレーンヨンカウントにより検出した。１２５１　３Ｂ６Ｆａｂを用い、これをヒト血小板とともに１〜１２０分間の種々の時間長でインキュベートして平衡および飽和結合研究を行った。ついで、血小板混合物（５０μｌ）を１ｍｌの冷２０％ショ糖（０°Ｃ）上に重層し、マイクロ遠心分離にかけて結合抗体を遊離抗体から分離した。上澄み液を吸引した後、血小板に結合した抗体をガンマシンチレーションカウンター（ミクローメディックス（Ｍｉｃｒｏ−Ｍｅｄｉｃｓ）　）でカウントした。これら実験は、室温にて平衡結合が１０分以内に達成されることを示した。ついで、非特異的なタンパク質結合部位をブロックするためにＴＢＳＡ中の１％ウン血清アルブミンとともに前以てインキュベートした１２Ｘ６５ｍｍポリスチレンチューブ中で飽和結合実験を行った。このブロックした空のチューブに、トロンビン（０，６単位／ｍ１）およびＣａ２Ｃａ２４（２およびＭｇ”　（１ｍＭ）を含有するかまたは含有しない変性チロード緩衝液中の５Ｘ１０’細胞を２０μＩの容量にて加えた。各３つずつのチューブに痕跡量の放射性標識８Ｂ６Ｆａｂ　（７ｘｌＯ”Ｍ）および種々の量の冷８Ｂ６　（ｌｎＭ〜０．９μＭ）を加えた。非特異的結合を評価するため、１００倍モル過剰以上の冷８Ｂ６Ｆａｂをチューブに加えた。室温で３０分間インキュベートした後、３ｍｌの水冷変性チロード緩衝液を各チューブに加えた。３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液を吸引して未結合抗体を除去した。結合抗体はγシンチレーションカウントにより定量した。結合データを、リガンドプログラム（マンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、１０７　：　２２０〜２３９　（１９８０）：マツクツ　７−７　ン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、　Ｇ、　Ａ、　）、ｒ　Ｋ　１ｎｅｔｉｃ、　Ｅ　Ｂ　Ｄ　Ａ、　Ｌ　ｉｇａｎｄ、　Ｌｏｖｒｙ　（バイオソフト、ミルタウンニューシャーシー）（１９８５））を用いて分析した。これら実験において、１００倍モル過剰以上の８Ｂ６Ｆａｂによってまたはリガンド評価によって評価されるように、非特異的結合は１％未満であった。

ｂ、休止およびトロンビン活性化血小板に対するモノクローナル抗体１２Ａ７の結合性の比較クエン酸処理したウサギ血液を２００Ｘｇにて２０分間遠心分離にかけて赤血球を除去した。血小板に富んだ血漿を、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するチロードで前以て洗浄しついで変性チロード緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムイオンを含有せず）で平衡化したセファロース２Ｂカラムに適用した（チモンズ（Ｔｉ■ ｍｏｎｓ）およびハウイガ−（Ｈａｗｉｇｅｒ）　、Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１６９　：　１１〜２１　（１９８９））。ついで、血小板を上記のようにしてゲルクロマトグラフィーにより血漿タンパク質から分離した。血小板をカウントした後、２つの部分に分けた。一方の部分にトロンビン（０，１５単位／ｍ１、最終）、ＣａＣ１ｔ（２ｍＭ）およびＭｇＣ１（１ｍＭ）を加えて凝集させた。このトロンビン活性化血小板を５ｘ１０’細胞／１００μｌの濃度に希釈し、＋２１１−モノクローナル抗体１２Ａ７　（３４，０００ｃｐｍ）とともに全量２００μｌでインキュベートした。

同様に、休止血小板を、２価カチオンを含有せず１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するチロード中に３．６　Ｘ　１０７細胞／１００μｍの濃度に希釈した。ついで、上記のようにして、休止血小板に１２５Ｉ−モノクローナル抗体１２Ａ７を加えた。非特異的結合を評価するため、大モル過剰（＞１００倍）の非放射性モノクローナル抗体１２Ａ７を平行チューブに阻害剤として加えた。４５分間インキュベートした後、２ｍｌの水冷チロード（２価カチオンを含有せず）を各チューブに加え、血小板を直ちに３５００ｒｐｍにて遠心分離にかけた。上澄み液を除去し、血小板に結合した抗体をガンマ−カウントにより測定した。

平衡飽和結合研究も同様にして行った。トロンビン（０，１５単位／ｍｌ）で活性化した血小板を、２つずつ、種々の量の１２８１−モノクローナル抗体１２Ａ７　（１，０００，０００〜６，２５０ｃｐｍ）とともに全量２００ｇ１にてインキュベートした。各チューブにはまた、同じイソタイプのコントロールの抗ジゴキシンモノクローナル抗体（マドゲット−ハンター（Ｍｕｄｇｅｔｔ　−Ｈｕｎｔｅｒ）ら、Ｍｏｌ。

Ｉａｉｕｎｏｌ、２２　：　４７７〜４８８　（１９８５））がモル過剰（＞１００倍）で含まれており、これはＦｃレセプターを介した＋２５１−モノクローナル抗体１２Ａ７の血小板への非特異的結合を阻害するために加えた。非特異的結合を評価するため、モル過剰（＞１００倍）の非放射性モノクローナル抗体１２Ａ７を１セ・ソトのチューブに加えた。室温にて４５分間インキュベートした後、２ｍｌの冷チロード緩衝液を加え、チューブを３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、未結合の＋２”ｌ−１２Ａ７モノクローナル抗体を除去した。結合した抗体をマイクローメディックス４／６００カウンター中のガンマカウントにより測定した。休止血小板へのモノクローナル抗体１２Ａ７の結合を研究するため、血小板の数を４００μｍの全インキュベーション容量中の１．２９Ｘ１０’細胞に増加させた他は同様の手順で行った。血小板を上記のようにして種々の量のモノクローナル抗体１２Ａ７　（２，０００，０００〜２５，０００ｃｐｍ）とともにインキュベートした。

