JPH10513365A - 粘膜血管アドレシンおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする単離された及び／又は組換え核酸、及び本発明で単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭと称した蛋白質又はポリペプチドに関する。さらに本発明は、本発明の霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸、その一部分、又は変異体を含有する核酸構築物；そのような構築物を含有し、組換え蛋白質の生産に有用である宿主細胞；霊長類ＭＡｄＣＡＭの機能の阻害剤（例えば、アンタゴニスト）を同定するアッセイにおける核酸及び／又は蛋白質の使用；及びインビトロ法である診断及び／又は治療応用に有用である、霊長類ＭＡｄＣＡＭと反応する抗体、に関する。本発明は、胃腸管又は他の器官への白血球補充に関連する疾患（例えば、炎症性腸疾患など）を患った個体、特にヒトの治療、例えば、ＭＡｄＣＡＭ分子（腸関連内皮）を発現する細胞への白血球の結合の結果、白血球のＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害する抗体等の、有効量の薬物を個体へ投与することを含む治療に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 粘膜血管アドレシンおよびその用途 関連出願 本願は、１９９５年９月１日に出願された米国出願番号０８／５２３，００４ （代理人事件番号ＬＫＳ９４−０４Ａ）の一部継続出願である、１９９５年２月 ２０日に出願された米国出願番号０８／３８６，８５７（代理人事件番号ＬＫＳ ９４−０４）の一部継続出願であり、それらの教示は全て、それぞれ参考として 本明細書の一部を構成する。発明の背景 循環系からリンパ組織へのリンパ球の帰還と、炎症部位へのリンパ球の移動は 、二次リンパ組織（例えば腸間膜リンパ小節やパイエル斑（ＰＰ）に見られる高 内皮性後毛細管小静脈（ＨＥＶ）を含む後毛細管小静脈で発現したレセプターと の相互作用によって調節される。Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ．Ｐ．，Ａｎｎ．Ｒ ｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１： ７６７−８０４（１９９３）；Ｂｕｔｃｈｅ ｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７：１０３３−１０３６（１９９１）；Ｐｉｃｋｅ ｒ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５６１−５９１（ １９９２）；及びＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１−３１ ４（１９９４））。これらの相互作用は本質的に組織特異的である。 炎症（慢性炎症など）は、リンパ球、リンパ芽球及び単核食細胞などの白血球 による、冒された組織の浸潤を特徴とする。通常の循環中や炎症中に、白血球が 種々の組織に選択的に移動する際の著しい選択性は、Ｂｕｔｃｈｅｒその他が提 唱するところによると、複数のレセプター−リガンド相互作用が関与する一連の 接着と活性化によってもたらされる（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６ ７：１０３３−１０３６（１９９１）；ｖｏｎＡｄｒｉａｎ，Ｕ．Ｈ．ら，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ，８８：７５３８（１９９１）；Ｍ ａｙａｄａｓ，Ｔ．Ｎ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：５４１（１９９３）；Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１（１９９４））。初期段階として、 白血球と内皮の間に一過性の回転相互作用があるが、これはセレクチン類（場合 によってはα４インテグリンも関与）とその炭水化物リガンドとの相互作用によ ってもたらされる。血流方向への回転を特徴とするこの相互作用は、公知の方法 で評価できる（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｂ．及びＴ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ ｅｌｌ，６５：８５９（１９９１）；ＷＯ９２／２１７４６，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ら（１９９２年１２月１０日））。この相互作用に続いて、ケモカインのような 化学誘引物質とそのレセプターによって媒介される活性化が起こり、それがイン テグリン接着性の活性化事象を引き起こし、血管壁を通過する白血球の移動方向 に影響を与える。このような二次シグナルが、今度は、白血球インテグリンとそ の内皮リガンド（Ｉｇ様レセプターとＥＣＭ）を介して内皮に対する白血球の強 固な接着と、それに続く、血管内皮を横切って起こる循環系からの経内皮移動と を誘発する。 パイエル斑（ＰＰ）やリンパ小節（例えば末梢リンパ小節（ＰＬＮ））などの 二次リンパ組織では、白血球の通行と帰還が、白血球表面の帰還レセプターと後 毛細管小静脈を裏打ちする内皮細胞（特に高内皮性後毛細管小静脈（ＨＥＶ）） との相互作用によって調節される（Ｇｏｗａｎｓ，Ｊ．Ｌ．及びＥ．Ｊ．Ｋｎｉ ｇｈｔ，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，１５９：２５７（１９６４））。 血管アドレシン（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）と呼ばれるレセプタ ー群は、内皮細胞表面に存在し、白血球亜集合の移動とそれに続く管外溢出を調 節する。血管アドレシンは制限された発現パターンを示し、その組織特異的発現 は、白血球通行の特異性に重要な貢献をしている（Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら， およびＥ．Ｃ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５ ６１−５９１（１９９２）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｉｎａｔｉｏ ｎ，２：１１１（１９９１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ，６７：１ ０３３−１０３６（１９９１））。 粘膜血管アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１（粘膜アドレシン細胞接着分子−１）は リンパ球に対する免疫グロブリンスーパーファミリー接着レセプターであり、Ｖ ＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１とは異なる。ＭＡｄＣＡＭ−１は、リンパ球管外溢出 部位に選択的に発現される約６０ｋｄ糖蛋白質として、マウスで同定された。具 体的に述べると、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、パイエル斑や小腸及び大腸の基底 膜の後毛細管小静脈のような腸−関連組織またはリンパ器官を含む粘膜組織の血 管内皮細胞、および泌乳性乳線で報告されているが、末梢リンパ小節では報告さ れていない。ＭＡｄＣＡＭ−１は、パイエル斑に対するリンパ球の結合に関与す る（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：４１−４６（１９ ８８）；Ｎａｋａｃｈｅ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：１７９−１８１（１ ９８９）；Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １０：５６１−５９１（１９９２）；Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒ ｅ，３６３：４６１（１９９３）；Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６ ６：６９５−６９８（１９９３）；Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，７４：１ ８５−１９５（１９９３））。ＭＡｄＣＡＭ−１は、プロ炎症刺激によって、イ ンビトロで誘導されうる（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｅ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５１：５２３９−５２５０（１９９３））。 ＭＡｄＣＡＭ−１は、パイエル斑への帰還に関与するリンパ球帰還レセプター であるリンパ球インテグリンα４β７（ＬＰＡＭ−１（マウス）、α４βｐ（マ ウス）とも呼ばれる）と特異的に結合する（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ， ８０：４１３−４２２（１９９４）；Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，７４： １８５−１９５（１９９３）；およびＥｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，１５３：５１７−５２８（１９９４））。α４β１とα４β７の両方と相 互作用するＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｃ．ら，Ｃｅ ｌｌ，７４：１８５−１９５（１９９３）；Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｕ．Ｓ．ら，Ｉｎ ｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：２６３（１９９４））とは対照的に、ＭＡｄＣＡＭ −１はα４β７に対する選択的レセプターである。 例えば潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管 の炎症が関与する衰弱性及び進行性の疾患でありうる。米国だけでも推定２００ 万人の人々を冒している症状には、腹痛、さしこみ、下痢および直腸出血などが ある。ＩＢＤ治療には、抗炎症剤（コルチコステロイドおよびスルファサラジン など）、免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、シクロスポリンおよびアザチオプ リンなど）及び外科手術（結腸切除など）などが用いられている。Ｐｏｄｏｌｓ ｋｙ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：９２８−９３７（１９９１ ）及びＰｏｄｏｌｓｋｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：１００８ −１０１６（１９９１）。 いくつかの研究によって、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１が、白血球表面リガンド 、すなわちＭａｃ−１またはＬＦＡ−１に対する接着を介して、炎症部位への白 血球補充を媒介することが示唆されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ， ３４６：４２５−４３４（１９９０））。また、α４β１インテグリン（ＶＬＡ −４）を認識する血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は、インビボにおける 白血球補充に役割を果たしているとも報告されている（Ｓｉｌｂｅｒら，Ｊ．Ｃ ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１５５４−１５６３（１９９４））。ＩＣＡＭ− １とＬＦＡ−１またはＭａｃ−１との相互作用や、ＶＣＡＭ−１とα４β１との 相互作用を阻害することによって、ＩＢＤを治療できるとの提案がある（例えば ＷＯ９３／１５７６４）。しかしながら、これらの治療標的は複数の器官の炎症 プロセスに関与すると思われ、機能の阻害は全身的な免疫機能不全を引き起こし かねない。 ＶＣＡＭ−１やＩＣＡＭ−１とは対照的に、ＭＡｄＣＡＭは胃腸管に選択的に 発現され、リンパ球上に認められるα４β７インテグリンを結合し、これらの細 胞の、粘膜部位（腸壁のパイエル斑など）への帰還に関与する（Ｈａｍａｎｎら ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２：３２８２−３２９３（ １９９４））。ＭＡｄＣＡＭの、そのレセプターα４β７との結合に対して阻害 因子を使用することは、これまで提案されていない。さらに、ヒトのα４及びα ７の遺伝子と蛋白質は同定されているが（Ｙｕａｎら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．２：１０９７−１１０８（１９９０）；Ｅｒｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．，２６６：１１００９−１１０１６（１９９１）；Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｍ ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：７６７−８０４（１９９ ３）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，７６：３０１−３１４（１９９ ４））、ヒトまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１はまだクローン化や特徴づけがなさ れていない。発明の要約 本発明は、以下、単離及び／又は組換え（例えば本質的に純粋な）霊長類ＭＡ ｄＣＡＭと呼ぶ、蛋白質またはポリペプチドに関する。一態様として、霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭは、α４β７インテグリンを発現する細胞（具体的にはリンパ球）に 選択的に結合できる。本発明の組換え蛋白質は変異体を含み、本明細書に記載の 宿主細胞で生産できる。さらに、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体 を免疫原として用いることにより、本発明の蛋白質と反応する抗体を生産するこ とができる。このような抗体またはその断片は、治療、診断及び研究に有用であ る。例えば、これらの抗体は、ＭＡｄＣＡＭの精製と研究、ＭＡｄＣＡＭを発現 する細胞の同定、試料中のＭＡｄＣＡＭの検出または定量などに使用できる。 さらに本発明は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（ヒトＭＡｄＣＡＭなど）をコードする 単離及び／又は組換え（例えは本質的に純粋な）核酸に関する。さらに他の側面 として、本発明は、本発明の蛋白質またはその一部をコードする核酸を含有する 、プラスミドやレトロウイルスベクターなどの組換え核酸構築物に関する。該核 酸と構築物を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを製造するために使用することがで きる。他の態様として、本発明の核酸は、霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする二番 目の核酸とハイブリッド形成することができ、かつ、（例えば細胞中に導入され た場合に）その蛋白質の発現を阻害できるアンチセンス核酸をコードする。 また、ＭＡｄＣＡＭ機能のリガンド及び／又は阻害因子（例えばアンタゴニス ト）を同定する方法も、本発明に包含される。例えば、ＭＡｄＣＡＭとそのリガ ンドα４β７インテグリンとの結合を阻害するアンタゴニストを同定するために 設計されたアッセイ法（例えば接着アッセイ法）に、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（変異 体を含む）を使用できる。 さらに本発明は、治療法（ＭＡｄＣＡＭ分子を発現する腸−関連内皮に対する 白血球結合の結果として起こる胃腸管や他の組織への白血球（リンパ球や単球な ど）補充に関連する疾患に冒された個体の治療法を含む）であって、その個体（ 例えば、霊長類などの哺乳類）に、内皮ＭＡｄＣＡＭに対する白血球の結合を阻 害する薬物または化合物（抗体など）の有効量を投与することを含む治療法にも 関係する。抗体はモノクローナル抗体、キメラ及び／又は人体に適合させた抗体 またはその抗原結合性断片であることが好ましく、β７鎖を含有するインテグリ ン（α４β７など）を発現する白血球の、ＭＡｄＣＡＭを発現する内皮への接着 を阻害する。ある態様では、そのようなモノクローナル抗体またはその抗原結合 性断片が、ＦＩＢ２１、ＦＩＢ３０、ＦＩＢ５０４及びＡＣＴ−１からなる群よ り選択されるモノクローナル抗体の抗原特異性を持つ。本願の請求された方法に よって、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性結腸炎、クローン病、窩炎（Ｐｏｕｃｈｉ ｔｉｓ）、腹腔疾患、微細（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）またはコラーゲン蓄積大 腸炎及び好酸球性胃腸炎などを、ただしこれらに限られるわけではないが、治療 できる。図面の簡単な説明 図１は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体４のサブクロ ーン体から決定したヌクレオチド配列（配列番号１）と、そのオープンリー ディングフレームによってコードされる予想される蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ −１；配列番号２）を表す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域 に太い下線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を、潜在的Ｎ 結合型グリコシル化部位と同様に囲んである。７１アミノ酸からなり、ＰＰＤＴ ＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅ反復を含有するムチンドメインを、細い線で囲んである。 図２は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体２０のサブク ローン体から決定したヌクレオチド配列（配列番号３）と、そのオープンリーデ ィングフレームによってコードされる予想蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ−１；配 列番号４）を示す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域に太い下 線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を、潜在的Ｎ結合型グ リコシル化部位と同様に囲んである。４７アミノ酸からなり、ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ ／Ｐ）Ｅ反復を含有するムチンドメインを、細い線で囲んである。 図３は、アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡクローン体３１Ｄ のサブクローン体から決定した核酸配列（配列番号５）と、そのオープンリーデ ィングフレームによってコードされる予想される蛋白質の配列（ＭＡｄＣＡＭ− １；配列番号６）を示す図である。予想されるシグナルペプチドと膜貫通領域に 太い下線を引いてある。２つのＩｇ様ドメインのシステイン残基を囲んである。 ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅ反復を一つだけ含有するムチンドメインを、細い線で 囲んである。 図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を形質導入した細胞の、α４β７を発 現するリンパ球に対する選択的結合を表すヒストグラムである。図４Ａは、α４ β７を発現する（α４β１は発現しない）ＲＰＭＩ８８６６細胞（０．５×１０⁶ ／ウェル）が、ネズミまたはヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＣＨＯ／Ｐ細胞 には結合するが、ヒトＶＣＡＭ−１を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞や、ｐｃＤＮ Ａ−３を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞には結合しないという実験結果を示してい る。図４Ｂは、ヒトＶＣＡＭ−１を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞が、Ｊｕｒｋａ ｔ細胞（これは高レベルのα４β１を発現する）には結合するが、ネズミまたは ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞や、対照としてのｐｃＤＮ Ａ−３を形質導入したＣＨＯ／Ｐ細胞には結合し得なかったという実験結果を示 している。結合は、ＣＨＯ／Ｐ細胞１個あたりに結合したＲＰＭＩ８８６６細胞 数（図４Ａ）か、ＣＨＯ／Ｐ細胞１個あたりに結合したＪｕｒｋａｔ細胞の数を 、少なくとも４つの視野（１０×対物レンズ）の平均値±標準誤差として示して ある。表に示すように、結合反応には、対照ＩｇＧ、抗α４β７（モノクローナ ル抗体ＡＣＴ−１）、または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（モノクローナル抗体Ｍ ＥＣＡ−３６７）を含めた。 図５は、クローン体４及び２０によってコードされているヒトＭＡｄＣＡＭ− １がＲＰＭＩ８８６６細胞を結合し、その結合がＡＣＴ−１抗体によって阻害さ れることを示すヒストグラムである。棒は、１回の実験の４つの視野の平均値を 、標準偏差と共に表している。 図６は、ネズミ及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１の推定ドメイン構造を表す図である 。細胞接着に関係する、ジスルフィド結合で結合した２つのＮ末端免疫グロブリ ンドメイン（輪で示した部分）、膜貫通領域及び細胞質テイルが、ネズミ、アカ ゲザル及びヒト蛋白質に存在する。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１は、より長い細胞質テ イルを持つ。ムチンドメインに認められる８アミノ酸反復は、ヒトイソ型には４ または８コピー存在するが、ネズミとアカゲザルには１回しか現れない。 図７Ａ及び７Ｂは、飲用水中のＤＳＳに１０日間さらされたマウスの左（下行 ）及び右（上行）結腸から得た、炎症活性と上皮損傷の組織学値を表すグラフで ある。無関係なラットＩｇＧ２ａ抗体、ＦＩＢ２１抗体またはＦＩＢ３０抗体を 与えた３群のマウスを示す。 図８は、飲用水中のＤＳＳを１０日間与えたマウスから得た、１分あたりのγ カウント（ｃｐｍ）（±ＩＳＥＭ）を、総投入カウントの百分率として表すグラ フである。水のみを与えた陰性対照群、ＤＳＳのみを与えた陽性対照群、無関係 なラットＩｇＧ２ａ抗体、ＦＩＢ２１、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ２１とＭ ＥＣＡ−３６７を与えた試験群からなる６群を示す。 図９は、２ｍｇ／ｋｇ／日のＡＣＴ−１モノクローナル抗体による処置の前及 び１４日後の普通のマーモセットの空腸生検試料から得た、絨毛融合に関する組 織学的値（±１ ＳＥＭ）を表すグラフである。 図１０は、２ｍｇ／ｋｇ／日のＡＣＴ−１モノクローナル抗体による処置の前 及び１４日後の普通のマーモセットの空腸生検試料から得た、絨毛萎縮に関する 組織学的値（±１ SEM）を表すグラフである。 図１１は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎動物（コットントップタマリン） の糞の粘稠度を表す図である。 図１２は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎動物（コットントップタマリン） における炎症活性を組織学的に評価した図である。 図１３は、ＡＣＴ−１抗体による慢性結腸炎コットントップタマリンの治療の 実験手順を表す図である。 図１４は、慢性結腸炎コットントップタマリンにＡＣＴ−１抗体（−●−）ま たは無関係なイソ型適合抗体（−○−）を投与した場合の、糞の粘稠度に対する 治療効果を表すグラフである。 図１５は、ＡＣＴ−１抗体または無関係な対照モノクローナル抗体で処置した 慢性結腸炎（ｃｏｌｉｔｉｃ ｃｏｌｉｔｉｃ）コットントップタマリンにおけ る、結腸の炎症活性に対するＡＣＴ−１免疫療法の治療効果を示すヒストグラム である。各棒は、第０日における同じ動物の値と特定の時点における値とを比較 することによって各動物について計算した、炎症活性の絶対変化の、一処置群内 の平均±１ＳＥＭを表す。 図１６は、ＡＣＴ−１抗体で処置した結腸炎コットントップタマリンの末梢循 環プールにおけるα４β７＋リンパ球の絶対数を表すヒストグラムである。各棒 は、ＡＣＴ−１によって検出されるα４β７⁺細胞の血中濃度の平均（±１ＳＥ Ｍ）を表す。 図１７Ａ〜１７Ｅは、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇキメラによるＨｕｔ７８細胞の特異 的染色を示す、ＦＡＣＳ分析の結果を表すプロットである。ヒトＭＡｄＣＡＭ− Ｉｇキメラ構築物で仮トランスフェクションしたCOS 細胞（４回の独立したトラ ンスフェクションから得た）の上清を、２ｍＭ Ｍｎ²⁺の存在下にＨｕｔ７８細 胞と共に培養し、結合したキメラを、ヒトＩｇＧ１に特異的なフィコエリトリン 結合抗体を用いて検出した。図１７Ａ，培地対照；図１７Ｂ〜１７Ｃ，クローン 体２１（ヒトＭＡｄＣＡＭの全細胞外ドメインを含む）を形質導入した細胞の上 清；図１７Ｄ〜１７Ｅ，細胞クローン体３８（ヒトＭＡｄＣＡＭの２つのＮ末端 Ｉｇドメインを含む）の上清。細胞を培地のみで予備培養した後の結合（右側） 。抗β７ＭＡｂＦＩＢ５０４と共に細胞を予備培養することによって、結合が阻 害された（左側）。 図１８は、１×１０⁶ＣＤ４５ＲＢ^hiＴ細胞（■）で復元した重症複合免疫不 全症（ｓｃｉｄ）マウスの体重と、同数のＢＡＬＢ／ｃ脾臓に由来するＣＤ４５ ＲＢ^loＴ細胞（▲）で復元した対照ｓｃｉｄマウスとの体重の相違を表すグラフ である。疾患の進行を評価するため、毎週、受容マウスの体重を測定した。 図１９は、ＣＤ４５ＲＢ^hiＴ細胞で復元したｓｃｉｄマウスに静脈内注射した １１１In−標識腸間膜リンパ小節細胞の、結腸における蓄積量が、同数のＣＤ４ ５ＲＢ^loＴ細胞で復元したｓｃｉｄマウスの結腸における蓄積量より増大するこ とと、抗β７モノクローナル抗体（ＦＩＢ５０４）と抗ＭＡｄＣＡＭ（ＭＥＣＡ −３６７）モノクローナル抗体の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）による ２週間の治療で、蓄積が阻害されることを表すヒストグラムである。結果は、膵 臓のカウント／分（ＣＰＭ）に対して正規化し、かつ、バックグラウンドについ て補正した％ＣＰＭとして、表してある。 図２０は、ｓｃｉｄマウスの結腸における¹¹¹Ｉｎ−標識細胞（静脈内注射し たもの）の蓄積が、ＦＩＢ５０４、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ５０４＋Ｍ ＥＣＡ−３６７による４ヶ月間（復元時から開始）の処置で、完全に阻害される ことを示すヒストグラムである。左から右へ：ＣＤ４５ＲＢ^loＴ細胞で復元され 、無関係なイソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａを投与されたｓｃｉｄマウス；ＣＤ ４５ＲＢ^hiＴ細胞で復元され、無関係なイソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａ、ＦＩ Ｂ５０４、ＭＥＣＡ−３６７またはＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７のいずれか を投与されたｓｃｉｄマウス。 図２１は、ＦＩＢ５０４とＭＥＣＡ−３６７の組み合わせで１４日間処置した ｓｃｉｄマウスの上行（右）または下行（左）結腸におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の数 （マウスＣＤ４に特異的なラット抗体で左及び右結腸の凍結切片を染色すること によって決定）が、イソ型適合対照ラットＩｇＧ２ａ抗体で処置されたマウスと 比較して減少することを示すヒストグラムである。発明の詳細な説明 蛋白質とペプチド 本発明は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（粘膜アドレシン細胞接着分子）と呼ばれる単 離及び／又は組換え（例えば本質的に純粋なものを含む）蛋白質またはポリペプ チドと、霊長類ＭＡｄＣＡＭの変異体に関する。好ましい態様では、本発明の単 離及び／又は組換え蛋白質が、（本明細書に規定する）霊長類ＭＡｄＣＡＭの特 性、活性または機能的特徴、例えば結合機能（例えばα４β７インテグリンと結 合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えばインビトロ及び／又はインビ ボでα４β７依存性接着などの細胞接着を媒介する能力）及び／又は本明細書に 規定する免疫学的特性などの少なくとも１つの性質を有する。例えば、本発明蛋 白質のいくつかは、α４β７インテグリンと選択的に結合することができ、それ によって、白血球などのα４β７インテグリンを保持する細胞（特にＴ細胞また はＢ細胞などのリンパ球）に対するα４β７依存性細胞接着を、インビトロ及び ／又はインビボで媒介する。一側面として、本発明の蛋白質は、異型細胞接着（ 例えば、リンパ球などの白血球に対する内皮細胞の異型細胞接着）を媒介でき る。 もう１つの態様として、本発明の蛋白質は、同じ霊長類種または異なる霊長類 種に由来する霊長類α４β７インテグリンを結合し、かつ／または、細胞接着分 子機能（例えば、インビトロ及び／又はインビボにおける、α４β７依存性接着 などの細胞接着を媒介する能力）を持つことができる。例えば、本明細書に示す ように、ｃＤＮＡクローン体の発現によって哺乳類細胞で生産したヒトとアカゲ ザルのＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質は、ヒトリンパ球上に存在するα４β７インテグ リンに選択的に結合でき、α４β７インテグリンを保持する細胞に対する選択的 接着を媒介できる細胞接着分子として機能できる。 本明細書でいう「単離（された）」蛋白質またはポリペプチドとは、哺乳類細 胞内に存在する時の状態よりも精製された蛋白質またはポリペプチドである。「 単離（された）」蛋白質またはポリペプチドとしては、本明細書に記述する方法 や類似の方法もしくは他の適切な方法で得られる蛋白質またはポリペプチドが挙 げられ、本質的に純粋な蛋白質またはポリペプチド、化学合成によって生産され た蛋白質またはポリペプチド（例えば合成ペプチド）、生物学的方法と化学的方 法の組み合わせで生産された蛋白質またはポリペプチド、単離された組換え蛋白 質またはポリペプチドなどが含まれる。蛋白質は、少なくとも約５０重量％の単 離された状態で、好ましくは少なくとも約７５重量％の単離された状態で、より 好ましくは本質的に純粋な状態で、得ることができる。本明細書でいう「組換え 」蛋白質またはポリペプチドとは、組換え核酸の発現によって生産された蛋白質 またはポリペプチドである。 