DD285611A5 - Interzellulare adhaesionsmolekuele und ihre bindungsliganden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein loesliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 sowie Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Behandlung von Entzuendungen.{ICAM-1-Derivate; loeslich; funktionell; Adhaesionsmolekuel; interzellular Arzneimittel; Behandlung von Entzuendungen}
Description
Hierzu 18 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein lösliches, funktionelles Derivat von ίΓΑΜ-1 und dessen Verwendung als Arzneimittel. Die erfindungsgemäß hergestellten Derivate sind interzellulare AdhSsionsmoleküle, wie ICAM-1, die an dem Prozeß beteiligt sind, durch welche Populationen von Lymphozyten .tellulare Substrate erkennen und an diesen haften, so daß sie zu Entzündungsstellen wandern können und mit den Zellen bei entzündlichen Reaktionen reagieren können. Vorliegende Erfindung betraft außerdem Ligandenmoleküle, die diese interzellularen Adhä.ionsmohküle binden können, eine „Screenings"-Analyse für diese Liganden und die Anwendungen dieses interzellularen Adhi'sionsnioleküls, der Ligandonmoleküle und der „Screening"-Analyse.
Bei dieser Anwendung handelt es sich um eine teilweise Fortsetzung der Ui -Patentanmeldungen mit den laufenden Nr. 07/ 045963, die am 4. Mai 1987 eingereicht wurde, 07/115798, die am 2. Novemoer 1987 eingereicht wurde, 07/155943, die am 16. Februar 1988 eingereicht wurde, 07/189815, die am 3. Mai 1988 eingereicht wurde, 07/250446, die am 28. September 198G eingereicht wurde, und 07/324481, die am 16. Mai 1989 eingereicht wurde. Diese Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung durch die Regierung erarbeitet. Die Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Leukozyten müssen in der Lage sein, an Zellsubstraten zu haften, um den Wirt in angemessener Weise von fremden Eindringlingen, wie Bakterien oder Viren, schützen zu können. Ein ausgezeichneter Überblick über das Abwehrsystem wird gegeben von Eisen, H.W. (in: Microbiology, 3. Aufl., Hsg. Harper & Row, Philadelphia, PA [1980], S. 290-295 und 381 bis 418). Sie müssen in der Lage sein, an Endothelzellen einer beginnenden Entzündung wandern können. Außerdem müssen sie an antigenaufweisenden Zellen haften, so daß eine normale spezifische Immunreaktion erfolgen kann, und schließlich müssen sie an geeigneten Zielzellen haften, so daß die Lyse von vireninfizierten oder Tumorzellen erfolgen kann.
In jüngster Zeit wurden Leukozytenoberflächenmoleküle identifiziert, die an der Vermittlung einer solchen Haftung beteiligt sind, dazu wurde die Hybridom-Tcchnik angewendet. Kurz gesagt, es wurden monoklonale Antikörper identifiziert, die gegen menschliche T-Zehen (Davignon, D. u.a., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:4535-4539 [1981]) und Milzzellen der Maus (Springer, T. u.a., Eur. J.Immunol.9:301-306 [1979]) gerichtet sind, die sich an Leukozytenoberflächen binden und die oben beschriebenen haftungsbezogenen Funktionen unterbinden (Springer, T. u.a., Fed. Proc.44: 2660 bis 2663 [1985J). Die durch diese Antikörper identifizierten Moleküle wurden als Mac-1 und lymphozytfunktionsassoziiertes Antigen-1 (LFA-1) bezeichnet. Mac-1 ist ein Heterodimer, das an Makrophagen, Granulozyten und großen granulären Lymphozyten gefunden wird. LFA-1 ist ein Heterodimer, das an den meisten Lymphozyten vorhanden ist (Springer, T.A. u.a., Immunol.Rev.68:111-135 [1982]). Diese beiden Moleküle sowie ein drittes Molekül, ρ 150,95 (mit einer ähnlichen Gewebeverteilung wie Mac-1), spielen eine Rollo bei der Zellhaftung (Keizer, G. u.a., Eur.J.;nvtiunol.15:1142-1147 [1985]).
Es wurde festgestellt, daß die oben beschriebenen Leukozytenmoleküle Glieder einer verwandten Familie von Glykoproteinen sind (Sanchez-Madrid, F. u.? . J.Exper.Med.158:1785-1803); (Keizer, G. u.a., Eur.J.lmmunol.15: Ί142 bis 1147 [1985]). Diese Familie von Glykoproteinen besteht aus Heterodimeren, die sich aus einer Alphaketto und einer Betakette zusammensetzen. Während sich die Alphaketten der einzelnen Antigene voneinander unterscheiden, wurde festgestellt, daß die Betakette im hohen Maße gleichbleibend ist (Sanchez-Madrid, F. u.a., J. Exper.Med.158; 1785 bis 1803 [1983]). Es wurde festgestellt, daß die Betakette der Proteinfamilie (die manchmal auch als „CD 10" bezeichnet wird) ein Molekulargewicht von 95kd hat, während das der Alphaketten zwischen 150kd und 180kd variierte (Springer, T., Fed.Proc.44: 2660-2663 [1985]). Obwohl die Alpha-Untereinheiten der Membranproteine die weitgehende Homologie der Beta-Untereinheiten nicht teilen, hat eine genaue Analyse der Alpha-Untereinheiten der Glykoproteine ergeben, daß sie beachtliche Ähnlichkeiten aufweisen. Ein Überblick über die Ähnlichkeiten zwischen den Alpha- und Beta-Untereinheiten wurde von Sanchez-Madrid, F. u.a., gegeben (J. Exper.Med. 158: 586-602 [1983], J.Exper.Med. 158:1785 bis 1803 [1983]).
Es wurde eine Gruppe von Personen ermittelt, die nicht in der Lage waren, normale Mengen der Glieder dieser Adhäsionsproteinfamilie auf der Leukozytenzelloberf lache zu expressieren (Anderson, D. C. u.a., Fed. Proc.44: 2671 bis 2677 [1985]; Anderson, D.C. u.a., J.Infect. DIs. 152:669-689 [1985]). Lymphozyten von diesen Patienten wiesen In vitro-Dafekte auf, die denen normaler Personen ähnlich waren, deren LFA-1-Familie von Molekülen durch Antikörper beeinflußt worden war.
Außerdem waren cHse Personen nicht in der Lage, auf Grund der Unfähigkeit ihrer Zellen, an Zellsubstraten zu haften, eine normale Immunroaktion hervorzubringen (Anderson, D.C. u.a., J.Infect.DIs. 162:668bis689 [19851; Anderson, D.C. u.a., Fed. Proc. 44: 2671 bis 2677 [1985]). Diese Angaben zeigen, daß Immunreaktionen abgeschwächt werden, wenn Lymphozyten nicht in der Lage sind, auf Grund des Fehlens der Funktionsadhäsionsmoleküle der LFA-1 -Familie auf normale Weise zu haften. Zusammenfassend kann also gesagt werden, daß die Fähigkeit der Lymphozyten, Gesundheit und Lebensfähigkeit eines Tieres zu erhalten, es erfordert, daß diese an anderen Zollen (beispielsweise an Endothelzellen) haften können, Es wurde festgestellt, daß dieses Haften Zell-Zell-Kontakte bedingt, an denen spezifische Rezeptormoleküle beteiligt sind, die an der Zelloberfläche der Lamphozyten in der Lage, an Endothelzellen, an anderen Lymphozyten sowie an anderen nichtvaskulären Zellen zu haften. Es wurde festgestellt, daß die Rezeptormoleküle der Zelloberfläche eng miteinander verwandt sind. Menschen, deren Lymphozyten diese Zelloberflächenrezeptorenmoleküle fehlen, weisen chronische und wiederkehrende Infektionen sowie andere klinische Symptome, einschließlich einer unzuieichenden Antikörperreaktion, auf.
Da die Lymphozytenadhäsion an dem Prozeß beteiligt ist, durch den fremdes Gewebe erkannt und abgestoßen wird, ist das Verständnis dieses Prozesses von entscheidender Bedeutung auf den Gebieten der Organtransplantation, der Gewebeverpflanzung, der Allergie und der Onkologie.
Ziel der Erfindung
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden pharmakologisch äußerst wertvolle lösliche funktioneile Derivate von ICAM-1 zur Verfügung gestellt.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, interzellulare Adhäsionsmoleküle aufzufinden, durch welche Populationen von Lymphoz /ten zellulare Substrate erkennen und an diesen haften, so daß sie zu Entzündungsstellen wandern können und mit den Zellen bei entzündlichen Reaktionen ι eagieren können, sowie Verfahren zur Herstellung von löslichen, funktioneilen ICAM-1-Derivaten zur Verfugung zu stellen.
Die Erfindung betrifft dan interzellulare Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) sowie dessen Funktionsderivate. Die Erfindung betrifft außerdem Antikörper und Fragmente von Antikörpern, welche die Funktion von ICAM-1 unterbinden können, sowie andere Inhibitoren der ICAM-1-Funktion, und sie betrifft Analysen, mit denen diese Inhibitoren identifiziert werden können. Außerdem betrifft die Erfindung diagnostische und therapeutische Anwendungen der oben beschriebenen Moleküle.
Im einzelnen betrifft die Erfindung das interzellulare Adhäsionsmolekül ICAM-1 oder dessen funktioneile Derivate, die im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten sind. Außerdem betrifft die Erfindung die Moleküle, die zusätzlich in der Lage sind, sich an ein auf der Oberfläche eines Lymphozyten vorhandenen Moleküls zu binden.
Die Erfindung betrifft außerdem das interzellulare Adhäsionsmolekül ICAM-1 und dessen Derivate, die nachweisbar markiert
Außerdem betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das in der Lage ist, ICAM-1. oder dessen funktionelles Derivat zu expressieren.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Gewinnung von ICAM-1 in einer im wesentlichen reinen Form, welche aus den folgenden Schritte" *:-3teht:
(a) Solubilisierung von ICAM-1 aus den Membranen von Zellen, welche ICAM-1 expressieren, um ein solubilisiertes ICAM-1-Präparat herzustellen,
(b) Einführung des solubilisierten ICAM-1-Präparats in eine Aflinitätsmatrix, wobei die Matrix Antikörper enthält, die sich an ICAM-1 binden können,
(c) Ermöglichung der Bindung von ICAM-1 an den Antikörper der Affinitätsmatrix,
(d) Entfernung jeder Verbindung, die nicht in der Lage ist, den Antikörper zu binden, aus der Matrix und
(e) Gewinnung des ICAM-1 in im wesentlichen reiner Form durch Eluieren von ICAM-1 aus der Matrix.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Antikörper, der sich an ein Molekül binden kann, das aus der aus ICAM-1 und einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 bestehenden Gruppe ausgswählt wurde. Die Erfindung schließt außerdem eine Hybridomzelie ein, die in der Lage ist, einen solchen Antikörper zu produzieren.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Hybridomzelie, die in der Lage ist, den monoklonalen Antikörper R6-5-D6 zu produzieren. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren für die Produktion einer gewünschten Hybridomzelie, welche einen Antikörper produziert, der in der Lage ist, sich an das Molekül ICAM-1 zu binden, welches aus den folgenden Schritten besteht:
(a) Immunisierung eines Tieres mit einer Zelle, die ICAM-1 expressiert,
(b) Verschmelzen der Milzzellen des Tieres mit einem Myelomzellstamm,
(c) Ermöglichung der Bildung von antikö r^ersekrotierenden Hybridomzellen durch die verschmolzenen Milz- und Myelomzellen und
(d) „Screening" der Hybridomzellen nach der gewünschten Hybridomzelie, die einen Antikörper produzieren kann, sie in der Lage ist, sich an ICAM-1-zu binden.