結合データをマンソンおよびロッドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）のりガントプログラム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｔ　１０７　：　２２０〜２３９　（１９８０））により分析した。これら実験において非特異的結合は、１００倍モル過剰以上の１２Ａ７によって、またはリガンド分析によって評価されるように、１％未満であった。異なるアゴニストによって刺激した血小板への１２Ａ７の結合についても研究した。血小板を上記のようにして分離した。変性チロード（２価カチオンを含有せず）中の血小板（５ＸｉＯ’細胞／４０ＫＩ）をプラスチ・ツクチューブに加えた。ＣａおよびＭｇ（４０μｍ）を含有するまたは含有しないチロードを幾つかのチューブに加え２２価カチオンを含有せずＥＤＴＡ　（１ｍＭ）を含有するチロードを他のチューブに加えた。血小板をトロンビン（０，５単位／ｍｌ）　、ＡＤＰ　（１０μＭ）、エピネフリン（２ｍＭ）　、またはＡ２３１８７　（２μｍ）で最終容量１００μ＋にて刺激した。細胞を室温にて１０分間インキュベートし、ついで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中の４％バラホルムアルデヒド（１／１０容量）を加えて固定した。３０分後、等容量の２０ｍＭ　ＮＨ２Ｃｌ　１５０ｍＭ　ＮａＣ＋、０．３Ｍ）リス、ｐＨ７，２を加えて該溶液を中和した。血小板を２ｍｌのチロードで洗浄し、３５００ｒｐｍで１０分間回転させ、上澄み液を除去した。非特異的結合を評価するための阻害剤として加える非標識モノクローナル抗体１２Ａ７（０，５μｇ）を用い、または用いずに、血小板を”５ｌ−１２Ａ７　（５０，００Ｑｃｐｍ）とともにインキュベートした。４５分後、血小板試料を再び洗浄し、回転させ、吸引し、ガンマカウントした。

休止血小板及びトロンビン活性化血小板由来の８Ｂ６を用いた免疫沈降の５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析貯蔵ヒト血小板を分画遠心によって血小板豊富な血漿から単離した。トロンビンによって活性化するつもりの血小板を）（ＢＳ中で２回洗浄し、トロンビン（０゜１５Ｕ／ｍ／）により活性化し、ＨＢＳ−ＣａＣ１２（２μｍＭ）で洗浄した。休止血小板をＨＢＳ−ＥＤＴＡ　（５μｍＭ）で２回洗浄した。休止及びトロンビン活性化血小板のベレットをトリプシン（ＴＰＣＫ処理済み、２．　５ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁し、３７℃で一晩インキユベートした。遠心後、上清を単離した。それぞれから１００ｔｔｌを取り、それをヨードケン法（Ｉｏｄｏｇｅｎ　ｍｅｔｈｏｄ）　［Ｆｒａｋｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　８０：８４９−８５７（１９７８）］によってヨウ素化した。ＰＤ−１０カラムのクロマトグラフィーによって、放射活性タンパク質を単離した。免疫沈降のため、ＭＡｂ８Ｂ６又は対照のＭＡｂ（抗−ジゴキシン４　Ｑ−１６Ｑ、　Ｍｕｄｇｅｔｔ−Ｒｕｎｔｅｒら、　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２２：４５５−４８８（１９８７））　１００　Ｉｔ　Ｉ！を、磁気粒子に固定化したヤギー抗マウス抗体２５μｐと共に前インキュベートした。０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳＡ　３ｍ１．でチューブを洗浄した。次いで、休止及びトロンビン活性化血小板由来のトリプシン開裂血小板タンパク質２０μ１（３００゜０００ｃｐ■）と共に、固定化ＭＡｂを室温にて３時間インキュベートした。０．１％ルブロール（ｌｕｂｒｏｌ）を含有するＰＢＳＡによって免疫沈降物を３回洗浄した。

その免疫沈降物を試料緩衝液［１，ｌｅａ＋ｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］中で可溶化し煮沸した後、１０％０％非還び還元５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。得られたゲルを乾燥させ、それをコダックＸＲフィルムのオートラジオグラフィーにかけた。

細胞標識及び１２Ａ７による免疫沈降分画遠心により、血小板豊富な血漿（ＥＤＴＡｌｒＡＭ）１２■ｌから血小板を単離した。得られた血小板を改変チロード（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔｙｒｏｄｅ’ 　ｓ）　５０　ｍ　ｌによって２回、次いでＥＤＴＡ又は２価陽イオンを含まない改変チロードによって１回洗浄した。細胞（８，９Ｘ１０”）をＣａ２＋及びＭｇ２＋を含むチロード１１中に再懸濁し、トロンビン２単位により凝集させた。トロンビン活性化細胞又は休止細胞を３００Ｏｒｐｍで５分間微小遠心した。

上清を取り出し、細胞を０．２Ｍ硫酸カリウムｐＨ７，２中に再懸濁した。次いで、休止又は活性化血小板を、カップリング化グルコースオキシダーゼ−ラクトペルオキシダーゼ触媒を用いて放射性ヨウ素化した［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ、Ｊ、Ｊ、、　ＢｉｏｃｈｅｔＪ、　１１３：２２９（１９６９）］　ａ洗浄及び遠心（３ＱＱＱｒｐｍ、５分）を３回繰り返し、非結合放射活性を除去した。次いで、細胞ペレットを、２価陽イオンを含む又は含まない改変チロード中に再懸濁した。０゜１％トリトンｘ−ｉｏｏを添加し、細胞を細胞溶解した。ヨウ素化血小板細胞溶解物（５００，０００ｃｐｍ）を精製ＭＡｂ　１２Ａ７　（５μｇ）と共に混合しながら１時間インキュベートした。次いで、アガロースに結合したウサギ抗−マウス抗体２５μｌを各チューブに３０分かけて加えた。そのアガロースをトリス緩衝化食塩水１厘ｌで洗浄し、遠心した。上清を除去し、アガロースを再び２回以上洗浄した。最終洗浄の後、β−メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液５０μｌ中にそのアガロースを再懸濁し、５分間煮沸した。細胞溶解物を１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーにかけた。

ＴＡＰＰ−１タンパク質のアフィニティー精製ＰＢＳｐＨ８，３中の精製したＭＡｂ　８Ｂ６　（６，３ｍｇ／ｍｌ）をＣＮＢｒ活性化セファロース−４Ｂと４ ℃にて一晩混合した。セファロース１ｍｌ当たりＭＡｂ約３．　６ｍｇをカップリングした。通常は、古い無作為ドナー血小板単位を幾つかプールし、遠心し、洗浄し、１％トリトンＸ−１００，１ＢＭ　ＣａＣ４及びｌＯμＭｏイペプチン［Ｆｉ　ｔｚｇｅｒａｌｄら、＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１　：　１６９−１７７（１９８５）］を含有するトリトン緩衝化食塩水（ＴＢＳ）中にて可溶化する。この可溶化した血小板を１５．　０００ｒｐｍ、４℃にて３０分間遠心した。次いで、上清をＴＢＳに対して透析した。次に、得られた試料を８８６−セファロースと一晩、混合した。その８Ｂ６−セファロースをＴＢＳで洗浄し、次いで高−塩ＴＢＳ　（０，５Ｍ　ＮａＣＺ’）で、次に０．０５％ルブロールを含有するＴＢＳで洗浄し、Ａ２８０が０゜０５以下になるようにした。０．２ＭグリシンｐＨ２，７を含有する５ｍ１画分中の結合タンパク質を、１０Ｍ　トリスｐＨ９，０を含有するチューブ中へ溶出し、中和した。このアフィニティー精製したタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び免疫プロッティングにかけた。次いで、精製ＭＡｂ及び分子量標品と共に、得られた溶出液を６％非還元又は１０％還元ポリアクリルアミドゲル両方の電気泳動にかけた。タンパク質は、クーマシーブリリアントブルー色素による染色によって検出した。配列決定装置において、アミノ末端エドマン分解を行った。