本明細書で「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」とは、天然に存在する若しくは内因性の霊 長類ＭＡｄＣＡＭ蛋白質、天然に存在する若しくは内因性の対応する霊長類ＭＡ ｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ蛋白質（例えば組換え蛋白質）、及び上記い ずれかの機能的変異体（例えば、突然変異及び／又は組換え技術によって生産さ れた機能的断片及び／又は変異体）をいう。したがって、本明細書に定義するよ うに該用語は、成熟霊長類ＭＡｄＣＡＭ、グリコシル化または非グリコシル化Ｍ ＡｄＣＡＭ蛋白質、霊長類ＭＡｄＣＡＭの多形または対立遺伝子変異体、及び他 のイソ型（例えば、択一的スプライシングまたは他の細胞内プロセスによって生 産されるもの、並びに機能的断片を包含する。 天然に存在する若しくは内因性の霊長類ＭＡｄＣＡＭ蛋白質としては、霊長類 （例えば、ヒトまたはアカゲザル、コットントップタマリンなどの他の非ヒト霊 長類）に自然に存在する成熟ＭＡｄＣＡＭ、多形または対立遺伝子変異体及び他 のイソ型が挙げられる。このような蛋白質は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを自然に生産 する供給源から回収できる。これらの蛋白質、及び天然に存在するまたは内因性 の対応する霊長類ＭＡｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ霊長類ＭＡｄＣＡＭ蛋 白質は、その対応する霊長類の名前で呼ばれる。例えば、対応する霊長類がヒト なら、その蛋白質はヒトＭＡｄＣＡＭ蛋白質（例えば、適当な宿主細胞で生産さ れた組換えヒトＭＡｄＣＡＭ）と称する。 霊長類ＭＡｄＣＡＭの「機能的変異体」としては、機能的断片、機能的変異蛋 白質及び／又は機能的融合蛋白質が挙げられる。一般に、本発明が包含する霊長 類ＭＡｄＣＡＭの断片または一部としては、成熟霊長類ＭＡｄＣＡＭと比較して アミノ酸（すなわち１以上のアミノ酸）の欠失（すなわち１以上の欠失）をもつ もの（例えばＮ末端欠失体、Ｃ末端欠失体または内部欠失体）が挙げられる。成 熟霊長類ＭＡｄＣＡＭに関連する、隣接するアミノ酸だけが欠失している断片ま たは一部や、隣接しないアミノ酸が欠失している断片または一部も想定される。 一般に、本発明が包含する霊長類ＭＡｄＣＡＭの変異体または誘導体としては 、１以上の隣接するアミノ酸残基若しくは不連続なアミノ酸残基が相違する天然 の若しくは人工的な変異体や、１以上の残基が修飾されている修飾ポリペプチド 、及び１以上の修飾残基を含む変異体が挙げられる。好ましい変異体は、１以上 の隣接する若しくは隣接しないアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によっ て 相違する霊長類ＭＡｄＣＡＭの天然の若しくは人工的な変異体である。 霊長類ＭＡｄＣＡＭの「機能的断片または一部」、「機能的変異体」及び／又 は「機能的融合蛋白質」とは、霊長類ＭＡｄＣＡＭの特性、活性及び／又は結合 機能など（例えばα４β７インテグリンを結合する能力）の機能的特徴、及び／ 又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存的接着のような細胞接着を、イン ビトロ及び／又はインビボで媒介できる能力）などの少なくとも１つを持ち、お よび／または、霊長類ＭＡｄＣＡＭの免疫学的特性の少なくとも１つを保持する 、単離及び／又は組換え蛋白質またはオリゴペプチドをいう。 本明細書において、霊長類ＭＡｄＣＡＭの「免疫学的特性の少なくとも１つ」 を有する蛋白質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドとは、（ａ）選択されたエ ピトープ特異性を持つ抗体であって、天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡ ｄＣＡＭに結合するか、あるいは天然に存在するまたは内因性の霊長類ＭＡｄＣ ＡＭ（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ−１）と同じアミノ酸配列を有する蛋白質に結合 する抗体の、少なくとも１つによって結合されるもの、及び／又は（ｂ）選択さ れたエピトープ特異性を持つ抗体であって、天然に存在するまたは内因性の霊長 類ＭＡｄＣＡＭに結合するか、あるいは天然に存在するまたは内因性の霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭと同じアミノ酸配列を持つ蛋白質に結合する抗体の、適当な動物にお ける形成を誘導できる免疫原であるものをいう。例えば、適当な断片は、単離さ れた霊長類ＭＡｄＣＡＭに対して生じる及び／又は単離された霊長類ＭＡｄＣＡ Ｍと反応する抗体と、交差反応できる。 適当な断片または変異体は、スクリーニングによって同定できる。例えば、蛋 白質のＮ末端、Ｃ末端または内部領域を段階的に欠失させることができ、その結 果生じる蛋白質を、本明細書に記述するアッセイのような適当な結合または接着 アッセイで、スクリーニングすることができる。生じた蛋白質がそのアッセイで 活性を示す場合、その生じた蛋白質（「断片」）は機能的である。本明細書に示 す霊長類ＭＡｄＣＡＭの構造と機能に関する情報及びネズミのＭＡｄＣＡＭと他 の接着分子の構造と機能に関する情報は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを機能ドメインに 分割するための基礎を与える（下記参照）。 変異体という用語は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば成熟ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ ）を第１部分とし、それに、自然界にみられる霊長類ＭＡｄＣＡＭには存在しな い第２部分が結合してなる融合蛋白質をも包含する。したがって、該第２部分は 、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドであってもよい。第１部分は、 その融合蛋白質のＮ末端位置、Ｃ末端位置または内部にあってもよい。一態様と して、融合蛋白質は、第１部分としてのヒトＭＡｄＣＡＭまたはその一部と、リ ンカー配列とアフィニティーリガンド（例えば酵素、抗原、エピトープタグなど ）を含む第２部分とを含有する。 別の態様は、融合蛋白質が、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分のＣ末端で、免 疫グロブリン部分（１以上の免疫グロブリン定常領域など）、好ましくは霊長類 のもののＮ末端に融合してなるハイブリッドであり、Ｃａｐｏｎら，米国特許第 ５，４２８，１３０号及び同第５，２２５，５３８号、これらの特許の教示は全 て参考文献として本明細書の一部を構成する、などに従って製造されるものなど ）などのハイブリッド免疫グロブリンである。ハイブリッド免疫グロブリンとし ては、免疫グロブリン鎖の少なくとも一部、好ましくは完全な免疫グロブリンド メイン（例えばＣＨｌやヒンジ）の少なくとも１つを含有する融合蛋白質または ポリペプチドが挙げられる。「免疫アドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ」 の他の例は、既に報告されている（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３４９：１６４−１６７（１９９１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ．，６７：３５６１−３５６８（１９９３）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１４７１−１４７６（１９９２）；Ｃａｐｏｎ ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｊａｋｕ ｂｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：９３８−９４６（１９９５） ）。例えば、霊長類（例えばヒト）ＭＡｄＣＡＭの全部または一部と、免疫 グロブリン重鎖または軽鎖定常領域またはその一部とを含有する融合蛋白質を、 （例えばその融合蛋白質をコードする核酸を調製することによって）調製するこ とができる。融合物は、一般的には、ＭＡｄＣＡＭのC末端が免疫グロブリン定 常領域のＮ末端につながるように構築される。しかしながらＭＡｄＣＡＭのＮ末 端が免疫グロブリン定常領域のＣ末端につながっている融合蛋白質も作成できる 。好ましくは、リガンド（例えばα４β７インテグリン）に結合する能力がある 霊長類ＭＡｄＣＡＭの一部であり、完全な細胞外ドメインまたは２つの膜貫通領 域を欠くＮ末端免疫グロブリンドメインを含む一部などを使用することが好まし い（例えば実施例３を参照）。 選択した定常領域のタイプと、融合ポリペプチドに使用する部分（例えば軽鎖 定常領域、重鎖定常領域（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから得 られるγ１、γ２、γ３、γγ４、α１、α２、δ、ε及びμ定常領域など）及 びその一部）に応じて、またそれらを、互いに及び／又は他のハイブリッド免疫 グロブリンまたは免疫グロブリン鎖と、多量体型に集合させるかどうかによって 、様々なハイブリッド免疫グロブリン分子（例えば単量体型、ホモ二量体型、ヘ テロ二量体型、ホモ四量体型、ヘテロ四量体型）を生産することができる（Ｃａ ｐｏｎら，米国特許第５，４２８，１３０号及び同第５，２２５，５３８号を参 照）。好ましい態様として、融合蛋白質は、完全な重鎖定常領域を含むか、ある いは少なくとも、機能的に活性なヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む 。エフェクター機能を仕立てるために、特定の定常領域（例えばＩｇＧ１）、そ の誘導体または一部を選択してもよい。例えば、Ｆｃレセプターへの結合を最小 限に抑え（実施例３；Ｗｉｎｔｅｒら，ＧＢ２，２０９，７５７Ｂ；及びＭｏｒ ｒｉｓｏｎら，ＷＯ８９／０７１４２）、および／または補体を固定する（ＷＯ ９４／２９３５１，１９９４年１２月２２日）などのために、変異した定常領域 （変異体）を融合蛋白質に組込むことができる。 「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」蛋白質の例としては、本発明のヒトまたはアカゲザル ＭＡｄＣＡＭ−１核酸によってコードされる蛋白質、例えば図１（配列番号２） 、図２（配列番号４）または図３（配列番号６）に記載の、若しくは実質上それ らに記載されているに等しい、アミノ酸配列を持つ蛋白質とその機能的な一部が 挙げられる。好ましい態様では、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは誘導体が、図１（配 列番号２）、図２（配列番号４）または図３（配列番号６）に示す蛋白質に対し て、少なくとも約５５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましく は少なくとも約９０％類似するアミノ酸配列を持つ。ＭＡｄＣＡＭ構造 免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの構成要素であるネズミＭＡｄＣＡ Ｍ−１ は、免疫グロブリン関連配列とムチン様配列の両方を持つマルチドメイ ン分子である（Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４６１（ １９９３））。図６に示すように、ネズミ型は、Ｉｇ様接着レセプターＩＣＡＭ −１及びＶＣＡＭ−１のドメインと相同であり、インテグリン結合に関係する２ つのアミノ末端免疫グロブリン型ドメインを含有する。第３の（膜近位）免疫グ ロブリン型ドメインは、このクラスの接着レセプターとは無関係であるが、他の 粘膜関連免疫グロブリンスーパーファミリー構成要素であるＩｇＡとの相同性を 持つ。上記３つの免疫グロブリン型ドメインに加えて、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１ は、第２Ｉｇ様ドメインと第３のＩｇ様ドメインの間に、セリン／スレオニンリ ッチなムチン型ドメインを持つ。これらの構造要素は、ＭＡｄＣＡＭ−１が細胞 接着カスケードにおいて２以上の機能を促進することを示唆しており、ネズミＭ ＡｄＣＡＭ−１に関する最近の研究は、ＭＡｄＣＡＭ−１がセレクチン結合とイ ンテグリン結合の両方に役割を果たすことを支持している（Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｌ ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：４４５（１９９２）；Ｂａｒｇａｔ ｚｅ，Ｒ．Ｆ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：９９−１０８（１９９５））。また これに関連して、腸間膜リンパ小節で発現したネズミＭＡｄＣＡＭ−１は、末梢 小節アドレシンエピトープＭＥＣＡ−７９に関連するＬ−セレクチン結合性炭 水化物を提示できると報告されている（Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３６６：６９５（１９９３））。 本明細書に記述するように、ヒト及びアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質は、 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の２つのアミノ末端免疫グロブリン様インテグリン結合 性ドメインと相同な、２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを持つ（図１ 〜３、６）。しかし、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチン／ＩｇＡドメインに相同 な領域内の配列の類似性は、はるかに少ない。ヒト及びアカゲザルレセプターの 膜近位領域は、ムチン様配列の長さと近位Ｉｇ（ＩｇＡ様）ドメインの欠失に関 して、（互いに、若しくはネズミＭＡｄＣＡＭ−１と比較して）かなりの変動を 示す。 ヒトＭＡｄＣＡＭ−１には、１つのアミノ酸多形と、ムチン領域内のセリン／ スレオニン／プロリンリッチな反復のコピー数の変動とを示す２つのイソ型が同 定された。これら２つのイソ型はゲノムＤＮＡにコードされているようであり、 この配列の異なるプロセシング及び／又は対立遺伝子変異を示唆している。これ ら２つのイソ型は、α４β７結合親和性の調節機構及び／又はセレクチン結合用 の炭水化物の提示機構の選択肢として機能するだろう。本明細書に記述する霊長 類ＭＡｄＣＡＭに、これらのＩｇ様ドメインとムチンドメインが存在することは 、インテグリン結合ばかりでなくセレクチン結合におけるその役割とも合致する 。 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１で最近行われたドメイン交換実験では、ＭＡｄＣＡＭ −１のドメイン１はα４β７を弱く結合できるものの、強いインテグリン活性化 が無ければ、接着が乏しいことが示された。２つのアミノ末端Ｉｇ様ドメイン（ これらはＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１のドメインと類似する）かあれば、野生 型ネズミＭＡｃＤＡＭ−１に匹敵する活性化非依存的なα４β７結合活性を示し 得る。 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のドメイン１に存在する短いモチーフ（ＧＬＤＴＳＬ ）は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３のドメイン１、ＶＣＡＭ −１のドメイン１及び４を含む他のＩｇ様接着レセブターに保存されており、そ れらのインテグリン結合に必要である（Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｅｌｌ ，５２：９２５−３３（１９８８）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｎａｔｕ ｒｅ，３３９：６１（１９８９）；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ，５９：１ ２０３（１９８９）；Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：４８１ （１９９２））。Ｇ−（Ｉ／Ｌ）−（Ｄ／Ｅ）−（Ｔ／Ｓ）−（Ｐ／Ｓ）−Ｌと いうこの配列は、これらのインテグリン結合ドメインのβシートｃとｄの間に位 置する。該ＧＬＤＴＳＬモチーフは、本発明が特徴づけた霊長類ＭＡｄＣＡＭに も認められた。 ＩＣＡＭ−１のドメイン１のこのモチーフ内のＥ３４（Ｇｌｕ³⁴）（上記下線 部）と、ＶＣＡＭ−１内のＤ４０（Ａｓｐ⁴⁰）（上記太字部分）の突然変異誘発 は、それぞれＬＦＡ−１とα４β１の結合に著しい影響を与えた（Ｏｓｂｏｒｎ ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２４：６０１−６０８（１９９４）； Ｒｅｎｚ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２５：１３９５−１４０ ６（１９９４）；Ｓｔａｕｎｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｃｅｌｌ，６１：２４３−２ ５４（１９９０）；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ．，１２５：２１５−２２２（１９９４））。さらに最近になって、２つの Ｎ末端ドメインを含むＶＣＡＭ−１の断片が結晶学的構造決定をされた（Ｊｏｎ ｅｓ，Ｅ．Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５３９−５４４（１９９５）；Ｗａ ｎｇ，Ｊ−Ｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：５ ７１４−５７１８（１９９５））。ＶＣＡＭ−１中の保存されたモチーフ（ＱＩ ＤＳＰＬ）は、第１ＩｇドメインのＣＤループのＮ末端部分で、インテグリンが 容易に接近できそうな位置に、高度に露出されているようである。 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のこのモチーフ内で、アミノ酸６１をロイシンからア ルギニンに変える（Ｌ６１→Ｒ６１）ヌクレオチド置換を施すと、α４β７を発 現する休止リンパ球とＭＡｄＣＡＭ−１との相互作用が破壊される。したがって ネズミＭＡｄＣＡＭ−１も、そのインテグリンリガンド（α４β７）を結合する ために、この保存されたアミノ酸モチーフ（ＧＬＤＴＳＬ）を、そのＮ末端ドメ インのコンピューターで予測されるＣＤループ内に必要とする。 ヒトＭＡｄＣＡＭｃＤＮＡクローン体４と２０（図１及び２）を比較すると、 アミノ末端の２２５アミノ酸がクローン体４と２０で同一であることがわかった 。この領域は、予想される１８アミノ酸疎水性リーダーまたはシグナル配列と、 ２つの免疫グロブリン型ドメインとを含む。霊長類及びネズミＭＡｄＣＡＭ−１ を用いてこの領域を整列させると、次の保存性が示される：（１）予想シグナル ペプチド（ヒト蛋白質間で同一、アカゲザル及びネズミシグナルペプチドと類似 ）；（２）第１Ｉｇ様ドメイン内の２対のシステイン残基、各対のシステイン間 には３アミノ酸が介在する；（３）Ｉｇ様ドメイン１の予想Ｃ−Ｄループ中の９ アミノ酸からなる配列（「ＬＤＴＳＬ」モチーフを含む）、一般的なインテグリ ン認識部位と考えられる（各霊長類クローン体間で同一）；（４）異常に大きい 第２免疫グロブリン型ドメイン。システイン残基に挟まれた約７０アミノ酸を持 つ第２Ｉｇ様ドメインは、そのサイズから考えて、Ｉｇ様接着レセプターにより 典型的に認められるＣ２型（定常）ドメインではなく、「Ｖ」（可変）型ドメイ ンに分類されるだろう（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｔ．ら，Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．，４４：１−６２（１９８９）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．ら， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３８１−４０５（１９８８））。こ のドメインには、負に荷電した残基を豊富に含む伸長Ｃ’−Ｅループがあり、こ れは特徴づけられた霊長類、ネズミ及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン体のそれ ぞれに共通するが、関連する接着レセプターには認められない。 クローン体４と２０に認められる次の領域は、セリン、スレオニン及びプロリ ン残基の出現率（クローン体４で６９％、クローン体２０で７６％）の点で、ネ ズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチンドメインに似ている（図１と図２の囲んだ部分） 。この領域は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とアミノ酸組成は似ているが、ネズミＭ Ａ ｄＣＡＭ−１とは著しく異なる。したがって、インテグリン結合性Ｉｇ様ドメイ ンの保存に関する選択は、ムチン配列のそれよりも強いようである。ヒトＭＡｄ ＣＡＭ−１ドメインはクローン体４では７１アミノ酸長、クローン体２０では４ ７アミノ酸長である。また、この領域は２つの多形を含む：（１）アミノ酸２４ ０の多形、これはクローン体４ではプロリン（Ｐ）、クローン体２０ではセリン （Ｓ）である；（２）アミノ酸２４２の多形、これはクローン体４ではアスパラ ギン（Ｎ）、クローン体２０ではアスパラギン酸（Ｄ）である。さらに、ヒトム チンドメインは、ＰＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅという配列からなる８アミノ酸の反 復を含み、この反復配列はクローン体４では８回、クローン体２０では５回現れ る。 ヒトムチンドメインは高度に反復性であるので、クローン体４と比べてクロー ン体２０中の反復が３つ欠如しているのは、オーブンリーディングフレームを維 持し、インテグリン結合に関して機能的なレセプターを与える択一的スプライシ ングまたは突然変異（例えば異常型組換え）などのプロセスの結果であろう。こ のことは、ムチン配列の一部または全部がインテグリン結合にとって重要でない ことを示唆している。また、α４β７に対する活性化非依存性接着には、ネズミ ＭＡｄＣＡＭ−１のＩｇ様ドメイン１及び２だけでも十分であることがわかって おり、これもまた、ネズミムチン配列がインテグリン結合にとって重要でないこ とを示している。この点に関して興味深いのは、単離したアカゲザルクローン体 がこの反復領域のほとんどを欠くことである。 残りのＣ末端側の１１０アミノ酸（４７アミノ酸に続いて、２０アミノ酸から なる予想疎水性膜貫通領域があり、それに続いて４３アミノ酸の細胞質テイルが ある）は、クローン体４と２０の間で同一である。ムチン領域のＣ末端直後の４ ７アミノ酸は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のＩｇＡ型Ｉｇドメインに対応する領域 である。ヒト蛋白質とアカゲザル蛋白質はこの領域が似ているが、それらはネズ ミＭＡｄＣＡＭ−１とは異なる。ネズミＭＡｄＣＡＭ−１と比較すると、ヒト蛋 白質はこの領域が５９アミノ酸短く、Ｉｇ様ドメインの特徴を何ら持たない。全 てのレセプターの膜貫通領域は類似しているが、細胞質テイルはヒト（霊長類で は２６、マウスでは２０）ＭＡｄＣＡＭ−１の方がかなり長い（４３アミノ酸） 。組換え蛋白質の製造法 本発明のもう１つの側面は、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体（例えば一 部）を製造する方法に関する。組換え蛋白質は、例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭま たはその誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子の、適当な宿主細胞における発現 などによって得ることができる。 霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体の発現に適した構築物も提供する。この 構築物は適当な宿主細胞に導入することができ、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまた はその変異体を発現する細胞を生産し、それを培養中に維持することができる。 このような細胞は種々の目的に有用であり、接着アッセイ（例えば、リガンド及 び／又はＭＡｄＣＡＭが媒介する接着の阻害因子候補をスクリーニングするため のアッセイ）や、特徴づけ、単離及び／又は精製（例えばアフィニティー精製） 用の蛋白質の生産などに使用したり、免疫原などとして使用できる。好適な宿主 細胞としては、原核細胞（これには大腸菌、枯草菌及び／又は他の適当な細菌な どの細菌細胞が含まれる）や、真核細胞、例えばカビ細胞や酵母細胞（例えばピ チア パストリス、アスペルギルス種、サッカロミセス セルビジエ、シゾサッ カロミセス ポンベ、ニューロスポラ クラッサ）または他の下等真核細胞、お よび昆虫由来の細胞（例えばＳｆ９昆虫細胞）や哺乳類由来の細胞（例えば、チ ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ＨｕＴ７８細胞、２９ ３細胞）などの高等真核細胞を挙げることができる（例えばＡｕｓｂｅｌ，Ｆ． Ｍ．ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，（１９９３）を参 照。）。一態様として、膜結合成熟蛋白質を発現することのできる宿主細胞を使 用する。他の態様として、Ｃ末端膜貫通領域と細胞質テイルを欠く可溶型ＭＡｄ ＣＡＭなどの可溶型ＭＡｄＣＡＭを分泌できる宿主細胞を使用する。 組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体を生産する宿主細胞は次のように 作成できる。例えば、所望の蛋白質のコード配列の全部または一部をコードする 核酸は、核酸ベクター、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レ プリコンなどのＤＮＡベクターなどに挿入できる。種々のベクターを利用するこ とができ、それらには単一コピーまたは多コピーとして維持されるベクターや、 宿主細胞染色体に組込まれるベクターなどが含まれる。 ＭＡｄＣＡＭ−１遺伝子の転写および／または翻訳シグナルを使用して、発現 を制御することができる。別法として、所望の蛋白質のコード配列の全部または 一部をコードする核酸の発現に適した発現ベクターも利用できる。適切な発現ベ クターはいくつかの成分を含有でき、それらには次の１以上が含まれるが、これ らに限られるわけではない：複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現 制御因子、例えば転写制御因子など（例えばプロモーター、エンハンサー、ター ミネーターなど）、および／または１以上の翻訳シグナル、（霊長類または異種 霊長類若しくは非霊長類種由来の）膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）または分泌の シグナル配列またはリーダー配列。構築物中、シグナル配列は、該ベクターから 提供されるものであってもよいし、その霊長類ＭＡｄＣＡＭコード配列、または 他の供給源から提供されるものであってもよい。 プロモーターは適切な宿主細胞での発現用に供給される。プロモーターは構成 的であってもよいし、誘導性であってもよい。ベクターでは、該プロモーターが 、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体をコードする核酸に実施可能に連結して おり、コードされているポリペプチドの発現を支配できる。原核生物宿主に適し た種々のプロモーター（例えば大腸菌にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモー ター）および真核生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば酵母アルコール デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ）を、利用できる。 さらに、発現ベクターは通例、該ベクターを保持する宿主細胞を選択するため の選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合、起点または複製（ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含む。抗生物質耐性または 薬物耐性を付与する産物をコードする遺伝子は一般的な選択可能マーカーであり 、原核細胞（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイ クリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）中および真核細胞（例えばネオマイシン（Ｇ４１ ８またはゲネチシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハ イグロマイシン耐性遺伝子）中で、使用できる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマー カー遺伝子は、メトトレキセートによる選択を、種々の宿主で可能にする。宿主 の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲ Ａ３、ＨＩＳ３）は、酵母における選択可能マーカーとしてしばしば使用される 。ウイルス（例えばバキュロウイルス）やファージベクター、及び宿主細胞のゲ ノムに組み込むことができるレトロウイルスベクターなどのベクターの使用も予 想される。また本発明は、これらの発現ベクターを保持する細胞にも関する。 例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその誘導体をコードする核酸をベクターに 取り込み、１以上の発現制御因子に実施可能に連結し、その構築物を、発現に適 した条件下に維持される宿主細胞に導入することによって、コードされているポ リペプチドを生産することかできる。構築物は、選択した宿主細胞に適した方法 （例えば形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染など）で細胞に導 入できる。蛋白質の生産には、上記構築物を含有する宿主細胞を、発現に適した 条件下（例えば、誘導物質、適当な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給物など を補足した培地の存在下）に維持する。コードされた蛋白質（例えばヒトＭＡｄ ＣＡＭ−１）は、その宿主細胞または培地から単離できる。 融合蛋白質もこの方法で生産できる。例えば、いくつかの態様は、霊長類ＭＡ ｄＣＡＭ ｃＤＮＡまたはその一部を、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ ＋／−（ストラタジーン）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ファルマシア）、ｐｃＤＮＡ −３（インビトロジェン）及びｐＥＴ−１５ｂ（ノバ−ジェン）などの適当な発 現ベクターに挿入することによって生産できる。次に、得られた構築物を、発現 に適した宿主細胞に導入する。発現後、適当なアフィニティーマトリックス担体 を利用して、細胞溶解液から融合蛋白質を単離または精製できる（例えば、Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，第２巻，増補２６，１６．４．１〜１６．７． ８頁（１９９１）を参照）。さらに、アフィニティーラベルは、融合蛋白質の検 出手段となる。