Die Erfindung betrifft auch die Hybridomzelie und den durch die Hybridomzelie produzierten Antikörper, die nach der obigen Methode gewonnen wurden.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Identifizierung eines Nichtimmunoglobulin-Antagonisten der interzellularen Adhäsion, die folgende Schritte umfaßt:
(a) Inkubation eines Nichtimmunoglobulin-Agens', das ein Antagonist der interzellularen Adhäsion sein kann, mit einem Lymphozytenpräparat, wobei das Lympho?ytenpräparat eine Vielzahl von Zellen enthält, die aggregieren oder sich zusammenballen können;
(b) Überprüfung des Lymphozytenpräparats, um festzustellen, ob das Vorhandensein des Agens' die Zusammenballung der
ausreichende Menge eines entzündungshemmenden Mittels zur Unterdrückung der Entzündung zu verabreichen; dabei wirddas entzündungshemmende Mittel aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus einem Antikörper, der sich an ICAM-1 bindenkann; einen Fragment eines Antikörpers, welches in der Lage ist, sich an ICAM-1 zu binden; ICAM-1; einem funktionellon Derivatvon ICAM-1 und einem Nichtimmunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
die Zelle zur Wanderung ein funktionelles Glied der LFA-1-Familie braucht, wobei diese Methode darin besteht, einem Patienten,der eine solche Behandlung braucht, eine ausreichende Menge eines entzündungshemmenden Mittels zur Unterdrückung der
einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 und einem Nichtimmunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
als LFA-1 ist.
welche darin besteht, einem Patienten, der eine soiche Behandlung braucht, eine ausreichende Menge eines Toxins zur
toxinabgeleitoten Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann; einem toxinabgeleiteten Fragment eines Antikörpers, welchessich an ICAM-1 binden kann; einem toxinabgeleiteten Glied der LFA-1-Familie von Molekülen und einem toxinabgeleitetenfunktioneilen Derivat eines Gliedes der LFA-1-Familie von Molekülen.
welche darin besteht, einem Patienten, der eine solche Behandlung braucht, eine ausreichende Menge eines Toxins zur
toxinabgeleiteten ICAM-1 und einem toxinabgeleiteten funktioneilen Derivat in ICAM-1 besteht.
welche aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems bei Säugern entspricht, bei denen eine solche Entzündung vermutetwird, wobei diese Methode besteht aus
(a) dem Verabreichen einer Zusammensetzung, welche einen nachweisbar markierten Bindungsliganden enthält, der eine Zelle identifizieren kann, die ICAM-1 expressiert, an eine Person und
(b) Nachweisen des Bindungsliganden.
Außerdem sieht die Erfindung eine Methode vor zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer Entzündung, die aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems resultiert, bei einem Säuger, bei dem eine solche Entzündung vermutet wird, die darin besteht,
(a) eine Gewebeprobe der Person mit einer Zusammensetzung zu inkubieren, die einen nachweisbar markierten Bindungsliganden enthält, der eine Zelle identifizieren kann, die ICAM-1 expressiert, und
(b) den Bindungsliganden nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer ICAM-1 -expressiei enden Turmorzelle in einem Säuger, bei dem eine solche Zelle vermutet wird, welche darin besteht,
(a) der Person eine Zusammensetzung zu verabreichen, welche einen nachweisbar markierten Bindungsliganden enthält, der sich an ICAM-1 binden kann, wobei der Ligand aus der Gruppo ausgewählt wird, die aus einem Antikörper und einem Fragment eines Antikörpers besteht, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-1 zu binden, und
(b) den Bindungsliganden nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer ICAM-1 -expressierenden Tumorzelle in einem Säuger, bei dem eine solche Zelle vermutet wird, welche darin besteht,
(a) eine Gewebeprobe der Person mit einer Zusammensetzung zu inkubieren, die einen nachweisbar markierten Bindungsliganden enthält, der ICAM-1 binden kann, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Antikörper und einem Fragment eines Antikörpers besteht, wobei das Fragment in der Lage ist, sich an ICAM-1 zu bindan, und
(b) den Bindungsliganden nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer Turmorzelle, welche ein Glied der LFA-1-Familie von Mc lekülen in einer Person expressiert, bei der eine solche Zelle vermutet wird, welche darin besteht,
(a) einer Person eine Zusammensetzung zu verabreichen, die einen nachweisbar markierten Bindungsliganden enthält, der sich an ein Glied der LFA-1 -Familie von Molekülen binden kann, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ICAM-1 und einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 besteht, und
(b) den Bindungsliganden nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer Tumorzelle, die ein Glied der LFA-1-Familie von Molekülen in einer Person expressiert, bei der eine solche Zelle vermutet wird, welche darin besteht,
(a) eine Gewebeprobe der Person bei Vorhandensein eines nachweisbar markiarten Bindungsliganden zu inkubieren, der in der Lage ist, sich an ein Glied der LFA-1-Familie von Molekülen zu binden, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ICAM-1 und einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 besteht, und
(b) den Bindungsliganden nachzuweisen, der an ein Glied der LFA-1 -Familie von Molekülen gebunden ist, die in der Gewebeprobe vorhanden sind.
(a) einem entzündungshemmenden Agens, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt wurde: einem Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann; einem Fragment eines Antikörpers, welches sich an ICAM-1 binden kann; ICAM-I, einem funktionell Derivat von ICAM-1 und einem Nichtimmunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1, und
(b) wenigstens einem immunosuppressiven Agens, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Dexamethason, Azathioprin und Zyklosporin A besteht.
Ausführungsbelsplole
Kurze Beschreibung der Ausbildungen:
Abb. 1 zeigt in schematische Form die Adhäsion zwischen einer normalen und einer LFA-1-defizienten Zelle.
Abb. 2 zeigt in schematicher Form den Vorgang der Normal-ZNormalzellonadhäsion.
Abb. 3 zeigt die Kinetik der Zellularzusammenballung beim Fehlen (X) oder Vorhandensein von 50ng/ml PMA (O).
Abb.4 zeigt die Koaggregation zwischen LFA-1 ~- und LFA-1+-Zellen. Mit Karboxyfluoreszeindiazetat markierte, EBV-transformierte Zellen (104), wie si? in der Abbildung bezeichnet sind, wurden mit 10s unmarkierten, autologen Zellen (massive Balken) oder JY-Zellen (offene Balken) bei Vorhandensein von PMA gemischt. Nach 1,5 Stunden wurden die marktiertsn Zellen, als Aggregate oder frei, unter Anwendung der qualitativen Analyse nach Beispiel 2 numeriert.. Es wird der Prozentsatz der markierten Zellen in Aggregaten gezeigt. Es wird eines von zwei repräsentativen Experimenten gezeigt.
Abb.5 zeigt d'o Immunoausfällung von ICAM-1 und LFA-1 aus JY-Zellen. Triton-X-100-Lysate von JY-Zellen (Bahnen 1 und 2) oder Kontroll-Lysepuffer (Bahnen 3 und 4) wurden mit Antikörper immunoausgefällt, der sich an ICAM-1 binden kann (Bahnen 1 und 3), oder mit Antikörpern, die sich an LFA-1 binden können (Bahnen 2 und 4). Tafel A zeigt Ergebnisse unter r< duziorenden Bedingungen; Tafel B zeigt Ergebnisse, die unter nichtrcduzierenden Bedingungen ermittelt wurden. Die Molekulargewichtsstandards wurden in Bahn Sausgeführt.
Abb. 6 zeigt die Kinetik der IL-I- und Gamma-Interferon-Wirkungen auf die ICaM-1-Expression bei menschlichen Dermalfibroblasten. Menschliche Dermalfihroblaste wurden bis zu einer Dichte von 8 χ 104 Zellen/0,32cm2 Vertiefung gezogen Es wurden IL-I (10 Einheiten/ml, geschlossene Kreise) oder rekombinantes Gamma-Interferon (10 Einheiten/ml, offene Rechtecke) zugesetzt, und zum angegebenen Zeitpunkt wurde die Probe auf 4 "C f^ühlt und eine indirekte Bindungsanalyse durchgeführt. Die Standardabweichung überstieg 10% nicht.
Abb. 7 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit derlL-1- und Gamma-Interferon-Wirkungen auf ICAM-1. Menschliche Hautfibroblaste wurden auf eine Dichte von 8 x 104 Zellen/0,32cm2 Vertiefung gezogen. IL-2 (offener Kreis), rekombinantes menschliches IL-1 (offenes Rechteck), rekombinantes Mäuse-IL-1 (massives Rechteck), rekombinantes menschliches Gamma-Interferon (massive Kreise) und rekombinantes Beta-Interferon (offenes Dreieck) wurden in der angegebenen Verdünnung zugesetzt und für die Dauer von 4 Stunden (IL-1) oder 16 Stunden (Beta- und Gamma-Interferon) inkubiert. Die angegebenen Ergebnisse sind dia Mittelwerte von Vierfachbestimmungen; dje Standardabweichung überschritt 10% nicht.
Abb.8 zeigt die Nukleotid- und Aminosäurefolge von ICAM-1-cDNA. Das erste ATG befindet sich in Position 58. Translaterierte Folgen, die ICAM-1 -Tryptinpeptiden entsprechen, sind unterstrichen. Die hydrophoben vermutlichen Signalpeptid- und Transmembranfolgen wurden stark unterstrichen. N-gekoppolte Glykosylationsstellen sind mit einem Kästchen versehen. Das Polyadenylationssignal AATAAA in der Position 2976 ist oben mit einem Strich versehen. Die gezeigte Folge steht für den HL-60-cDNA-Klon. Die Endothelzellen-cDNA wurde über dem größten Teil der Länge sequenziert und wies nur geringe Differenzen auf.
Abb. 9 zeigt die ICAM-I-homologen Domänen und das Verhältnis zur Immunoglobulin-Supergen Familie. (A) Ausrichtung von 5 homologen Domänen (D1 -5). Zwei oder mehr identische Reste, die ausgerichtet sind, sind mit einem Kästchen versehen. Reste, die zwei- oder mehrmals in NCAM-Domänen erhalten sind, sowie Reste, die in Domänen der Sätze C2 und C1 erhalten sind, wurden mit den ICAM-1-internen Wiederholungen ausgerichtet. Die Lage der vorhergesagten ß-Stränge in der ICAM-1-Domäne ist mit Balken und Kleinbuchstaben über den Ausrichtungen gekennzeichnet, und die bekannte Lage der ß-Stränge in Immunoglobulin-C-Bereichen ist mit Balken und Großbuchstaben unter der Ausrichtung gekennzeichnet. Die Position oo. mutmaßlichen Disulfidbrücke innerhalb der ICAM-1 -Domänen wird durch S-S bezeichnet. (B-D) Ausrichtung von Proteindomänen, die homolog zu den ICAM-1 -Domänen sind; Proteine wurden zunächst durch Absuchen von NBRF-Datonbasen unter Anwendung des FASTP-Programms ausgerichtet. Die Proteinfolgen sind MAG, NCAM, T-Zellenrezeptor-Alpha-Untereinheits-V-Domäne, IgMp-Kette und Alpha-1-B-Glykoprotein.
Abb. 10 zeigt einen schematischen Vergleich dor Sekundärstrukturen von ICAM-1 und MAG.
Abb. 11 zeigt die Bindung von LFA-1-positiven, EBV-transformierten B-Lymphoblastoidzellen an ICAM-1 in planaren Membranen.
Abb. 12 zeigt die Bindung von LFA-1-positiven T-I.ymphoblasten und T-Lymphomzellen an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen.
Abb. 13 zeigt die Unterbindung der Bindung von JY-B-Lymphoblastoidzellen an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen durch Vorbehandlung der Zellen oder Bläschen mit monoklonalen Antikörpern.
Abb. 14 zeigt die Wirkung der Tempeiatur auf die Bindung von T-Lymphoblasten an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen.
Abb. 15 zeigt die zweiwertigen Kationenanforderungen für die Bindung von T-Lymphoblasten an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen.
Abb. 16 zeigt die Wirkung von Antiadhäsionsantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren mononukloaren Blutzellen, sich in Reaktion auf die Erkennung des T-zellenassoziierten Antigens OKT3 zu vermehren. „OKT3" gibt den Zusatz des Antigens an.
Abb. 17 zeigt die Wirkung von Antiadhäsionsantikörporn auf die Fähigkeit von peripheren mononuklearen Blutzellen, sich in Reaktion auf die Erkennung des nichtspezifischen T-Zellenrnitogens, Concanavalin A, zu vermehren. „CONA" gibt den Zusatz von Concanavalin A an.
Abb. 18 zeigt die Wirkung von Antiadhäsionsantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren mononuklearen Blutzellen, sich in Reaktion auf die Erkennung des „keyhole'-Napfschneckenhämozyaninantigens zu vermehren. Der Zusatz des „keyhole"-Napfschnecken-Hämozyanins zu den Zellen wird durch „KLH" gekennzeichne·.