ＴＡＰＰ−２タンパク質のアフィニティー精製ハイブリドーマ１２Ａ７由来の腹水（１７ｍＡ’）を、５０％硫安沈澱によって両分した。４°Ｃにおける１７．　０００ｒｐｍ、３０分の遠心によって沈澱物を単離した。得られたペレットを初期容量の半分に再懸濁し、ＰＢＳ　ｐＨ８，０に対して透析し、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに一晩混合し、室温にて２時間、次いで４℃にて一晩、混合した。その午前中にカラムを洗浄し、ＴＢＳＡとインキュベートし、残った活性部位をブロックした。使用する前に、カラムを０．１ＭグリシンｐＨ２，９で前溶出した。通常の実験では、活性化血小板豊富な血漿的２００８１から血小板を単離した。その血小板を遠心し、２，５ＥＤＴＡを含有するＴＢＳ　ｐＨ７，４で３回洗浄した。得られた血小板ペレットを、１ｍＭ　Ｃａ２゛、１０ｍＭｏイペブチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）及び１％トリトンＸ−１００を含有するＴＢＳ１０ｍｆ中に再懸濁した。そのペレットを１５．ＯＯＯｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。上清をカラム中のＭＡｂ１２Ａ７−アガロースと６０分間混合した。

アガロースをＴＢＳ　（カラム容量の１５倍）で３回洗浄し、次いで２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２になるまで、５００ｍＭ　ＮａＣ１を含有するＴＢＳで洗浄した。結合タンパク質を０．１ＭグリシンｐＨ２，９と共に、３Ｍ　トリスｐＨ９゜０（７０μｌ）を含有するチューブ中に溶出し、その酸度を中和した。溶出タンパク質をＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　［Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］にかけA 銀染色した。精製したＡＰＰをエンドグリコンダーゼＦによって脱グリコリル化した。凍結乾燥した後、ＴＡＰＰ−２を１％トリトンＸ−１００を含有するＴＢＳ中で透析した。次いで、ＥＤＴＡ　（２５ｍＭ）　、ＳＤＳ　（０，５％）、メルカプトエタノール（１％）及びエンドグリコシダーゼ（総タンパク質２％）を加えた。３７℃にて一晩消化させた。消化したＴＡＰＰ−２及び未消化のＴＡＰＰ−２を１０％５ＤＳ−ゲルの電気泳動及び銀染色により分析した。精製したＴＡＰＰ−２を、ｐＨ３−１０範囲の両性電解質を使用するパイロラド１１１ミニＺＥＦ装置により等電フォーカッソングにかけた。

免疫プロッティング正常なウサギ血液５（：ｈｌから分画遠心によって血小板を単離した［１ｌｕｓ　ｔａｒｄら９ｌｅｔｈ、Ｅｎｚｙ＋＋＋ｏ１．１６９：３−１１（１９８９）］　。血小板を５ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するヘペス緩衝化食塩水に再懸濁し、緩衝液５　Ｑｍｊ！で洗浄し、再び遠心した。さらに洗浄し、遠心した後、血小板ペレットを１０％ＳＤＳ　５００μｌに溶解し、２分間煮沸した。可溶化した洗浄ペレット（５Ｍｌ＞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝系［ＬａｅＩＩｌｍｌｉ、Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］を使用して６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。次いで、Ｋｈｙｓｅ−＾ｎｄｅｒｓｏｎ　［Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１ｌｅｔｈ、　１（１２０３−２０９（１９８４j］に記載されている半一乾燥電気プロッティングにより、そのタンパク質をポリビニリデン・ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移した。その膜をトリス緩衝化食塩水（０，０２％アジド）中で洗浄し、４℃にて１％アルブミン中で一晩インキユベートし、それにより非特異的なタンパク質結合部位をブロックした。ＴＢＳＡ中で３缶洗浄した後、得られたプロットを０．　１ＸＢＳＡ中にて精製ＭＡｂ８Ｂ６と共に１時間インキュベートした。さらに３回洗浄した後、プロットを放射線標識化ヤギ−抗（マウスＦａｂ’２）と共に１時間インキュベートした。このプロットを再び３回洗浄し、コダックＸｏｍａｔ　ＡＲフィルムに暴露し、それにより結合抗体を検出した。同様の態様にてＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭのＮ末端配列に特異的なウサギポリクローナル血清を用いる免疫プロッティング実験も行った。

洗浄後、結合ウサギ抗体を、１２５■−プロティンＡによるブロービングにより検出した。

細胞を音波処理、トリトンＸ−１００又はトリトンＸ１１４により細胞溶解した後、ＴＡＰＰ−２についてさらに免疫プロッティング実験を行った。血小板豊富な血漿（１５璽ｊ）を３つの等量の試料に分け、上述のようにして遠心により血小板を単離した。得られた血小板を再懸濁し、ＴＢＳ　［２，５ＢＭ　ＥＤＴＡ、１００Ｕ／＋＋１アプロチニン、及び１０μＭロイペプチン］中にて洗浄し、遠心した。洗浄をもう１サイクル繰り返し、次いで血小板ペレットを１ｍＭＰＭＳＦを含有する同じ緩衝液中に再懸濁した。１つの試料を氷上で１分間、１００ワツトの音波処理を行い、懸濁液を清澄化した。もう１つの血小板試料を、トリトンＸ−１００を含有する同じ緩衝液中に再懸濁し、３番目の試料を１％トリトンＸ−１１４を含有する緩衝液中に再懸濁した。トリトンＸ−１１４を水性及び洗浄剤層に分配した［Ｈａｙｗａｒｄら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、２６６：７１１４−７１２０（１９９１）］、すべての試料、を微小遠心によって１２．０００ｒｐｍで３０分、遠心した。音波処理した血小板の上清、トリトンＸ− １００及びトリトンＸ−１１４抽出物（水層）のタンパク質濃度は、それぞれ５．９．７及び９．　３ｍｇ／ａｉｌ！と算定された。各工程の後の上清をＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　［Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］にがけ、次いで上記のＭＡｂ１２Ａ７による免疫プロッティングを行った。