例えば、抗原またはエピトープアフィニティーラベルを含有する 融合蛋白質の細胞表面発現またはその特定の細胞画分における存在は、適当な抗 体を利用して検出できる。核酸、構築物およびベクター 本発明は、本明細書に記載の霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体をコードす る配列を持つ単離されたおよび／または組換え（例えば、本質的に純粋なものを 含む）核酸に関する。 本明細書でいう「単離された」核酸とは、その起源の細胞ＲＮＡまたはゲノム ＤＮＡ（例えば細胞中や、ライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合 など）から分離された核酸であり、さらなるプロセシングを受けていてもよい。 「単離された」核酸としては、本明細書に記載の方法、類似の方法または他の適 当な方法で得られる核酸が挙げられ、例えば本質的に純粋な核酸、化学合成によ って生産された核酸、生物学的方法と化学的方法の組み合わせによって生産され た核酸、及び単離された組換え核酸などがある（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２ ４７６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ及びＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ， １０１：２９７−３０２（１９９１）を参照）。本明細書でいう「組換え」核酸 とは、組換えＤＮＡ法によって生産された核酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなどと いった人工的組換え法による操作で作成される核酸を含む。また「組換え」核酸 は、細胞の天然の機構を介して起こる組換え事象によってもたらされる核酸であ って、所望の組換え事象を許容し、それを起こりやすくするように設計された核 酸の、細胞への導入後に選択される核酸であってもよい。 一態様として、上記核酸またはその一部は、（本明細書に規定する）霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭの特性、活性または機能的特徴、例えば結合活性（例えば、α４β７ インテグリンを結合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７ 依存性接着などの細胞接着を、試験管内及び／又は生体内で媒介する能力）及び ／又は本明細書に規定する免疫学的特性などの、少なくとも１つを持つ蛋白質ま たはポリペプチドをコードする。 より具体的に述べると、本発明は、ヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ま たはその変異体をコードする配列を持つ、単離されたおよび／または組換え核酸 またはその一部に関する。 さらに本発明は、以下を特徴とする、単離された及び／又は組換え核酸に関す る： （１）以下の核酸にハイブリダイズできること：（ａ）霊長類ＭＡｄＣＡＭをコ ードする核酸、例えば、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）または図３（ 配列番号５）に記載のヌクレオチド配列、若しくは実質上そこに記載されている に等しいヌクレオチド配列を持つ核酸；（ｂ）（ａ）のうちいずれかの相補鎖； 若しくは（ｃ）前記核酸の一部（読み取り枠を含む一部など）；あるいは、 （２）霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６ ）のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードできること；あるいは、 （３）上記の両特徴を持つこと。 一態様として、該核酸は、図１、図２または図３、（それぞれ配列番号１、３ または５）に示すヌクレオチド配列のいずれか、若しくはそのＭＡｄＣＡＭコー ド領域の１つと、少なくとも約５０％のヌクレオチド配列類似性を共有する。よ り好ましくは、該核酸は、図１、図２または図３（それぞれ配列番号１、３また は５）のいずれか、若しくはそのＭＡｄＣＡＭコード領域と、少なくとも約７５ ％のヌクレオチド配列類似性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％のヌク レオチド配列類似性を共有する。 これらの基準に合致する単離されたおよび／または組換え核酸としては、天然 に存在する霊長類ＭＡｄＣＡＭの配列若しくはその天然に存在する配列の変異体 と同一の配列を持つ核酸が挙げられる。そのような変異体としては、１以上の残 基の付加、欠失または置換によって相違する突然変異体、１以上の残基が修飾さ れている修飾核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡアナログなど）および１以上の修飾残基 を含む突然変異体などが挙げられる。 本発明の核酸は、前記の選択した核酸にハイブリダイズするものを含めて、例 えば高ストリンジェント条件または中ストリンジェント条件下で、検出または単 離できる。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェント条件」と 「中ストリンジエント条件」は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，第１巻， 増補２６，１９９１）の２．１０．１−２．１０．１６頁（特に２．１０．８− １１を参照）と６．３．１−６頁に説明され、その教示は参照により本明細書に 取り込まれる。プローブ長、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ 率、温度およびイオン強度などの因子が、核酸ハイブリッドの安定性に影響を与 える。したがって高または中ストリンジェント条件は、一部には、既知の核酸（ 例えばＤＮＡ）の特徴と、その既知核酸に対するハイブリダイゼーションを評価 しようとする他の核酸の特徴に応じて、実験的に決定できる。 （ａ）霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸（例えば図１（配列番号１）、図 ２（配列番号３）及び図３（配列番号５）に記載の核酸）、（ｂ）そのような核 酸の相補鎖、若しくは（ｃ）その一部に、（例えば高または中ストリンジェント 条件下で）ハイブリダイゼーションできることを特徴とする単離されたおよび／ または組換え核酸は、さらに、（本明細書に規定する）霊長類ＭＡｄＣＡＭの特 性、活性または機能的特徴、例えば結合機能（例えば、α４β７インテグリンを 結合する能力）及び／又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存性接着など の細胞接着を、試験管内及び／又は生体内で媒介する能力）及び／又は本明細書 に規定する免疫学的特性などの少なくとも１つを持つ蛋白質またはポリペプチド をコードしてもよい。好ましい核酸は、少なくとも約４０ヌクレオチド、より好 ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約７５ヌ クレオチドの長さを持つ。 本発明の核酸によってコードされる霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体の結 合機能は、リガンド結合に関する標準的なアッセイ（例えば、単離された及び／ 又は組換えＭＡｄＣＡＭとα４β７インテグリンの間の複合体の形成をモニター するアッセイ）または標準的な接着アッセイ（例えば、組換え霊長類ＭＡｄＣＡ Ｍを発現する第１細胞と、α４β７インテグリンを保持する第２細胞の間の接着 をモニターするアッセイ）または他の適当な方法で検出できる。結合及び／又は 接着アッセイ若しくは他の適当な方法を、本発明のポリペプチドをコードする核 酸の同定及び／又は単離操作に使用することもできる（例えば実施例１を参照） 。本発明の核酸がコードする蛋白質またはポリペプチドの抗原特性は、霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭに結合する抗体を用いる免疫学的方法（例えば免疫ブロッティング、 免疫沈降法及びイムノアッセイ（放射線イムノアッセイやＥＬＩＳＡなど））に よって決定できる。 本発明の核酸は、蛋白質またはポリペプチドの生産に使用できる。例えば、前 記のように霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸（例えばＤＮＡ）を、さらなる 配列操作若しくはコードされているポリペプチドの適当な宿主細胞における生産 のために作成される、種々の構築物およびベクターに組込むことができる。 本発明のさらなる態様は、センス鎖を含む標的分子に全部または一部が相補的 で、その標的分子とハイブリダイゼーションできるアンチセンス核酸である。標 的はＤＮＡであってもよいし、そのＲＮＡ体（すなわちＤＮＡのＴ残基がＲＮＡ 体ではＵ残基である）であってもよい。細胞に導入されると、アンチセンス核酸 は、そのセンス鎖がコードする遺伝子の発現を阻害できる。アンチセンス核酸は 標準的な技術で生産できる。 ある態様として、このアンチセンス核酸は、ある標的核酸に対して完全にまた は部分的に相補的で、該標的核酸とハイブリダイズすることができ、該標的核酸 は、図１（配列番号２）、図２（配列番号３）または図３（配列番号５）に示す 上段の鎖の相補鎖の配列を持つ核酸にハイブリダイゼーションできる。例えば、 アンチセンス核酸は、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）または図３（配 列番号５）の読み取り枠の上段の鎖に示す配列を持つ標的核酸若しくはハイブリ ダイズするに足るその一部に、相補的であってもよい。もう１つの態様として、 アンチセンス核酸は、哺乳類ＭＡｄＣＡＭをコードする標的核酸に対して完全に または部分的に相補的で、その標的核酸とハイブリダイズできる。 また、本発明の核酸は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（または他の症状）と、冒さ れた組織における霊長類ＭＡｄＣＡＭ発現の増大との間の関係を評価するための （例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける）プローブとしても 使用できる。また本発明の核酸は、例えば霊長類から得た試料（炎症を起こした 組織など）中の多形または対立遺伝子変異体を（ＲＮＡまたはＤＮＡとのハイブ リダイゼーションなどによって）検出及び／又は単離するためのプローブとして も使用できる。さらに、１以上の冒された霊長類から得た試料中の特定の変異体 の存在または出現頻度を、正常な霊長類由来の試料と比較すれば、それは炎症性 腸疾患（ＩＢＤ）（または他の症状）と特定の変異体との間に存在する関係の指 標となり、ひいてはそれを、その症状の診断に使用することができる。 実施例に記述するように、アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡ クローン体を発現クローニングによって単離し、そのｃＤＮＡをプローブとして 、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコ ー ドする２種類の核酸が単離され、それらを特徴づけた。さらなるヒト、アカゲザ ルまたは他の霊長類遺伝子もしくはｃＤＮＡを得ることもできる。例えば、本明 細書に記載の遺伝子やその十分な一部は、それが単離された及び／又は組換え体 あるいは合成物であるかどうかにかかわらず、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変 異体をコードするさらなる核酸を、適当な供給源（例えば霊長類のゲノムライブ ラリーやｃＤＮＡライブラリー）から、本明細書に記載の方法または他の適当な 方法に従って（例えばハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、発現クローニング若し くは他の適当な技術によって）検出及び／又は回収するための、プローブまたは プライマーとして使用できる。 一態様として、霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸は、ＰＣＲ増幅のような 方法で生産できる。例えば、本明細書に記載の霊長類ＭＡｄＣＡＭ ｃＤＮＡの 一部に相補的もしくは実質上相補的な配列を含む適当なプライマー（例えば一対 のプライマーや、ネステッド（入れ子型）プライマー）を設計することができる 。例えば、コード配列の５’−または３’−末端及び／又はコード配列に隣接す る５’−または３’−末端に相補的なプライマーを設計できる。このようなプラ イマーを、適当な鋳型核酸と共にポリメラーゼ連鎖反応に使用することにより、 例えば霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸を得ることができる。好適な鋳型と しては、例えば本明細書に記述する構築物（ｐｃＤ３ＰＭＡｄ、ｐｃＤ３ＨｕＭ Ａｄ−４またはｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ−２０など）、ｃＤＮＡライブラリー、霊長 類（例えばヒト）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの他の適当な供給源が挙げられる 。プライマーは、鋳型として選択した構築物の隣接配列に相補的な部分を、適宜 、含有してもよい。 さらなる遺伝子またはｃＤＮＡは、本明細書に記載の用途に対応する用途を持 つ霊長類ＭＡｄＣＡＭの発現に使用でき、また、本明細書に記載の方法を用いて 構築物、宿主細胞及び抗体を生産する際にも使用できる。本明細書に記載の方法 には、アカゲザル及びヒトＭＡｄＣＡＭ−１を単離し、操作するための方法、ベ クター及び宿主株を構築するための方法、蛋白質を生産及び使用するための方法 、抗体を生産するための方法などがあり（ただしこれらに限られない）、これら は他の霊長類にも適用できる。治療法と組成物 本発明は、（１）「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」を試験管内及び／又は生体内で結合 でき、およびかつ／または、（２）「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」の活性または機能的 特徴、例えば結合機能（例えば、α４β７インテグリンを結合する能力）及び／ 又は細胞接着分子機能（例えば、α４β７依存性接着などの細胞接着を、試験管 内及び／又は生体内で媒介する能力）を阻害できる、抗体をも提供する。そのよ うな抗体としては、ｃＤＮＡクローン体４、ｃＤＮＡクローン体２０またはｃＤ ＮＡクローン体３１ＤによってコードされるヒトまたはアカゲザルＭＡｄＣＡＭ を結合できる抗体などが挙げられる。また、天然に存在する若しくは内在性の霊 長類ＭＡｄＣＡＭ（例えばヒトＭＡｄＣＡＭ）を結合できる抗体も包含される。 抗体は、試験管内及び／又は生体内で霊長類ＭＡｄＣＡＭを選択的に結合できる （例：（例えば免疫組織学的に評価したときに）粘膜組織及び／又は脾臓で発現 される霊長類ＭＡｄＣＡＭに選択的に結合する）ことが好ましい。 一態様として、本発明の抗体は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを結合し、かつ、（例え ばヒトの）α４β７インテグリンに対する「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」の結合を阻害 することによって、ＭＡｄＣＡＭが媒介する細胞接着を（好ましくは選択的に） 阻害できる。このような抗体は、試験管内及び／又は生体内で、α４β７インテ グリンを保持する細胞、例えば白血球（特にＴ細胞やＢ細胞のようなリンパ球） に対するα４β７依存性接着を、阻害できる。例えば、ＭＡｄＣＡＭ-1に対する ＲＰＭＩ８８６６細胞の接着を特異的に阻害する抗体を産出する１１種類のハイ ブリドーマが同定された（実施例２，１０Ｇ４、８Ｃ１、１０Ｇ３、９Ｇ１２、 ９Ｅ４、７Ｈ１２、１０Ｆ２、１０Ａ６、１Ｅ５、２Ｆ５、７Ｇ１１と命名した ハイブリドーマ）。したがって、α４β７インテグリンを保持する細胞の、粘膜 組織（腸−関連組織またはリンパ器官を含む）内の血管内皮細胞に対する細胞接 着を阻害できる抗体は、本発明の抗体に包含される。 該抗体は、霊長類ＭＡｄＣＡＭを高い親和性（例えば、Ｋａが約１〜１０ｎＭ もしくはＫｄが約１×１０^-8〜１×１０^-10ｍｏｌ^-1）で結合できることが好ま しい。 本発明の抗体は、加工、研究、診断及び治療などを含む様々な用途に有用であ る。例えば、これらを使用して、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を（例え ばアフィニティー精製や他の適当な方法によって）単離されたおよび／または精 製したり、ＭＡｄＣＡＭの構造（例えばコンフォメーション）と機能を研究する ことができる。 本発明の抗体は、（例えば試験管内での）診断的用途や治療的応用において、 ＭＡｄＣＡＭ機能を調節するためにも使用できる。例えば、抗体は、阻害因子と して作用して、本明細書に記述するように、霊長類ＭＡｄＣＡＭの結合機能及び ／又は細胞接着分子機能を阻害（軽減または防止）することができる。 さらに、本発明の抗体を用いて、試料（例えば組織または体液（炎症性滲出物 、血液、血清、腸液など）または本発明の核酸でトランスフェクションされた細 胞）中の霊長類ＭＡｄＣＡＭを検出し、かつ／または、そのレベルを測定するこ とができる。例えば、試料（組織及び／又は体液など）を霊長類から得て、適当 な免疫学的方法を用いて、霊長類ＭＡｄＣＡＭレベルを検出及び／又は測定する ことができる。その免疫学的方法としては、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、放射線免疫アッセイ及び免疫組織学などが挙 げられる。一態様として、試料中の選択した霊長類ＭＡｄＣＡＭを検出する方法 であって、単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭを結合する抗体を、選択した霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭに対する該抗体の特異的結合に適した条件下で、試料と接触させ、形 成される抗体−ＭＡｄＣＡＭ複合体を検出することを含む方法を提供する。 該方法の応用として、ある霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１と反応する抗体を用いて、 ヒト及び非ヒト霊長類中の正常組織と炎症組織とを、霊長類ＭＡｄＣＡＭの反応 性及び／又は発現について、（例えば免疫組織学的に）対比、分析することがで きる。したがって、本発明の抗体は、正常組織と炎症組織における霊長類（例え ばヒトＭＡｄＣＡＭ−１）の発現を対比、評価する免疫学的方法を与え、それに よって、疾患の存在、疾患の進行及び／又は抗霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１療法の炎 症性疾患における効力を評価できる。 また本発明は、本明細書に定義する「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」（機能的な変異体 、例えば可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ（例えば、分泌された蛋白質のように膜貫通 領域と細胞質テイルの全部または一部を欠くもの）及び機能的な融合蛋白質（例 えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分のC末端と免疫グロブリン部分のＮ末端とが融合 してなるハイブリッド免疫グロブリン）などを含む）をも提供する。これらの分 子は、加工、研究、診断および治療など、種々の応用に有用である。 例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合蛋白質または他の組換 え可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子は、霊長類ＭＡｄＣＡＭ：α４β７相互作用の リガンドまたは阻害因子（例えば遮断性抗体）を同定するためのアッセイに使用 できる。本明細書において阻害因子とは、リガンド（α４β７インテグリンを含 む）に対する霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１の結合を阻害（軽減または防止）し、およ び／または、該リガンドによって媒介される細胞応答の誘引を阻害する化合物を いう。有効量とは、霊長類ＭＡｄＣＡＭ−１に対する結合または接着の阻害及び ／又はシグナリングの阻害を達成するに足る量（例えば、霊長類ＭＡｄＣＡＭ− １リガンド（α４β７インテグリン（ヒトα４β７インテグリンとその霊長類相 同体など）を含む）を保持する細胞の、単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡ ｄＣＡＭに対する接着を阻害するに足る量）をいう。 一側面として、霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを結 合する薬物を検出または同定する方法であって、試験すべき１以上の薬物（また はリガンド候補）を、本明細書に定義する単離された及び／又は組換え「霊長類 ＭＡｄＣＡＭ」（「機能的変異体」を含む）と、該ＭＡｄＣＡＭに対するリガン ドの結合に適した条件下に接触させ、該薬物と霊長類ＭＡｄＣＡＭとの間の複合 体の形成を検出することを含む方法を提供する。一態様として、試験すべき薬物 を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体を発現する宿主細胞と、 該ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体に対するリガンドの結合に適した条件下 に混合する。また一態様として、霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異体を 適当なラベル（例えば蛍光ラベル、同位体ラベル）で標識し、そのラベルの検出 によって結合を決定する。結合の特異性は、例えば標識していない薬物、標識し ていない単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその機能的変異 体、若しくは霊長類ＭＡｄＣＡＭの第２リガンドなどを競争因子として用いる競 争または置換によって評価できる。 もう１つの側面として、霊長類ＭＡｄＣＡＭによって媒介される細胞接着の阻 害因子を検出する方法も提供する。一態様として、試験すべき薬物を、霊長類Ｍ ＡｄＣＡＭのリガンド並びに単離された及び／又は組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭま たはその機能的変異体（例えば融合蛋白質）と、リガンドと該ＭＡｄＣＡＭまた はその機能的変異体との結合に適した条件下に混合する。リガンドと霊長類ＭＡ ｄＣＡＭまたはその機能的変異体との間の複合体の形成をモニターする。適当な 対照（例えば薬物の不在下における結合）と比べて薬物の存在下にリガンドの結 合が減少したら、それはその薬物が阻害因子であるという指標になる。例えば、 実施例３に記載のアッセイと融合蛋白質を使用して、阻害剤を検出することがで きる。試験すべき薬物を、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現する第１細胞及びα ４β７インテグリンを保持する第２の細胞と、該第２細胞に対する該第１細胞の 接着に適した条件下に、混合することができる。該第１細胞と該第２細胞との接 着をモニターし、適当な対照と比べて接着が減少（軽減または完全に破壊）した ら、それはその薬物が阻害因子であるという指標になる。ＭＡｄＣＡＭ-1のリガ ンドを自然に発現する細胞または細胞群（例えば白血球（α４β７＋Ｂリンパ球 、 Ｔリンパ球など））若しくはＭＡｄＣＡＭ−１のリガンドを発現する他の細胞（ 例えば組換え細胞）を使用できる。 実施例３に記述するようなアッセイを用いると、結合を阻害する化合物を試験 管内で同定できる。本明細書に示すように、霊長類ＭＡｄＣＡＭ部分を持つ融合 蛋白質（２つのキメラＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合物）は、溶液中で、α４β７陽性 リンパ球に結合することができる。したがって、霊長類ＭＡｄＣＡＭ（機能的変 異体を含む）、特に可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子及び融合蛋白質（実施例３に 記載のキメラＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合物など）は、α４β７：ＭＡｄＣＡＭ相互 作用の阻害因子候補及び生体内における炎症部位に対するリンパ球補充の阻害因 子候補となり、それは後述するように、治療において有効でありうる。これらの 分子の生体内効力は、本明細書に記述する方法（例えば実施例４及び５を参照） または他の適当な方法を用いて評価できる。例えば、実施例５に記載のような霊 長類モデルを使用できる。ＣＤ４５ＲＢ^Hi／ＳＣＩＤモデルは、クローン病及び 潰瘍性大腸炎の両方と類似性を持つマウスモデルとなる（実施例４、Ｐｏｗｒｉ ｅ，Ｆ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：５５３−５６２（１９９４））。このモデ ルにおける効力は、モノクローナル抗体に用いた実験手順と同様の手順で評価で きる（実施例４）。投与（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）及 び経口（ｐ．ｏ．））後の、¹¹¹Ｉｎ−標識細胞の結腸に対する補充の阻害や、 大腸基底膜中のＣＤ＋Ｔリンパ球数の減少などといったパラメーターを評価でき る。ヒトの炎症性腸疾患と類似する腸障害を発生させるノックアウトマウスも既 に記述されており（Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．及びＥｈｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｏ．，Ｃ ｅｌｌ，７５：２０３−２０５（１９９３））、またＮＯＤマウスは、インスリ ン依存性真性糖尿病の動物モデルとなる。 さらに本発明は、α４β７インテグリンに対するＭＡｄＣＡＭ結合及び／又は α４β７が媒介する細胞応答の誘発を阻害することによって、胃腸路または他の 粘膜組織に対する白血球補充に関連する疾患（例えばＩＢＤ）を治療できるとい う発見に関する。結合を阻害する化合物または薬物としては、本明細書に定義す る「霊長類ＭＡｄＣＡＭ」（可溶型霊長類ＭＡｄＣＡＭ分子及び融合蛋白質を含 む）や、ＭＡｄＣＡＭ及び／又はα４β７インテグリンを結合する抗体またはそ の抗原結合性断片を挙げることができる。この方法に使用できる抗体としては、 組換え型または非組換え型のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ 抗体、ヒトに適合させたおよび／または抗イディオタイプ抗体が挙げられる。 ＭＡｄＣＡＭまたはα４β７を結合するモノクローナル抗体は既に記述されて いる。例えば、ＭＥＣＡ−３６７はＩｇＧ２ａサブタイプの抗ＭＡｄＣＡＭ抗体 であり、Ｇａｌｌａｔｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３０４：３０（１９８３）及びＭ ｉｃｈｉｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４３：１６８８−１６９８（１９ ９３）に記述されている。ACT-1は、α４β７インテグリンを結合するモノクロ ーナル抗体である（Lazarovitsら，J．Immunol，133:1857（1984）；Schweighof ferら，J．Immunol.，151:717-729（1993））。FIB21はβ７鎖を結合し、Berlin ら，Cell，74:184-195（1993）やAndrew，D.P.ら，J．Immunol.，153:3847-3861 （1994）に記述、特徴づけがなされている。 他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えば前記の抗体と同じまた は類似のエピトープに結合する抗体などは、本明細書に記載の方法、当該技術分 野で公知の方法、または他の適当な方法（例えばKohlerら，Nature，256:495-49 7（1975）、Harlowら，1988，Antibodies: A Laboratory Manual，（ニューヨー ク州コールドスプリングハーバー）またはCurrent Protocols in Molecular Bio logy,第２巻（増補27,1994年夏），Ausubelら編（John Wiley & Sons：ニューヨ ーク州ニューヨーク），第11章（1991））に従って作成できる。また、α４β７ インテグリン（好ましくはヒトα４β７インテグリン）を保持する細胞に対する 結合に関して、10G4、8C1、10G3、9G12、9E4、7H12、10F2、10A6、1E5、2F5また は7F11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体のいずれか１ つと、競争できる抗体を作成することもできる。 例えば、適当な哺乳類（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなど）中で適当な免 疫原に対して抗体を生じさせることができる。免疫原としては、例えば、ＭＡｄ ＣＡＭ、α４β７、またはそれらの免疫原性断片を挙げることができる。例えば 、ある霊長類ＭＡｄＣＡＭまたはその変異体を生産し、それを免疫原として、適 当な免疫化法で抗体を生じさせることができる。 抗体産生細胞（リンパ球など）は、例えば感作動物のリンパ小節または脾臓か ら単離できる。次に、これらの細胞を適当な不死化細胞（例えば骨髄腫細胞株） と融合することによって、ハイブリドーマを形成させる。融合細胞は、選択培養 技術を使用して単離できる。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞は、適当な アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択できる（例えば実施例２を参照）。 一態様として、免疫原を、例えばＭＡｄＣＡＭ、α４β７またはそれらの免疫 原性断片を結合する抗体としてもよい。これによって生じた抗体は抗イディオタ イプ抗体であることができ、これもまた本発明で使用できる（米国特許第４，６ ９９，８８０号）。 単鎖抗体、キメラ、ヒトに適合させたまたは霊長類に適応させた（例えばＥＰ ０，５９２，４０６；Ｐａｄｌａｎら，１９９４年４月１３日などに従ってＣＤ Ｒ移植または再表面処理した）抗体ならびに異なる種に由来する部分を含むキメ ラまたはＣＤＲ移植単鎖抗体が、本発明で使用できる。これらの抗体の様々な部 分は、従来の技術を用いて、互いに化学的に結合するか、若しくは遺伝子操作技 術を用いて、一つの連続的蛋白質として調製することができる。例えば、キメラ またはヒトに適合させた鎖をコードする核酸を発現させることによって、連続的 蛋白質を製造することができる。例えばＣａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１ ６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号、Ｂｏ ｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓら，欧州特許第０，１２０ ，６９４Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，国際特許第８６／０１５３ ３ 号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号、 Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号およびＷｉｎｔｅｒ，欧州特許 第０，２３９，４００Ｂ１号を参照のこと。