Abb. 19 zeigt die Wirkung von Antiadhäsionsantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren mononuklearen Blutzellen, sich in Reaktion auf die Erkennung des Tetanustoxoidantigens zu vermehren. Der Zusatz des Tetanustoxoidantigens zu den Zellen wird durch „AGN" gekennzeichnet.
Abb.20 zeigt die Bindung der monoklonalen Antikörper RR1/1, R6.5, LB2 unr! CL203 an ICAM-1-Deletionsmutanten.
Abb. 21 zeigt die Bindung von ICAM-1-Deletionsmutanten an LFA-1.
Abb. 22 zeigt die Epitope, die durch die monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1, R6.5, LB2 und CL203 erkannt wurden.
Abb.23 zeigt die Bindungskapazität der Mutanten der ICAM-1-Domäne 2 an LFA-1.
Abb. 24 zeigt die Bindungskapazität von Mutanten der ICAM-1-Domäne 3 an LFA-1.
Abb. 25 zeigt die Bindungskapazität der Mutanten der ICAM-1-Domäne 1 an LFA-1.
Abb. 26 zeigt die Ausrichtung der ICAM-Aminoterminaldomänen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung eines natürlichen Bindungsliganden an LFA-1. Moleküle wie die der LFA-1-Familie, die am Vorgang der Zelladhäsion beteiligt sind, werden als „Adhäsionsmoleküle" bezeichnet. Der natürliche Bindungsligand der vorliegenden Erfindung wird als „interzellulares Adhäsionsmolekiil-I" oder „ICAM-1" bezeichnet. ICAM-1 ist ein Glykoprotein von 76 bis 97kd. ICAM-1 ist kein Heterodimer. Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ICAM-1 und dessen „funktioneile Derivate". Ein „funktionelles Derivat" von ICAM-1 ist eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (funktionell oder strukturell) aufweist, die im wesentlichen einer biologischen Aktivität von ICAM-1 ähnlich ist. Der Begriff „funktioneile Derivate" soll „Fragmente", „Varianten", „Analoge" oder „chemische Derivate" eines Moleküls einschließen. Unter einem „Fragment" eines Moleküls wie ICAM-1 versteht man jede Polypeptiduntermengu des Moleküls. Besonders bevorzugt werden Fragmente von ICAM-1, die ICAM-1-Aktivität haben und löslich (d.h. nicht membrangebunden) sind. Unter einer „Variante" eines Moleküls wie ICAM-1 versteht man ein Molekül, das in Struktur und Funktion entweder dem gesamten Molekül oder dessen Fragment im wesentlichen ähnlich ist. Man bezeichnet ein Molekül als einem anderen Molekül „im wesentlichen ähnlich", wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen haben oder wenn beide Moleküle eins ähnliche biologische Aktivität aufweisen. So werden zwei Moleküle, wenn sie eine ähnliche Aktivität aufweisen, als Varianten betrachtet, da dieser Begriff in vorliegender Anmeldung selbst dann verwendet wird, wenn die Struktur des einen Moleküls nicht im anderen gefunden wird oder wenn die Folge der Aminosäurereste nicht identisch ist. Unter einem „Analog" eines Moleküls wie ICAM-1 versteht man eine. .olekül, das in der Funktion entweder dem gesamten Molekül oder dessen Fragment im wesentlichen ähnlich ist. In der vorliegenden Anwendung bezeichnet man ein Molekül als ein „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es zusätzlich chemische Komponenten enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Kor ponenten können die Solubilität, Absorption, biologische Halbwertszeit des Moleküls usw. verbessern. Als Alternative dazu können die Komponenten die Toxizität des Moleküls herabsetzen, eine mögliche unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls ausschalten oder dämpfen usw. Komponenten, die eine solche Wirkung herbeiführen können, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben. „Toxinabgeleitete" Moleküle stellen eine Sonderklasse der „chemischen Derivate" dar. Ein „toxinabgeleitetes" Molekül ist ein Molekül (wie ICAM-1 oder ein Antikörper), das eine Toxinkomponente enthält. Die Bindung eines solchen Moleküls an eine Zelle bringt die Toxinkomponente in unmittelbare) Nähe der Zelle und fördert damit das Absterben der Zelle. Es kann jede geeignute Toxinkomponente eingesetzt werden; vorteilhaft ist es jedoch, solche Toxine wie beispielsweise das Rinzintoxin, das Diphtherietoxin, radioisotopische Toxine, membrankanalbildende Toxine usw. einzusetzen. Verfahren zur Kopplung solcher Komponei ten an ein Molekül sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Ein antigenes Molekül wie ICAM-1 oder Glieder der LFA-1-Familie von Molekülen werden natürlicherweise auf der Oberfläche von Lymphozvten expressiert. So führt die Einführung von solchen Zellsn in ein geeignetes Tier, beispielsweise durch intraperitoneale Injektion usw., zur Produktion von Antikörpern,die in der Lage sind, sich an ICAM-1 oder Glieder der LFA-1-Familie von Molekülen zu binden. Auf Wunsch kann das Serum eines solchen Tieres entfernt und als Quelle für polygonale
Antikörper genutzt werden, die diese Moleküle binden können. Vorteilhaft ist es jedoch, die Splenozyten von solchen Tieren zu entfernen, um solche Milzzellen mit einem Myelomzellstamm zu verschmelzen, und eine Bildung von Hybridomzellen, die monoklonalen Antikörper sekretieren, welche sich an ICAM-1 oder Glieder der LFA-1-Familie von Molekülen binden können, zuzulassen.
Die auf oben beschriebene Weise gewonnenen Hybridomzellen können nach eine Reihe von Methoden „screeniert" werden, um gewünschte Hybridomzellen zu identifizieren, welche Antikörper sekretieren, die sich entweder an ICAM-1 oder an Glieder der LFA-1-Familie von Molekülen binden können.
Bei einer bevorzugten „Screening'-Analyse werden derartige Moleküle anhand ihrer Fähigkeit identifiziert, die Aggregation oder Zusammenballung von Zellen zu unterbinden, die mit dem Epstoin-Barr-Virus transformiert wurden. Antikörper, die diese Aggregation unterbinden können, werden dann weiter „screeniert", um festzustellen, ob sie diese Aggregation durch Bindung an ICAM-1 oder an ein Glied der LFA-1 -Familie von Molekülen unterbinden. Bei einem solchen „Screening" kann jed^s Mittel angewendet werden, mit dem ICAM-1 von der LFA-1-Familie von Molekülen unterschieden werden kann. Beispielsweise kann das durch den Antikörper gebundene Antigen durch Immunoausfällung und Polyakrylamidgelelektrophorese analysiert werden. Wenn das gebundene Antigen ein Glied der LFA-1-Familie von Molekülen ist, kann man feststellen, daß das immunoausgefällte Antigen ein Dimer ist, während eine einzelmolekulargewichtige Spezies immunoausgefällt werden muß, wenn das gebundene Antigen ICAM-1 ist. Als Alternative dazu kann man zwischen den Antikörpern, die sich an Glieder der LFA-1-Familie von Molekülen binden, und denen, die sich an ICAM-1 binden, durch „Screening" nach der Fähigkeit des Antikörpers unterscheiden, sich an solche Zellen wie Granulozyten zu binden, die LFA-1, nicht aber ICAM-1 exprossieren. Die Fähigkeit eines Antikörpers (von dem bekannt ist, aaß er die Zellaggregation unterbindet), sich an Granulozyten zu binden, gibt an, daß der Antikörper in der Lage ist, LFA-1 zu binden. Das Fehlen einer solchen Bindung ist einHinweis auf einen Antikörper, der ICAM-1 erkennen kann. Die Fähigkeit eines Antikörpers, sich an eine Zelle wie eine Granuolozyte zu binden, kann durch Mittel nachgewiesen werden, wie sie allgemein auf diesem Gebiet angewendet werden. Zu diesen Mitteln gehören die Immunanalyse, die Zellagglutination, Filterbindungsuntersuchungen, Antikörperausfällung usw.
Alternativ dazu können die Antiaggregationsantikörper nach der vorliegenden Erfindung anhand der Messung ihrer Fähigkeit identifiziert werden, sich differentiert an Zellen zu binden, welche ICAM-1 expressieren (wie beispielsweise aktivierte Endothelzellen), und ihrer Fähigkeit, sich an Zellen zu binden, die ICAM-1 nicht expressieren. Wie Fachleute leicht erkennen werden, können die oben genannten Analysen modifiziert oder in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden, um eine Vielzahl von potentiellen „Screening"-Analysen zu ergeben, von denen jede einzelne in der Lage ist, Antikörper, die sich an ICAM-1 binden können, im Vergleich zu Gliedern der LFA-1-Familie von Molekülen zu identifizieren und zwischen diesen zu unterscheiden.
Die entzündungshemmenden Mittel der vorliegenden Erfindung können durch natürliche Prozesse (wie beispielsweise die Induzierung eines Tieres, einer Pflanze, von Pilzen, Bakterien usw., einen Nichtimmunoglobulin-Antagonisien von ICAM-1 zu produzieren, oder durch Induzierung eines Tieres, um polyklonale Antikörper zu produzieren, die sich an ICAM-1 binden können); durch synthetische Methoden (wie beispielsweise durch Anwendung der Meerifield-Methode zur Synthetisierung von Polypeptiden zum Synthetisieren von ICAM-1, funktlonellen Derivaten von ICAM-1 oder Protein-Antagonisten von ICAM-1 [Immunoglobulin oder Nichtimmunoglobulin)); durch die Hybridom-Technik (wie beispielsweise die Produktion von monoklonalon Antikörpern, die sich an ICAM-1 binden können) ocer durch die Rekombinant-Technik (wie beispielsweise die Produktion der entzündungshemmenden Mittel nach der vorliegenden Erfindung In verschiedenen Wirten [d. h., Hefe, Bakterien, Pilzen, gezüchteten Säugerzellen usw.] oder aus rekombinanten Plasmiden oder Virenvektoren) gewonnen werden. Die Auswahl der anzuwendenden Methode ist von solchen Faktoren wie Angemessenheit, gewünschte Ausbeute usw. abhängig. Es ist nicht notwendig, mit nur einer der oben beschriebenen Methoden, Prozesse) oder Techniken zu arbeiten, um ein bestimmtes entzündungshemmendes Mittel herzustellen; die oben beschriebenen Methoden, Prozesse und Techniken können kombiniert werden, um ein bestimmtes entzündungshemmendes Mittel zu gewinnen.
A. Identifizierung des LFA-1-Bindungspartners (ICAM-1)
1. Analysen der LFA-1-abhänglgon Aggregation
Viele durch den Epstein-Barr-Virus transformierte Zellen weisen Aggregation auf. Diese Aggregation kann bei Vorhandensein von Phorbolestern verstärkt werden. Es wurde festgestellt, daß diese homotypische Aggregation (d. h. die Aggregation unter Beteiligung nur eines Zelltyps) durch Anti-LFA-1 -Antikörper blockiert wird (Rothlein, R. u.a., J. Exper. Med. 163:1132-1149 [1986]), dieser Literaturhinweis wird als Referenz einbezogen. Also kann das Ausmaß der LFA-1-abhängigen Bindung durch Bestimmung des Ausmaßes der spontanen oder phorbolesterabhängigen Aggregatbildung bestimmt werden. Ein Agens, das eine LFA-1-abhängige Aggregation behin Jert, kann unter Anwendung einer Analyse identifiziert werden, mit welcher bestimmt werden kann, ob das Agens die spontane oder die phorbolesterabhängige Aggregation von durch den Epstein-Barr-Virus tiansformierten Zellen behindert. Die meisten durch den Epstein-Barr-Virus transformierten Zellen können bei einer solchen Analyse eingesetzt werden, solange die Zellen in der Lage sind, das LFA-1-Rezeptormolekül zu expressieren. Derartige Zellen können nach der Methode von Springer, T. A. u.a., J. Exper. Med. 166.1901-1918 (1984) hergestellt werden, wobei dieser Literaturhinweis hier als Referenz einbezogen wird. Zwar kann bei der LFA-1 -abhängigen Bindungsanalyse nach der vorliegenden Erfindung jede dieser Zellen eingesetzt werden, man zieht es aber vor, Zellen des JY-Zellstammes zu verwenden (Terhost, C. T. u. a., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 73:910 [1176]). Die Zellen können in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden; vorteilhafter ist es jedoch, die Zellen in RMPI-1640-Kulturmedium, das durch 10% fötales Kälberserum und 50Mg/mI Gentamycin (Gibco Laboratories, NY) ergänzt ist, zu züchten. Die Zellen sollten unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Vermehrung von Säugerzellen geeignet sind (d. h. bei einer Temperatur von allgemein 37 0C, in einer Atmosphäre von 5% COj, bei einer relativen Feuchtigkeit von 95% usw.).