音波処理細胞融合の後、検定により、候補ハイブリドーマの５．４％がウサギ血小板に特異的に結合する抗体を産生ずることが判明した。これらのハイブリドーマの１つであるＭＡｂ８Ｂ６もトロンビン活性化ヒト血小板に結合する抗体を産生じた。このハイブリドーマを限界希釈法によりクローンし、γＩＫ血清型であることが見いだされた。

結合実験を行い、休止血小板及びトロンビン活性化血小板に関するＭＡｂ８Ｂ６の結合の特異性を測定した。放射性ヨウ素化８Ｂ６Ｆａｂを種々の数の休止及びトロンビン活性化血小板とインキュベートした。８Ｂ６を休止血小板とインキュベートした場合、有ったとしても最小のタンパク質結合性でしがながった。これとは対照的に、８Ｂ６をトロンビン活性化血小板とインキュベートした場合、血小板の数の関数として結合抗体の量が鋭く増大した。この曲線を比較すると、ＭＡｂ８Ｂ６が殆ど排他的にトロンビン活性化血小板と結合することは明らかである（第１図）。

ＭＡｂ８Ｂ６が活性化血小板に優先的に結合することを確かめるため、免疫沈降実験を行った。トロンビンにより血小板を活性化し、次いで洗浄して血小板表面に結合しなかった分泌タンパク質を除去した。次に、休止血小板（ＥＤＴＡ）又は洗浄しトロンビン活性化した血小板をトリプシンと共にインキュベートし、血小板表面から結合タンパク質を開裂させた。その血小板を遠心し、タンパク質消化物を含有する上清を取り出した。このタンパク質消化物を放射線標識し、次いでＭＡｂ８Ｂ６又は、同じアイソタイプの無傷の対ｆｆ１ＭＡｂ　（抗−ジゴキシン４０−１５　Ｑ　）　［Ｍｕｄｇｅｔｔ−Ｈｕｎｔｅｒら９Ｍｏ１．１ｍｍｕｎｏ１．２２＋４５５−４８８（１９８５）］にょって免疫沈降した。免疫沈降物を洗浄し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにかけた。ＭＡｂ８Ｂ６及び対照ＭＡｂ群由来の免疫沈降物は共に、免疫沈降に使用した第２のヤギ抗マウス抗体におそらくは由来しているのであろう、同様の非特異的結合パターンを示した。しかし、対照のＭＡｂと比較すると、ＭＡｂ８Ｂ６は、トロンビン活性化血小板由来の非還元条件下でのＭｒ９４　ｋ　ｄの唯一のバンドと沈降した。還元条件下では、ＭＡｂ８Ｂ６は唯一、Ｍｒ４２ｋｄ及び３６ｋｄの２つの断片と免疫沈降した。ＭＡｂ８Ｂ６が活性化血小板の表面に選択的に発現する（トリプシン−開裂）タンパク質に結合することが証明されたことによって、これらの結果は、全細胞結合実験を独立して支持するものである。

平衡結合試験を行い、活性化血小板に存在するＴＡＰＰ−１の分子の数を測定した。最大結合性を得るために必要な時間及びトリプシン用量を測定した後、放射活性８Ｂ６Ｆａｂ単独（「ホット」実験計画）　［Ｍｕｎｓｏｎら、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈ、　１０７：２２０−２３９（１９８０）］及び、競合物質として非標識化８Ｂ６Ｆａｂを使用する計画の競合（コールド）型の両方を使用し、実験を行った。第３図は通常の「コールド」実験の結果を示すものである。プールしたヒト血小板を種々の容量の１２５１　３１３６Ｆａｂと共に室温にて３０分間インキュベートした。結合は飽和され得ることが見いだされ、過剰のコールド８Ｂ６Ｆａｂによって阻害された（＞９９．５％）。

このリガンド・プログラム［Ｍｕｎｓｏｎら、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈ、　１０７：２２０−２３９（１９８０）　；　ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、　Ｇ、＾、、　Ｋｉｎｅｔｉｃ、　ＥＢＤＡ、　Ｌｉｇａｎｄ、　Ｌｏｗｒｙ（バイオソフト、ミルタウンＪＪ）　（１９８５）］に基づく結合等温曲線の分析により、８Ｂ６は解離定数５．０２Ｘ１０−’Ｍ（ＫＡ＝２．００±０．３７Ｘ１０’Ｍ−りで単一のクラスの結合部位（Ｎ＝１２．０００±２０６０分子／血小板）を認識することが示された。放射線標識化リガンドのみを使用する飽和結合実験により、同様の結果が得られた。しかし、これらの実験を休止血小板を用いて同様に行った場合は、ＫＡ又は結合部位の数を算定するには不充分な特異的結合性であった。

ＳＤＳ可溶化全ウサギ結合性の免疫プロッティングを行い、活性化が存在しない場合のＴＡＰＰ−１抗原の分子量を測定した。ＭＡｂ８Ｂ６は、非還元ゲル上のＭｒ２５０ｋｄの単一タンパク質と結合した。還元５ＤＳ−可溶化血小板タンパク質の免疫プロットはＭＡｂ８Ｂ６に結合しなかった。このことは、ＭＡｂがジスルフィド結合に依存するエピトープを認識することを示している。ＴＡＰＰ− １がＧＭＰ−１４０を含有するタンパク質複合体から構成されていないことを確かめるため、本発明者らはＧＭＰ−１４０に対する抗血清を用いて免疫プロッティング実験を行った。この非還元プロットでは、ＧＭＰ−１４０抗血清は約１５０ｋＤａの単一のバンドと結合したが、ＴＡＰＰ−１とは結合しなかった。

ＭＡｂ８Ｂ６を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、ＴＡＰＰ−１抗原を血小板の洗浄剤抽出液から精製した。トリトンＸ−１００で可溶化した血小板を、セファロースに固定化したＭＡｂ８Ｂ６を含有するアフィニティーカラムに通した。次いで、このカラムを高塩濃度及び洗浄剤洗液で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次いで、ＴＡＰＰ−１タンパク質を１２ＭグリシンｐＨ２，７で溶出させた。精製したＴＡＰＰ−１を還元及び非還元ゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけ、クーマシーブリリアントブルー色素で染色した。このゲルから、非還元の精製ＴＡＰＰ−１タンパク質が約２５０ｋｄのＭｒを有することが決定された。明瞭てない染色パターンはＴＡＰＰ−１が糖タンパク質であることを示している。３つの主要なバンドの組みがＴＡＰＰ−１の還元ゲル上に同定された・１つは１３８ｋｄ、約５６ｋｄのトリブレット、及び約４２ｋｄの型染色バンド。これよりも明瞭でないバンドも〜８５ｋｄ及び〜３４ｋｄに同定された。〜８５ｋｄのバンドは〜４２ｋｄ種のダイマーであるかもしれない。