また、霊長類に適応させた抗体につ いては、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５ −１４６０（１９９２）を、単鎖抗体についてはＬａｎｄｅｒら，米国特許第４ ，９４６，７７８号とＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３ −４２６（１９８８）をも参照のこと。 さらに、抗体の機能的断片（キメラ、ヒトに適合させた、霊長類に適応させた または単鎖抗体の断片を含む）も製造できる。前記の抗体の機能的断片は、それ らが由来する完全長抗体の結合機能の少なくとも１つを保持し、好ましくは、相 互作用を阻害する能力を保持する。例えば、α４β７インテグリン、ＭＡｄＣＡ Ｍまたはそれらの一部に結合できる抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ およびＦ（ａｂ’）₂断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 このような断片は、酵素的切断や組換え技術によって生産できる。例えば、パパ インまたはペプシン切断によって、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂断片を 生成させることができる。別法として、天然の停止部位の上流に１以上の停止コ ドンが導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の先端欠失型抗体を生産するこ ともできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重 鎖のヒンジ領域とＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むように設計する ことができる。 本願に係る方法に使用できる抗体及びその抗原結合性断片としては、ＭＡｄＣ ＡＭ及び／又はα４β７に結合する抗体、例えば抗β７鎖抗体などが挙げられる 。例えば、ＦＩＢ２１、ＦＩＢ３０、ＦＩＢ５０４及びＡＣＴ−１ならびにそれ らの混合物からなる群より選ばれる抗体を、投与することができる。別法として 、もしくはそれに加えて、これらの抗体の抗原断片を投与することもできる。 ＭＡｄＣＡＭとα４β７インテグリンの結合を阻害する化合物または薬物は、 ＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織の白血球（リンパ球、単球など）浸潤（組 織における白血球の補充及び／又は蓄積を含む）に関係する疾患の治療において 、本願に係る方法に従って投与することができる。そのような疾患を治療するに は、（１以上の）化合物または薬物の有効量を個体（例えば哺乳類（ヒトや他の 霊長類など））に投与する。例えば、炎症性疾患（胃腸路（腸−関連内皮を含む ）、他の粘膜組織、若しくはＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織（例えば、小 腸大腸の基底膜の細静脈のような腸−関連組織、乳腺（泌乳性乳腺など））の白 血球浸潤に関連する疾患を含む）を、本願方法に従って治療できる。さらに、Ｍ ＡｄＣＡＭ−１分子を発現する細胞（例えば内皮細胞）に対する白血球結合の結 果として起こる、組織の白血球浸潤に関連する疾患を持つ個体を、本発明に従っ て治療できる。 特に好ましい態様では、そのように治療できる疾患として、炎症性腸疾患（Ｉ ＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎、腹腔疾患、非熱帯性スプル ー、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細またはコラーゲン性大腸炎、 好酸球性胃腸炎、若しくは直腸結腸切除術や回腸肛門吻合術後に起こる窩炎（ｐ ｏｕｃｈｉｔｉｓ）などが挙げられる。 膵炎とインシュリン依存性真性糖尿病は、本発明の方法を用いて治療できるそ の他の病気である。ＭＡｄＣＡＭ−１は、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウス、なら びにＢＡＬＢ／ｃマウス及びＳＪＬマウスの外分泌腺・膵臓中のいくつかの血管 によって発現されると報告されている。ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、ＮＯＤマウ スの膵臓の炎症を起こした島の内皮上で誘導されると報告されており、またＭＡ ｄＣＡＭ−１は、インスリン炎の初期段階にＮＯＤ島内皮によって発現される主 要アドレシンであった（Ｈａｎｎｉｎｅｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ．，９２：２５０９−２５１５（１９９３））。さらに、島内にはα４β７を 発現するリンパ球の蓄積が認められ、ＭＡｄＣＡＭ−１は、炎症を起こした島の 血管に対する（α４β７による）リンパ球細胞の結合と関係した（Ｈａｎｎｉｎ ｅｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５０９−２５１５（１９ ９３））。 本発明方法に従って治療できる粘膜組織関連炎症性疾患の例としては、乳腺炎 （乳腺）、胆嚢炎、胆管炎または胆管周辺炎（胆管と肝臓周辺の組織）、慢性気 管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息及び（例えば胃腸路における）対宿主性移植片病な どが挙げられる。クローン病に見られるように、炎症はしばしば粘膜表面を超え て広がるので、間質性繊維症をもたらす胚の慢性炎症性疾患、例えば過敏性肺炎 、コラーゲン病、類肉腫症及び他の突発性疾患なども治療できる。 化合物は、α４β７インテグリンに対するＭＡｄＣＡＭの結合を阻害する有効 量で投与される。治療の場合、有効量とは、所望の治療及び／又は予防効果を達 成するに足る量（例えば、ＭＡｄＣＭＡが媒介する結合及び／又はシグナリング を軽減または予防することによって、白血球の接着と浸潤及び／又は関連する細 胞応答を阻害するに足る量）になるだろう。化合物は、１回量で投与してもよい し、多数回量で投与してもよい。用量は、当該技術分野で知られる方法によって 決定でき、例えば患者の年齢、感受性、耐性及び総合的健康状態などに依存する 。抗体の好適な用量としては、１処置あたり０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ−体重が 考えられる。 化合物または薬物は、本発明に従って、単独で、若しくはもう１つの薬物と組 み合わせて、個体（例えばヒト）に投与できる。化合物または薬物は、その追加 薬物投与の前、追加薬物投与と同時または追加薬物投与後に投与できる。一態様 として、内皮ＭＡｄＣＡＭに対する白血球の結合を阻害する１以上のモノクロー ナル抗体を投与する。あるいは、内皮リガンドに対する白血球の結合を阻害する モノクローナル抗体を、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体または抗β７抗体に加えて投与する 。例えば、ＭＡｄＣＡＭ以外の内皮リガンドに対する白血球の結合を阻害する抗 体（例えば抗ＩＣＡＮ−１抗体や抗ＶＣＡＭ−１抗体など）を投与することもで きる。もう１つの態様として、追加の薬学的に活性な成分（例えばスルファサラ ジ ン、抗炎症性化合物、ステロイド系抗炎症性化合物または他の非ステロイド系抗 炎症性化合物）を、前記化合物または薬物（例えば本発明の抗体）と組み合わせ て投与してもよい。 様々な投与経路が可能であり、治療すべき状態または疾患に応じて、腸管外投 与法（静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射など）、経口投与法（食 餌法など）、局所投与法、吸入投与法（気管支内吸入、鼻孔内吸入または経口吸 入、鼻孔内滴剤など）、直腸投与法などが挙げられるが、必ずしもこれらに限ら れるわけではない。腸管外投与が好ましい投与法である。 投与すべき化合物の製剤は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例え ば液剤、乳剤、カプセル剤など）。投与すべき化合物を含む適当な組成物を、生 理学的に許容される担体または賦形剤中に調製することができる。液剤や乳剤の 場合は、適当な担体として、例えば食塩水や緩衝培地などの水溶液、アルコール ／水溶液、乳液、懸濁液などが挙げられる。腸管外用の賦形剤としては、食塩溶 液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リ ンゲルまたは脂肪油などを挙げることができる。静脈内用の賦形剤としては、種 々の添加物、保存剤、液体、栄養または電解物質補充剤などを挙げることができ る（一般的にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ，第16版，Ｍａｃｋ編，１９８０を参照のこと）。吸入法の場合は、 化合物を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー（アトマイザー、ネブライザー または加圧エアゾールディスペンサーなど）に入れることができる。実施例 以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例等によ りなんら限定されるものではない。概論 ネズミＭＡｄＣＡＭ ＤＮＡプローブとズー ブロットとを用いる低ストリン ジェント条件下でのハイブリダイゼーション解析によって、ネズミＭＡｄＣＡＭ −１とそれより高等な種との間には、ヌクレオチド保存があまりないことが示さ れた。霊長類及びヒトホモログのクローン化には機能発現法を使用し、それによ って、ＭＡｄＣＡＭ−１リガンド（α４β７）を高レベルに発現する標的リンパ 球細胞株への接着能を付与するｃＤＮＡを形質導入した細胞を同定し、そのｃＤ ＮＡを回収した。ヒト組織供給源は少なかったので、まず、ＭＡｄＣＡＭ−１の 霊長類相同体を同定した。 発現クローニングのために、アカゲザルの腸間膜リンパ小節由来の霊長類ｃＤ ＮＡ発現ライブラリーを、真核発現ベクターｐＲＳＶｓｐｏｒｔ（ギブコ（Ｇｉ ｂｃｏ）／ＢＲＬ製）中に作成した。ＣＨＯ／Ｐ細胞株を用いる高効率形質導入 株（Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ，Ｍ．及びＪ．Ｄ．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：８５−９２（１９９１））を使用した。ライブラリ ーを分離し、個々のプール（約１，５００クローン体に相当）を２４ウェル組織 培養プレートのウェル内で形質導入した。細胞接着アッセイを行なって、ＭＡｄ ＣＡＭ−１の既知のリガンドであるα４β７インテグリンを発現するＴ及びＢ細 胞株に対する接着表現型を付与するｃＤＮＡを同定した。接着は、形質導入され た細胞に対するＴ及びＢ細胞株のロゼット形成によって、顕微鏡的に同定した。 所望の表現型を付与するプールを、さらに細分化し続けることによって、単一の 完全長ｃＤＮＡクローン体（クローン体３１Ｄと命名）を同定した。このｃＤＮ Ａのアミノ末端部分のＤＮＡ配列決定によって、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（Ｂｒ ｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．らＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３６３：４６１−４６４ （１９９３））に対する該アカゲザルクローン体の相同性が、蛋白質レベルでも 核酸レベルでも明らかになった。 一過性トランスフェクションによってＣＨＯ／Ｐ細胞に導入すると、クローン 体３１Ｄから得たｃＤＮＡ挿入物は、α４β７を発現する２つの細胞株、すなわ ち（１）ＴＫ１，ネズミＴ細胞リンパ腫（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｅｕｒ ．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５５６−５６１（１９８０））と（２）Ｒ Ｐ ＭＩ８８６６，ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，１５３：５１７−５２８（１９９４））に対する結合を媒介できる蛋白質 の発現を指示した。アカゲザルｃＤＮＡを形質導入した細胞に対するＴＫ１細胞 の結合は、α４（ＭＡｂ ＰＳ／２）またはβ７（ＭＡｂ ＦＩＢ５０４）イン テグリンのいずれかに対する抗体によって遮断することができ、アカゲザルｃＤ ＮＡ（ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ中のクローン体３１Ｄ）を一過性トランスフェクショ ンしたＣＨＯ／Ｐ細胞に対するＲＰＭＩ８８６６の結合は、抗α４β７ＭＡｂで あるＡＣＴ−１によって遮断された。対照実験において、ヒトＶＣＡＭ−１をコ ードするｃＤＮＡは、ＲＰＭＩ８８６６ヒトＢ細胞株に結合できなかった。α４ β１を発現するがα４β７を発現しないＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｖ ＣＡＭ−１を結合するが、アカゲザルｃＤＮＡを発現する形質導入体を結合でき ないことがわかった。 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の霊長類（アカゲザル）ホモログをコードするｃＤＮ Ａをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によって、ヒトホモログをコー ドするクローン体を得た。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン体を得るために、２つ のｃＤＮＡライブラリー（１つは組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節（ＭＬ Ｎ）に由来し、もう１つはクローン病患者から得た炎症を起こしたＭＬＮリンパ 小節に由来する）を、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ製のλＺｉｐｌｏｘファー ジベクター中に構築した。上記アカゲザルクローン体から得たｃＤＮＡを用いて 、これらのライブラリーをスクリーニングした。よく似たサイズを持つ２種類の ヒトｃＤＮＡが単離された。予備的な配列分析によると、これらのクローン体は 、それぞれ完全長であるようだった。ヒト及びアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ ｃ ＤＮＡの分析は、コードされている蛋白質のそれぞれが、疎水性リーダーと推定 される配列（図１〜３の下線部）と、それぞれ推定成熟ヒトまたはアカゲザルＭ ＡｄＣＡＭ−１に相当する蛋白質からなる残余部分とを持つことを示す。 機能を評価するために、ヒトｃＤＮＡ挿入物をｐＣＤＮＡ３発現ベクター（イ ンビトロジェン）中にサブクローニングし、一過性発現アッセイを用いて機能を 立証した。ヒトｃＤＮＡは機能的蛋白質として発現させることができ、α４β７ を発現する細胞に対する特異的な結合を媒介できる。したがって、これら２つの ヒトｃＤＮＡクローン体をヒトＭＡｄＣＡＭ−１ ｃＤＮＡと呼ぶ。 霊長類ｃＤＮＡとヒトｃＤＮＡ両方の安定な形質導入体を、マウスプレＢ細胞 株Ｌ１−２及びＣＨＯ細胞中に作成した。Ｌ１−２形質導入体を用いてマウスを 免疫化し、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を作成した。ＭＡ ｄＣＡＭ−１とα４β７の間の相互作用を阻害できる抗体を同定した。ヒトＭＡ ｄＣＡＭ−１に対する遮断性抗体の生産は、意義深い進歩である。なぜなら、ヒ トホモログとの交差反応性を持つこのような遮断性抗体をネズミＭＡｄＣＡＭ− １を用いて生産しようとした過去の試みは失敗に終わっているからである。実施例１ アカゲザルとヒトＭＡｄＣＡＭ−１のｃＤＮＡのクローニング ＲＮＡの単離とメッセージの選抜 全ＲＮＡは、（ａ）霊長類（アカゲザル）腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）； （ ｂ）組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節； （ｃ）クローン病の患者由来の ヒト腸間膜リンパ小節（回腸小節）； および（ｄ）組織培養細胞からＣｓＴＦ Ａ^TM（トリフルオロ酢酸セシウム）試薬（ファルマシア；Ｃａｔ．＃１７−０８ ７−０２）の使用により単離された。腸間膜リンパ小節由来の全ＲＮＡは、アカ ゲザルの２種（マカク ファサイキュラリス、およびマカク ムラッタ）から得 られ、ポリ−Ａ ＲＮＡの単離前に併合した。組織培養細胞（１−５×１０⁸） はリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄し、ピペッティングにより均質 化すると同時に、組織は、最初に、液体窒素中で瞬間冷凍し、５．５Ｍ イソチ オシアン酸グアニジン、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％ ラウレルサ ルコシンナトリウム、および０．２Ｍ ２−メルカプトエタノールを含有する溶 液中でダウンスホモジナイゼーションに付された。不純物を除去した分離物は、 ＣｓＴＦＡの緩衝物上に重層するとともに、全ＲＮＡを２０時間、３０，０００ ＲＰＭの遠心分離によりペレットにした。 ｍＲＮＡはプロメガ社のｐｏｌｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ アイソレーション システムで選抜した。該システムは、ビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プライマー を、真核生物のメッセージのポリＡ末端とハイブリダイズするために（溶液中で ）使用する。ハイブリッドは、微磁気粒子および磁気分離スタンドと共役したス トレプトアビジンを用いて、高いストリジェンシーで得、洗浄した。ｍＲＮＡは 、このシステム中で一回の精製で選抜し、収率は、全ＲＮＡ収率の１−２％の範 囲であった。全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方のインテグリティーはゲル電気泳動 および臭化エチジウム染色により解析した。ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡは、スーパースクリプト^TMラムダシステム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^TM ｌａｍｄａ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃａｔ．＃１８２５６−０１６）を、ヒトラ イブラリーの場合は、λＺｉｐｌｏｘ^TMベクター（ギブコ／ビーアールエル（Ｇ ｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ガイゼルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ、 Ｃａｔ．＃１９６４３−０１４）と、または、アカゲザルライブラリーの場合は 、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクター（ギブコ／ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ／Ｂ ＲＬ）、Ｃａｔ．＃１５３８８−０１０）とのいずれかと共に使用することによ って合成された。通常のプロトコールから下記の改良をした。ｃＤＮＡは第１鎖 か第２鎖にのみ（しかし両方でない）をα³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、量の推定 は、等分量のｃＤＮＡフラクションの臭化エチジウム染色の検査により行った。ＤＮＡシークエンシング アカゲザルおよびヒトＭＡｄＣＡＭ−１の完全なｃＤＮＡは、それぞれ、まず 最初にライブラリーベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１とｐＺＬ１（λＺｉｐｌｏ ｘ^TMから取り出した）から単離した。制限地図に基づき、ｃＤＮＡの内部領域か らのシークエンシングを行いやすくするため、断片をブルースクリプト（Ｂｌｕ ｗｓｃｒｉｐｔ）ベクター（ストラタジーン）にサブクローン化した。これら のクローン体のシークエンス解析の後、シークエンスを相補するようにオリゴヌ クレオチドプライマーを作成した。両鎖のオーバーラップする配列を得た。シー クエンス解析は、シーケナーゼ バージョン２．０ Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラー ゼ（ユナイテッド ステーツ バイオケミカル）と³⁵Ｓ−ｄＣＴＰ（アマシャム ライフ サイエンス アンド ニュー イングランド ニュークリアー）と共 に、シーケナーゼ^TM ７−デアザ−ｄＧＴＰ ＤＮＡシークエンシングキットを 利用した。Ｇ−Ｃリッチな配列には、デルタＴＡＱシークエンシングキット（Ｕ ＳＢ）とガンマ³²Ｐ−ＡＴＰ（アマシャム社製）Ｇ−Ｃリッチ シークエンスを 用いた。 シークエンスは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅシステム（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いて 入力し解析した。ヌクレオチド配列のアラインメントは、ウェートされた残基の ウェート表による、ギャップ ペナルティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１０お よびギャップ レングス ペナルティー（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔ ｙ）１０、およびデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅ ｒ）（アラインメントパラメーター（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ）と対をなすものに関しては：ｋｔｕｐｌｅ＝２、ギャップ ペナルティー（ｇ ａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ウインドー（ｗｉｎｄｏｗ）＝４、およびダイア ゴナルセーブド（ｄｉａｇｏｎａｌ ｓａｖｅｄ）＝４である）を用いたクラス タルメソッドにより行った。 アミノ酸配列アラインメントはＰＡＭ２５０残基重量表で、ギャップ ペナル ティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１０およびギャップ レングス ペナルティ ー（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１０、およびデフォルトパラメー ター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（アラインメントパラメーター（ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）と対をなすものに関しては：ｋｔｕ ｐｌｅ＝１、ギャップ ペナルティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝３、ウイン ドー（ｗｉｎｄｏｗ）＝４、およびダイアゴナルセーブド（ｄｉａｇｎａ ｌ ｓａｖｅｄ）＝５である）を用いたクラスタルメソッドにより行った。アカゲザル発現ライブラリーの調製 サイズフラクション手順は、大きい挿入断片（＞１．５ｋｂ）を確保するアカ ゲザル発現ライブラリーの構築のために、またわずかに改良した。一巡の分画の 後、一番目の（最も大きい）ｃＤＮＡの画分のみを取って置き、残りの画分は貯 めておき次の一巡の分画にかけた。次の一巡の一番目の画分は、前の一巡の一番 目の画分と共に貯めておき、この一巡の二番目の画分もまた使用した。これらの ２つの画分を沈澱させ、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１ベクターとのライゲーションに 加え、そしてそれぞれのライゲーションの画分は、ライブラリーのタイターおよ び平均挿入断片サイズの両方を評価するために、エレクトロコンピテントＤＨ１ ０Ｂバクテリア（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））に形質転換した。一番目の最も大きい ｃＤＮＡフラクションのみのライゲーションの評価は、平均１．９ｋｂの挿入断 片サイズおよび中間値が２ｋｂのサイズを持つ２４０万個の独立なクローン体を 作ることの可能性を示した。 実際のスクリーニングされたライブラリーは、１００枚の５０μｇ／ｍｌのア ンピシリンのＬＢ寒天プレートに１，５００クローン体／プレートの密度でプレ ーティングし（１００個の１，５００クローン体／プールを生じさせる）、３７ ℃で一晩培養した１５０，０００の独立クローン体を含有した。個々のプールの 精製のために、それぞれのプレートに約２ｍｌのルリア培地（ＬＢ）を重層し、 各々のプレートのコロニーを標準組織培養細胞スクラッパーでこそぎ落とし、ま たバクテリアの懸濁物を微量遠心チューブに移した。精製の前に、各々のプール からグリセロールストックを作成した。プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐスピ ンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の使用説明書に従って用いて精製した。形質導入 ＣＨＯ／Ｐ細胞（ヘッファナン、Ｍ．およびＪ．Ｄ．デニス、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９：８５−９２（１９９１））を、形質導入に約 ２４時間先立って、４０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに接 種した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM試薬（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）；Ｃａｔ． ＃１８３２４−０１２）を用いて、推薦された、プロトコールに基本的に従って 、２４ウェルプレートに以下のように最適化して、ＤＮＡを一過性に形質導入し た： ２００ｎｇのＤＮＡ（プラスミドプールまたは精製された対照のＤＮＡを示す） をＯｐｔｉ−ＭＥＭ１還元血清培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））で２０μｌに希釈 し、１８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１と２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM試 薬からなる２０μｌの混合物に希釈した。このリポソーム混合物は、さらに約３ ０分間、周囲の温度でインキュベートし、その後、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥ Ｍ１を添加し、完全な混合物を、さらにＣＨＯ／Ｐ細胞のウェルに重層し、イン キュベーターに戻した。３７℃で２．５時間のインキュベートの後、２０％ウシ 胎児血清（ＦＣＳ）を有する２４０μｌのＭＥＭ−α（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）） 培地をと共に各々のウェルに添加し、細胞をさらに１８−２４時間、３７℃でイ ンキュベートした。培地は、さらに１０％ＦＣＳを含む標準ＭＥＭ−αに変え、 約２０−２４時間後、接着アッセイを行った。発現クローニングのための接着アッセイ 発現クローニングスクリーニングにおける接着アッセイのために、高レベルの α４β７を発現するネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１（ブッチャー，Ｅ．Ｃ．等、ヨ ーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ）、１０：５５６−５６１（１９８０））を接着の表現型を授ける能力があるｃ ＤＮＡを導入したＣＨＯ／Ｐ細胞を検出する為に使用した。ＴＫ１細胞は２％ウ シ胎児血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、２ｍＭ Ｍｇ²⁺、および２ｍ Ｍ Ｃａ²⁺を補ったＨＢＳＳ（ハンクス バランスド塩溶液、Ｃａ²⁺またはＭｇ²⁺ は無し）からなる、アッセイ緩衝液中、２×１０⁶／ｍｌの密度で再懸濁され た。ＤＮＡプールにより形質導入した各々のウェルは、ＶＣＡＭ−１（それは、 初期リンパ小節中に高レベルで発現する）により仲介される接着、あるいは、ネ ズミＭＡｄＣＡＭ−１発現プラスミドの潜在的な混入を除去するため、ヒトＶＣ ＡＭ−１（ＭＡＢ ２Ｇ７；グラバー、Ｎ．Ｔ．、等．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１４５：８１９−８３０（１９９０））およびネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ＭＡ ｂ ＭＥＣＡ−３６７；アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ロッ クバイル、ＭＤ）、アクセッションＮｏ．ＨＢ９４７８；ストリーター、Ｐ．Ｒ ．、等、ネーチャー、３３１：４１（１９８８））；ブッチャーのＵ．Ｓ．Ｐａ ｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４０３，９１９も参照せよ）の両方に対するモノクローナ ル抗体を含有する混ぜた上清０．２５ｍｌと共にプレインキュベートした。４℃ で１５分間のインキュベーションの後、０．２５ｍｌのＴＫ１細胞懸濁物（５× １０⁵ＴＫ１細胞）を、各々のウェルに添加し、振盪台上でのインキュベーショ ンを、さらに３０分間、４℃で続けた。プレートを、リン酸緩衝生理的食塩水（ ＰＢＳ）の大きいビーカー中で、緩やかに反転することにより洗浄し、続いて、 最低限１時間の固定のために、１．５％グルタルアルデヒドの入ったＰＢＳのビ ーカーで反転した。ウェルは、さらに顕微鏡的（１０×対物レンズ）にＴＫ１細 胞のロゼッティングを調べた。アカゲザルクローン体の精製 １種以上のＴＫ１ロゼットを産生するプールをさらに以下のプロトコールで再 分画した。：陽性プールを示すＤＮＡでＤＨ１０Ｂを再び形質転換し、９６枚の １００ｍｍペトリ皿に約２００コロニー／プレートの密度でプレーティングした 。ニトロセルロース膜をレプリカブレートの作成に使用し、各々のプレートの１ セットをさらに前記のＤＮＡ精製および続く接着アッセイに付した。陽性プール を示すレプリカプレートは、そしてさらに、レプリカプレートを行い、アンピシ リンを含むＬＢ培地で一晩培養した５個のコロニーのプールにサブフラクション した。一巡以上のＤＮＡ精製と接着アッセイの後、個々のクローン体を、さらに 培養することができ、ＴＫ１細胞の接着を授与するクローン体を同定した。 ＭＡｄＣＡＭ−１をコードすることを示す完全長のクローン体を得、クローン 体３１Ｄと称した。ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（Ｐ２５）で構築した、クローン体 ３１Ｄは、５’−ＳａｌＩからＮｏｔＩ−３’ｃＤＮＡ挿入断片を含有する。ク ローン体３１Ｄを有するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株の形質転換体を得た。安定 な細胞株における発現のため、本ｃＤＮＡを、Ｇ４１８選抜に適したｎｅｏ耐性 遺伝子を持つ発現ベクターｐｃＤＮＡ−３（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ））にサブクローン化した。