2. LFA-1-Bindung an ICAM-1
Es wurden Menschen ermittelt, bei deren Lymphozyten die Familie der LFA-1-Rezeptormoleküle fehlt (Anderson, D.C. u.a., Fed. Proc. 44:2671-2677 [1985]; Anderson, D.C. u.a., J. Infect. DIs. 152:668-689 [1985]). Man sagt, daß diese Menschen an einem Leukozytenadhäsionsdefekt (LAD) leiden. EBV-transformierte Zellen solcher Personen ballen sich weder spontan noch bei
Vorhandensein von Phorbolestern bei der obGn beschriebenen Aggregationsanalyse zusammen. Werden solche Zellen mit LFA-1 -exprestierenden Zellen gemischt, konnte eine Aggregation beobachtet werden (Rothlein, R. u.a., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 [1986]) (Abb. 1). Wichtig ist.daß eich diese Zusammenballungen nicht bildeten, wenn diese Zellen bei Vorhandensein von Anti-LFA-1-Antikörpern inkubiert wurden. Folglich verlangte zwar die Aggregation das Vorhandensein von LFA-1, die Fähigkeit der LFA-1-defekten Zellen, Zusammenballungen mit LFA-1-haltigen Zellen zu bilden, wies jedoch darauf hin, daß der LFA-1 -Bindungspartner nicht LFA-1, sondern vielmehr ein bisher unentdecktes Zeiladhäsionsmolekül war. Abb. 1 zeigt den Mechanismus der Zelladhäsion.
Das neuartige interzellulare Adhäsionsmolekül ICAM-1 wurde zuerst nach dem Verfahren von Rothlein, R. u.a., (J. Immunol. 137: 1270-1274 [1986]), identifiziert und teilweise charakterisiert, und dieser Literaturhinweis wird hier als Referenz einbezogen. Um das ICAM-1-Molekül nachzuweisen, wurden aus Milzzellen von Mäusen, die mit Zellen von Personen immunisiert worden waren, die einen genetischen Dgfekt in der LFA-1-Expression aufwiesen, monoklonal Antikörper hergestellt. Die resultierenden Antikörper wurden nach ihrer Fähigkeit „screeniert", die Aggregation von LFA-1-expressierenden Zellen zu unterbinden (Abb. 2). Im einzelnen wurden das ICAM-1-Molekül betreffend, Mäuse mit EBV-transformierten B-Zellen von LAD-Patienten immunisiert, welche nicht das LFA-1 -Antigen expressieren. Anschließend wurden die Milzzellen dieser Tiere entfernt, mit Myelomzellen verschmolzen, und es wurde zugelassen, daß sie zu Hybridomzellen wurden, die monoklonal Antikörper bilden. Anschließend wurden bei Vorhandensein des monoklonalon Antikörper der Hybridomzelle EBV-transformierto B-Zellen von normalen Personen, welche LFA-1 expressieren, inkubiert, um mögliche monoklonal Antikörper zu identifizieren, die in der Lage waren, die phorbolestervermittelto, LFA-1-abhängige, spontane Aggregation von EBV-transformierten B-Zellen zu unterbinden. Da die Hybridomzellen von Zellen abgeleitet wurden, die niemals auf das LFA-1 -Antigen gestoßen waren, wurden keine monoklonalen Antikörper zu LFA-1 produziert.
Folglich muGte jeder ermittelte Antikörper, der die Aggregation unterband, in der Lage sein, sich an ein Antigen zu binden, das zwar nicht LFA-1 war, aber an dem LFA-1 -Adhäsionsproz.iß beteiligt war. Zwar kann jede Methode zur Gewinnung solcher monoklonalen Antil.örper angewendet werden, vorteilhaft ist es aber, ICAM-1-bindende monoklonal Antikörper durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen zu gewinnen, wobei die von Rothlein, R. u.a. (J. Immunol. 137:1270-1274 [1986]), beschriebenen Routen und Abläufe bei durch den Epsteln-Barr-Virus transformierten peripheren, mononuklearen Blutzellen von LFA-1-defizienten Personen anzuwenden sind. Solche Zellen werden von Springer, T.A. u.a. (J. Exper. Med. 160:1901-1918 [1984]), offengelegt.
Bei einer bevorzugten Methode für die Erzeugung und den Nachweis von Antikörpern, die sich an ICAM-1 binden können, wurdon Mäuse entweder mit EBV-transformierten Zellen, welche sowohl ICAM-1 als auch LFA-1 expressieren, oder vorzugsweise mit TNF-aktivierten Endothelzellen, welche ICAM-1, nicht aber LFA-1 expressieren, immunisiert. Bei der am meisten bevorzugten Methode zur Erzeugung von Hybridomzellen, die Anti-ICAM-1 -Antikörper produzieren, wurde eine Balb/c-Maus nacheinander mit JY-Zellen und mit differenzierten U 937-Zellen (ATCC CRL-1593) immunisiert. Die Milzzellen dieser Tiere wurden entfernt, mit Myelomzellen verschmolzen und die Entwicklung zu antikörperproduzierenden Hybridomzellen ermöglicht. Die Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit „screeniert", die LFA-1-abhängige, phorbolesterinduzierte Aggregation eines EBV-transformierten Zellstammes, beispielsweise von JY-Zellen, die sowohl den LFA-1-Rezeptor als auch ICAM-1 expressieren, zu unterbinden. Wie von Rothlein, R. u. a. (J. Immunol. 137:1270-1274 [1987]), gezeigt wurde, werden Antikörper, die zur Unterbindung einer solchen Aggregation in der Lage si, v, dann auf ihre Fähigkeit geprüft, die phorbolesterinduzierte Aggregation eines Zellstammes zu unterbinden, beispielsweise von SKW3 (Dustin, M. u. a., J. Exper. Med. 165:672-692 (1987]), dessen Fähigkeit zur spontanen Zusammenballurig bei Vorhandensein eines Phorbolesters durch Antikörper unterbunden wird, welche zur Bindung von LFA-1 in der Lage sind, nicht aber unterbunden wird durch Anti-ICAM-1-Antikörper. Antikörper, welche die phorbolesterinduzierte Aggregation von Zellen unterbinden können, wie JY-Zellen, nicht aber die phorbolesterinduzierte Aggregation von Zellen, wie SKW3-Zellen, unterbinden können, sind wahrscheinlich Anti-ICAM-1-Antikörper. Als Alternative dazu können Antikörper, die slcn an ICAM-1 binden kennen, identifiziert werden durch „Screening" nach Antikörpern, welche die LFA-1 -abhängige Aggregation von LFA-Expressionszellen (wie JY-Zellen) unterbinden können, die sich aber nicht an Zellen binden können, welche LFA-1, aber nur wenig oder kein ICAM-1 expressieren (wie beispielsweise normale Granulozyten), oder welche sich an Zellen binden !«innen, die ICAM-1, aber nicht LFA-1 expressieren (wie beispielsweise TNF-aktivierte Endothelzellen). Eine weitere Alternative besteht darin, eine Immunoausfäilung von Zellen vorzunehmen, die ICAM-1, LFA-1 oder beides expressieren, wobei Antikörper verwendet werden, welche die LFA-1 -abhängige Aggregation von Zellen, wie JY-Zellen, unterbinden, und durch SDS-PAGE oder eine äquivalente Methode einige molekulare Charakteristika des mit dem Antikörper ausgefällten Moleküls zu bestin men. Wenn das Charakteristikum das gleiche wie das von ICAM-1 ist, dann kann angenommen werden, daß der Antikörper ein Anti-ICAM-1-Antikörper ist.
Unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern, die auf oben beschriebene Weise hergestellt worden waren, wurde das ICAM-1 -Zeiloberflächenmolekül gereinigt und charakterisiert. ICAM-1 wurde aus menschlichen Zellen oder Gewehe unter Anwendung der monoklonalen Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt. Bei einer solchen Methode wird ein mit ICAM-1 reaktiver, moncklonaler Antikörper an eine träge Kolonnenmatrix gekoppelt. Es kann mit jeder geeigneten Methode zur Herbeiführung einer solchen Kopplung gearbeitet werden, bevorzugt aber wird die Methode von Oettgen, H. C. u. a., J. BIoI. Chem. 259:12034 [1984]). Wird ein Zellysat durch die Matrix geleitet, werden die vorhandenen ICAM-1-Moleküle durch die Matrix adsorbiert und zurückgehalten. Ändert man den pH-Wert oder die lonenkonzentration der Kolonne, können die gebundenen ICAM-1 -Moleküle aus der Kolonne eluiert werden. Gearbeitet werden kann mit jeder geeigneten Matrix, vorteilhaft ist es aber, als Matrixmaterial eine Sepharose (Pharmacia) zu verwenden. Die Bildung von Kolonnenmatrizen und deren Anwendung in der Proteinreinigung sind in Fachkreisen allgemein bekannt.
Auf die Fachleuten bekannte Weise können die oben beschriebenen Analysen angewendet werden, um Verbindungen zu identifizierten, die in der Lage sind, die Rate oder das Ausmaß der Zelladhäsion zu dämpfen oder zu unterbinden. ICAM-1 ist ein Zelloberflächenglykoprotein, das auf nichthämatopoetischen Zellen expressiert wird, wie vaskulären Endothelzellen, Thymusepithelzellen, bestimmten anderen Epitehlzellen und Fibroblasen, und auf hämotopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen, mitogenstimulierten T-Lymphozytblasten und germinalzentrierten B-Zellen und dendritischen Zellen in Tonsilen, Lymphknoten und Peyer-Platten. ICAM-1 wird stark expressiert auf vaskulären Endothelzellen in
T-Zellenbereichen von Lymphknoten und Tonsilen mit reaktiver Hyperplasie. Auf peripheren Blutlymphozyten wird ICAM-1 in geringen Mengen expression. Die phorbolesterinduzierte Differenzierung von einigen myelomonozytischen Zellsiämmen erhöht die ICAM-1-Expression stark. So wird ICAM-1 vorzugsweise an Entzürdungsstellen expressiert, während es im allgemeinen durchg ruhende Zellen nicht expressiert wird. Die ICAM-1 -Expression auf Hautfibroblasten wird um das Drei- bis Fünffache durch Interleukin 1 oder durch Gamma-Interferon in Werten von 10 Einheiten/ml über einen Zeitraum von 4 bzw. 10 Stunden erhöht. Die Induzierung ist von Protein und der mRNA-Synthese abhängig, und sie ist reversibel. ICAM-1 weist in verschiedenen Zelltypen Heterogenität des Molekulargewichts auf, mit einem Molekulargewicht von 97 kd auf Fibroblasten, 114kd auf dem myelomonozytischen Zellstamm U 937 und 90kd auf der B-Lymphoblastoidzelle JY. Es wurde festgestellt, daß an der ICAM-1-Biosynthese ein intrazellularer Vorläufer von etwa 73 kd beteiligt ist. Die nicht-N-glykosylierte Form, die aus Tunikamycinbehandlung (welche die Glykosylation unterbindet) resultiert, hat ein Molekulargewicht von 55kd. ICAM-1, das aus phorbolesterstimulierten U937-Zellen oder aus Fibroblastzellen isoliert wurde, ergibt ein identisches Hauptprodukt mit einem Molekulargewicht von 60kd nach der chemischen Deglykosylation. Monoklonal ICAM-1-Antikörper unterbinden die Adhäsion von Phyiohämaglutininblasten an LFA-1-defizienten Zellstämmen. Die Vorbehandlung von Fibroblasten, nicht aber von Lymphozyten, mit monoklonalen Antikörpern, die zur Bindung von ICAM-1 in der Lage sind, unterbindet die Lymphozyten-Fibroblast-Adhäsion. Es wurde festgestellt, daß die Vorbehandlung von Lymphozyten, nicht aber - τ Fibroblasten, mit Antikörpern gegen LFA-I ebenfalls die Lymphozyt-Fibroblast-Adhäsion unterbindet. ICmM-1 ist folglich der Bindungsligand des Komplexes CD 18 an Leukozyten. Es kann auf Fibroblasten und Endothelzellen in vitro durch Entzündungsmediatoren, wie IL-1, Gamma-Interferon und dem Turmornekrosefaktor, in einem Zeitrahmen induziert werden, der mit der Infiltration von Lymphozyten in entzündliche Läsionen In vitro übereinstimmt (Dustin, M. L. u. a., J. Immunol. 137:245-254 (1986); Prober, J.S. u.a., J. Immunol. 137:1893-1896 [1936]). Ai ßerdem wird ICAM-1 expressiert auf nichthämotopoetischen Zellen, wie vaskulären Endothelzellen, Thymusepitehlzellen, anderen Epithelzellen und Fibroblasten, und auf hämotopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen, mitogenstimulierten T-Lymphozytblasten und germinalzentrierteri B-Zellen und dendritischen Zellen in Tonsilen, Lymphknoten und Peyer-Platten (Dustin, M.L. u.a., J. Immunol. 137: 245-254 [1986]). IC.iM-1 wird expressiert auf Keratinozyten in gutartigen entzündlichen Läsionen, wie allergischem Ekzem, Liehen planus, Exanthem, Urtikaria und buliösen Erkrankungen. Allergische Hautreaktionen, welche durch die Anwendung eines Haptens auf der Haut hervorgerufen werden, gegenüber dem der Patient allergisch ist, machten auch eine starke ICAM-1 -Expression an den Keratinozyten sichtbar. Dagegen wiesen toxische Flecken auf der Haut keine ICAM-1-Expression an den Keratinozyten auf. ICAM-1 ist an Keratinozyten vorhanden aus Biopsien von Hautläsionen von verschiedenen dermatologischen Störungen, und die ICAM-1-Expression wird an Läsionen von allergischen Fleckenversuchen induziert, während Keratinozyten von toxischen Flecken-Testläsionen kein ICAM-1 expressierten.