Ｔ、ＡＰＰ−１抗原の本体を確認するため、それをアミノ末端エドマン配列分析にかけた。得られた配列をＧＥＮＢＡＮＫ又はＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２（１）：３８７−３９５（１９８４）］の既知のアミノ酸配列と比較したが、強い配列相同性（〉６０％）は認められなかった。同様に、アミノ酸配列を可能性あるすべてのヌクレオチド配列に逆翻訳し、それを報告されているヌクレオチド配列と比較しても、強い相同性を認めることはできなかった。従って、ＴＡＰＰ−１抗原は明らかに、これまでには報告されていないアミノ酸配列を含有している。

２、ＭＡｂ　１２Ａ７及びＴＡＰＰ−２ウサギ血小板に特異的に結合する抗体を産生ずるハイブリドーマを充分に試験し、血小板に対するそれらの結合性が血漿タンパク質によって阻害されるか否かを決定した。これらのハイブリドーマの１つである１２Ａ７は活性化血小板に結合し、血漿によって有意に阻害されなかった。比較全血小板結合実験を行い、ＭＡｂ１２Ａ７によって認識される抗原が休止及び活性化血小板から別個に発現されるか否かを調べた。精製した放射性ヨウ素化ＭＡｂ１２Ａ７を休止及びトロンビン活性化血小板と共にインキュベートした（第３図）。１２Ａ７を休止血小板（３，６Ｘ１０’細胞）と共にインキュベートした場合、抗体結合性は有っても極く最小であった。比較すると、１２Ａ７をトロンビン活性化血小板（５Ｘ１０６細胞）と共にインキュベートすると、結合抗体の量が顕著に増大した。このことは、ＭＡｂ１２Ａ７が活性化血小板タンパク質（ＴＡＰＰ−２）又は、トロンビンによる細胞活性化の後に血小板表面に主として発現される抗原を認識することを示している。

細胞標識実験を行い、ＭＡｂ１２Ａ７が優先的に活性化血小板に結合した観察事項を確認した。休止及び活性化血小板の表面タンパク質を放射性ヨウ素化した。

次いで、血小板をトリトンＸ−１００で細胞溶解し、得られた細胞溶解物をＭＡｂｌｏｏによって免疫沈降させた。次に、この免疫沈降物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。この手法を使用すると、ＴＡＰＰ−２が活性化血小板の表面に検出されたが、休止血小板には検出されなかった。

細胞結合実験を行い、血小板膜におけるＴＡＰＰ−２の発現が種々のアゴニストによって誘発されるか否か、及びその発現に細胞外Ｃａ”の存在が必要であるか否かを調べた。第４図は、ＡＤＰ　（１０μＭ）　、Ａ２３１８７　（２μＭ）及びトロンビン（０，５Ｕ／ｍｆ）による細胞の刺激により、’２’ｌ−ＭＡｂ　１２Ａ７の結合によって示されるようにＴＡＰＰ−２発現が休止血小板と比較して顕著に増大されることを示している。しかし、エピネフリン（２μＭ）は有ったとしても若干の作用しか有していないようである。細胞外Ｃａ”はトロンビンによるＴＡＰＰ−２の発現には重要ではないようであった。即ち、Ｃａ”の不存在下、Ｃａ２゛キレータ−としてＥＤＴＡを存在させて活性化させた血小板に対しては　１２５１−ＭＡｂ　１２Ａ７の結合性が顕著であった。この実験で試験したアゴニストの用量では、ＴＡＰＰ−２の血小板上での発現を誘発させる最も強力な活性物質はトロンビンであった。

平衡結合試験を行い、活性化血小板に存在する活性化血小板タンパク質（ＴＡＰＰ−２）の分子の数を測定した。最大結合に必要な時間及びトロンビン用量を測定した後、通常の「ホット」実験計画［Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０７：２２０−２３９（１９８０）］において放射性ヨウ素化ＭＡｂ１２Ａ７の両者を用いて実験を行った。過剰な非標識化１２Ａ７を同様の２つのチューブに加え、非特異的結合性を算定した。ＭＡｂ１２Ａ７の血小板に対する結合性は飽和でき、阻害し得ることが見いだされた（９９％）。休止血小板に対する１２Ａ７結合部位の数は比較的少ないので（第３図参照）、活性化血小板を試験するよりも、１チユーブ当たり１．００倍以上の休止血小板を使用する必要がある。結合性データをリガンド・プログラム［Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、＾ｎａｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０７：２２０−２３９（１９８０月を使用して分析した。得られたデータのスカッチャード変換（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を第５図に示す。ＭＡｂ　１２Ａ７は活性化血小板当たり１４．２００±１１００分子が、休止全小板当たり２９０±３０分子が存在している結合部位の単一のクラスを認識した。活性化血小板に対する抗体結合性の計算された解離定数は６．４４±０．６６Ｘ１０’ Ｍであった。

初めの実験ではＴＡＰＰ−２は休止血小板の表面には有意な量で検出することができないことが示された。このことは、ＴＡＰＰ−２が細胞活性化の前では細胞内タンパク質である可能性を示している。結果として、我々は洗浄剤−細胞溶解体止血小板に対して免疫プロッティング実験を行った。変性条件下での電気泳動の後、血小板溶解物をポリビニリデンジフルオライド膜に移し、ＭＡｂ１２Ａ７を用いてブロービングした。免疫プロットは、ＭＡｂ１２Ａ７がＭｒ〜１２０ｋｄの単一のバンドとしてＴＡＰＰ−２を同定することが示された。この分子重量は、放射線標識化活性化血小板の細胞溶解物由来の、ＭＡｂ１２Ａ７によって免疫沈降されたものと同じであった。

ＴＡＰＰ−２が膜又は細胞質の細胞画分に存在しているか否かを調べるため、血小板を音波処理、トリトンｘ−ｉｏｏ又はトリトンＸ−１１４により細胞溶解した。免疫プロッティングを行い、各細胞溶解物由来の上清におけるＴＡＰＰ−２の存在を検出した。ＴＡＰＰ−２は超音波溶解の後の上清には検出されなかったが、トリトンＸ−１００及びトリトンＸ−１１４による洗浄剤溶解後の上清では容易に検出することができた（レーン２−４）。従って、このような洗浄剤画分へのＴＡＰＰ−２分配は疎水性の膜関連タンパク質に最も符号している。

次いで、ＴＡＰＰ−２を免疫アフィニティークロマトグラフィーによって休止血小板の洗浄剤抽出物から精製した。洗浄剤−可溶化血小板をセファロースに固定化したＭＡｂ１２Ａ７のアフィニティーカラムに通した。このカラムを高塩緩衝液及び洗浄剤で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次いで、タンパク質を０．２Ｍグリシン、ｐＨ２，７で溶出させた。溶出したタンパク質を還元条件下の分析用５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけ、次いで銀染色することで、精製した還元ＴＡＰＰ−２が分子量〜１２０ｋｄを有することが示された。３つの実験から得られた平均（±Ｓ、Ｄ、）の還元分子重量は１１７±７ｋｄであった。