特に、クローン体３１Ｄの挿入断片はＥｃｏＲ Ｉ（５’）およびＮｏｔＩによる消化により切り離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉで切断したｐｃＤＮＡ−３に挿入しｐｃＤ３ｐＭＡｄを得た。結果 １，５００個の独立クローン体のプールに分割した、ｃＤＮＡ発現ライブラリ ーは、アカゲザル腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）から精製したｍＲＮＡから構築し た。各々のプールは、一過性にＣＨＯ／Ｐ細胞株に形質導入し、形質導入後４８ 時間後、細胞接着アッセイを、ネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１を用いて行った。Ｖ ＣＡＭ−１がＭＬＮで発現したので、アッセイを、抗−ＶＣＡＭ−１ ＭＡｂ ２Ｇ７（グラバー，Ｎ．Ｔ．、等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：８１９−８ ３０（１９９０））の存在下で行った。さらに、ＩＣＡＭ ｃＤＮＡにより仲介 された接着を評価するために４℃で試験を行った（ＴＫ１細胞は、高レベルのＬ ＦＡ−１を発現し、ＬＦＡ−１は４℃では機能しない）。該アッセイの顕微鏡検 査によると、ＴＫ１細胞の顕著なロゼッティングを有するいくつかのウェルが示 された。形質導入を繰り返し、プールにより仲介された結合が、抗−β７または 抗−α４ ＭＡｂｓにより阻害されうるかどうかを決定することによるさらなる 解析のために、二つのウェルを選んだ。プールの中の一つへのＴＫ１の結合は、 抗−α４ ＭＡｂ ＰＳ／２または抗−β７ ＭＡｂ ＦＩＢ ５０４いずれか とのＴＫ１細胞のプレインキュベーションによって完全に阻害される。このプー ルは、３１Ｄと呼ぶ１つのクローン体を、単離するまで３巡のサブフラクション に付された。精製したクローン体３１Ｄは、抗−α４または抗−β７抗体によっ て阻害されうるＴＫ１細胞結合を仲介した。 クローン体３１Ｄの挿入断片の大きさは約１．８ｋｂであった。アミノ−末端 のシークエンシングは、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の霊長類のホモログと一致する 幾つかの特徴を示した。シグナルペプチドは両方とも２１アミノ酸の長さであっ た。アミノ酸の類似性はわずか４８％であることがわかったが、非−保存置換を 考慮すれば、相同性は７１％であった。さらに、クローン体３１Ｄによってコー ドされる蛋白質は、Ｉｇ−ファミリー接着レセプターに独特の特徴：最初の免疫 グロブリンドメイン中の３−４（本件では３）アミノ酸離れた二対のシステイン を有する。最終的に、最初の二つのシステインに対して８アミノ酸Ｃ末端側は、 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１の配列と同一である９アミノ酸の範囲である。この領域 の中には、ＬＤＴＳＬ配列があり、それはインテグリン／Ｉｇファミリーメンバ ーの相互作用のコンセンサスモチーフを配列する。このモチーフは、ＩＣＡＭ− １、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３およびＶＣＡＭ−１（オズボーン，Ｌ．等、Ｊ ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１２４：６０１−６０８（１９９４）；レンツ，Ｍ．Ｅ ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１２５：１３９５−１４０６（１９９４））等 の他のＩｇ接着レセプターに関係する一般的な保存を有するが、この正確な配列 が、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１にのみに、以前に見つけられた。本モチーフの機能 的な重要性は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１におけるモチーフのアミノ酸６１の最初 のＬ（ロイシン）からＲ（アルギニン）へ変換させたポイント変異がＭＡｄＣＡ Ｍ−１：α４β７結合に劇的な影響を有する事実により示唆される（示されてい ない）。これらの配列の特徴に伴う機能的研究は、クローン体３１Ｄが、ネズミ ＭＡｄＣＡＭ−１に対する霊長類のホモログをコードすることを示す。ヒトファージライブラリーのスクリーニングとヒトクローン体の精製 ヒトファージｃＤＮＡライブラリーをλＺｉｐｌｏｘ^TMベクター（ギブコ（Ｇ ＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）において構築した。ヒトｃＤＮＡも、前記の正常または炎 症を起こした腸間膜リンパ小節（ＭＬＮ）のどちらかから単離したＲＮＡから作 成した。ｃＤＮＡは前記のように合成し、該ファージベクターに連結し、細菌株 Ｙ１０９０（ＺＬ）（”ＺＬ”＝Ｚｉｐｌｏｘ）でのタイターを測定した。正常 およびクローンＭＬＮファージライブラリー両方由来の約５００，０００個の独 立のクローン体（５０，０００個クローン体／フィルター）の複製のフィルター を³²Ｐラベルした全長アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ｃ ＤＮＡでスクリーニング した。 プローブを調製するために、約１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を、ク ローン体３１Ｄから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ １０１）を用いて 単離した。該断片は、ランダムヘキサマーを用いてプライミングして、α³²Ｐ− ｄＣＴＰでラベルした（マニアティス．等、モレキュラー クローニング中（コ ールド スプリング ハーバー ラボラトリー、コールド スプリング ハーバ ー、ニューヨーク、１９９０））。 スクリーニング条件は下記のようである：５０，０００ファージクローン体を 、ＮＺＹＣＭ寒天（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）を含む１５０ｍｍのペトリ 皿にプレーティングした。７−１６時間にわたってインキュベーションした後、 プレートに１３２ｍｍのニトロセルロースフィルター（シュライチャーおよびシ ュエル，キーン，ＮＨ）を２分間重ね合わせ、次いで５分間、ファージクローン 体の１番目および２番目の（複製）リフトに、個々に、移した。フィルターは、 次いで５分間、変性溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸化ナトリウム ）に浸し、次いで１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５中で中和した。フィルターは１５分間、風乾し、次いで２時間、８０℃、 減圧下で焼き付けた。 フィルターを、２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート（１ ×デンハート溶液は０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコール、お よび０．０２％ポリビニル−ピロリドンである）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および ５０μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ中で、２時間、５５℃でプレハイブリダイ ゼーションし、その後、同じ緩衝液中で、一晩５５℃でハイブリダイズした。フ ィルターは、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナ トリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）中で、室温で一度洗浄し、 次いで、６５℃で、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で、３から４回の 洗浄を行った。フィルターは、バックグラウンドを減らすことを見るためにガイ ガーカウンターでモニターされた。 陽性クローン体はプラーク精製し、ｃＤＮＡ挿入断片を含むプラスミドｐＺＬ １をＣＲＥ ＬＯＸレコンビネーション システム（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を 用いて切り離した（プラスミドｐＺＬ１はラムダＺｉｐｌｏｘベクター本体中に 含まれる）。特に、精製したファージプラークを２００μｌのファージ緩衝液（ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｍ ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１％ゼラチン）中、５分間、室温で懸濁した。次いで 、２０μｌのファージ懸濁液を１００μｌのＤＨ１０Ｂ（ＺＬ）の一晩培養液に 添加し、さらに５分間インキュベートした。混合物の希釈液を、次いでアンピシ リン５０μｇ／ｍｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を補ったＬＢプレートにプレー ティングし、３０℃で一晩インキュベートした。ｐＺＬ１ベクター中に挿入した ｃＤＮＡを含む、単一のコロニーを標準一晩培養液として培養し、プラスミドを Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製試薬を用いて精製した。はっきりした機能のヒトＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローン体の同定 組織学的に正常なヒト腸間膜リンパ小節、およびクローン病の患者由来の炎症 を起こした腸間膜リンパ小節由来の二つのヒトｃＤＮＡライブラリーを、完全な アカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングし た。１つのクロスーハイブリダイするクローン体を正常なライブラリーから単離 し、２つのクロス−ハイブリダイするクローン体をクローン病のライブラリーか ら単離した。クローン病のライブラリーから単離した２つクローン体のうち１つ は約１．３ｋｂであり、５’−末端で不完全であるように見え、シークエンスを 行わなかった。正常なライブラリー由来のクローン体（クローン体４）は、クロ ーン病のライブラリーから単離した、より長いクローン体（１５５８ｂｐ）（ク ローン体２０）より、わずかに大きかった（１６２４ｂｐ）。これらの２つのｃ ＤＮＡは、大きさで約１００ｂｐ異なるが、それらの５’および３’非翻訳配列 は、ほとんど同じ長さであった。それらは両方がアカゲザル配列とほとんど同一 であるアミノ−末端シグナル配列を含んでいるので、各々のクローン体は全長を 示した。 さらに、予備的なシークエンシングは、霊長類ｃＤＮＡと同じアミノ−末端の Ｉｇ−様ドメインの顕著な特徴を示した。これらのクローン体の大きさの差は、 非翻訳配列の長さに帰することができないので、おそらく変化はコード領域に帰 するであろう。 各々のクローン体が、機能的なヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするかどうかを 決定するために、各々のクローン体の挿入断片をＧ４１８選抜に適切であるｎｅ ｏ耐性遺伝子を持つｐＣＤＮＡ−３発現ベクター（インビトロゲン、サンディエ ゴ、ＣＡ）にサブクローン化した。ヒトｃＤＮＡ（３’−末端にＮｏｔＩオリゴ −ｄＴプライマー、および５’−末端にＳａｌＩアダプターを用いて作成された ）を、プラスミドｐＺＬ１を含有するλＺｉｐｌｏｘベクターに連結した。ｃＤ ＮＡ挿入断片を有するｐＺＬ１ベクターは、前記のように切り離した。サブクロ ーニングのためにクローン体４および２０の挿入断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉを用いてｐＺＬ１骨格から消化により切り離した。該ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ（ ５’→３’）断片を１％アガロースゲルで電気泳動を行った後、ジーンクリーン （Ｂｉｏ１０１）で単離し、該断片を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて切断 したｐｃＤＮＡ−３に連結した。ライゲーション混合物は、ＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃ ｏｌｉ マックスエフェシェンシー株（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を形質転換する ために用い、形質転換体を５０μｇ／ｍｌ アンピシリン（Ａｍｐ）を補ったＬ Ｂ寒天で選抜を行って得た。ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（クローン体４由来の挿入断 片）およびｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ２０（クローン体２０由来の挿入断片）で示され るプラスミドを得、制限消化により解析した。 クローン体ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（クローン体４由来の挿入断片）またはｐｃ Ｄ３ｈｕＭＡｄ２０（クローン体２０由来の挿入断片）を一過性にＣＨＯ／Ｐ細 胞へ形質導入した。ＣＨＯ／Ｐ形質導入体のヒトＢ細胞リンパ腫ＲＰＭＩ８８６ ６（図５）またはＴＫ１細胞（示していない）への接着により評価されるように 、各々のクローン体は結合および接着をを仲介しうる機能的な蛋白質の発現を指 示する。 ＣＨＯ／Ｐ形質導入体のＲＰＭＩ８８６６細胞への接着は、対照ＩｇＧによる のではなく、抗−α４β７ ＭＡｂ ＡＣＴ−１を用いてプレインキュベートす ることにより阻害された。形質導入体のＴＫ１細胞への接着は、抗−β７ ＭＡ ｂ ＦＩＢ ５０４により阻害された。これらの結果は、クローン体４（正常な 腸間膜小節ライブラリー由来）およびクローン体２０（クローン病のライブラリ ー由来）各々が、機能的なＭＡｄＣＡＭ−１蛋白質をコードすることを示す。さ らにこれらのはっきりしたｃＤＮＡを特徴付けるために、両方のクローン体を完 全にシークエンスした。結果 ヒトＭＡｄＣＡＭ−１をコードするクローン体４および２０由来のｃＤＮＡは 、それぞれ、１６２８ｂｐおよび１５４３ｂｐの長さである。クローン体４由来 のｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、４０６アミノ酸の推定される蛋白質（配 列番号：２）をコードする１２１８ｂｐの読み枠、および４１０ｂｐの３’非翻 訳領域を含むが、５’非翻訳領域は、含まなかった。クローン体２０由来のｃＤ ＮＡ（図２；配列番号：３）は、４ｂｐの５’非翻訳配列、３８２アミノ酸の予 想される蛋白質（配列番号：４）をコードする１１４６ｂｐの読み枠、および３ ９３ｂｐの３’非翻訳領域を含む。推定される１８アミノ酸のシグナル配列の切 断 後、コードされる蛋白質の推定される分子量は、４０，９１０（クローン体４） および３８，３７５（クローン体２０）ダルトンである。 複数のアラインメントは、ＭＡｄＣＡＭ−１の異なるクローン化された種間の 相同性の程度を解析するために行われた。ヌクレオチドのアライメントは、マウ スとラットのＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では８１．９％の相同性、マウスとア カゲザルｃＤＮＡ間では４１．８％の相同性、ネズミとヒト（クローン体４）Ｍ ＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では４２．１％の相同性、およびネズミとヒト（クロ ーン体２０）ＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡ間では４１．８％の相同性を示した。ヒ トクローン体４およびクローン体２０ｃＤＮＡとのアカゲザルＭＡｄＣＡＭ−１ のヌクレオチド配列のアライメントは、それぞれ７０．７％および７５．０％の 相同性を示した。 アミノ酸配列相同性はマウスとラットＭＡｄＣＡＭ−１間では７８．５％、マ ウスとアカゲザルでは４４．３％、およびネズミとヒトクローン体４がコードす るＭＡｄＣＡＭ−１間では３９％であることが決定された。 ｃＤＮＡクローン体４および２０の比較は、セリン、スレオニンおよびプロリ ン残基の頻度（クローン体４が６９％、クローン体２０が７６％）による（図１ と図２で囲まれた）、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチンドメインとの相同性があ る領域を示した。この領域は、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１にアミノ酸組成において 似ているが、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１とは高く異なる。該ドメインは、クローン 体４では７１アミノ酸の長さ、およびクローン体２０では４７アミノ酸の長さで ある。該領域は、２つの多型も含んでいる。：（１）アミノ酸２４０における多 型であり、それがクローン体４においてはプロリン（Ｐ）でありクローン体２０ においてはセリン（Ｓ）である；および（２）アミノ酸２４２における多型であ り、それがクローン体４においてはアスパラギン（Ｎ）でありクローン体２０に おいてはアスパラギン酸（Ｄ）である。さらに、ヒトムチンドメインが、配列Ｐ ＰＤＴＴＳ（Ｑ／Ｐ）Ｅからなる８アミノ酸の繰り返しを含み、それが、クロー ン体４では８回およびクローン体２０では５回現れる。 クローン体４および２０の起源を評価するため、該繰り返しの側に位置するＰ ＣＲプライマーを、ヒトゲノムＤＮＡを増幅するために使用した。下記のプライ マーを使用した。： 該プライマーは、ネステッドプライマーである。一回目の反応においては、プラ イマー１および２を使用した。二回目の増幅反応には、一回目の反応の１：１０ ００希釈物を調製し、１μｌをプライマー３および４と共に使用した。増幅反応 は、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、１０ピコグラムの対照プラスミド（ｐｃＤ３Ｈ ｕＭＡｄ４またはｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ２０）、または前にＺｉｐｌｏｘライブラ リーのために調製した約１ｍｇの二本鎖ｃＤＮＡのいずれかを含んだ。ゲノムＤ ＮＡは３つの供給源から得た（プロメガ、クロンテック、およびジャーカット細 胞から精製したもの）。増幅の条件は：９４℃で５分を１サイクル；９４℃で４ ５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分を２５サイクルし、７２℃で５分を１サイ クル行った。 ゲノムＤＮＡからの増幅反応により、テンプレートとしてクローン体４および クローン体２０ｃＤＮＡのいずれかを用いてＰＣＲ反応の個々の産物に由来する ２つのバンドを得た。このデータから２つのｃＤＮＡクローン体はゲノムＤＮＡ によりコードされるイソ型であり、恐らく択一的スプライシング、または２つの 異なる対立遺伝子からの転写により生じるのであろう。拡大した多型および配列 の発散は他のムチン配列において証明されている（例えば、ヒルケンス，Ｊ、等 ．、Ｔｒｅｎｄｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ、１７：３５９−３６３（１９９２ ））。例えば、腸のムチンの反復部分は、ネズミとヒトの間に良く保存されては いない（ガム，Ｊ．Ｇ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２２７３３− ２２７３８（１９９１））。一つの予告は、ネズミゲノム構造の解析に基づいて 、ヒトゲノムＤＮＡはこの領域にイントロンを含むことができることである。も しそうであれば、本実験に用いたＰＣＲプライマーは、イントロンにわたるであ ろうし、ヒトゲノムＤＮＡの増幅は、ｃＤＮＡ対照の増幅により産生されるもの と同じ大きさのバンドを産生することが期待されないであろう。ヒトＭＡｄＣＡ Ｍ−１ゲノムクローン体の単離および解析は結果的にクローニングアーチファク トの可能性を除いた。クローン体２０イソ型および炎症病または活性間に相互関 係があるかどうかを決定するために、正常および／または正常な個人およびＩＢ Ｄ、クローン病または他の炎症の条件を有する患者由来の炎症を起こした組織の 評価を行うことができる。 ネズミ、アカゲザル、およびヒトＭＡｄＣＡＭ−１の２つのイソ型の比較は、 これらのレセプターのアミノ末端部分がおそらくα４β７認識に関与するドメイ ン構造を提示することを示唆する。対照的に、ネズミＭＡｄＣＡＭ−１のムチン ／ＩｇＡドメインの位置に一致する位置のこれらのレセプターの領域は、アミノ 酸組成が似ているが（セリン、スレオニン、プロリン−リッチなムチン領域）、 他からさらに発散する。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ ＲＮＡの発現 ヒトの複数の組織のノーザンＩおよびＩＩ（クロンテック，パロ オルト市、 カリフォルニア州により市販調製された）、または前記のようにして調製された 細胞株および組織由来の２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを用いて、ノーザン解析を行っ た。ＲＮＡは１％アガロース ホルムアルデヒドゲルにより変性し、電気泳動し 、ＰＶＤＦ膜（イモビロン、ミリポア）へ標準キャピラリーブロット法によって 転写した。ＲＮＡ試料は、細胞または組織ＲＮＡそれぞれの質および量が均等で あることを最初に確かめるために臭化エチジウムで染色した。転写後、ＲＮＡは ＵＶクロスリンキング（ストラタリンカー、ストラタジーン）により膜に固定し 、 このブロットおよび市販調製されたブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（クロンテ ック）中６８℃で１時間プレハイブリダイズした。クローン体４由来のｃＤＮＡ 挿入断片を、ランダムヘキサマーを用いたプライミングによりα³²Ｐ−ｄＣＴＰ でラベルした（マニアティス等、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリ ー マニュアル、コールド スプリング ハーバー、コールド スプリングハー バー ラボラトリーズ、ニューヨーク、（１９９））。ハイブリダイゼーション は２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの濃度の変性プローブを用いてＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙ ｂ中６８℃で１時間行った。 ブロットは、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６０分間６５℃で 、３０分で洗浄の一回の交換をして洗浄した。露光時間は、増感スクリーンを用 いて４８時間した。この露光の後、該ブロットは０．５％ ＳＤＳ中１０分間の 洗浄ではがし、同じ条件下でβ−アクチンｃＤＮＡを用いて再ハイブリダイズし た。露光時間は２時間した。結果 プローブとしてクローン体４由来の完全なｃＤＮＡ挿入断片を用いてＭＡｄＣ ＡＭ−１発現についてノーザンブロットを調べた。約１．６ｋｂの単一のＲＮＡ 種が、小腸中で高度に発現し、結腸および脾臓中で、より少ない程度で発現した 。顕著な発現は、これらの条件下でアッセイした、胸腺、前立腺、卵巣、精巣お よび末梢血液白血球（ＰＢＬ）を含む他の組織において観察されなかった。この 発現の組織特異的パターンは、パイエル板、ＭＬＮ（腸間膜リンパ小節）、腸の 粘膜固有層におけるＭＡｄＣＡＭ−１の制限された発現および脾臓中の脾性白髄 小節の周りの洞縁（ｔｈｅ ｍａｒｇｉｎａｌ ｓｉｎｕｓ ａｒｏｕｎｄ ｓ ｐｌｅｎｉｃ ｗｈｉｔｅ ｐｕｌｐ ｎｏｄｕｌｅｓ）における若干の発現（ ヘムラー、Ｍ．Ｅ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：３６５（１９ ９０）；ベルグ，Ｅ．Ｌ．等、炎症化の細胞内分子機構（セルラー アンド モ レキュラー メカニズムズ オブ インフラムメーション）、２：１１１（１９ ９ １）；ブリスキン，Ｍ．Ｊ．等、ネーチャー、３６３：４６１（１９９３））を 示すマウスにおける研究と一致する。顕著な発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓 、骨格筋、または腎臓を含むアッセイされた他の組織において観察されなかった 。；しかしながら、低レベルの発現が、膵臓において検出された。これらのデー タは、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１発現が、粘膜組織および脾臓における発現に組織特 異的であることを示す。；詳細な組織分布の免疫組織化学的解析はヒトＭＡｄＣ ＡＭ−１に対するモノクロナール抗体を用いて行うことができる（下記を参照） 。実施例２．ＭＡｄＣＡＭ−１クローン体の特徴付け 機能的接着アッセイ プラスミド： 以下のプラスミドを機能的接着アッセイに用いた：（１）ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ −１（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ製）またはｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製 ）を対照として用いた；（２）ｐＣＤＭ８中のネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ｐＣＤ ＭＡＤ−７；ブリスキン（Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．），ら，Ｎａｔｕｒｅ，３ ６３：４６１（１９９３））；（３）ｐｃＤＮＡ３中の７ドメインヒトＶＣＡＭ −１（ポルテ（Ｐｏｌｔｅ，Ｔ．），ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，１８：５９０１（１９９０））（ｐＣＤ３ＶＣＡＭ）；および（４）ｐｃＤ ＮＡ−３中のヒトＭＡｄＣＡＭ−１（ｐＣＤｈｕＭＡｄ４）（前記参照）。 モノクローナル抗体： 以下のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を機能的接着アッセイに用いた：（１） 抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１ ＭＡｂ ＭＥＣＡ−３６７（アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル，メリーランド州），寄託番号ＨＢ９４７８ ；ストリーター（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．），ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１： ４１（１９８８）；およびブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）に対する米国特許 番号５，４０３，９１９）；（２）抗ヒトＶＣＡＭ−１ ＭＡｂ ２Ｇ７（アメ リカン タイプ カルチャー コレクション（ロックビル，メリーランド州）； グラバー（Ｇｒａｂｅｒ，Ｎ．Ｔ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５：８ １９−８３０（１９９０））；（３）抗ネズミα４β７ ＭＡｂ ＤＡＴＫ ３ ２（アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ５３：３８４７−３８６１（１９９４））；（４）抗ネズミβ７ ＭＡｂ ＦＩ Ｂ ５０４（アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，１５３：３８４７（１９９４））；（５）抗ヒトα４β７ ＭＡｂ ＡＣ Ｔ−１（ラザロビッツ（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．，１３３：１８５７（１９８４））；（６）抗ヒトインテグリンβ１（ ＣＤ２９）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製；サンホゼ，カリフォルニア 州，カタログ番号＃５５００３４）；ならびに（７）無関係の対照としてネズミ ＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２Ａ。 細胞株 以下の細胞株を機能的接着アッセイに用いた： （１）ネズミＴ細胞リンパ腫ＴＫ１（ブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ． ），ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５５６−５６１（１９８０）； ブッチャー（Ｅ．Ｂｕｔｃｈｅｒ）（スタンフォード，カリフォルニア州）；（ ２）ＲＰＭＩ ８８６６、α４β７（そしてα４β１ではない）を発現するヒト Ｂ細胞リンパ腫株（アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ロックビ ル，メリーランド州）；アール（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，１５３：５１７（１９９４）；アール（Ｄ．Ｅｒｌｅ）からの供与物）； （３）ＪＵＲＫＡＴ、α４β１（そしてα４β７ではない）を発現するヒトＴ細 胞株（アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ロックビル，メリーラ ンド州））；および（４）Ｒａｍｏｓ、α４８１（そしてα４８７ではな い）を発現するヒト（Ｂリンパ球）バーキットリンパ腫細胞株（アメリカン タ イプ カルチャー コレクション（ロックビル，メリーランド州），寄託番号Ａ ＴＣＣ ＣＲＬ １５９６）。 機能的接着アッセイ： 機能的接着アッセイのために、以下のように変えて前記（実施例１）のように 、様々な種のＭＡｄＣＡＭ−１、ヒトＶＣＡＭ−１をコードするプラスミド、お よび対照プラスミドを、一過性トランスフェクションによりＣＨＯ／Ｐ細胞に導 入した。数個のウェルが抗体阻害実験のためにトランスフェクションされるので 、トランスフェクションされる複数のウェルの原リポソーム混合物を、まず各プ ラスミドに対して作製した。これは、いくつかのリポソーム混合物が各ウェルに トランスフェクションされることを確実にした。 トランスフェクションの４８時間後、培地を除いた。抗体上清（０．２５ｍｌ ）（抗ヒトＶＣＡＭ−１ ＭＡｂ ２Ｇ７または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１ Ｍ Ａｂ ＭＥＣＡ−３６７のいずれかを含む）、もしくは対照として０．２５ｍｌ の接着アッセイ緩衝液を加え、そして該混合物を４℃で１５分間プレインキュベ ーションした。 並行して、リンパ球細胞株（ＲＰＭＩ ８８６６またはＪｕｒｋａｔ）をスピ ンして沈殿させ、そして２％子ウシ血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３ 、２ｍＭ Ｍｇ⁺⁺および２ｍＭ Ｃａ⁺⁺を補ったＨＢＳＳ（Ｃａ⁺⁺またはＭｇ⁺⁺ なし）からなるアッセイ緩衝液で、２×１０⁶／ｍｌの密度で再懸濁した。これ らのＲＰＭＩ ８８６６またはＪＵＲＫＡＴ細胞懸濁物の０．２５ｍｌのアリコ ート（５×１０⁵細胞）を、少量の様々な精製抗体と共に、または等量のＤＡＴ Ｋ ３２上清と共に４℃で１５分間プレインキュベーションした。ＤＡＴＫ ３ ２を細胞株とのプレインキュベーションに用いた場合、アッセイの開始に先立っ て、接着アッセイのために合計０．５ｍｌの量を得るために、ウェル（トランス フェ クタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を含む）中に存在する上清または緩衝液 を吸引した。 プレインキュベーションのために、精製抗体（ＡＣＴ １、ＦＩＢ ５０４抗 β１）および対照ＩｇＧ抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。