ICAM-1 ist daher ein Zellsubstrat, an das sich Lymphozyten anheften können, so daß die Lymphozyten an Entzündungsstellen wandern und/oder verschiedene Effektorfunktionon ausführen können, die zu dieser Entzündung beitragen. Zu dieser Funktion gehören die Produktion des Antikörpers, die Lyse von vireninfizierten Zielzellen usw. Der Begriff „Entzündung" schließt in seiner vorliegenden Verwendung Reaktionen des spezifischen und des nichtspezifischen Abwehrsystems ein, In der vorliegenden Verwendung versteht man unter dem Begriff „spezifisches Abwehrsystem" die Komponente des Immunsystems, die auf das Vorhan Jensein von spezifischen Antigenen reagiert. Man sagt, daß eino Entzündung aus einer Reaktion des spezitischen Abwehrsystems resultiert, wenn die Entzündung verursacht, vermittelt oder verbunden wird bzw. ist mit einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems. Zu den Beispielen für eine Entzündung, die aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems resultiert., gehören die Reaktion auf Antigene wie den Rötelvirus, Autoimmunkrankheiten, Hypersensitivitätsreaktion des verzögerten Typs, der durch T-Zellen vermittelt wird (wie das beispielsweise bei Personen deutlich wird, die beim Mantaux-Test ein positives Ergebnis aufweisen), Psoriasis usw.
Eine „nichtspezifische Abwehrsystemreaktion" ist eine Reaktion, die durch Leukozyten vermittelt wird, die kein immunologisches Gedächtnis aufweisen. Zu diesen Zellen gehören Granulozyten und Makrophagen. In der vorliegenden Verwendung wird eine Entzündung als das Ergebnis einer Reaktion des nichtspezifischen Abwehrsystems bezeichnet, wenn die Entzündung verursacht, vermittelt wird oder verbunden ist mit einer Reaktion des nichtspozifischen Abwehrsystems. Zu den Beispielen für Entzündungen, die zumindest teilweise aus einer Reaktion des nichtspezifischen Abwehrsystems resultieren, gehört beispielsweise die Entzün ung in Verbindung mit solchen Zuständen, wie Asthma, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS) oder Mehrfachorganschbdigungssyndrome als Sekundärerscheinung von Septizemie oder Trauma; Reperfusionsschädigung des Myokard- oder anderer Gewebe; akute Glomeruionephritis, reaktive Aethritis; Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten; akute purulente Meningitis; Wärmeschädigung; Hämodialyse; Leukapherese; ulzerative Colitis; Crohnsche Krankheit; nekrotisierende EnterokolHis; granulozyttransfusionsassoziierte Syndrome und zytokininduzierte Toxizität.
Nach der vorliegenden Erfindung können funktioneile ICAM-1-Derivate und insbesondere solche Derivate, die Fragmente oder mutapte Varianten von ICAM-1 aufweisen, welche die Domänen 1,2 und 3 haben, bei der Behandlung oder Therapie solcher Reaktionen des nichtspezifischen Abwehrsystems eingesetzt werden. Für eine solche Behandlung oder Therapie besonders bevorzugt werden ICAM-1 -Fragmente oder mutante Varianten, welche die Domäne 2 von ICAM-1 enthalten. Besonders bevorzugt werden für eine solche Behandlung oder Therapie ICAM-1 -Fragmente oder mutante Varianten, welche die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten.
Jedes einer Reihe von Verfahren kann zum Klonieren des ICAM-1 -Gens angewendet werden. Eine dieser Methoden beinhaltet die Analyse einer Schaukalvektor-Bibliothek von cDNA-lnserts (die aus einer ICAM-1 -expressierenden Zelle abgeleitet wurden) nach dem Vorhandensein eines Inserts, welches das ICAM-1-Gon enthält. Eine solche Analyse kann durchgeführt werden durch die Transfektion von Zellen mit dem Vektor und die anschließend··) Untersuchung auf die Expression von ICAM-1. Die bevorzugte Methode zum Klonieren dieses Gens beinhaltet die Bestimmung der Aminosäurefolge des ICAM-1-Moleküls. Dazu kann das ICAM-1 -Protein gereinigt und durch automatisierte Sequenatoren analysiert werden. Als Alternative dazu kann das Molekül fragmentiert werden, beispielsweise mit Zyanogenbromid odi · mit Proteasen wie Papain, Chymotrypsin oder Trypsin (Oike, Y. u.a., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 [1982]; Liu, C. u.a., Int. J. Pept. f-Voteln Res. 21: 209-215 [1983]). Man kann zwar die gesamte
Aminosäurefolge von ICAM-1 bestimmen, vorteilhaft ist es jedoch, die Folge der Peptidfragmente des Moleküls zu bestimmten. Wenn die Peptide länger als 10 Aminosäuren sind, reicht die Sequenzinformation im allgemeinen aus, um dio Klinierung eines Gens, wie des Gens von ICAM-1, zu ermöglichen.
Die Sequenz der Aminosäurereste in einem Peptid wird hier entweder unter Verwendung der allgemein üblichen Dreibuchstabenbezeichnung oder ihrer Einbuchstabenbezeichnungen bezeichnet. Eine Aufstellung dieser aus drei bzw. einem Buchstaben bestehenden Bezeichnungen wird in Lehrbüchern, wie Biochemistry (Biochemie), Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY (1979), gegeben. Wird eine solche Sequenz vertikal aufgelistet, muß sich der Aminosäureterminalrest oben an der Liste befinden, während der Karboxyterminalrest des Peptids unten an der Liste stehen soll. Ebenso muß, wenn eine waagerechte Auflistung erfolgt, der Amirioterminus am linken Ende stehen, während der Karboxyterminus rechts stehen soll. Die Aminosäurereste in einem Peptid können durch Bindestriche getrennt werden. Diese Bindestriche so'len nur die Darstellung ainer Folge erleichtern. Als rein illustrativas Beispiel gibt die Aminosfiurefolge mit der Bezeichnung
-Gly-Ala-Ser-Phe-
an, daß ein Ala-Rest an die Karboxygruppe von GIy gebunden ist, und daß ein Ser-Rest an die «arboxygruppe von Rest ALa und an die Aminogruppe eines Phe-Restes gebunden ist. Die Bezeichnung gibt außerdem an, daß die Aminosäurefolge das Tetrapeptid Gly-Ala-Ser-Phe enthält. Die Bezeichnung soll nicht die Aminosäure auf dieses Tetrapeptid begrenzen, sondern vielmehr (1) das Tetrapeptid mit einem oder mehreren Aminosäureresten, die entweder an das Amino- oder an das Karboxyende gebunden sind, (2) das Totrapeptid mit einem oder mehreren Aminosäureresten, die sowohl mit dem Amino- als auch mit dem Karboxyende verbunden sind, und (3) das Tetrapeptid ohne zusätzliche Aminosäurereste einschließen. Sobald ein oder mehrere geeignete Peptidfragmente sequenziert sind, werden die DNA-Folgen untersucht, welche diese verschlüsseln können. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Kodon zum Verschlüsseln einer bestimmten Aminosäure verwendet werden (Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene [Molekularbiologie des Gens], 3. Aur'l., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA [1977], S.356-357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um die Sequenzen von Aminosäuren zu identifizieren, welche durch Oligonukleotide mit dem niedrigsten Grad an Degenerierung verschlüsselt werden können. Das wird vorzugsweise durch die Identifizierung von Folgen erreicht, die Aminosäuren enthalten, welche durch einen einzigen Kodon verschlüsselt werden. Zwar kann gelegentlich eine solche Aminosäurefolge nur durch ein einziges Oligonukleotid verschlüsselt werden, häufig aber kann die Aminosäurefolge durch jedes einer Reihe von ähnlichen Oligonukleotiden verschlüsselt werden. Wichtig ist, daß zwar alle Glieder der Reihe Oligonukleotide enthalten, die das Peptidfragment verschlüsseln können und folglich potential die gleiche Nukleotidfolge wie das Gen enthalten, das das Peptidfragment verschlüsselt, aber nur ein Glied der Reihe eine Nukleotidfolge enthält, die mit u'er Nukleotidfolge dieses Gens identisch ist. Da dieses Glied in der Reihe vorhanden ist und selbst bei Vorhandensein der anderen Glieder der Reihe auf die DNA hybridisieren kann, ist es möglich, die unfraktionierle Reihe der Oligonukleotide in derselben Weise einzusetzen, wie man ein einzelnes Oligonukleotid anwenden würde, um das Gen zu klonieren, welches das Peptid verschlüsselt.
Auf eine Art und Weise, die der oben beschriebenen genau analog ist, kann man ein Oligonukleotid (oder einen Satz von Oligonukleotiden) einsetzen, der eine Nukleotidfolge hat, die komplementär zur OligonuHeotidfolge oder Satz von Folgen ist, welche das Peptidfragment verschlüsseln können.
Ein geeignetes Oligonukleotid oder ein Satz von Oligonukleotiden, die in der Lage sind, ein Fragment des ICAM-1-Gens zu verschlüsseln (oder die komplementär zu einem solchen Oligonukleotid oder Satz von Oligonukleotiden sind), werden (unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens) identifiziert, synthetisiert und nach bekannten Methoden anhand eines DNA- oder vorzugsweise eines cDNA-Präpsrats hybridisiert, das von menschlichen Zellen abgeleitet wurde, die ICAM-1-Gen-Folgen expressieren können. Methoden zur Nukleinsäurehybridisation werden von Maniatis, T., u.a., in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor, NY (1982), und von Haymes, B.D., u.a., in: Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach (Nukleinsäurehybridisation. Eine praktische Methode), IRL Press, Washington, DC (1985), offengelegt, und diese Literaturhinweise werden hier als Referenz einbezogo Die verwendete Quelle für DNA oder cDNA wurde vorzugsweise auf ICAM-1 -Folgen angereichert. Diese Anreicherung kann a. einfachsten bei cDNA erreicht wenden, die durch Extraktion von RNA aus Zellen gewonnen wurde, welche unter Bedingungen gezüchtet wurden, die die ICAM-1-Synthese induzieren (wie beispielswe;se U937, die bei Vorhandensein von Phorbolestern gezogen wurden, usw.). Methoden wie die oben beschriebenen oder diesen ähnliche Methoden haben das erfolgreiche Klonieren von Genen für menschliche Aldehyddehydrogenasen (Hsu, L. C, u.a., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 82:3771-3775 [1985)), Fibronektin (Suzuki, S., u.a., Eur. Mol. BIoI. Organ. J. 4: 2519-2524 [1985]), das menschliche Östrogenrezeptorgen (Walter, P., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei USA 82: 7889-7893 [1985]), den Plasminogenaktivator des Gewebetyps (Pennica, D., u. a., Nature 301: 214-221 [1983]) und die menschliche komplementäre alkalische Phosphatase-Plazenta-DNA (Kam, W., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8715-8719 [1985]) ermöglicht.