非還元タンパク質の平均（±Ｓ、Ｄ、）分子重量は１０９±５ｋｄであった（６つの実験）。ＴＡＰＰ−２は銀染色及び免疫プロッティングの後では鋭いバンドとして現れるが、このことはＴＡＰＰ−２が全くグリコリル化されていないことを示している。ＴＡＰＰ−２をエンドグリコシダーゼＦによって一晩消化させると、その分子重量は僅かに１４ｋｄＬか減少しなかった（１．１８−１．０４ｋｄ）。精製ＴＡＰＰ−２はｐｌ＝６．　０−６．　５を有していることが見いだされた。

考察本発明者らは、トロンビン活性化血小板の表面に存在する新規なタンパク質抗原に対してモノクローナル抗体８Ｂ６を生成させた。このトロンビン活性化血小板タンパク質（ＴＡＰＰ−１）を免疫精製し、アミノ末端のアミノ酸を配列決定した。これまで記載されていなかったアミノ酸配列を含むことがわかった。５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析から、ＴＡＰＰ−１はＭｒ　〜２５０ｋｄのコンプレックスのようである。予備試験のデータは、ＴＡＰＰ−１がジスルフィド結合した３本の鎮からなることを示唆した。〜１３８ｋｄの１本の鎖は、その染色パターンから糖タンパク質のようである。次に大きい鎖（複数）は平均Ｍｒが〜５６ｋｄのトリプレットからなる。最も小さい鎖は〜４２ｋｄのようであった。

最近、他の研究者らは、活性化タンパク質の表面に選択的に発現されるタンパク質を同定した［Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓら、「活性化血小板の検出の際のモノクローナル抗体パネルの利用Ｊ、　ＡＳＨ５ａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｓｙ＋ｎｐｏｓｉｕａ＋において、　Ａｔ１ａｎｔａ、　ＧＡ（１９８９）ＨＨａｙｗａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ　７６　（Ｓｕｐｐｌ、１）：４５８Ａ　（１９９０）：　Ｈｓｕ− Ｌｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌ、２５X：９１２１−９１２６　（１９８４）、およびＭｃＥｖｅｒ、Ｇ、Ａ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９：９７９９−９８０４　（１９８４）n。これらの中で最もよく特徴付けられているのは、ＧＭＰ−１４０またはＰＡＤＧＥＭタンパク質である［ＭｃＥｖｅｒ、　Ｇ、＾、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９：９７９９−９８０４　（１９８４）コ。重要なことは、還元５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析において、ＴＡＰＰ−１の１本の鎖がＰＡＤＧＥＭ／ＧＭＰ−１４０（１４８ｋｄ）に対して同等であるが同一ではない分子量（１３８ｋｄ）を有することである［１ｉｃＥｖｅｒ、　Ｇ、＾、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌ、　２５９：９７９９−９８０４　（１９８４）：およびＩ（ｓｕ−Ｌｉｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５９：９１２１−９１２６　（１９８４）］。しかし、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＴＡＰＰ−１はＭｒ〜２５０の単一バンドとして移動し、これはＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭタンパク質に対して報告されている１３８ｋｄとは大きく異なっている。さらに、ＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭのＮ−末端配列に対するポリクローナル抗血清はＴＡＰＰ−１と交差反応しない。最後に、ＴＡＰＰ−１から得たアミノ酸配列は、ＧＭＰ　１４０／Ｐ、ＡＤＧＥＭタンパク質に対して報告されている配列とは異なっている［Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、　Ｃｅ１ｌ　５６：１０３３−４４（１９８９）］。ヒト血小板中の他の報告されている活性化依存性抗原のどれもＴＡＰＰ−１に類似した分子量を有していない［Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓら、「活性化血小板の検出の際のモノクローナル抗体パネルの利用」、ＡＳＨ５ａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍにおいて。

Ａｔ１ａｎｔａ、　ＧＡ　（１９８９）ＨＧｒａｌｎｉｃｋら、　Ｂｌｏｏｄ　７６　（Ｓｕｐｐｌ、　１）＋４５７＾（１９９０）　；お謔■Pｌａｙｖａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ　７６　（Ｓｕｐｐｌ、ｌ）：４５８＾（１９９０）］。

ＴＡＰＰ−１が活性化血小板の表面に発現されるようになる機序は不明である。

この抗原が２つのタンパク質の組合せからなり、これらが血小板集合の後に共に結合することになる可能性がある。２またはそれ以上の分子の結合によるこの新しいタンパク質エピトープの創製は、Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２６５：６３４６−６３５２（１９９０）］により「受容体誘導の結合部位」または「リガンド誘導の結合部位」と呼ばれている。また、この抗原は、存在する血小板タンパク質の酵素修飾の結果としてトロンビン活性化の後に創製されることもある。［゛酵素創製エピトープ」と呼んでもよいこの現象を利用して特異的なＭＡｂが調製されている［ｔｌｕｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２：２１１２９−１１３１　（１９８３）；　Ｌｕｋａｃｏｖａら、［抗ペプチド、モノクローナル抗体による因子ｎＩＩ活性化の阻害上未公表（１９９１）］。しかし、休止している全血小板を用いた結合の研究によっては有意量のＴＡＰＰ− １は検出されなかったので（可溶化した休止全血小板の免疫プロットによってこれが検出された）、このタンパク質は血小板中に存在し、活性化と分泌の後にのみ利用可能になるようである（ＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭに類似している）。

糖タンパク質が血小板中で多くの機能的役割を果すことが示されている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはＧＰＴｂのようにいくつかは、集合または吸着に必要なタンパク質リガンドと結合する。他のものは、血小板アゴニスト（例えば、アグレギン）の「真の」受容体であることが示されている［Ｃｏｌｅｍａｎ、　Ｒ，ｆ、　、Ｈｅａ＋ａｔｏｌｏｇｙ１０ｎｃｏｌｏｇｙＣ１ｉｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ：　２７−４２　（１９９０）］。その他のタンパク質はトロンビンのようなタンパク質の結合部位であることが示されているが、それらの重要性ははっきりしないままである（例えば、ＧＰＶ）。また、活性化依存性の血小板抗原は、他の血管細胞との相互作用の合図を送る手段であるのかもしれない（ＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭの場合がそうであろう）。現在のところ、本発明者らはＴＡＰＰ−１の機能的意義を知らないし、また、このタンパク質がトロンビン以外のアゴニストによって刺激された血小板上で発現されるか否かを決定するための徹底的な実験を行なっていない。これらの疑問に答えるための研究は進行中である。