０．２５ｍｌの 抗ヒトＶＣＡＭ−１（ＭＡｂ ２Ｇ７）または抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１（ＭＡ ｂ ＭＥＣＡ−３６７）を含む抗体上清（無希釈で用いた）をプレインキュベー ションに用いた。０．２５ｍｌのＤＡＴＫ ３２の抗体上清をプレインキュベー ションに用いた。 プレインキュベーション後、細胞株（ＪｕｒｋａｔまたはＲＰＭＩ ８８６６ ）をウェル中でトラスフェクタント（ｔｒａｎｆｅｃｔａｎｔｓ）と組み合わせ て、そしてロッキングプラットフォーム上でインキュベーションをさらに３０分 間４℃で続けた。 アッセイを前記のように固定した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）の大きなブレーカー中で穏やかに反転させて洗浄し、続いて、固定のために１ ．５％グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含むＰＢＳのブ レーカー中で最低１時間反転させた。２０×倍率で視野中のリンパ球およびＣＨ Ｏ細胞の両方を数えて、接着を評価した。各アッセイに対して、ＣＨＯ／Ｐ細胞 当たりの結合したリンパ球の数を、標準誤差を有する４つの視野の最小値として 平均化した。各場合における結果は、同様の結果を有する３つの行われた実験の １つからのものである。結果 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１は、α４β７（そしてα４β１ではない）を発現する リンパ球を特異的に結合する。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１リンパ球の相互作用の特異 性を決定するために、接着アッセイを行って、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する 一過性トランスフェクションされたＣＨＯ／Ｐ細胞の、α４β７しか発現しない ＲＰＭＩ ８８６６細胞株（アール（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．，１５３：５１７（１９９４））へ、またはα４β１を独占的に発現す るＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔへ結合する能力を評価した。これらの細胞株の結合を、 ネズミＭＡｄＣＡＭ−１およびヒトＶＣＡＭ−１を発現する一過性トランスフェ クションされたＣＨＯ／Ｐ細胞の結合と比較した。結果は図４Ａ〜４Ｂに示す。 ＲＰＭＩ ８８６６細胞は対照トランスフェクタントには結合しなかったが、 ヒトまたはネズミＭＡｄＣＡＭ−１を発現するトランスフェクタントには貪欲に 結合した。この結合は抗α４β７ ＭＡｂ ＡＣＴ−１とのプレインキュベーシ ョンにより完全に阻害された（図４Ａ）。ＶＣＡＭ−１トランスフェクタントは ＲＰＭＩ ８８６６に結合しなかった。このことは、α４β７／ＶＣＡＭ−１相 互作用が活性化依存であるという以前の証明（ポスティゴ（ｐｏｓｔｉｇｏ，Ａ ．Ａ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２４７１−２４８３（１９９３ ）；ルエッグ（Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．），ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１７： １７９−１８９（１９９２））と一致している。抗ＶＣＡＭ−１ ＭＡｂ ２Ｇ ７を用いたＦＡＣＳ分析が約６０％のトランスフェクション効率を示したように 、ＲＰＭＩ ８８６６細胞がＶＣＡＭ−１トランスフェクタントを結合しないの は、発現の欠乏によるものではなかった。さらに、同じＶＣＡＭ−１トランスフ ェクタントはＪｕｒｋａｔ細胞を結合でき、そして結合は抗ＶＣＡＭ−１または 抗β１ ＭＡｂのいずれかとのプレインキュベーションにより完全に阻害された （図４Ｂ）。ネズミおよびヒトＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントはＪｕｒ ｋａｔ細胞（α４β１陽性株）を結合しなかった。これらのデータは、ヒトＭＡ ｄＣＡＭ−１が選択的にα４β７インテグリンを発現するヒト白血球リンパ球と 結合することができることを実証している。 Ｌ１−２およびＣＨＯ細胞トランスフェクタント マウスＬ１−２細胞株は前Ｂリンパ腫由来であり、ユージン・ブッチャー（Ｅ ｕｇｅｎｅ Ｂｕｔｃｈｅｒ）博士（スタンフォード大学、スタンフォード、カ リフォルニア州）から得た。ＭＡｄＣＡＭ−１に対するアカゲサルまたはヒトｃ ＤＮＡをいずれかコードする遺伝子を、前記のようにｐｃＤＮＡ−３ベクター（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐｃＤ ３ＨｕＭＡｄ４、ｐｃＤ３ＨｕＭＡｄ２０、またはｐＣＤ３ＰＭａｄ（アカゲサ ル））を、以下のようなトランスフェクションによりＬ１−２細胞に導入した： Ｌ１−２細胞を約１０⁶／ｍｌの密度になるまで増やした。５０、２５または１ ２．５×１０⁶個いずれかの細胞をＨＢＳＳで洗浄し、それから２０ｍＭＨＥＰ ＥＳ、ｐＨ ７．０５を補ったＨａｎｋｓ平衡化塩溶液からなる０．８ｍｌの緩 衝液に再懸濁した。最終量２００μｌにした２０μｇの鎖状プラスミド、５００ μｇのｔＲＮＡおよびＨＢＳＳからなる溶液を、細胞懸濁物に加えて合計量１ｍ ｌにした。室温で１０分インキュベーションの後、細胞／ＤＮＡ混合物をエレク トロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ製、リッチモンド、カリフォルニア 州）に移し、ＢｉｏＲａｄ遺伝子パルサー中で２５０ボルト、９６０ｍＦでエレ クトロポレーションした。続いてさらに室温で１０分インキュベーションし、標 準Ｌ１−２成長培地（ＲＭＰＩ １６４０、１０％ Ｈｙｃｌｏｎｅ ウシ胎児 血清、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｔｙｒｅｐｔｏｍｙ ｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ製）および０．２９ｍｇ／ｍｌ Ｌグルタミン（Ｇｉｂｃ ｏ製）で細胞を２５ｍｌに希釈し、そして３７℃のインキュベーターに戻した。 ４８時間後、細胞を遠心分離によりペレットにし、０．８ｍｇ／ｍｌでＧ４１８ （ジェネティシン；Ｇｉｂｃｏ製）を補った５０ｍｌのＬ１−２培地に再懸濁し た。細胞懸濁物の希釈物を９６−ウェルマイクロタイタープレートにプレートし 、単一コロニーを成長させ、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現を分析した。 ＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＬ１−２細胞クローン体は、ＴＫ１細胞への付着 により検出できた。Ｌ１−２（非トランスフェクション細胞）およびＴＫ１細胞 は両方、単一細胞懸濁物として成長する。ＭＡｄＣＡＭ−１の表面発現は、ＴＫ １細胞上に発現したα４β７との相互作用の効能により接着を媒介する能力に よって検出することができる。この相互作用の特異性を、抗β７ ＭＡｂ ＦＩ Ｂ ５０４を用いたＴＫ１細胞の前処理による阻害によりさらに立証した。 アカゲサルまたはヒトいずれかのＭＡｄＣＡＭ−１クローン体で安定にトラン スフェクションしたＣＨＯ細胞（中国ハムスター卵巣細胞；アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ロックビル，メリーランド州））を、以下の例外 と共に、Ｌ１−２細胞に対して前記したようなエレクトロポレーションにより調 整した。ＣＨＯ細胞成長用培地はデオキシリボヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ製）お よび１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製）および５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ス トレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ製）および０．２９ｍｇ／ｍｌ Ｌグルタミン（ Ｇｉｂｃｏ製）を含むα−ＭＥＭであった。選択培地は、０．５５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ製）を含む同じ培地からなっていた。単一クローンを成長 させ、細胞をアッセイの１日前に２４ウェルプレートにウェル当たり５０，００ ０細胞でプレートした点を除き、前記（一過性について）の機能的接着アッセイ を用いてＲＰＭＩ ８８６６細胞のα４β７依存結合を示す能力について分析し た。この基準を用いて、ＣＨＯ ＨｕＭＡｄ ４と呼ぶ株を設立した。 接着を阻害する力のあるモノクローナル抗体 ヒトＭＡｄＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス をＬ１−２ ＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントで免疫して作製した。マウ スをＨＢＳＳに再懸濁した１０００万個の細胞で、２週間間隔で３回腹腔内に免 役し、そして最後の４回目の免疫（ＨＢＳＳに再懸濁した１０００万個の細胞） を静脈内に注射した。最初の免疫を、アカゲサルＭＡｄＣＡＭ−１を発現する２ つのクローン体（Ｌ１−２細胞クローン体２３およびクローン体１９）の混合物 で行った。残りの投与は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する単一のＬ１−２クロ ーン体（Ｌ１−２クローン体ＨｕＭＡＤ４／１７）で行った。 約５，０００個のハイブリドーマを生じる好結果の融合を行った。最後の静脈 内注射の４日後、脾臓を除き、単一細胞懸濁物を無血清ＤＭＥＭ培地中で調整し た。ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら（ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．），ら，Ｎａ ｔｕｒｅ，２９９：５５０−５５２（１９９７））の方法にしたがって、これら の細胞を融合パートナーＳＰ２／０と融合させた。２０ｍｌの脾臓細胞および２ ０ｍｌのＳＰ２／０細胞を組み合わせて、８００ｇで５分間スピンして、培地を 吸引により除いた。３７℃にプレウォームした５０％ポリエチレングリコール１ ５００（ＰＥＧ１５００）（ベーリンガーマンハイム製、インディアナポリス、 インディア州）溶液を細胞ペレットに２分間かけて加え、続いて１０ｍｌのＤＭ ＥＭ培地を３分間かけて加えた。細胞懸濁物を６００ｇで３分間スピンし、上清 を除いた。ペレットを、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン硫酸塩、および ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ製、セントルイス、ミズーリ州）を含むＤＭＥＭ培 地に穏やかに再懸濁した。細胞を、１０個の９６ウェル平底マイクロタイタープ レートに２００μｌ／ウェルでプレートした。 融合の１０日後、蛍光染色により、ウェル由来の上清をＣＨＯヒトＭＡｄＣＡ Ｍ−１トランスフェクタント（ＣＨＯ ＨｕＭＡｄ ４細胞）に対する反応性に ついてスクリーンした。試料あたり５００，０００個の細胞の染色を、５０μｌ の各上清および５０μｌの細胞を用いて、本質的に既述のように行った（ハーロ ー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｄ．Ｌａｎｅ），１９８９，Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハ ーバー研究所，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州）。二次抗体は、 １：２００に希釈したＦＩＴＣ−標識抗ネズミＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏ ｎ Ｌａｂｓ製）であった。強い反応性は、非トランスフェクションＣＨＯ細胞 と比較して、蛍光の２〜３対数の増加として判断した。 ４８個の抗体上清を、ＣＨＯ ＨｕＭＡｄ ４細胞に対する強い反応性につい て選択した。それから、これらの抗体上清を、ＣＨＯ ＨｕＭＡｄ ４細胞のＲ ＰＭＩ ８８６６細胞への接着をブロックするそれらの能力についてスクリーン した。特異的抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ ＭＡｂにより影響されないので、対照と して、Ｒａｍｏｓ細胞がＶＣＡＭ−１トランスフェクタントと結合するのを阻害 する上清の能力を試験した。ブロッキング抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１モノクローナ ル抗体を同定するために、以下のアッセイを行った。対照トランスフェクタント を供給するために、ＣＨＯ／Ｐ細胞を前記のようにｐＣＤ３ＶＣＡＭでトランス フェクションし、そしてトランスフェクションの４８時間後アッセイした。接着 阻害アッセイの４８時間前に、ウェル当たり４０，０００個のＶＣＡＭ−１一過 性トランスフェクタント細胞を２４ウェルプレートにプレートした。アッセイの ２４時間前に、ウェル当たり５０，０００個のＣＨＯＨｕＭＡｄ ４トランスフ ェクタント細胞を、２４ウェルプレートにプレートした。アッセイの日に、各抗 ヒトＭＡｄＣＡＭ−１上清（０．２５ｍｌ）をＣＨＯＨｕＭＡＤ ４トランスフ ェクタントまたはＶＣＡＭ−１トランスフェクタントのいずれかを含むウェルに 加え、そして混合物を４℃で１５分間プレインキュベートした。（１）ＲＰＭＩ ８８６６細胞をＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントと共に、または（２） Ｒａｍｏｓ細胞（α４β１を発現するヒトＢ細胞株）をＶＣＡＭ−１トランスフ ェクタントと共に用いて、接着アッセイを行った。 並行して、細胞（ＲＰＭＩ ８８６６またはＲａｍｏｓ）を２×１０⁶／ｍｌ の密度で、２％子ウシ血清、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３、２ｍＭ Ｍ ｇ⁺⁺および２ｍＭ Ｃａ⁺⁺を補ったＨＢＳＳ（Ｃａ⁺⁺またはＭｇ⁺⁺なし）からな るアッセイ緩衝液に再懸濁した。抗体と共にトランスフェクタントをプレインキ ュベーションした後、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ ８８６６またはＲａｍｏｓ細胞 懸濁物（５×１０５細胞）を各ウェルに加え、そしてロッキングプラットフォー ム上でのインキュベーションを４℃でさらに３０分間続けた。前記のようにウェ ルを洗浄し、固定し、そして試験して、結合の阻害を評価した。 試験した４８個のハイブリドーマ上清中１１個が、ＲＰＭＩ ８８６６細胞の ＭＡｄＣＡＭ−１を発現しているトランスフェクタントへの接着を阻害し、実質 的なブロッキング活性を示した。Ｒａｍｏｓ細胞のＶＣＡＭ−１を発現している トランスフェクタントへの接着は影響されず、α４β７媒介相互作用の選択的阻 害を示した。選択したブロッキングハイブリドーマを、限定希釈によりサブクロ ーン化した。結果 アカゲサルまたはヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現する安定細胞株を、ネズミ前Ｂ リンパ腫Ｌ１−２中に作製した。これらの細胞を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス を免疫し、ハイブリドーマを調製した。ヒトＭＡｄＣＡＭ−１を発現するＣＨＯ ＨｕＭＡｄ ４トランスフェクタントの免疫蛍光染色により、生じた融合をス クリーンした。約１，０００個のウェルのスクリーニングにより、ＣＨＯ Ｈｕ ＭＡｄ ４トランスフェクタントに対して強い反応性を示す４８個の上清が製造 されたが、しかるに非トランスフェクションＣＨＯ細胞は陰性であった。続いて 、ＲＰＭＩ ８８６６細胞のヒトＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクタントへの接 着を特異的にブロックするそれらの能力について、これらの上清を試験した。 試験した４８個のハイブリドーマ上清中１１個が、ＲＰＭＩ ８８６６細胞の ＭＡｄＣＡＭ−１への接着を特異的に阻害することができたが、しかるにＲａｍ ｏｓ細胞（α４β１を発現する）のＶＣＡＭ−１トランスフェクタントへの接着 は、同じ上清により影響されなかった。これらのハイブリドーマを、１０Ｇ４、 ８Ｃ１、１０Ｇ３、９Ｇ１２、９Ｅ４、７Ｈ１２、１０Ｆ２、１０Ａ６、１Ｅ５ 、２Ｆ５、７Ｇ１１と名付けた。実施例３．ヒトＭＡｄＣＡＭ−１−ＩｇＧキメラの設計および機能的分析 ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧキメラの構築 ｐｃＤ３ｈｕＭＡｄ４（実施例１）と呼ばれる、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ製、サンディエゴ、カリフォルニア州）中のヒトＭＡｄＣＡＭ−１クロ ーン体４ ｃＤＮＡを、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の細胞外領域のＰＣＲ増幅のため の鋳型として用いて、ヒトＩｇＧ１の定常領域と融合させた。ヒトＭＡｄＣＡ Ｍ−１コード配列（ＡＴＧコドン、太字）の５’末端を含む、プライマーＨＵＭ ＡＤＩＧ４／２（配列番号：１１）を合成した： この５’プライマーをＨＵＭＡＤＩＧ２（配列番号：１２）と名付けた３’プラ イマーと共に用いて、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の２つのアミノ末端免疫グロブリン 様（Ｉｇ）ドメインをコードする領域を増幅した。プライマーＨＵＭＡＤＩＧ２ （配列番号：１２）は、配列番号：１のコード鎖ヌクレオチド６６７〜６８３に 相補的な部分を含み、以下の配列を有している： あるいは、５’プライマーを３’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ３と共に用いて、ヒ トＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインをコードする領域を増幅した（クローン 体４）。３’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ２（配列番号：１２）は、配列番号：１ のコード鎖ヌクレオチド９９２〜１０１０に相補的な部分を含み、以下の配列を 有している： プライマーは、示されているように、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位または３’Ｓｐｅ Ｉ部位を有するように設計された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サンディエゴ、カリ フォルニア州）製のＰＣＲ最適化キット（ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ ｋｉｔ）を用い 、これらのプライマーを用いて、２つの異なるＭＡｄＣＡＭ断片をＰＣＲ増幅し た。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化して、クローニング 用末 端を生じさせた。続いて、該産物をＧｌａｓｓｍａｘ ＤＮＡ単離システム（ｉ ｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ製、ベテスダ、メリーランド州 ）を用いて、ゲル電気泳動により精製した。 ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む約１ｋｂの断片を、Ｓ ｐｅＩおよびＥｃｏＲＩでの消化により、Ｆｃ変異ヒト定常領域を持つヒト免疫 グロブリンγ１重鎖をコードする構築物から切り出した。この構築物によりコー ドされる抗体を、これより後イソタイプ適合の無関係な対照として用いた。この 構築物中のヒト定常領域は、シムズ（Ｓｉｍｓ，Ｍ．Ｊ．）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．，１５１：２２９６−２３０８（１９９３））およびウォルドマン（Ｗａ ｌｄｍａｎｎ）ら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット，２月４日，１ ９９３（２３頁））により述べられているように、最初ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重 鎖のＰＣＲ増幅により得られ（レイクマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｌ．）ら，Ｎ ａｔｕｒｅ，３２２：３２３−３２７（１９８８））、この説明は各々全体にお いて参照により本明細書に取り込まれる。この構築物の定常領域の変異（Ｌｅｕ²³⁴ →Ａｌａ²³⁴およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）はヒトＦｃγレセプターとの結合 を減少するように設計され、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により製造 された。このように、製造されたＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合は、Ｌｅｕ²³⁴→Ａｌ ａ²³⁴およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷変異の導入を除き、シムズ（Ｓｉｍｓ）ら（ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６−２３０８（１９９３））およびウォ ルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）ら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット ）により述べられたＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ定常領域断片を含む。 Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域をコードする１ｋｂのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を Ｇｌａｓｓｍａｘ ＤＮＡ単離システム（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ） （Ｇｉｂｃｏ製、ベテスダ、メリーランド州）を用いて、ゲル電気泳動により精 製した。（ａ）２つのＭＡｄＣＡＭ−１のＮ末端Ｉｇドメインまたは（ｂ）全細 胞外ドメインのいずれかを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ断片であるこの定常領 域断片を、３ウェイライゲーションにより、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで 消化したベクターｐＥＥ１２（ステファンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｌ．）お よびコケット（Ｍ．Ｌ．Ｃｏｃｋｅｔｔ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：７１１０（１９８９）ならびにベービントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ ．Ｒ．）およびヘンシェル（Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ），１９８７，Ｔ ｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎ ｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州））にライゲーションした。微生物株ＤＨ１０ Ｂの形質転換体を得た。コロニーを成長させ、ミニプラスミドプレップを制限地 図を作製して分析した。Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域に融合させたＭＡｄＣＡＭ− １の全細胞外ドメイン（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ２１）または２つのＮ末端Ｉｇド メイン（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ３１またはＨｕＭＡｄＩｇ３８）のいずれかから なる融合蛋白質をコードする３つの構築物を、全ＭＡｄＣＡＭ−１部分を通じて 配列決定し、セグメントの正しい融合およびＰＣＲ導入変異の非存在を確認した 。 最初の試験のために、標準条件（９６０μＦ、２５０Ｖ）下でＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒでのエレクトロポレーションを用い、各構築物を１ｍｌ のＲＰＭＩ緩衝液（無血清）および２５μｇのプラスミド中の単層の５×１０⁷ 個のＣＯＳ細胞上で一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの ７２〜９６時間後、上清を集め、０．４５μフィルターに通し、０．０５％アジ 化ナトリウムの存在下４℃で保存した。キメラの製造は、抗ヒトＩｇＧ１抗体を 捕捉抗体として、およびアルカリンフォスファターゼに結合した同じ抗体を２次 抗体として用い、サンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。無関係な対照抗体（ 同一の定常領域を有する）を標準として用いた。また、キメラは抗ヒトＭＡｄＣ ＡＭ−１モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによっても分析し、約 ２００ｋｄに泳動することが分かり、ホモ二量体の大きさと一致していた。 溶解性ヒトＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラは特異的にα４β７陽性細胞に結合する 以前にＭｎ++の存在下でのみＭＡｄＣＡＭ−１を結合することが示されたＴ細 胞株ＨｕＴ ７８を染色する能力について、４つの異なるトランスフェクション 由来の上清をアッセイした。それに応じて、このアッセイに用いた各溶液は２ｍ Ｍ Ｍｎ++を含んでいた。ＨｕＴ ７８細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫株；（アメリ カン タイプ カルチャー コレクション、寄託番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ １６１ ）は、α４β７を持つ細胞である。キメラの結合特異性を試験するために、Ｈｕ Ｔ ７８細胞を培地単独（２％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０）、または培 地および１０μｇ／ｍｌの抗β７抗体ＦＩＢ ５０４のいずれかと共にプレイン キュベートした。約１００，０００個の細胞を氷上で１５分間インキュベートし 、それから２％ ＦＣＳ／２ｍＭ Ｃａ⁺⁺／２ｍＭ Ｍｎ⁺⁺を含むＨＢＳＳで洗 浄した。それから、細胞を氷上で２０分間培地と共にもう一度、または４つの独 立したトランスフェクションの１つ由来の上清と共に（２つはＭＡｄＣＡＭ−１ の全細胞外ドメインを含むキメラ（クローン体２１）と共に、そして２つは２つ のＮ末端Ｉｇドメインを含む切断型のＭＡｄＣＡＭ（クローン体３８）と共に） ２０分間インキュベーションした。洗浄後、それから細胞をフィコエリトリン（ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）と結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベ ーションし、バックグラウンド以上の染色をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃ ａｎ）により評価した。キメラ上清と共にインキュベーションした細胞しかバッ クグラウンド以上に染色されなかったが、しかるにβ７ ＭＡｂとのプレインキ ュベーションはこの染色をバックグラウンドレベルまで減少され、キメラのα４ β７インテグリンとの特異的相互作用を示した（図１７Ａ〜１７Ｅ）。 ヒトＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラを分泌する永久ＮＳＯ細胞株をエレクトロポレ ーションによるトランスフェクション後、既述（コケット（Ｃｏｃｋｅｔｔ，Ｍ ．Ｌ．），ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：６６２−６６７（１９９０ ））のように無グルタミン培地中での成長により選択した。クローン体株を攪 拌培養での成長に採用した。これらのクローン体株の３つ由来の上清（試料Ｂ〜 Ｄ）、および部分精製キメラ（クローン体２１、プロテインＡとの結合により精 製した、試料Ａ）を、Ｂ細胞株ＲＰＭＩ ８８６６の接着を維持する能力につい て試験した。簡単に言えば、ＮＥＮ ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを１００μｌ／ ウェルの炭酸緩衝液、ｐＨ ９．５中の２０μｇ／ｍｌのブロテインＡと共に４ ℃で一晩インキュベーションした。それから、プレートをＲＰＭＩ １６４０培 地（無血清）で２度洗浄した。１００μｌのキメラ（またはＲＰＭＩの一連の希 釈物）をウェルに３７℃で２時間結合させ、それから１度洗浄した。それから、 ウェルをＦＣＳを用いて１時間３７℃でブロックし、１度洗浄し、そしてそれか ら、対照として抗ヒトＶＣＡＭ−１ ＭＡｂ（２Ｇ７）または抗ヒトＭＡｄＣＡ Ｍ−１ ＭＡｂ １０Ｇ３（実施例２）のいずれかを含む組織培養上清と共にプ レインキュベーションした。２Ｇ７および１０Ｇ３ ＭＡｂを細胞の添加前に除 いた。ＲＰＭＩ ８８６６細胞をＢＣＥＣＦ−ＡＭ染色（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ；２ ’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシ フルオレセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ），アセトキシメチル エステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）とのプレインキュベーション により蛍光標識し、１００μｌの細胞を各ウェルに加え（最終濃度１０⁵細胞／ ウェル）、そしてロータリーシェーカーで３０分間室温でインキュベーションし た。ＲＰＭＩ ８８６６細胞の固定キメラへの結合を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ ｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＩＤＥＸＸ）を用いて蛍 光値を読むことにより評価した。抗ヒトＭＡｄＣＡＭ−１ ＭＡｂのみが細胞の ＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラとの結合をブロックできたので、特異的結合は立証さ れた（表１）。 これらおよび他のこのようなキメラ融合蛋白質を、剤（例えば、低分子）のキ メラとのα４β７の結合をブロックする能力を評価するために用いて、α４β７ −ＭＡｄＣＡＭ相互作用の阻害剤を同定することができる。さらに、キメラ融合 蛋白質は溶液中のα４β７陽性リンパ球と結合することができるので、それらは 炎症部位へのｉｎ ｖｉｖｏリンパ球補充の候補阻害剤を供給する。 実施例４．結腸へのリンパ球補充の阻害 Ａ．