Bei einem bevorzugten, alternativen Weg zum Klonieren des ICAM-1 -Gens wird eine Bibliothek von Expressionsvektoren durch Klonieren von DNA oder vorzugsweise von cDNA aus einer Zelle hergestellt, welche ICAM-1 in einen Expressionsvektor expressieren kann. Anschließend wird die Bibliothek nach Gliedern „screeniert", die zur Expression eines Proteins in der Lage sind, welches sich an den Anti-ICAM-1 -Antikörper bindet und welches eine Nukleotidfolge hat, die Polypeptide verschlüsseln kann, welche die gleiche Aminosäurefolge wiö das ICAM-1 -Molekül oder Fragmente von ICAM-1 haben. Das Monierte Gen von ICAM-1, das nach den oben beschriebenen Methoden gewonnen wurde, kann operabel an einen Expressionvektor gebunden und in Bakterien- oder eukaryotische Zellen eingeführt werden, um ICAM-1 -Protein zu produzieren. Verfahren für solche Manipulationen werden von Maniatis, T., u. a., siehe oben, offengelegt und sind in Fachkreisen allgemein bekannt.
Die oben beschriebene Analyse, mit der es möglich ist, die LFA-1-abhängige Aggregation zu messen, kann zur Identifizierung von Agentien angewendet werden, welche als Antagonisten zur Unterbindung des Ausmaßes der LFA-1-abhängigen Aggregation wirken. Diese Antagonisten können dadurch wirken, daß sie die Fähigkeit von LFA-1 oder ICAM-1 beeinträchtigen,
die Aggregation zu vermitteln. Folglich schließen diese Mittel Immunoglobuline ein, wie beispielsweise einen Antikörper, der sich entweder an LFA-1 oder ICAM-1 binden kann. Außerdem können Nichtimmunoglobulinagentien (d. h. chemische Agentiun) unter Anwendung der oben beschriebenen Analyse untersucht werden, um festz' 'stellen, cb sie Antagonismen der LFA-1 Aggregation sind.
1. Entzündungshemmende Mittel
Monoklonal^ Antikörp' r zu Gliedern des Komplexes CD 18 unterbinden viele adhäsionaabhängige Funktionen der Leukozyten, einschließlich der Bindung an das fcndothel (Haskard, O- u.a., J. Immunol. 137: 2M!-2906 [1986]), von homotypischen Adhäsionen (Rothlein, Fl., u.a., J. Exp. Mad. 163:1132-1149 [1986]), der antigen- und mitogeninduzierten Vermehrung von Lymphozyten (Davignon, D., u.a., Proc. Natl. Aced. ScI. USA78:4535-4539 [1981]), der Antikörperbildung (Fischer, A., u.a., J. Immunol. 136: 3198-3203 [1986]) und von Effektcrfunktionen aller Leukozyten, wie die lytische Aktivität von zytotoxischen T-Zellen (Krensky, A. M., u. a., J. Immunol. 132:218ί>-2182 [1Ί84]), Makrophage (Strassman, G., u. ε., J. Immunol. 136:4328-4333 [1986]) und allen Zellen, die an antikörperabhängigen, zelli ren Zytotoxizitätsreaktionen beteiligt sind (Kohl, S., u. a., J. Immunol. 133:2972-2973 [1984]). Bei allen oben genannten inktionen unterbinden die Antikörper die Fähigkeit der Leukozyten, an dem entsprechenden Zellsubstrat zu haften, was wiederum das Endergebnis unterbindet.
Wie oben ausgeführt wurde, ist die Bindung von ICAM-1 -Molekülen an Glieder der I.EA-1 -Familie von Molekülen von zentraler Bedeutung für die Zelladhäsion. Durch den Prozeß der Adhäsion sind Lymphozyten in der Lage, ein Tier ständig auf das Vorhandensein von Fremdantigenen zu überwachen. Obwohl diese Prozesse normalerweise wünschenswert sind, sind sie auch die Ursache für die Abstände von Organtransplantaten, für die Abstoßung von Gewebeverpflanzungen und viele Autoimmunkrankheiten. Folglich wäre jedes Mittel, mit dem die Zellhaftung abgeschwächt oder unterbunden werden könnte, bei Empfängern von Organtransplantaten, Gewebeverpflanzungen oder Autoimmunpatienten äußerst wünschenswert. Monoklonal Antikörper, die sich an ICAM-1 binden können, sind als entzündungshemmende Mittel bei Säugern sehr gut geeignet. Signifikant ist, daß sich diese Mittel von den allgemeinen entzündungshemmenden Mitteln darin unterscheiden, daß sie die Adhäsion selektiv unterbinden können und keine Nebenwirkungen wia Nephrotoxizität haben, die bei den herkömmlichen Mitteln auftreten. Monoklonale Antikörper, die sich an ICAM-1 binden können, können daher verwendet werden, um Organ- oder Gewebeabstoßungen zu verhindern oder um Autoimmunreaktionen zu modifizieren, ohne daß die Gefahr von Nebenwirkungen bei den behandelten Säugern besteht.
Wichtig ist, daß der Einsatz von monoklonalen Antikörpern, welche in der Lage sind, ICAM-1 zu erkennen, die Möglichkeit schafft, Organtransplantationen selbst zwischen Personen mit e'ner HLA-Fehlanpassung vorzunehmen.
2. Unterdrücker der verzögerten Hyperaensltivitätsreaktlon
Da ICAM-1 -Moleküle vor allem an Entzündungsstellen expressiert werden, beispielsweise Stellen in Verbindung mit einer verzögerten Hypersensitivitätsreaktion, haben Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper), welche sich an ICAM-1-Moleküle binden können, ein therapeutisches Potential bei der Dämpfung oder Verhinderung solcher Reaktionen. Diese potentielle therapeutische Anwendung kann auf zweierlei Weise genutzt werden. Erstens kann einem Patienten mit einer verzögerten Hypersensitivitätsreaktion eine Zusammensetzung, welche einen monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 enthält, verabreicht werden. Beispielsweise könnten solche Zusammensetzungen einem Menschen verabreicht werden, der mit solchen Antigenen wie Giftsumach, Gifteiche usw. in Kontakt gekommen ist. Beim zweiten Ausführungsbeispiel wird der monoklonale Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann, einem Paiienten in Verbindung mit einem Antigen verabreicht, um eine nachfolgende entzündliche Reaktion zu verhindern. So kann die zusätzliche Vercbreichung eines Antigens mit einem ICAM-1-bindenden, monoklonalen Antikörpei bewirken, daß eine Person die ar jchließendn Konfrontation mit diesem Antigen zeitweilig tolerieren kann.
3. Therapie bei einer chronischen entzündlichen Krankheit
Da LAD-Patienten, denen LFA-1 fehlt, keine entzündliche Reaktion hervorbringen, wird angenommen, daß auch der Antagonist des natürlichen Liganden von LFA-1, ICAM-1, eine entzündliche Reaktion unterbindet. Die Fähigkeit von Antikörpern geqen ICAM-1, eine Entzündung zu unterbinden, bildet die Grundlage für deren therapeutische Nutzung bei der Behandlung chronischer, entzündlicher Erkrankungen und von Autoimmunkrankheiten, wie beispielsweise Lupus errythematosus, Autoimmun-Thyroiditis, experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE), multipler Sklerose, einigen Formen von Diabetis, dem Reynaud-Syndrom, rhsumatoider Arthritis usw. Solche Antikörper könne. ·> ich zur Therapie bei der Behandlung von Psoriasis eingesetzt werden. Im allgemeinen können monoklonale Antikörper, die sich an ICAM-1 binden können, bei der Behandlung von den Krankheiten eingesetzt werden, die gegenwärtig mit der Steroid-Therapie behandelt werden können.
4. Diagnostische und prognostische Anwendungen
Da ICAM-1 vor allem an Entzündungsstellen expressiert wird, können monoklonale Antiköiper, die sich an ICAM-1 binden können, zur Bildlich- oder Sichtbarmachung von Infektions- und Entzündungsstellen bei einem Patienten eingesetzt werden. Bei dieser Anwendung werden die monoklonalen Antikörper nachweisbar durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (wie Biotin, Avidin usw.), fluoresr.enten Markierungen, paramagnetischen Atomen usw. markiert. Dio Verfahren für diese Markierung sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Eine Übersicht über die klinische Anwendung von Antikörpern bei der diagnostischen Sichtbarmachung wird von Grosiman, H. B., Urol. CIIn. North Amer. 13:465-474 [1986]), Unger, E.C., u.a.. Invest. Radiol.20: 693-700 [1985]) und Khaw, B.A, u.a., Science209: 295-297 [1980]) gegeben. Das Vorhandensein einer Entzündung kann auch durch die Anwendung von Sindungsliganden, wie beispielsweise mRNA oder DNA, die sich an ICAM-1-Gansequenzen oder an ICAM-1-mRNA-Sequenzen von Zellen binden, welche ICAM-1 exprarsieren, nachgewiesen werden. Methoden zur Ausführung dieser Hybridisationsanalysen werden von Maniatis, T., (εϊ?}ΐ6 obon) beschrieben.
Der Nachweis von Herden solcher nachweisbar markierten Antikörper ist ein Anzeichen auf eine Stelle mit Entzündung odor Tumorentwicklung. Bei einem Ausführungsbeispiel wird diese Untersuchung nach einer Entzündung dadurch durchgeführt, daß Gewebe· oder Blutproben entnommen und diese Proben bei Vorhandensein der nachweisbar markierten Antikörper inkubiert werden Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wi d diese Methode auf nichtinvasive Weise durch die Anwendung der magnetischen Sichtbarmachung, Fluorografie usw. praktiziert. Ein solcher diagnostischer Test kann bei der Überwachung von Empfängern von Organtranspiantaten zur Erkennung von Frühzeichen einer potentiellen Gewebeabstoßung angewendet werden. Solche Untersuchungen können auch in dem Bestreben angewendet werden, die Präsisposition von Personen für rhoumatoide Arthritis oder andere chronische, entzündliche Erkrankungen zu bestimmen.
5. Zusatz bei der Einführung von antigenem, für therapeutische oder diagnostische Zwecke verabreichtem Material Immunr aktionen auf therapeutische oder diagnostische Mittel, wie beispielsweise Rinderinsulin, Interferon, Plasminogenalc.ivator des Gewebetyps oder Mäusemonoklonalantikörpor, beeinträchtigen den therapeutischen oder diagnostischen Wert solcher Mittel erheblich und können faktisch solche Erkrankungen wie die Serumkrankheit hervorrufen. Eine solche Situation kann durch den Einsatz der Antikörper nach der vorliegenden Erfindung gebessert werden. Bei diesem Ausführungsbeispiel würden die Antikörper in Verbindung mit dem therapeutischen oder diagnostischen Mittel verabreicht. Der Zusatz von Antikörpern verhindert, daß der Empfänger das Mittel erkennt, und verhindert damit, daß der Empfänger eine Immunreaktion darauf einleitet. Das Fehlen einer solchen Immunreaktion schafft beim Patienten die Möglichkeit, zusätzliche Verabreichungen des therapeutischen oder diagnostischen Mittels aufzunehmen.