細胞性の活性化依存性抗原は、インビトロでの休止および活性化血小板の識別研究のための強力な方法を与える。さらに、これらの抗原を識別する抗体または他のプローブは、インビボで血小板血栓を同定または標的化するのに有用であろう。血小板密度またはある種の活性化依存性抗原の数は血小板年齢によって変化するようであるので［Ｓａｖａｇｅら、　Ｂｌｏｏｄ　７４：１００７−１０１４　（１９８９）コ、これらの変化を利用して、時間とともに血小板血栓中に現れる分子変化を研究することができる本発明者らは、ＡＤＰ、Ａ２３１８７およびトロンビンによる細胞活性化の後に血小板表面上で容易に検出することができる〜１２０ｋｄのタンパク質抗原を識別するモノクローナル抗体を調製した。全細胞結合実験により、ＴＡＰＰ−２が休止血小板上に痕跡量（〜３００分子／細胞）で存在すること、およびその発現がトロンビンによる血小板活性化の後にはほぼ５０倍に増加することがわかった。

外側の血小板膜タンパク質を放射ラベルしたときに、ＴＡＰＰ−２は活性化後の血小板からの免疫沈殿物においてオートラジオグラフィーによって検出することができたにすぎない。しかし、休止全血小板を清浄剤中で可溶化したときには、ＴＡＰＰ−２を免疫プロットで検出することができた。細胞を超音波処理によって溶解したときには、ＴＡＰＰ−２は水性上清中に放出されなかった。しかし、トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−１１４で溶解した後には、清浄剤により上清中にＴＡＰＰ−２が抽出された。このパターンは膜結合タンパク質に典型的なものである。

３タイプの血小板活性化抗原がＭＡｂによって同定されている［概説については＾ｂｒａ銘および５ｈａｔｔｉｌ　（１９９１）を参照］。第１タイプの血小板活性化抗原は、血小板活性化の結果として、または受容体もしくはりガントへの結合の結果として、独特の立体配座をとる［例えば、Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２６５：６３４６−６３５２　（１９９０）コ。このＭＡｂはこの独特の立体配座を認識し、従って活性化血小板に結合する。このタイプの活性化抗原の例には、フィブリノーゲンおよび糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＨａ分子が含まれる。しかし、ＭＡｂ１２Ａ７は、ＳＤＳによってＴＡＰＰ−２の立体配座が破壊された後であっても他のタンパク質の非存在下でＴＡＰＰ−２だけに結合するので、ＴＡＰＰ−２がこのタイプの活性化抗原であるとは考えにくい。

別のタイプの血小板活性化抗原が血小板によって放出され、活性化後に血小板膜に結合するようになる。通常、これらのタンパク質は低濃度で血漿中にも見い出される（例えば、トロンポスポンジン、因子Ｖなど）。本発明者らの実験はＴＡＰＰ−２が評価しつる濃度で血漿中に存在しないことを示すので、ＴＡＰＰ−２はこのタイプの抗原ではないようである。さらに、ＴＡＰＰ−２は細胞の超音波処理後の水相中に検出されず、むしろ溶解のために清浄剤を必要とするようであった。

第３タイプの活性化抗原は、顆粒融合後に血小板の外部膜表面に結合することになるタンパク質である（表■を参照）。多くのこれらタンパク質と同様、ＴＡＰＰ−２は溶解のための清浄剤を必要とするようであり、その発現はトロンビンによる活性化の後に血小板膜上で最も強力に誘導される。ＴＡＰＰ−２の正体を決定するために、本発明者らはその分子の特徴を他のこのタイプの血小板活性化抗原の特徴と比較した（表■）。

ＴＡＰＰ−２の分子量は、２つの他の一本鎖タンパク質ＬＡＭＰ−１およびＧＭＰ−１４０に最も近い。しかし、ＴＡＰＰ−２は活性化された血小板あたりに発現される分子数がＬＡＭＰ−１とは顕著に異なっている（それぞれ、１４．２００と１２００〜２２００）。さらに、ＬＡＭＰ−■とは異なり、ＴＡＰＰ−２はトロンビンによる発現のための細胞外Ｃａ”″に対して感受性ではないようである。

さらにＬＡＭＰ−１とは対照的に、ＴＡＰＰ−２はＡＤＰによって誘導されることができ、分子量において同じ量の不均質性を示さないようであり、そのｐＩは有意に酸性度が低い。活性化された血小板は、細胞あたりに類似した数のＴＡＰＰ−２およびＧＭＰ−１４０のコピーを発現する。しかし、ＴＡＰＰ−２およびＧＭＰ−１４０の分子量の間に顕著な相違が存在する。さらに、ＧＭＰ−１４０とは異なり、ＴＡＰＰ−２はエピネフリン刺激した血小板に対する有意の結合を全く示さなかった［Ｈｓｕ−Ｌｉｎら（１９８４）］。これら全体から、ＴＡＰＰ−２と他の血小板活性化抗原の間の上記相違は、ＴＡＰＰ−２がこれまで知られていなかった血小板タンパク質であることを示唆する。

表１．血小板活性化抗原抗　原　非還元（還元）　活性化　休止ＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ）’　１４０（１５０）　〜１０．０００　＜　１０００１０００ＬＡ　２　１１０−１２０　１．２００　≦９０ＣＤ−６３３３０−６０（３０−６０）　１２．６００　６５０Ｐ−１５５’　１５５−多量体　４．１００　６００グラニユロフインン５４０（４０）　−−Ｔ　Ａ　Ｐ　Ｐ−１６２５０（１３ｇ、５６．４２）　〜１０，０００　−ＴＡＰＰ−２１１０（１２０）　１４．２００　３００’ 　ｌ１ｓｕ−Ｌｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：９１２１−９１２６　（１９８４）；ＭｃＥｖｅｒおよびＭａｒｔｉｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９：９７９９−９８０４　（１９８４）；”　Ｆｅｂｂｒａｉｏおよび５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　２６５：１８５３１− １８５３７　（１９９０）；’　Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓら、Ｂｌｏｏｄ　７０：８３８−８４５　（１９８７）：’　ｆＩａｙｗａｒｄら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：７１１４−７１２０　（１９９１）；’　Ｇｅｒｒａｒｄら、　Ｂｌｏｏｄ　７７：１０１−１１２　（１９９１）；６本発明。