マウスにおける結腸炎のＤＳＳ−誘導 既述（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８−２４９，１９９３）のように、 ＢＡＬＢ／ｃマウスをそれらの飲み水中の５％デキストランナトリウム硫酸塩（ ＤＳＳ）溶液に１０日の期間の間接触させた。この期間の間に、マウスは軟便お よび観血性下痢を含む結腸炎の臨床的症状を発達させた。ヒトにおける潰瘍結腸 炎に似た、多病巣性上皮傷害および潰瘍は、作用させたマウス由来の結腸粘膜の 組織学的実験における証拠である。さらに、作用させたマウスは１０日目までに 最初の体重の２０〜３０％を失った。 β７およびＭＡｄＣＡＭ相互作用の抗体妨害 結腸へのリンパ球の補充をブロックするときにおけるβ７−特異的抗体の効率 を決定するために、既に特徴付けられて既述されているように（ベルリン（Ｂｅ ｒｌｉｎ，Ｃ．），ら，Ｃｅｌｌ ７４：１８５−１９５，１９９３：ミシェ（ Ｍｉｃｈｉｅ，Ｓ．Ａ．），ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６８８− １６９８，１９９３；ハマン（Ｈａｍａｎｎ，Ａ．），ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５２：３２８２−３２９３，１９９４）、生理食塩水中のＦＩＢ２１または ＦＩＢ３０のいずれかからなる１００μｇのβ７に対するモノクローナル抗体、 もしくは同量のイソタイプ適合対照ラットモノクローナル抗体（アンドリュー（ Ａｎｄｒｅｗ）ら，前述）を、ＤＳＳ処理の１０日の経過期間にわたって、ＢＡ ＬＢ／ｃマウスに毎日腹膜内（ｉ．ｐ．）に注射した。 評価方法 ２つの方法を用いて、結腸炎マウスにおける白血球浸潤および粘膜傷害を阻害 する抗体療法の効率を評価した。最初の方法では、上皮傷害および白血球細胞質 浸潤の程度を評価するために評点システムを用いて、２人の知らされていない観 察者により組織学的に処理を判断した（表２）。この評価のために、結腸組織を 最初に１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィン中に包埋し 、 切片にし、そして実験の前に切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 β７インテグリンを発現するリンパ球およびＭＡｄＣＡＭを発現する粘膜細静 脈の検出および半定量のために免疫組織化学を用いて、さらなる組織学的評価を 行なった。既述（リングラー（Ｒｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ，），ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐ ａｔｈｏｌ．，１３４：３７３−３８３（１９８９））のように、結腸組織をま ずＯＣＴ化合物中でスナップ凍結し、凍結中に切片にし、そして切片を続いてア セトン中で１０分間４℃で固定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後 、非特異的抗体結合部位をＰＢＳで希釈した１０％正常ウサギ血清で１０分間ブ ロックし、続いて、連続して、３０分間室温（ＲＴ）で、ＰＢＳで２０μｇ／ｍ ｌにしたＦＩＢ２１抗体、ビオチニル化ウサギ抗ラットポリクローナル抗体、ア ビジン−ペルオキシダーゼ複合体、ならびに最後にＴｒｉｓ緩衝液で希釈したク ロモゲン、ジアミノベンジジンおよび過酸化水素で洗浄した。 次の方法では、同系のドナーマウス由来の放射腺標識腸間膜リンパ節リンパ球 を用いて、リンパ球の結腸への補充を定量的に評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを ５％ ＤＳＳに９（１０の代わり）日間置いて、８日目に、マウスに１００μｇ の生理食塩水中のＦＩＢ２１（抗β７）、ＭＥＣＡ−３６７（抗ＭＡｄＣＡＭ） 、両者の混合物、またはイソタイプ適合対照モノクローナル抗体をｉ．ｐ．注射 したことを除き、動物実験の実験計画は、前記のものと同様であった。９日目に 、腸間膜リンパ節細胞をドナー同系ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離し、⁵¹Ｃｒで標 識し、そして５．０×１０⁶細胞／マウスを３０分間３７℃で、生理食塩水中の ５００μｇの対照抗体、２５０μｇのＭＥＣＡ−３６７、５００μｇのＦＩＢ２ １、または両者（合計量は７５０μｇである）と共にインキュベーションした。 それから、標識細胞および抗体をＤＳＳ−処理受容マウスに静脈（ｉ．ｖ．）注 射した。注射の１時間後、全長の結腸を全実験動物から集め、そしてγ−放射を γ−カウンターを用いて測定した。 データ分析 動物の各グループに対して得た平均値間の違いを、１対のＴ検定を用いて、統 計上の有為さについて評価した。Ｐ＜０．０５の時に、平均間の違いは有為であ ると見なした。結果 組織学的に、粘膜に対する浸潤および上皮傷害は、下行結腸、直腸および盲腸 において最も激しかった。免疫組織化学による結腸の凍結組織切片の分析により 、最も有為なβ７⁺リンパ球の補充が右結腸にあることが示された。さらに、粘 膜血管アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−１の発現のレベルは 、ＤＳＳ処理初期（３日）の腸粘膜の血管においては低レベルでしか発現しない が、ＤＳＳ処理の９日後、劇的に増加することが分かった。このことは、β７お よびＭＡｄＣＡＭ−１の相互作用がＤＳＳ誘導結腸炎の間の結腸粘膜における炎 症過程に関連しているという結論を支持している。 ＤＳＳに１０日間曝したマウスおよびβ７特異的抗体を用いた日々の治療の組 織学的評価は、等量の対照抗体を受けた動物と比較して、白血球補充（ＦＩＢ３ ０に対してＰ＜０．０１およびＦＩＢ２１に対してＰ＜０．００１）ならびに上 皮傷害（Ｐ＜０．０５）の実質的な減少が右（上行）結腸で起きたことを示した （図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、これらの動物由来の凍結切片の免疫組織化学を 用いた分析により、ＤＳＳ処理の間に結腸の他の部分ではなく右結腸に補充した β７⁺細胞の数が減少したことが示された。 それから、同系ドナー由来の放射線標識腸間膜リンパ球を用いて、炎症を起こ した結腸へのリンパ球の補充を定量的に評価した。ＤＳＳ処理レセプターにおけ るこれらの細胞の注射の１時間後、β７特異的抗体またはＭＡｄＣＡＭ特異的抗 体のいずれかで処理したマウスの結腸に補充した⁵¹Ｃｒ標識細胞の数に減少の傾 向があったが、しかし同位体適合対照抗体で処理したマウスにおいてはなかった （図８）。Ｂ．重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスにおける結腸炎の誘導および結腸への リンパ小節細胞の補充の阻害 ＣＤ４５ＲＢ^hiＣＤ４⁺Ｔ細胞で再構築された重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ） マウスは、結腸炎および激るいそう症候群（ａ ｓｅｖｅｒｅ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を発現する。ＣＤ４５ＲＢ^hiＣＤ４⁺Ｔ細胞で再構築した ｓｃｉｄマウスにおいて発現する結腸炎は、ｓｃｉｄマウスにおいて誘導された 結腸炎が、病原性でないが、病気の誘導にＣＤ４⁺Ｔ細胞の存在を明瞭に必要と する点で、大部分の他のＩＢＤのネズミ科モデルと異なる（ポウリー（Ｐｏｗｒ ｉｅ），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：１７１（１９９５）、その教義はそのまま参照 することで、本明細書中に組み込まれている）。 モリゼイら（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）およびポウリーら（Ｐｏｗ ｒｉｅ ｅｔ ａｌ．）の改変法（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘ ｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２３７（１９９３）；Ｐｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉ ｎｔ．Ｉｍｍ．，５：１４６１（１９９３），その教義はそのまま参照すること で、本明細書中に組み込まれている）をＢＡＬＢ／ｃ脾臓から単離された、顆粒 白血球、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、Ｂ２２０⁺細胞、Ｉ−Ａ⁺細胞およびＭＡＣ−１⁺マクロ ファージを消耗させることによりＣＤ４⁺Ｔ細胞を増やすために用いた。ＣＤ４ ５ＲＢ^hi細胞をセルソーターにより、抗ＣＤ４５ＲＢで染色された最も明るい４ ０〜４５％のＣＤ４⁺細胞を捨てて、選別した。１×１０⁶個のＣＤ４５ＲＢ^hiま たはＣＤ４５ＲＢ^loＴ細胞を尾静脈内に静脈（ｉ．ｖ．）注射することにより、 感受容ｓｃｉｄマウスを再構築した。４匹のマウスをＣＤ４５ＲＢ^hiＴ細胞で再 構築し、４匹のマウスをＣＤ４５ＲＢ^loＴ細胞で再構築した。 再構築されたマウスを、体重変化および糞潜在血液の発生について週毎に測定 した。一般的に、再構築後４〜６週間以内に、同数のＣＤ４５ＲＢ^loＴ細胞で再 構築した対照ｓｃｉｄマウスに関してＣＤ４５ＲＢ^hiＴ細胞で再構築したマウス の体重の違いが、統計的に有為になった（図１８）。 ２、３および５×１０⁴個の細胞を用い、このモデル内に結腸炎を誘導するこ とができる。一般的に１〜５×１０⁵個が用いられる。病気の兆候の速度論は、 所定の再構築についてマウス間で同一ではないが、結腸炎は、、同様に激しく、 一度体重が開始時の７５〜８５％に減少するほどである。組織構造観察は、他者 の報告と一致しており、このモデルにおける結腸炎が、粘膜および粘膜下組織に おけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の大規模な浸潤、上皮未成熟、潰瘍、陰窩過形成、杯状細 胞の損失および陰窩膿瘍（ｃｒｙｐｔ ａｂｓｅｓｓｅｓ）により特徴づけられ ることを示す。また、クローン病と同様に、ｓｃｉｄモデルにおけるＩＢＤは、 深いフィステルを有する粘膜経壁の浸潤により特徴づけられる。結腸炎の他のネ ズミ科モデルと異なり、病気の激しさは、遠位の結腸のみに限定されず、横行お よび近位の結腸においても同じ激しさがある。β７の抗体妨害およびＭＡｄＣＡＭ相互作用 抗ネズミＭＡｄＣＡＭ−１抗体（ＭＡｂ ＭＥＣＡ−３６７；アメリカンタイ プカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビレ、ＭＤ）、寄託番号ＨＢ ９４７８；ストリ ーターら（Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，３３ １：４１（１９８８）；また、ブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）に与えられた米国 特許第５，４０３，９１９号明細書を参照せよ）および抗ネズミβ７抗体（ＭＡ ｂ ＦＩＢ ５０４；アンドリューら（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ． ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：３８４７（１９９４））をこれらの研究に 使用した。 ｓｃｉｄマウスを２×１０⁵個のＣＤ４５ＲＢ^hiまたはＣＤ４５ＲＢ^loＣＤ４ ＋Ｔ細胞で再構築した。再構築５ヶ月後、２００μｇ／日のラットＩｇＧ２ａ対 照抗体または１００μｇ／日のＦＩＢ−５０４（ネズミβ７特異的）＋１００μ ｇ／日のＭＥＣＡ−３６７（ネズミＭＡｄＣＡＭ特異的）の混合物をマウスに１ ４日の間注射した。抗体はＰＢＳ中においた。各処理群には５匹のマウスがあっ た。１４日後、¹¹¹Ｉｎ−オキシンで標識した５×１０⁶個の腸間膜リンパ小節細 胞（ＢＡＬＢ／ｃ）をマウスに静脈注射した。標識細胞の養子移入後２４時間 で、組織を採取し、放射活性について評価した。細胞の非特異的トラッピングに より与えられる、組織における放射活性のバックグラウンドのレベルを２％ＰＢ Ｓ緩衝化ホルムアルデヒドで固定した５×１０⁶個の標識細胞の注射により評価 した。結果を脾臓の％カウント／分（ＣＰＭ）で標準化し、バックグラウンドを 補正した結腸におけるＣＰＭとして表した。 このＣＤ４５ＲＢ^hiＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築されたｓｃｉｄマウスの大腸への 浸潤の定量的な評価は、同数のＣＤ４５ＲＢ^loＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築されたｓ ｃｉｄレセプターに見られるレベルと比べ１０〜１００倍の局在化の増加を表し た。この結腸における標識細胞の増加された蓄積を、抗β７と抗ＭＡｄＣＡＭモ ノクローナル抗体との組合せを用いて２週間処理することにより、５０〜７５％ 阻害した（図１９）。 他の実験において、ｓｃｉｄマウスを５×１０⁴個のＣＤ４５ＲＢ^hiまたはＣ Ｄ４５ＲＢ^loＣＤ４⁺Ｔ細胞で再構築した。再構築の際に、マウスを（ａ）５０ ０μｇのＦＩＢ５０４（β７特異的）（６匹のマウス）；（ｂ）５００μｇのＭ ＥＣＡ−３６７（ＭＡｄＣＡＭ特異的）（３匹のマウス）；（ｃ）１ｍｇのイソ タイプ適合対照抗体（７匹のマウス）；または、（ｄ）１ｍｇのＦＩＢ５０４＋ ＭＥＣＡ−３６７（各５００μｇ）（５匹のマウス）のいずれかで処理した。再 構築に続いて、抗体を１週間の間隔で投与した：（ａ）２５０μｇのＦＩＢ５０ ４；（ｂ）２５０μｇのＭＥＣＡ−３６７；（ｃ）５００μｇのイソタイプ適合 対照；または（ｄ）５００μｇのＦＩＢ５０４＋ＭＥＣＡ−３６７（各２５０μ ｇ）。 処理の４ヶ月後、マウスに５×１０⁶個の¹¹¹Ｉｎ標識した腸間膜リンパ小節細 胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を注射し、放射活性のレベルを測定することにより結腸への 補充を評価した。結果を図１９で述べるように計算した。再構築の時間から始め て、ＦＩＢ５０４およびＭＥＣＡ−３６７を単独でまたは組み合わせて用いて４ ヶ月間、ｓｃｉｄマウスを処理することで、結腸へのリンパ球の増加させた補 充を１００％まで阻害した（図２０）。 ｓｃｉｄマウスを、２．０×１０⁵〜４．０×１０⁵個のＣＤ４５ＲＢ^hiまたは ＣＤ４５ＲＢ^loＣＤ４⁺Ｔ細胞で再構築した。４ヶ月後、マウスをＦＩＢ５０４ （β７特異的）＋ＭＥＣＡ−３６７（ＭＡｄＣＡＭ特異的）（全２００μｇ／日 について１００μｇの各ＭＡｂ／日）またはイソタイプ適合対照抗体（２００μ ｇ／日）の組合せを用いて、１４日間処理した。抗体をＰＢＳ中においた。各実 験群は４匹のマウスで構成した。右および左結腸の凍結断片を、マウスＣＤ４に 特異的なラットモノクローナル抗体で染色し、ファストレッド（Ｆａｓｔ Ｒｅ ｄ）またはＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）クロモーゲンのいず れかを用いて発現させた。各マウス由来の右結腸および左結腸の１横断面を、レ イカ クアンティメット５００イメージ アナライザー（ａ Ｌｅｉｃａ Ｑｕ ａｎｔｉｍｅｔ ５００ Ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてＣＤ４のポ ジティブ染色について分析した。１０倍対物レンズを用いてその全体おける各部 を調べた。有為さをｔ検定を用いて決定した。データは平均陽性数／組織領域± １標準偏差で表す。 細胞系譜のマーカーおよび分化状態に対して特異的な抗体のパネルを用いる免 疫組織化学による組織構造評価は、ＣＤ４５ＲＢ^hiＴ細胞で再構築されたｓｃｉ ｄマウスの結腸に浸潤している細胞が、実質上全てＣＤ４⁺Ｔ細胞であることを 示した。ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢ２２０⁺Ｂ細胞を、使用条件下では単離するこ とができなかった。さらに、これらのマウスをβ７およびＭＡｄＣＡＭ特異的モ ノクローナル抗体の組合せで処理することにより、対照に関して上行または下行 結腸中のＣＤ４⁺Ｔ細胞数を有為に減少させた（図２１）。腸間膜リンパ小節細 胞の約９５％がリンパ球であるので、これらの結果は、リンパ球上のα４β７と ＭＡｄＣＡＭとの相互作用が結腸中の炎症部へのリンパ球の補充に重要であり、 この相互作用をブロックする薬剤が炎症を減少することができることを示してい る。実施例５ 吸収不良性腸炎をもつ一般的なマーモセット（カリスリックス ジャ カハス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ））における柔突起変化の分析 モデルの解説 一般的なマーモセット（カリスリックス ジャカハス）は、新規の世界的な非 ヒト霊長類であり、それらはニューイングランド地方霊長類研究センター（ＮＥ ＲＰＲＣ）での閉鎖条件下において、ステロイド非反応性、体重減少に特徴づけ られる自発性吸収不良症候群、下痢、および吸収能の低下と一致した小腸粘膜変 化を発現している。これらの組織構造の変化には小腸柔突起の萎縮および融合お よびヒトにおけるセリアック症（非熱帯性スプルー）と同様、単核白血球の基底 膜内への浸潤が含まれる。ＮＥＲＰＲＣでの病理学公記録保管文書から回顧した 分析により、８０％以上の一般的なマーモセットが、様々な程度で、吸収不良性 腸炎を持つことが死後の実験時に示された。抗体治療プロトコール ＮＥＲＰＲＣにおいて、広い範囲のコロニーから成体の一般的なマーモセット を、研究用に選択した。全動物における基礎の研究には、身体検査、全血球数（ ＣＢＣ）、血液化学プロフィール、血清Ｂ１７、ｃ−反応性蛋白質および腸壁切 開による全厚み空腸生検を含まれた。腹部手術からの回復に続いて、動物を、２ ｍｇ／ｋｇ／日のＡＴＣ−１モノクローナル抗体、α４β７の配座エピトープに 対するブロッキングモノクローナル抗体で１４日間処理した（シュバイホッファ ーら（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．１５１：７１７−７２９，１９９３）。以前の研究により、この抗体はカリ スリックス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）α４β７と交差反応することが示された。 抗体治療前に行われた全ての評価を第１０日目と第１４日目の抗体治療の間で繰 り返した。空腸生検の分析 各マーモセット由来の全厚み空腸生検を２人の無関係な病理学者が組織学的に 評価し、柔突起構造を次の格付け基準に従って評価した。柔突起萎縮 ０−正常の粘膜の厚さおよび柔突起の高さ １−穏やかな萎縮；柔突起の軽微な短化；正常の約７５％の高さ ２−中程度の萎縮；正常の高さの約３３〜５０％の柔突起 ３−激しい萎縮；短い（普通の３３％未満）または観察できる柔突起がない柔突起融合 ０−正常；融合なし １−試料中１〜２個の柔突起が融合 ２−試料中１〜２から５０％の間の柔突起が融合 ３−試料中５０％より多い柔突起が融合データ分析 各群の動物で得られる平均値間の違いを組み合わせｔ検定を用いて統計的な有 為さについて評価した。Ｐが０．０５未満のとき平均値間の違いを有意であると した。結果 ＡＴＣ−１モノクローナル抗体を用いた抗体治療の前後における柔突起の融合 および萎縮についての平均値を図９および１０にそれぞれ示す。明らかに、柔突 起萎縮（Ｐ＜０．０１）のほとんど完全な解消およびＡＴＣ−１抗体を用いた２ 週間にわたる治療後に柔突起融合改善の傾向があった。ＡＴＣ−１により認識さ れるもの以外のエピトープに対して方向づけられた様々なモノクローナル抗体で 処理された他の動物は、柔突起の融合および萎縮値の減少に効果がないので、効 果は外来免疫グロブリンにさらすという非特異的な効果に比べ二次的なものでは なかった。実施例６ コットントップタマリン（ｔｈｅ Ｃｏｔｔｏｎ Ｔｏｐ Ｔａｍａ ｒｉｎ）における結腸炎の消散 モデルの解説 コットントップタマリン（ＣＴＴ）（サグイナス オエディプス（Ｓａｇｕｉ ｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ））は、ヒトにおける潰瘍化結腸炎に臨床的および組織 形態的に似た、自発的な、そしてしばしば慢性的な結腸炎を発生する新規の世界 的な非ヒト霊長類である（マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．） ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９８５））。免疫治療、臨床評価および粘膜生検 臨床評価、結腸粘膜生検および結腸炎ＣＴＴのＡＴＣ−１免疫治療を含む実験 プロトコールを始めた（図１３）。ＡＴＣ−１はヒトα４β７と反応するネズミ ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（シュバイホッファーら（Ｓｃｈｗｅｉｇｈ ｏｆｆｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：７１７− ７２９（１９９３）；ラザロビッツら（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：１８５７−１８６２（１９８４） ；アールら（Ｅｒｌｅ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ５３．５１７−５２８（１９９４））。作用させた動物由来の結腸炎粘膜のＡＣ Ｔ−１抗体で免疫組織学的染色することによって評価したところ、ＡＴＣ−１が タマリン中で交差反応することがわかった。これらの初期の試験的研究により、 ヒト結腸炎粘膜と同様、作用させた動物由来の結腸の基底膜内にある単核細胞の うちの４０〜８０％がα４β７＋であることが示された。また、ＣＴＴ末梢血リ ンパ球（ＰＢＬ）についてフローサイトメトリーを用いたところ、ＡＴＣ−１が ＣＴＴ由来のα４β７と交差反応することがわかった。 下痢および体重減少の臨床診察に基づき、マサチューセッツ、ソウボロスにあ るニューイングランド地方霊長類研究センターにおいて広範囲のコロニーから慢 性結腸炎をもつＣＴＴを選んだ。結腸炎の存在を確認するため（２または３の組 織学的炎症活性値で規定される）、臨床的るいそうおよび下痢を有すると記録さ れたコロニーの動物を、抗体免疫治療の実験的評価に先立って多くの機会に、結 腸粘膜生検試料の通常の組織学的評価により結腸炎症活性について評価した（図 １３）。小児科ファイバーオプティクス内視鏡（ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｆｉ ｂｅｒｏｐｔｉｃ ｅｎｄｏｓｃｏｐｅ）を用いて、肛門から２〜３ｃｍにある 末端下行結腸由来の粘膜試料試験により、少なくとも２度の結腸炎炎症活性につ いて、慢性的な結腸炎ＣＴＴを予備選択した。炎症活性値は、基底膜、陰窩管腔 、陰窩上皮および表皮内の好中球の相対数に基づいた。特に、急性および慢性炎 症活性の組織病理学的な評価系を用いた（マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９ ８５）により述べられている）。全生検試料について評価し、普通の粘膜を０、 最も激しく炎症をおこした粘膜を３で表わすことで４群に選別した。０および１ の値は、前兆となる結腸炎を表わさず、一方２〜３の値は、中程度から激しい結 腸炎活性を表わす。研究用に選択された動物には、（１）一番目の生検試料にお いて慢性の結腸炎を思わせるような、表面および陰窩上皮の中程度（階級２）ま たは激しい（階級３）構造変化、（２）免疫治療前に３〜７日ばらばらに少なく とも２度生検試料において中程度（階級２）または激しい（階級３）炎症活性を 有していた。これらの基準を満たす生検試料には陰窩分岐の存在および／または 、基底膜および／または上皮区画のいずれにも多型核白血球（ＰＭＮ）の浸潤を 伴う損失という特徴があった。 従って、研究用に選択された動物は、結腸炎炎症活性および最近鎮静した形跡 のない慢性の臨床的に関連した結腸炎を繰り返している形跡を有していた。さら に、モノクローナル抗体の投与初日に持続する下痢は、研究に含まれる動物には 必須である。結腸炎の確認から５日以内に、動物はＡＴＣ−１モノクローナル抗 体を用いて免疫治療を始めた。 滅菌した発熱原を有しない流動路を用いて中空繊維細胞発酵層中で培養するこ とにより、ＡＴＣ−１を生産させ、Ａ蛋白質アフィニティークロマトグラフィー により精製し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用する前に滅菌０．９％ＮａＣ ｌ中に希釈した。また、ＣＴＴは絶滅に瀕した種であるので、結腸炎ＣＴＴに投 与する前に抗体の薬物速度論的解析を行なうために、関連した種である一般的な マーモセット（カリスリックス ジャカハス）由来のＰＢＬにおいて、ＡＣＴ− １がα４β７と交差反応することが示された。研究のこの成分について、始めに 静脈に１回注入し、２４時間後に次に筋肉内注射した際に、ＡＣＴ−１は２匹の 正常な成体の一般的マーモセットに投与した。これらの動物において２．０ｍｇ ／ｋｇのＡＴＣ−１の静脈投与は、１回の筋肉内注射後２〜２４時間の間で抗体 の継続した吸収を用い、約５０時間の半減期と考えられる血清を生産した。この 投与形式を用い、抗体の山の血清濃度は、約６０μｇ／ｍＬであり、一方谷の濃 度は１８．０μｇ／ｍＬ以上であった。有害な臨床効果は、ＡＣＴ−１を投与さ れたマーモセットには見られなかった。 これらの観点において、研究要件（ｎ＝４；集齢＝３１齢）を満たすコットン トップタマリンの半数に第１日目に２．０ｍｇ／ｋｇの投与量でＡＣＴ−１の丸 薬を静脈内（ｉ．ｖ．）に１回投与し、続いて２４時間毎に同じ量の筋内（Ｉ． Ｍ．）注射を７回し、全部で８日間の免疫治療を施された。他の半数の慢性的結 腸炎対照動物（ｎ＝４；集齢＝２６齢）には、抗体８６Ｄ、ＣＴＴ中で交差反応 しない（データを示さず）ヒツジＴＣＲγδに対するネズミモノクローナル抗体 を与えた（マッカイら（Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．），Ｅｕｒ．Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：１４７７−１４８３（１９８９））。この無関係な イソタイプ適合抗体を生産し、精製し、ＡＣＴ−１として同一の条件下で投与し た。 結腸粘膜生検を再び第一回抗体投与（第０日）の時点、および第５、第１０お よび第２０日に採取した。生検を無関係な組織学者が評価した。追加の結腸生検 を免疫組織学のために凍結した。組織構造分析について、肛門から２〜３ｃｍで 採取した結腸粘膜生検試料を、ＯＣＴ組成物中で直ぐに急速冷凍し、近接した範 囲から採取した複製試料を１０％リン酸緩衝ホルマリン中で固定し、普通の組織 学的技術により加工し、パラフィン中で包埋して６．０μｍの厚さに切り、断片 をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。続いて、ホルマリン固定試料を組 織構造について試験した。アセトン固定され、凍結された断片を用い、以前に述 べたアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ免疫組織化学的技術（レイラーら（Ｒ ｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍ ｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，４９：３４９−３６４（１９８８））の順に第一抗体を 除去することによりインビボで投与されたネズミＩｇＧ１を検出した。 動物管理人には、治療方式（ＡＣＴ−１対イソタイプ適合無関係モノクローナ ル抗体）について分からないようにし、下痢、半固体または固体のように糞を分 類することにより、１日あたりの基準について、各動物における糞の粘稠度を評 価した。値は次のように割当てた：０、形のある固体の糞；１、数個の固形物を 有する液体状の糞（半固体）；２、液体状の糞（下痢）。動物を一日おきに体重 測定し、一方、血液を同じ間隔でフローサイトメトリー、血液学、および抗体濃 度、抗マウスＩｇＧ力価、臨床化学、または急性期蛋白質等のさらなる分析のた めの血清または血漿の保存用に採取した。コンピューター補助された形態計測映像分析 定量的な、コンピューター補助された、粘膜生検断片の形態計測分析をレイカ クアンティメット５００イメージアナライザーを用いて行なった。最初にアビ ジン−ビオチンペルオキシダーゼ技術を用いて、以前に述べたように（リングラ ーら（Ｒｉｎｇｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，４９：３４９−３６４（１９８８））、粘膜断 片の免疫組織化学的分析を行ない、特異的な白血球細胞型を詳細にした。好中球 、β７⁺細胞および単球／マクロファージ（Ｍφ）を同定するために、それぞれ 一次試薬として順に、ヒツジ抗エラスターゼポリクローナル抗体（バイオデザイ ン、ケンネブルク、ＭＥ）を好中球を同定するために、パラホルムアルデヒド− 、アセトン−、またはホルマリンー固定化凍結断片を使用して、ＦＩＢ２１モノ クローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）をβ７鎖を同定するために（アンドリ ューら（Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ５３：３８４７−３８６１（１９９４））、およびＨＡＭ−５６モノクローナル 抗体（マウスＩｇＭ）をマクロファージを同定するために（ダコ株式会社、カー ピンテリア、ＣＡ）用いた。エラスターゼ抗体を用いて染色された組織断片の試 験から、この試薬だけがＣＴＴ結腸粘膜中の多型核白血球細胞を認識したことが 詳細に記録された。ＴおよびＢ細胞を数えるために、それぞれ、第一試薬として 順に、ヒトＣＤ３へのウサギポリクローナル抗体（ダコ株式会社、カーピンテリ ア、ＣＡ）、およびＬ２６モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ２ａ）（ダコ株式 会社、カーピンテリア、ＣＡ）を用いて、ホルマリン固定化、パラフィン包埋化 組織断片を使用した。第一抗体検出用に、種およびイソタイプ特異的第二試薬を 、組織中におけるＡＣＴ−１または無関係なネズミＩｇＧ１抗体の認識を排除す るために用いた。免疫組織化学的手段後、各細胞数を２〜４個の任意の粘膜の領 域／断片において数えた。細胞を褐色ジアミノベンジジン反応生成物から生じる 色波長に基づいて選択したところ、色選択基準は各細胞特異的マーカーについて 分析した全断片において同一であった。凍結断片の形態およびβ７＋白血球およ びマクロファージの高い相関密度のために、これらの細胞型の定量化を、粘膜の 免疫反応断片域として推定し、一方、全ての他の白血球細胞を、細胞数／粘膜域 として評価した。ある特定の時点における各動物の生検試料由来の値と第０日の 同一の動物から得られる値とを比較して得られる値は、処理群内で前処理（第０ 日）値の平均（±１ＳＥＭ）％で表した。従って、１００％未満の値（下記表３ に太字で記載）は、前処理試料と比較して白血球細胞密度の減少を表しており、 一方１００％を数える値は、粘膜白血球細胞密度の増加を表している。組み合わ せｔ検定を用い、ある特定の時点における細胞密度の平均の未処理値と前処理時 の値とを比較することで、有為さを決定した。平均値間の差は、Ｐが０．０５未 満の時、有為であると考えた。血液学およびフローサイトメトリー α４β７インテグリンを発現するリンパ球を、以前に述べた方法（マッカイら （Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９：１４７７−１４８３（１９８９））を用い、フローサイトメトリーおよび ＡＣＴ−１モノクローナル抗体により数えた。ＡＣＴ−１の飽和血清濃度を、注 入プロトコールで達成したので、血清中に外来投与されたＡＣＴ−１を用いて、 血液中のα４β７＋リンパ球数を数えることができた。簡単には、１００μＬの ＥＤＴＡで凝血を阻止させた血液をＰＢＳ／１０％ウサギ血清／５％ヒトＡＢ血 清で２０分間４℃で希釈することにより、各血液コレクションにおける各動物由 来の全血液を分析した。