F. Anwendungen des interzellularen Adhäsionsmoleküls (ICAM-1)
ICAM-1 ist ein Bindungspartner von LFA-1. Als solcher können ICAM-1 oder seine funktionellon Derivate austauschbar mit Antikörpern eingesetzt werden, welche sich an LFA-4 binden können, dieser austauschbare Einsatz ist bei der Behandlung von Krankheiten möglich. Folglich können diese Moleküle in solubilisierter Form eingesetzt werden, um Entzündungen, Organabstoßungen, Abstoßungen von Verpflanzungen usw. zu unterbinden. ICAM-1 oder seine funktionellon Derivate können in der gleichen Weise wie Anti-ICAM-Antikörper eingesetzt werden, um die Immunogenizitüt von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln herabzusetzen.
ICAM-1, seine funktioneilen Derivate und seine Antagonisten könnon eingesetzt werden, um die Metastase oder Wucherung von Tumorzellen zu blockieren, welche auf ihren Oberflächen ICAM-1 oder LFA-1 expressieren. Um dieses Ziel zu erreichen, kann eine Vielzahl von Methoden c-ngewendet werden. Beispielsweise verlangt die Wanderung der hämatopoetischen Zellen eine LFA-MCAM-1-Bindung. Antagonisten dieser Bindung unterdrücken folglich diese Wandung und blockieren die Metastase von Zellen eines Tumors der Leukozytenfamilie. Als Alternative dazu können einem Patienten toxinabgeleitete Moleküle, die entweder ICAM-1 oder ein Glied der LFA-1-Familie von Molekülen binden können, verabreicht werden. Binden sich solche toxinabgeleiteten Moleküle an Tumorzellen, welche ICAM-1 oder ein Glied der LFA-1-Familie von Molekülen expressieren, tötet das Vorhandensein des Toxins die Tumorzellen ab, wodurch die Wucherung des Tumors unterbunden wird.
G. Anwendungen von Nfchtlmmunoglobulln-Antagonisten der ICAM-1-abhSngigen AdhSsion
Die ICAM-1 -abhängige Adhäsion kann durch Nichtimmunoglobulin-Antagonisten unterbunden werden, die zur Bindung an ICAM-1 oder LFA-1 in der Lage sind. Ein Beispiel für einen Nichtimmunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 ist LFA-1. Ein Beispiel für einen Nichtimmunoglobulin-Antagonisten, der sich an LFA-1 bildet, ist ICAM-1. Unter Anwendung der oben beschriebenen Analysen können weitere Nichtimmunoglobulin-Antagonisten identifizier; und gereinigt werden. Nichtimmunoglobulin-Antagonisten der ICAM-1-abhängigen Adhäsion können für die gleichen Zwecke wie Antikör^r zu LFA-1 oderAntikörper zu ICAM-1 eingesetzt werden.
H. Verabreichung der Zusammensetzungen der vorlief "nden Erfindung
Die therapeutischen Wirkungen von ICAM-1 können dadu h erzielt werden, daß einem Patienten das vollständige ICAM-1-Molekül oder ein beliebiges, therapeutisch aktives Peptidfragment davon verabreicht werden.
ICAM-1 und dessen funktionell Derivate kennen entweder synthetisch, unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technik oder durch Proteolyse gewonnen werden. Die therapeutischen Vorteile von ICAM-1 können durch die Verwendung der funktionellen Derivate von ICAM-1 verstärkt werden, welche zusätzliche Aminosäurereste enthalten, die zur Verstärkung der Kopplung an den Träger oder zur Verstärkung der Aktivität von ICAM-1 hinzugefügt wurden. Der Rahmen der vorliegenden Erfindung soll außerdem funktioneile Derivate von ICAM-1 einschließen, denen bestimmte Aminosäurereste fehlen oder die geänderte Aminosäurereste enthalten, solange diese Derivate die Fälligkeit aufweisen, die Zellularadhäsion zu beeinflussen.
Man bez .ichnet sowohl die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung als auch das hier offengelegte ICAM-1-Molekül als „im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten", wenn die Präparate, in denen sie enthalten sind, im wesentlichen frei von Stoffen sind, mit denen diese Produkte normalerweise und natürlich vorkommen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antikörper und deren biologisch ektive Fragmente (sowohl polygonale als auch monoklonal), die zur Bindung an ICAM-1 in der Lage sind. Solche Antikörper können entweder durch ein Tier, durch eine Gewebekultur oder durch Mittel der Rekombinant-DNA-Technik produziert werden.
Bei der Verabreichung von Antikörpern oder deren Fragmenten, die sich an ICAM-1 binden können, an einen Patienten oder bei der Gabe von ICAM-1 (oder dessen Fragment, Variante oder Derivat) an einen Empfänger-Patienten variiert die Dosierung des verabreichten Mittels in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeiner medizinischer Zustand, bisherige Krankengeschichte des Patienten usw. Im allgemeinen ist es ratsam, dem Empfänger eine Dosis des Antikörpers zu verabreichen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10mg/kg (Körpergewicht des Patienten) reicht, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosierung möglich ist. Wenn einem Patienten ICAM-1-Moleküle oder deren funktioneile Derivate gegeben werden, ist es vorteilhaft, diese Moleküle in einer Dosierung zu verabreichen, die auch zwischen etwa 1 pg/kg und 10mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosierung möglich ist. Wie unten aisgeführt wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis gesenkt werden, wenn der Anti-ICAM-1 -Antikörper zusätzlich mit einem
Anti-LFA-1 -Antikörper verabreicht wird. In der vorliegenden Anwendung spricht man davon, daß eine Verbindung zusätzlich mit einer zweiten Verbindung verabreicht wird, wenn die Verabreichung der beiden Verbindungen in zeitlich so geringem Abstand erfolgt, daß beide Verbindungen gleichzeitig im Serum des Patienten nachgewiesen werden können.
Sowohl der Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann, als auch ICAM-1 selbst können den Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Bei der Verabreichung des Antikörpers oder von ICAM-1 durch Injektion kann diese Verabreichung als Dauerinfusion oder durch einzelne oder mehrfache Gaben erfolgen.
Die Entzündungshemmittel der vorliegenden Erfindung sollten Empfängerpersonen in einer ausreichenden Menge verabreicht werden, um die Entzündung zu unterdrücken. Man bezeichnet eine Menge als ausreichend, um eine Entzündung „zu unterdrücken", wenn die Dosierung, Verabreichungsroute usw. für das Mittel ausreichend sind, um die Entzündung zu dämpfen oder zu verhindern.
Der Anti-ICAM-1-Antikörper oder dessen Fragment können allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen immunosupressiven Mitteln (vor allem an einen Empfänger eines Organ- oder Gewebetransplantats) verabreicht werden. Die Verabreichung von (einer) solchen Verbindung(en) kann entweder aus „prophylaktischen" oder aus „therapeutischen" Zwecken erfolgen. Bei der prophylaktischen Verabreichung werden die Immunosuppressiwerbindung(en) vor einer entzündlichen Reaktion oder einem entzündlichen Symptom gegeben (d.h., beispielsweise vor, zum oder kurz nach dem Zeitpunkt der Organoder Gewebetransplantation, auf jeden Fall aber vor jedem Anzeichen einer Organabstoßung). Die prophylaktische Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, eine mögliche nachfolgende entzündliche Reaktion (wie beispielsweise die Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes usw.) zu verhindern oder zu dämpfen. Bei der therapeutischen Verabreichung wird (werden) die immunusuppressiven Verbindung(en) gegeben zu Beginn (oder kurz nach einem solchen Beginn) eines Symptoms einer tatsächlichen Entzündung (wie beispielsweise einer Organ- oder Gewebeabstoßung). Die therapeutische Verabreichung der Verbindung(en) dient der Dämpfung jeder tatsächlichen Entzündung (wie beispielsweise der Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes). Die entzündungshemmenden Mittel dor vorliegenden Erfindung können daher entweder vor Beginn der Entzündung (um beispielsweise eine erwartete Entzündung zu unterdrücken) oder nach Ausbruch der Entzündung verabreicht werden.
Man bezeichnet eine Zusammensetzung als „pharmakologisch akzeptabel", wenn der Empfänger-Patient deren Verabreichung tolerieren kann. Man spricht davon, daß ein solches Mittel in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Eine Menge ist physiologisch signifikant, wenn ihr Vorhandensein zu einer nachweisbaren Änderung in der Physiologie eines Empfänger-Patienten führt.
Der Antikörper und die ICAM-1-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung können nach den bekannten Methoden verarbeitet werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wodurch diese Stoffe oder deren funktioneile Derivate in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und ihre Zubereitung, einschließlich anderer Humanproteine, wie z.B. menschliches Serumalbumin, warden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflage, Osol, A., Hsg., Mack, Easton, PA (198O]) beschrieben. Um eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung, die für eine effektive Verabreichung geeignet ist, herzustellen, enthalten diese Zusammensetzungen eine effektive Menge des Anti-ICAM-1-Antikörpers oder ICAM-1-Moleküls und deren funktioneller Derivate zusammen mit einer geeigneten Menge des Trägervehikels.
Um die Dauer der Wirkung zu kontrollieren, können zusätzliche pharmazeutische Methoden angewendet werden. Präparate mit kontrollierter Freisetzung kann man durch die Verwendung von Polymeren herstellen, um mit dem Anti-ICAM-1-Antikörper oder ICAM-1 oder deren funktioneilen Derivaten einen Komplex zu bilden oder diese zu absorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann durch Auswahl entsprechender Makromoleküle (beispielsweise von Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinyl, Pyrrolidon, Ethylenvinylazetat, Methylzellulose, Karboxymethylzellulose oder Protamin, Sulfat) und die Konzentration der Makromoleküle sowie durch die Einbeziehungsmethoden zur Steuerung der Freisetzung ausgeübt werden. Eine andere mögliche Methode zur Kontrolle der Wirkungsdauer durch Präparate mit kontrollierter Freisetzung ist die Einbeziehung von Anti-ICAM-1-Antikörperoder ICAM-1 -Molekülen oder deren funktionellen Derivaten in Teilchen eines polymeren Materials, wie beispielsweise von Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogeln Poly(milchsäure) oder Ethylen-Vinylazetat-Kopolymeren. All jrnativ zur Einbeziehung dioser Mittel in polymere Teilchen ist es möglich, dieses Material in Mikrokapseln einzuschließen, die beispielsweise durch Koazervationsmethoden oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, wie beispielsweise Hydroxymethylzellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethazylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Drogenabgabesysteme, beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln, oder in Makroemulsionen. Diese Methoden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offengelegt. Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, soll sie durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht werden, die der Illustration dienen sollen und die Erfindung in keiner Weise einschränken, wenn dss nicht ausdrücklich angegeben wird.
denen die T-Zellen entzogen wurden,/ml in RPMI 1640-Medium, das mit 20% fetalem Kalbsserum (FCS) und 50ng/ml Gentamizinergänzt worden war, 16 Stunden mit EBV-haltiger, obenaufschwimmender Schicht von B95-8-Zelleninkubiort(Thorley-Lawson,
das eine Verdünnung an PHA-P von 1:800 enthielt (Difco Laboratories, Inc., Detroit, Ml) ermittelt. PHA-Stämme wurden mit
unterzogen (Cantrsll, D. A., u.a., J. Exper. Med. 158:1895(1983]). Das oben beschriebene Verfahren wurde von Springer, T., u.a.,
J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984) offengelegt, und diese Literaturangabe wird hier als Verweis einbezogen. Die nach dem oben beschriebenen Verfahren gewonnenen Zellen werden dann mit Anti-LFA-1-Antikörpern „screeniert", um festzustellen, ob sie das LFA-1-Antigen expressieren. Solche Antikörper werden von Sanchez-Madrid, F., u. a., J. Exper. Med. 158:1785 (1983), offengelegt.