外部膜タンパク質は血小板において多くの機能的役割を果す。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびＧＰＩｂのようにいくつかは、集合または吸着に必要なタンパク質リガンドと結合する。他のものは、ＡＤＰまたはトロンビンのような血小板アゴニストの受容体である［Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｒ，？、、　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙｌｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｎ、　Ａ１１．４：　２７−４２@（１９９０）；　Ｖｕら、　Ｃｅ１ｌ　６４：　１０５７−１０６８　（１９９１）コ。その他のタンパク質はトロンビンのようなタンパク質の結合部位であることが示されているが、それらの重要性ははっきりしないままである（例えば、ＧＰ −Ｖ）。活性化された血小板上での独特の発現があるとすれば、活性化依存性の血小板抗原は、ＧＭＰ−１４０／ＰＡＤＧＥＭに対して示唆されているように［Ｌａｒｓｅｎら、　Ｃｅ１ｌ　５９：　３０５−３１２　（１９８９）コ、血小板が他の血管細胞に合図を送るかまたはそれらと相互作用する手段であるのかもしれない。

現在のところ本発明者らはＴＡＰＰ−２の目的を知らないが、休止血小板上にそれがほとんど存在しないことおよびトロンビン活性化された細胞上での突出した発現はこれが重要な機能的役割を果すことを示唆する。Ｔ−細胞特異的な抗原の研究によって例示されるように、血小板活性化抗原の研究は細胞機能および細胞相互作用に一層の知見を与えるであろう。これらの血小板活性化抗原を識別するプローブは、インビボで血小板血栓を同定または標的化するのに有用であり、傷治癒およびアテローム性動脈硬化症などの過程において血小板と他の細胞の間で起こる複雑な相互作用を研究する手段を与えるであろう。

ハイブリドーマセルライン８Ｂ６は１９９１年９月１６日にＡ　Ｔ　ＣＣ［Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ］に寄託され、受託番号ＨＢ１０８７０を受けている。

ＨＢ１０８７０は１９９２年１０月１日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

以上の本発明の好ましい態様の記述は例示および説明のために挙げたものである。この記述は完全であることまたは開示した態様に本発明を限定することを意図したものではなく、明らかに多くの修飾および変化が上記の教示に照らして可能である。これらの態様は、本発明の本質およびその実際的な適用を最もうま（説明し、それによって当業者が本発明を種々の態様において、そして意図した特定の用途に好都合なように種々の修飾を加えて最良の利用ができるようにするために選択し記載したものである。本発明の範囲は、本明細書に添付した請求の範囲に規定されるものとする。

ｌｏｇ血小板計数結合　（ｎＭ）ＦＩＧ、　２活性化　休止血小板ＦＩＧ、　３結合　１２Ａ７　ＭＡｂ　（ｃｐｍ）ＦＩＧ、　４結合（ピコモル濃度）　結合（ピコモル濃度）ＦＪＧ−５Ａ　ＦＩＧ、　５８フロントページの続き（５１）　ＩｎＬ　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｎ　９２８４−４ＣＧＯＩＮ　３３１５３　Ｋ　８３１０−２ＪＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．トロンビン活性化血小板の表面に選択的に発現される実質的に精製されたタンパク質であって、約２５０ｋｄの分子量を有し、８Ｂ６の結合特異性を有する抗体によって認識されるタンパク質。
２．タンパク質がＴＡＰＰ−１である請求項１に記載のタンパク質。
３．請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
４．抗体がポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそのフラグメントである請求項３に記載の抗体。
５．抗体がモノクローナル抗体である請求項４に記載の抗体。
６．モノクローナル抗体が８Ｂ６である請求項５に記載の抗体。
７．トロンビン活性化血小板の表面に選択的に発現される実質的に精製されたタンパク質であって、約１２０ｋｄの分子量を有し、１２Ａ７の結合特異性を有する抗体によって認識されるタンパク質。
８．タンパク質がＴＡＰＰ−２である請求項７に記載のタンパク質。
９．請求項７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
１０．抗体がポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそのフラグメントである請求項９に記載の抗体。
１１．抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
１２．モノクローナル抗体が１２Ａ７である請求項１１に記載の抗体。
１３．活性化された血小板を検出するための方法であって、トロンビン活性化血小板タンパク質の存在を測定することからなる方法。
１４．トロンビン活性化血小板タンパク質がＴＡＰＰ−１である請求項１３に記載の方法。
１５．トロンビン活性化血小板タンパク質がＴＡＰＰ−２である請求項１３に記載の方法。
１６．トロンビン活性化血小板タンパク質に特異的に結合する抗体であってラベルした抗体を用いて該トロンビン活性化血小板タンパク質の存在を検定することからなる請求項１３に記載の方法。
１７．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６に記載の方法。
１８．モノクローナル抗体が８Ｂ６である請求項１７に記載の方法。
１９．モノクローナル抗体が１２Ａ７である請求項１７に記載の方法。
２０．血栓に対する治療薬物を標的化するための方法であって、トロンビン活性化血小板のタンパク質に特異的に結合する抗体に該薬物を結合させ、該抗体／治療薬物を投与することからなる方法。
２１．抗体がモノクローナル抗体である請求項２０に記載の方法。
２２．モノクローナル抗体が８Ｂ６である請求項２１に記載の方法。
２３．モノクローナル抗体が１２Ａ７である請求項２１に記載の方法。
２４．治療薬物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ、またはチスイコウモリプラスミノーゲン活性化因子からなる群から選ばれる請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．治療薬物が活性化プロテインＣ、ヒルジン、および因子ＶＩＩＩ阻害物質からなる群から選ばれる請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
２６．患者の血栓を処置するための方法であって、トロンビン活性化血小板タンパク質に特異的に結合する抗体と治療薬物からなる組成物の有効量を投与することからなる方法。
２７．組成物が、治療薬物からなる第２のタンパク質に結合させた、トロンビン活性化血小板タンパク質に特異的な抗原結合部位を有するキメラの免疫グロブリン分子である請求項２６に記載の方法。
２８．トロンビン活性化血小板のタンパク質がＴＡＰＰ−１である請求項２７に記載の方法。
２９．トロンビン活性化血小板のタンパク質がＴＡＰＰ−２である請求項２７に記載の方法。
３０．治療薬物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ、またはチスイコウモリプラスミノーゲン活性化因子からなる群から選ばれる請求項２７に記載の方法。
３１．患者の血栓を検出するための方法であって、（ａ）トロンビン活性化血小板タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する組成物を投与し、そして（ｂ）結合した抗体の存在を検出する、ことからなる方法。
３２．トロンビン活性化血小板タンパク質がＴＡＰＰ−１である請求項３１に記載の方法。
３３．トロンビン活性化血小板タンパク質がＴＡＰＰ−２である請求項３１に記載の方法。
３４．抗体がラベルされている請求項３１に記載の方法。
３５．抗体が放射ラベル、酵素ラベルまたは磁気ラベルされている請求項３２に記載の方法。
３６．抗体がモノクローナル抗体である請求項３３に記載の方法。
３７．モノクローナル抗体が８Ｂ６である請求項３６に記載の方法。
３８．モノクローナル抗体が１２Ａ７である請求項３６に記載の方法。