ブロッキング血清を除去した後、ＡＣＴ−１で処理され た動物の場合には、血球を、直接１００μＬのフルオレセイン結合したウサギ抗 マウスＩｇＧ（ダコ株式会社、カーピンテリア、ＣＡ）とインキュベートさせる か又は、無関係な抗体または前処理血液試料を与えた動物の場合、続いて二次抗 体で１０μｇ／ｍＬになるように血液にＡＣＴ−１を添加した。各試料について 、最小限の１０，０００個の細胞を分析した。ベーカー５０００血液分析機（ａ Ｂａｋｅｒ ５００ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用い適切 にコットントップタマリン赤血球、白血球および血小板を排除して、普通の血球 値および示差解析を行なった。血液分析、およびフローサイトメトリーの結果か ら、血液のμＬあたりのα４β７＋リンパ球の絶対数を計算した。結果／推論 血清濃度 研究の初めの１０日間にＡＣＴ−１および無関係なイソタイプ適合抗体の血清 濃度は、一般的に両方とも１０μｇ／ｍＬ以上であった。研究２〜１０日目に、 １０μｇ／ｍＬの濃度で全血液中に用いたビオチン化ＡＣＴ−１は、ＡＣＴ−１ で処理された動物におけるフローサイトメトリーにより評価される際に、有為な 標識末梢リンパ球を欠乏させ、一方、第０日の無関係な抗体で処理された動物に おいて同じ抗体は、ヒトリンパ球におけるＡＣＴ−１の染色プロフィールと同様 に、７０〜９０％の間の末梢リンパ球プールを認識した。まとめると、これらの 結果は、結腸炎ＣＴＴにおけるＡＣＴ−１に関する治療プロトコールが、末梢循 環のリンパ球上のα４β７インテグリンの飽和を導くということを示した。 また、結腸炎ＣＴＴの結腸粘膜の基底膜内にある、血管外のα４β７⁺細胞を 認識するＡＣＴ−１の能力を評価した。免疫組織化学的技術を用いて研究動物由 来の結腸粘膜生検中のネズミＩｇＧ１を検出し、予想されるように、抗体注入前 の第０日目からではなく、ＡＣＴ−１で処理された動物における研究の最初の１ ０日間で、全ての生検時点において、基底膜内にある単核白血球細胞膜について 、ＡＣＴ−１を観察した。標識されていない基底膜細胞を無関係な抗体を投与し た動物内で観察した。従って、研究において利用された投与形式は、ＡＣＴ−１ の血清濃度を中和し、付随する血管外の認識し、および結腸炎粘膜内の免疫細胞 を標識した。ＡＣＴ−１抗体は、標的部位、即ち、末梢血液内のリンパ球、およ び特に結腸炎粘膜内の血管外の区画に位置していた。臨床効果 ４匹の試験動物は全て、前処理および第０日の生検試料の両方において、段階 ２または３のどちらかの結腸炎炎症活性を維持し、そのために３種の動物を５日 までに分離させた。加えて、４匹全ての動物の粘膜構造内の変化は、これら４匹 の動物が持続性の結腸炎を有することを証明した。従って、全ての動物は慢性病 の病歴をもつことが明らかとなった。 結腸粘膜生検の組織病理学的解析を行った。ＡＣＴ−１を用いた免疫治療の前 および５日後における典型的なＣＴＴ（動物Ｓｇｏ ３２６−８４およびＳｇｏ １７−８５）からの結果は、結腸炎ＣＴＴ中の結腸粘膜の顕微鏡的変化に対す るＡＣＴ−１免疫治療の治療効果を説明した。免疫治療前に、上皮区画および陰 窩管腔内に化膿した滲出物があり、完全に区別される杯状細胞の喪失で特徴づけ られる未成熟上皮および基底膜が単核白血球および化膿した炎症性浸潤により広 げられた（Ｓｇｏ ３２６−８４、筋肉粘膜）。ＡＣＴ−１免疫治療後、免疫組 織化学技術を用いて、基底膜内に単核白血球細胞膜にＡＣＴ−１を位置づけさせ （Ｓｇｏ １７−８５、筋肉粘膜）、好中球成分の炎症浸潤が解消し、完全に分 化した杯状細胞を観察し、そして基底膜は単核白血球または／および好中球によ り、さらに広げられなかった（Ｓｇｏ ３２６−８４）。 結腸炎ＣＴＴの糞粘稠度に対するＡＣＴ−１の治療効果は著しかった（図１４ ）。１回目の投与後２４時間以内に、下痢が少なくとも半固体糞成分へ改善する ことが観察され、一方、７２時間までに全ての動物において、固体糞への完全な 解消が全ての動物において生じた。対照動物は改善せず、全研究期間中、下痢で あることが観察され、加えて、この動物群に対する前選択の基準が、効果的に自 然な鎮静をもつものを除去することが示された。 全ての動物は、抗体注射終了後約１週間、固体糞を維持した（図１１）。個々 の動物に関して、１匹の動物（Ｓｇｏ ６３−９３）は第４日目から第２０日目 プロトコールの終了まで固体糞をした（図１１）。２匹の動物（Ｓｇｏ １２９ −９１、Ｓｇｏ １７−８５）は、研究第１４日後に半固体糞に逆戻りした（図 １１）。４匹目の動物（Ｓｇｏ ３２６−８４）は、第６日〜第２０日の間、下 痢の持続的な改善／解消を示した。 同様に、結腸における白血球浸潤が、ＡＣＴ−１を投与されたＣＴＴにおいて 著しく和らげられた。前処理生検と比べ、ＡＣＴ−１で処理された動物由来の結 腸粘膜（結腸粘膜のホルマリン固定化生検試料）の組織分析は、浸潤活性および 付随した粘膜の構造的変化において改善を示した。結腸炎症活性の組織評価系（ マダラら（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ ｏｌｏｇｙ，８８：１３−１９（１９８５））を用いたところ、ＡＣＴ−１で処 理された動物は基準の前処理値と比べ、全ての時点において炎症活性値の著しい 減少をしており、一方、対照抗体を投与した動物の値は変化しなかった（図１５ ）。第２０日の無関係処理群の炎症値には変化がなかった（図１５）。ＡＣＴ− １処理された群の全ての時点で炎症活性の平均未処理値は統計的に第０日での 同じ動物の値より低かった（第５日および第１０日、Ｐ＜０．０５：第２０日、 Ｐ＜０．０１）。 個々の動物に関して、４匹全ての試験動物は、ＡＣＴ−１免疫治療の間または 後に炎症活性に改善を示した。２匹の動物（Ｓｇｏ １２９−９１およびＳｇｏ １７−８５）における結腸炎は完全に第１０日までに解消された（図１２）。 他の動物（Ｓｇｏ ６３−９３）は第２０日までに結腸炎活性の完全な解消を示 さず、一方４匹目の動物（Ｓｇｏ３２６−８４）の粘膜生検値は研究期間の間ず っと改善を示した（図１２；Ｓｇｏ ３２６−８４における第２０日の２つの生 検は０および１と評価された）。さらに、動物３２６−８４は研究期間中、元の 体重の２０％増加した。 効果のより定量的な評価を提供するために、全ての研究動物由来の結腸粘膜内 にある白血球部分集合のコンピューター補助した形態映像分析を行った。表３は 慢性結腸炎ＣＴＴの結腸炎症活性に対するＡＣＴ−１免疫治療の効果の分析結果 を示している（前処理値のパーセントとして表現）。ＡＣＴ−１免疫治療により 、抗体投与前に測定される基準数と比較して粘膜白血球の密度が大幅に減少し、 一方対照群は無関係抗体の投与後に一般的に同数の又は増加した粘膜白血球数を 有していた。ＡＣＴ−１抗体の第１回投与後１０日で、前処理値に比べ約３０％ 弱の粘膜単核白血球がβ７インテグリンを発現していた。この減少は末梢循環プ ールのα４β７＋白血球数を減少させず（図１６）、また対照動物由来の結腸粘 膜中のα４β７＋白血球数が増加または大きく変化しないままなので、操作また は非特異的な効果にも関係しない。同様に、粘膜Ｔ細胞は、ＡＣＴ−１で処理し た動物において第５日目で約５０％に、第１０日目で約２５％にまで減少し、一 方、同じ時点における無関係抗体群の粘膜Ｔ細胞は変化しなかった。粘膜Ｂ細胞 において比較できるような減少は、ＡＣＴ−１処理群には見られたが、対照群に は見られなかった。また、興味深いことにＡＣＴ−１免疫治療は、α４β７を僅 かまたはほとんど発現しない粘膜白血球の密度を減少した。好中球は第１０日と 第２ ０日で４０〜４５％まで、ＡＣＴ−１処理された動物においては２０％にまで減 少したが、ＰＭＮの減少は対照群では観察されなかった。同様に粘膜マクロファ ージは、全ての治療後生検試料においてＡＣＴ−１を投与した動物において３０ 〜４５％にまで減少し、一方対照群におけるマクロファージは変化しなかった。 興味深いことに、免疫組織化学およびクローン化されたヒトＭＡｄＣＡＭ（１０ Ｇ３、実施例２）に特異的な交差反応性モノクローナル抗体を用いたところ、Ａ ＣＴ−１または対照抗体で処理された結腸炎ＣＴＴにおいて、発現の変化が見ら れなかった。 ＡＣＴ−１投与に帰することができる研究動物において、明白な毒性は観察さ れなかった。研究動物のうちで肝臓および腎臓の機能の臨床化学評価に変化が見 られるものはなかった（データ示さず）。ＡＣＴ−１抗体は非分解性モノクロー ナル試薬であり（ラザロビッツら（Ｌａｚａｒｏｖｉｔｓ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａ ｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：１８５７−１８６２（１９８４））、 白血球減少は、研究の間、どの動物にも見られなかった。実際に、研究の始めの 週の間、対照動物を含む全ての試験動物において好中球に対する傾向（周辺血液 におけるピーク数は４０×１０³／μＬに近く；ＣＴＴ標準範囲は１．４−１２ ．０×１０³／μＬ）があった。その際に、抗体を投与するのに毎日の麻酔／操 作が用いられた。また、周辺血液におけるリンパ球の絶対数が１８×１０³／μ Ｌ近くになるような（ＣＴＴ通常範囲は０．６−５．７×１０³／μＬである） ＡＣＴ−１を投与された動物におけるリンパ球増加に対する傾向があった。。従 って、ＡＣＴ−１処理群の結腸への白血球細胞型の補充の減少により、末梢循環 プール中の白血球数を変化させることはできなかった。要約 慢性結腸炎コットントップタマリンに投与した際に、α４β７インテグリンに 対するモノクローナル抗体は、下痢および結腸炎症活性を急速に解消して、結腸 炎を改善する効果を示した。これらは組織炎症活性値と糞粘稠度との間に完全な 相互関係があることを明らかにした。糞粘稠度が、一般的にＡＣＴ−１抗体を受 けた動物において１−２日で改善されるという観察結果は注目すべきものである 。更に、粘膜白血球部分集合の関連した密度は、一般的に抗α４β７抗体を用い た免疫治療に応じて弱められた。また、これらの結果は、器官または組織特異的 （粘膜特異的）であるような炎症過程に対して効き目のある治療を明らかにして いる。 結腸炎ＣＴＴにおけるＡＣＴ−１の治療効果は、消化管へのリンパ球補充の阻 害により媒介されるかもしれない。代わりに、または加えて、観察された治療効 果は、他の細胞相互作用における変化またはα４β７インテグリンにより媒介さ れる前兆事象における変化に影響するかもしれない。これらの結果は、ＡＣＴ− １抗体がα４β７インテグリン作用の効果的なアンタゴニストであり、α４β７ インテグリン作用の阻害が炎症腸疾患を有する個々動物の臨床治療技術における 器官または組織特異的な処理方法とすることができることを示している。さらに 、結果は、炎症性腸疾患の病原におけるα４β７インテグリンの役割を示してい る。α４β７インテグリンは、潜在的に、炎症性腸疾患に対する組織特異的な治 療標的を提供する。均等物 当業者は、日常の実験を用いるだけで、ここで詳細に記載された本発明の特定 の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。 かかる均等物は、請求の範囲に包含されることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｖ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ピカレラ，ドミニク アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01776 サドベリー，ケイ ストリート ９ (72)発明者 ニューマン，ウォルター アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115 ボストン，ナンバー ３ ダラム ストリート ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする単離された核酸。 ２． 単離された核酸が組換え体である、請求項１記載の単離された核酸。 ３． 該核酸がストリンジェントな条件下で二番目の核酸とハイブリダイズし、 該二番目の核酸が図１（配列番号：１）、図２（配列番号：３）または図３（配 列番号：５）に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離された 核酸。 ４． 該核酸が本質的に純粋である、請求項３記載の単離された核酸。 ５． 該核酸が図１（配列番号：２）に示されるポリペプチド、図２（配列番号 ：４）に示されるポリペプチド、図３（配列番号：６）に示されるポリペプチド または対応する成熟蛋白質をコードする、請求項１記載の単離された核酸。 ６． 組換え核酸である、請求項５記載の単離された核酸。 ７． 該核酸が本質的に純粋である、請求項５記載の単離された核酸。 ８． 図１（配列番号：１）に示されるヌクレオチド配列、図２（配列番号：３ ）に示されるヌクレオチド配列、図３（配列番号：５）に示されるヌクレオチド 配列およびコード配列を含有してなる前記のいずれかの一部からなる群より選ば れたヌクレオチド配列を有する請求項５記載の単離された核酸。 ９． 請求項１記載の核酸を含有してなる組換え核酸構築物。 １０． 組換え核酸が発現制御配列に実施可能に連結している、請求項９記載の 組換え核酸構築物。 １１． 該核酸が図１（配列番号：２）、図２（配列番号：４）、図３（配列番 号：６）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸を含 有してなる請求項９記載の組換え核酸構築物。 １２． 核酸が発現制御配列に実施可能に連結している、請求項１１記載の組換 え構築物。 １３． 単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 １４． 霊長類ＭＡｄＣＡＭがヒトＭＡｄＣＡＭであり、ストリンジェントな条 件下で二番目の核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされ、該二番目の核 酸が図１（配列番号：１）または図２（配列番号：３）に示されるヌクレオチド 配列を有する、請求項１３記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 １５． 霊長類ＭＡｄＣＡＭが図１（配列番号：２）、図２（配列番号：４）に 示されるヒトＭＡｄＣＡＭまたは前記のいずれかの対応する成熟蛋白質である、 請求項１３記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 １６． 霊長類ＭＡｄＣＡＭがアカゲザルＭＡｄＣＡＭであり、ストリンジェン トな条件下で二番目の核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされ、該二番 目の核酸が図３（配列番号：５）に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項 １３記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 １７． 霊長類ＭＡｄＣＡＭが図３（配列番号：６）に示されるアカゲザルＭＡ ｄＣＡＭまたは対応する成熟蛋白質である、請求項１３記載の単離された霊長類 ＭＡｄＣＡＭ。 １８． 図１（配列番号：２）の１９〜４０６、図２（配列番号：４）の１９〜 ３８２または図３（配列番号：６）の２２〜３４６のアミノ酸からなるアミノ酸 配列を本質的に有する請求項１５記載の単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 １９． α４β７インテグリンへの結合および細胞接着の媒介からなる群より選 ばれた１以上の機能を有する単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 ２０． 細胞接着がα４β７インテグリン依存性である、請求項１９記載の単離 された霊長類ＭＡｄＣＡＭ。 ２１． 結合がα４β７に対して選択的である、請求項２０記載の単離された霊 長類ＭＡｄＣＡＭ。 ２２． 請求項２記載の組換え核酸を含む宿主細胞。 ２３． 核酸が発現制御配列に実施可能に連結し、それによって宿主細胞を発現 に適した条件下で維持した時に霊長類ＭＡｄＣＡＭが発現される、請求項２２記 載の宿主細胞。 ２４． 霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる融合蛋白質。 ２５． 第１部分および第２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣ ＡＭであり、該第２部分が少なくとも免疫グロブリン鎖またはその変異体の一部 である、請求項２４記載の融合蛋白質。 ２６． 該第１部分がそれのＣ末端で第２部分のＮ末端に結合している、請求項 ２５記載の融合蛋白質。 ２７． 第１部分が全細胞外ドメインを含むヒトＭＡｄＣＡＭの断片および２つ のＮ末端免疫グロブリンドメインを含むヒトＭＡｄＣＡＭの断片からなる群より 選ばれた、請求項２５記載の融合蛋白質。 ２８． 第２部分が少なくとも免疫グロブリン重鎖定常部またはその変異体の一 部である、請求項２５記載の融合蛋白質。 ２９． 免疫グロブリン重鎖がＩｇＧクラスである、請求項２８記載の融合蛋白 質。 ３０． 第２部分が免疫グロブリン重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン を含有する、請求項２８記載の融合蛋白質。 ３１． 請求項２５記載の融合蛋白質を含有してなるハイブリッド免疫グロブリ ン。 ３２． 該ハイブリッド免疫グロブリンがホモ二量体である、請求項３１記載の 融合蛋白質を含有してなるハイブリッド免疫グロブリン。 ３３． 必要に応じてコード配列が発現制御配列に実施可能に連結している、請 求項２４記載の融合蛋白質をコードするコード配列を含む核酸を含有してなる核 酸構築物。 ３４． 必要に応じてコード配列が発現制御配列に実施可能に連結している、請 求項２５記載の融合蛋白質をコードする配列を含む核酸を含有してなる、核酸構 築物。 ３５． 下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭの製造方法： （ａ） 宿主細胞に霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする核酸を含有してなる核酸構 築物を導入し、それによって少なくとも１つの発現制御配列に実施可能に連結さ れた該コード配列を有する組換え宿主細胞を製造する工程；および （ｂ） 工程（ａ）において製造された宿主細胞を核酸が発現される条件下で適 した培地中で維持する工程。 ３６． さらに霊長類ＭＡｄＣＡＭを単離する工程を有する、請求項３５記載の 方法。 ３７． 霊長類ＭＡｄＣＡＭをコードする組換え核酸を含む宿主細胞を核酸の発 現に適した条件下で維持し、それによって霊長類ＭＡｄＣＡＭが製造される工程 からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭの製造方法。 ３８． さらに霊長類ＭＡｄＣＡＭを単離する工程を有する請求項３７記載の方 法。 ３９． 霊長類ＭＡｄＣＡＭに結合する抗体またはその機能的部分。 ４０． 該抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭの１以上の機能を阻害することができる、 請求項３９記載の抗体。 ４１． 該抗体が選択的にα４β７依存性接着を阻害することができる、請求項 ３９記載の抗体。 ４２． 霊長類がヒトである、請求項４０記載の抗体。 ４３． 下記工程からなる試料中の選択された霊長類ＭａｄＣＡＭの検出方法： ａ） 選択された霊長類ＭＡｄＣＡＭへの該抗体の特異的結合に適した条件下で 単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する抗体に試料を接触させる工程；および ｃ） 抗体−ＭＡｄＣＡＭ複合体を検出する工程。 ４４． 単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下 で試験される薬物を単離された霊長類ＭＡｄＣＡＭと組み合わせて（ｃｏｍｂｉ ｎｉｎｇ）、該薬物および霊長類ＭＡｄＣＡＭ間の複合体の形成を検出または測 定する工程からなる、霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭ と結合する薬物の検出または同定方法。 ４５． 下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドまたは霊長類ＭＡｄＣ ＡＭと結合する薬物の検出または同定方法。 ａ） 組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下で試験 される薬物を組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現する宿主細胞と組み合わせる（ｃ ｏｍｂｉｎｉｎｇ）工程；および ｂ） 該薬物および霊長類ＭＡｄＣＡＭ間の複合体の形成を検出または測定する 工程。 ４６． 下記工程からなる霊長類ＭＡｄＣＡＭのそのリガンドへの結合の阻害剤 の検出方法： ａ） 霊長類ＭＡｄＣＡＭに対するリガンドの結合に適した条件下で試験される 薬物を霊長類ＭＡｄＣＡＭのリガンドおよび単離されたおよび／または組換え霊 長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる組成物と組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ） 工程；および ｂ） 霊長類ＭＡｄＣＡＭおよびリガンド間の結合を検出または測定し、それに よって適したコントロールと比較して減少した結合が該薬物が阻害剤であること を示す工程。 ４７． 単離されたおよび／または組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭが融合蛋白質であ る、請求項４６記載の方法。 ４８． 単離されたおよび／または組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる組 成物が組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現している宿主細胞を含む、請求項４６記 載の方法。 ４９． 下記工程からなる、ＭＡｄＣＡＭにより媒介される細胞接着の阻害剤の 検出方法： ａ） 試験される薬物、組換え霊長類ＭＡｄＣＡＭを発現している第１細胞およ びα４β７インテグリンを有している第２細胞を該第１細胞の該第２細胞への接 着に適した条件下で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）工程；および ｂ） 該第１および第２細胞間の接着を検出または測定し、それによって適した コントロールと比較して減少した接着が該薬物が阻害剤であることを示す工程。 ５０． 薬物が抗体または抗体断片である請求項４９記載の方法。 ５１． 白血球のＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害できる有効量の抗体を個体に投与 する工程からなる、分子ＭＡｄＣＡＭを発現している組織の白血球浸潤と関連す る疾患を有する個体の治療方法。 ５２． 疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結 果としての胃腸管または他の組織への白血球補充と関連する疾患であり、抗体が 白血球の内皮ＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害できる請求項５１記載の方法。 ５３． 抗体がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である請求項５２記 載の方法。 ５４． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７鎖を含んでいるイン テグリンを発現している白血球およびＭＡｄＣＡＭを発現している内皮の接着を 阻害する請求項５３記載の方法。 ５５． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７インテグリンと 結合する請求項５４記載の方法。 ５６． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７と結合する請求項５ ５記載の方法。 ５７． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する 請求項５６記載の方法。 ５８． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル 抗体の抗原特異性を有する請求項５４記載の方法。 ５９． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原 結合断片である請求項５８記載の方法。 ６０． モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である請求項５９記載の方法。 ６１． モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる 群より選ばれる請求項５４記載の方法。 ６２． 白血球がリンパ球である請求項５４記載の方法。 ６３． 白血球が単球である請求項５４記載の方法。 ６４． 疾患が炎症性の腸疾患である請求項５４記載の方法。 ６５． 疾患が潰瘍性結腸炎である請求項６４記載の方法。 ６６． 疾患がクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）である請求項６ ４記載の方法。 ６７． 疾患が腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしく はコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、または窩炎である請求項６４記載の 方法。 ６８． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７と結合する請求 項６４記載の方法。 ６９． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する 請求項６４記載の方法。 ７０． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル 抗体の抗原特異性を有する請求項６４記載の方法。 ７１． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原 結合断片である請求項７０記載の方法。 ７２． モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である請求項７１記載の方法。 ７３． モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる 群より選ばれる請求項６４記載の方法。 ７４． 白血球の内皮ＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害する１以上のモノクローナル 抗体が投与される請求項６４記載の方法。 ７５． 白血球の内皮リガンドへの結合を阻害する１以上のモノクローナル抗体 が投与される請求項６４記載の方法。 ７６． 少なくとも１のモノクローナル抗体がＭＡｄＣＡＭ以外の内皮リガンド への白血球の結合を阻害する請求項７５記載の方法。 ７７． 内皮ＭＡｄＣＡＭまたはα４β７インテグリンと結合する有効量の抗体 を個体に投与する工程からなる個体における炎症性の腸疾患の治療方法。 ７８． 抗体がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である請求項７７記 載の方法。 ７９． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がα４β７インテグリンと 結合する請求項７８記載の方法。 ８０． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がβ７と結合する請求項７ ９記載の方法。 ８１． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＭＡｄＣＡＭと結合する 請求項７８記載の方法。 ８２． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれたモノクローナル 抗体の抗原特異性を有する請求項７８記載の方法。 ８３． モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦＩＢ ２１、ＦＩＢ ３０、ＦＩＢ ５０４およびＡＣＴ−１からなる群より選ばれ、またはその抗原 結合断片である請求項８２記載の方法。 ８４． モノクローナル抗体がＡＣＴ−１である請求項８３記載の方法。 ８５． モノクローナル抗体がキメラ抗体およびヒトに適合させた抗体からなる 群より選ばれる請求項７８記載の方法。 ８６． 疾患が潰瘍性結腸炎である請求項７８記載の方法。 ８７． 疾患がクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）である請求項７ ８記載の方法。 ８８． 疾患が腹腔疾患、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしく はコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、または窩炎である請求項７８記載の 方法。 ８９． 霊長類ＭＡｄＣＡＭに対して特異性を有する抗体の有効量を投与する工 程からなる、分子ＭＡｄＣＡＭを発現している組織の白血球浸潤と関連する疾患 を有する霊長類の治療方法。 ９０． 抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害 することができる、請求項８９記載の方法。 ９１． 疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結 果としての組織の白血球浸潤と関連する疾患である、請求項８９記載の方法。 ９２． 霊長類ＭＡｄＣＡＭと結合する抗体の有効量を霊長類に投与する工程か らなる、霊長類における炎症性腸疾患の治療方法。 ９３． 抗体が霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作用を阻害 できる、請求項９２記載の方法。 ９４． 霊長類ＭＡｄＣＡＭの有効量または霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる ハイブリッド免疫グロブリンの有効量を投与する工程からなる、分子ＭＡｄＣＡ Ｍ−１を発現している組織の白血球浸潤と関連する疾患を有する霊長類の治療方 法。 ９５． 霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリ ッド免疫グロブリンが、霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作 用を阻害することができる、請求項９４記載の方法。 ９６． 該ハイブリッド免疫グロブリンが融合蛋白質を含み、第１部分および第 ２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣＡＭであり、該第２部分が 少なくとも免疫グロブリン鎖の一部である、請求項９４記載の方法。 ９７． 疾患が分子ＭＡｄＣＡＭを発現する腸−関連内皮への白血球の結合の結 果としての組織の白血球浸潤と関連する疾患である、請求項９４記載の方法。 ９８． 霊長類ＭＡｄＣＡＭの有効量または霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなる ハイブリッド免疫グロブリンの有効量を霊長類に投与する工程からなる、霊長類 における炎症性の腸疾患の治療方法。 ９９． 霊長類ＭＡｄＣＡＭまたは霊長類ＭＡｄＣＡＭを含有してなるハイブリ ッド免疫グロブリンが、霊長類ＭＡｄＣＡＭのα４β７インテグリンとの相互作 用を阻害することができる、請求項９８記載の方法。 １００． 該ハイブリッド免疫グロブリンが融合蛋白質を含み、第１部分および 第２部分を含有してなり、該第１部分が霊長類ＭＡｄＣＡＭであり、該第２部分 が少なくとも免疫グロブリン鎖の一部である、請求項９８記載の方法。