Um das Ausmaß der zellularen Adhäsion zu bestimmen, wurden Untersuchungen zur Zusammenballung oder Aggregationsanalysen vorgenommen. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Zellstämme wurden zweimal mit dem Medium RPM11640, das 5 mM Hepes-Puffer enthielt (Sigma Chemical Co., St. Louis), gewaschen und in einer Konzentration von 2 x 10e Zellen/ml wieder zur Suspension gebracht. Zu Mikrotiter-Platten mit flachem Boden und 96 Vertirrungen (Nr.3596; Costar, Cambridge, MA) wurden 50μΙ der entsprechenden obenaufschwimmenden monoklonalen Antik jrperschicht oder 50μΙ des kompletten Mediums mit oder ohne gereinigten monoklonalen Antikörpern, 50 μ! des kompletten Medkms mit 200ng je ml Phorbolesterphorbolmyristatazetat (PMA) und 100μΙ von Zellen mit einer Konzentration von 2 x 10s Zellen/ml in komplettes Medium gegeben. Pas ergab eine Endkonzentration von 50 ng/ml PMA und 2 χ 105 Zellen/Vertiefung. Die Zellen konnten sich spontan absetzen, und der Grad der Aggregation wurden zu verschiedenen Zeitpunkten ermittelt. Die Bewertung reichte von 0 bis 5+, wobei 0 angab, daß im wesentlichen keine Zellen in Bündeln vorhanden waren; 1 + gab an, daß weniger als 10% Zellen in Zusammenballungen vorhanden waren; 2+ gab an, daß weniger als 50%der Zellen zusammengeballt waren; 3+ gab an, daß bis zu 100% der Zellen kleine, lose Trauben bildeten; 4+ gab an, daß bis zu 100% der Zellen in größeren Trauben zusammengeballt waren, und 5+ gab an, daß 100% der Zellen große, sehr kompakte Aggregate oder Zusammenballungen bildeten. Um eine quantitativere Bestimmung der Zelladhäsion zu erhalten, wurden Reagentien und Zellen in der gleichen Reihenfolge wie oben zu 5 ml Polystyrenröhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden auf einem Kreiselrüttler in ein Gestell gegeben und bei 370C behandelt. Nach 1 Stunde bei 200U/min wurden 10μΙ der Zellsuspension in ein Hämozytometer gegeben, und es wurde die Anzahl der freien Zellen quantitativ bestimmt. D!: prozentuale Aggregation wurde durch folgende Gleichung bestimmt:
„, _ ... ... (. Anz.d. freien Zellen 1
%Zusammenballung = 100 χ \ 1 —τ ;—; — I
\ Anz.d.Einsatzzellen /
Die Anzahl der Einsatzzellen in der vorstehenden Formel ist die Anzahl der Zellen je Millimeter eines Kontrollröhrchens, das nur Zellen und Komplettmedium enthält, die nicht inkubiert wurden. Die Anzahl der fre'.on Zellen in der vorstehenden Gleichung ist gleich der Anzahl der nichtzusammengeballten Zellen je ml von experimentellen Röhrchen. Diese Verfahren wurden von Rothlein, R., u.a., J. Exper. Med. 163:1132-1149(1986), beschrieben.
Die qualitative Aggregationsuntersuchung aus dem Beispiel 2 wurde unter Verwendung von einem mit den ι Epstein-Barr-Virus transformierten Zellstamm JY durchgeführt. Nach dem Zusatz von PMA zum Kulturmedium in den Mikrotiterplatten wurde die Aggregation der Zellen beobachtet. Videozeitraft'eraufnahmen zeigten, daß die JY-Zellen am Boden der Mikrotiter-Vertiefungen freibeweglich waren und eine aktive Membrankräuselung und Pseudopodiebewegung aufwiesen. Der Kontakt zwischen den Scheinfüßchen von benachbarten Zellen führte oft zum Haften der Zellen aneinander. Wenn die Haftung ausgedehnt war, bewegte sich die Region des Zelikontaktes zum Uropod. Der Kontakt konnte trotz kräftiger Zallbewegungen und dem Zerren der Zellen in entgegengesetzte Richtungen aufrechterhalten werden. Der Hauptunterschied zwischen PMA-behande'ten und -unbehandelten Zellen schien in der Stabilität dieser Kontakte, nachdem sie sich gebildet hatten, zu bestehen. Mit PMA entwickelten sich Zelltrauben, deren Größe zunahm, da sich zusätzlich Zellen an ihren Umfang anhafteten. Als zweite Methode zur Messung der Adhäsion wurde die im Beispiel 2 beschriebene quantitative Untersuchung angewendet. Zellsuspensionen wurden 2 Stunden lang bei 200 U/min geschüttelt, auf ein Hämozytometer übertrugen und die Zellen ausgezählt, die nicht zu Zusammenballungen geformtwaren. Beim Fehlen von PMA waren 42%(SD -- 20%,N = 6) der JY-Zellen nach 2 Stunden in Zusammenballungen vereint, während JY-Zellen, die unter identischen Bedingungen mit 50ng/ml PMA inkubiert worden waren, 87% der Zellen (SD = 8% N = 6) in Zusammenballungen enthielten. Kinetische Untersuchungen der Aggregation zeigten, daß PMA die Rate und Größenordnung der Aggregation zu allen untersuchten Zeitpunkten erhöhte (Abb. 3).
Um die Wirkung der monoklonalen Anti-LFA-1 -Antikörper auf die PMA-induzierte Zellaggregation zu untersuchen, wurden diese Antikörper Zellen zugesetzt, die nach der qualitativen Aggregationsuntersuchuny aus Beispiel 2 inkubiert worden waren. Es wurde festgestellt, da'J die monoklonalen Antikörper die Bildung von Zusammenballungen von Zellen sowohl bei Vorhandensein als ai ch bei Fehlen von PMA unterbinden. Sowohl die F(ab')2- «ils auch die Fab'-Fragmente der monoklonalen Antikörper gegen Jie Alpha-Kette von LFA-1 waren in der Lage, die Zellaggregation zu unterbinden. Während im wesentlichen 100% der Zellen Zusammenballungen bildeten, wenn der Anti-LFA-1-Antikörper fehlte, waren nur weniger als 20% der Zellen in Zusammenballungen enthalten, wenn der Antikörper zugesetzt wurde. Die Ergebnisse dieses Experimentes wurden von Rothlein, R., u.a. (J. Exper. Med. 163:1132-1149 [1986]), beschrieben.
Auf die in dem Beispiel 1 beschriebene Art und Weise wurden EBV-transformierte Lymphoblastoidzellen von Patienten hergestellt. Diese Zellen wurden nach monoklonalen Antikörpern, die LFA-1 erkennen konnten, „screeniert", und es wurde festgestellt, daß die Zellen LFA-1-defizient waren.
Die im Beispiel 2 beschriebene qualitative Aggregationsuntersuchung wurde unter Anwendung der cu. »schriebenen, LFA-1-defizienten Zellen angewendet. Derartige Zellen ballten sich bei Vorhandensein von PMA nicht spjiu.in zusammen.
Die LFA-1-defizienten Zellen aus Beispiel 5 wurden mit Karboxyfluoreszeindiazetat (Patarroyp, M., u.a., Cell Immunol. 63: 237-248 [1981 ]) markiert. Die markierten Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:10 mit autologen oder JY-Zellen gemischt, und der Prozentsatz der fluoreszeinmarkierten Zellen in den Zusammenballungen wurde nach dem Verfahren von Rothlein, R., u. a., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986), bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die LFA-1-defizienten Zellen zur Koaggregation mit LFA-1-expressierenden Zellen in der Lagewaren (Abb.4).
Um festzustellen, ob LFA-1 nur bei der Bildung der Zusammenballungen oder auch bei ihrer Erhaltung von Bedeutung ist, wurden den bereits gebildeten Zusammenballungen in der oben beschriebenen Weise Antikörper zugesetzt, die sich an LFA-1 binden können. Es wurde festgestellt, daß der Zusatz des Antikörpers die vorgeformten Zusammenballungen stark unterbrach. Video-Zeitraffer-Aufnahmen bestätigten, daß der Zusatz der monokonalen Antikörper zu den vorgebildeten Zusammenballungen innerhalb von 2 Stundt ί deren Aufspaltung zu bewirken begann (Tabelle 1). Nach dem Zusatz von mone .donalen Antikörpern gegen LFA-1 dauerten die Pseudopodialbewegungen und Änderungen in der Form einzelner Zellen innerhalb der Zusammenballungen unverändert an. Einzelne Zellen lösten sich allmählich aus dem Rand der Zusammenballung; nach 8 Stunden waren die Zellen vorwiegend dispergiert. Bei Video-Zeitraffer-Aufnahmen schien das Aufbrechen der vorher gebildeten Zusammenballungen durch monoklonale LFA-1-Antikörper gleichwertig zu sein mit dem Aggregationsprozeß beim Fehlen von monoklonalen LFA-1-Antikörpern, wenn man zeitlich zurückging.
gebildete, PMA-induzierte JY-Zellzusammenballungen aufzubrechen
2 Stunden* 18 Stunden
-mAb +mAb
1 4+ 4+ H-"
2 3+ 4+ 1+c
3 5+ 5+ 1+d
Die Aggregation bei der qualitativen Mikrotiter-Platten-Analyse wurde visuell bewertet. War während der gesamten Analyseperiode Anti-I.FA-1 vorhanden, betrug die Aggregation weniger als 1 +.
a Menge der Aggregation unmittelbar vor dem Zusatz des monoklonalen
Antikörpoi s bei 2 Stunden, b TS1/18 + TS1/22 c TS1/18 d TS1/22
LFA-1 -abhängige Adhäsionen zwischen zytotoxischen T-Zellen und Zielen verlangen immer das Vorhandensein von Magnesium (Martz, E., J. Cell. BIoI. 84:584-598 (1980)). Die PMA-induzierte JY- Zellaggregation wurde auf die Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen untersucht. JY-Zellen ballten sich (unter Anwendung der Untersuchung aus dem Beispiel 2) nicht zusammen, wenn das Medium frei von Kalzium- oder Magnesiumionen war. Der Zusatz von zweiwertigem Magnesium unterstützte die Aggregation bereits bei so niedrigenKonzentrationen wio 0,3 mM. Der Zusatz von Kalziumionen allein hatte nur geringe Wirkung. Es wurde jedoch festgestellt, daß Kalziumionen die Fähigkeit der Magnesiumionen verstärken, die PMA-induzierte Aggregation zu unterstützen. Wenn dem Medium 1,25 mM Kalziumionen zugesetzt wurden, reichten bereits so niedrige Konzentrationen wie 0,02 mM Magnesiumionen aus, um die Aggregation zu unterstützen. Diese Daten zeigten, daß die LFA-1 -abhängige Aggregation von Zellen Magnesiumionen braucht und daß Kalziumionen zwar allein unzureichend sind, mit den Magnesiumionen aber eine synergistische Wirkung hervorrufen, um die Aggregation zu ermöglichen.
Die Isolierung von Hybrldomzellen, die zur Expression von monoklonalen Antl-ICAM-1-Antikörpern in der Lage sind Monoklonafe Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 in der Lage sind, wurden nach der Methode von Rothlein, R., u.a., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986), isoliert, und dieser Literaturhinweis wird hier als Verweis einbezogen. So wurden 3 BALB/C-Mäuse intraperitoneal mit EBV-trans'ormierten, peripheren, mononuklearen Blutzellen von LFA-1-defizienten Personen immunisiert (Springer, T. A., u.a., J. Exper. Med. 160:1901 [1984]). Für jede Immunisierung wurden etwa 107 Zellen in 1 ml Medium RPM11640 verwendet L'.e Immunisierungen wurden 45,29 und 4 Tage vor der Entnahme der Milzzellen aus den Mäusen durchgeführt, um daraus die gewünschten Hybridomzellstämme herstellen zu können. Am Tag 3 vor der Entnahme der Milzzellen erhielten die Mäuse zusätzlich 107 Zellen in 0,15ml Medium (intravenös).
Die isolierten Milzzellen von den oben beschriebenen Tieren wurden mit Myelomzellen P3X73 Ag 8,653 in einem Verhältnis von 4:1 nach dem Protokoll von Galfre, G., u.a., Nature 266:550 (1977), verschmolzen. Aliquote der resultierenden Hybridomzellen wurden in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen eingeführt. Die obenaufschwimmenden Hybridomschichten wurden auf
Unterbindung der Aggregation „screeniert" und ein unterbindendes Hybridom (von mehr als 600 getesteten Vertiefungen) wurde kloniert und subkloniert durch begrenzende Verdünnung. Dieser Subklon wurde als RR1 /1.1.1 bezeichnet (nachstehend abgekürzt als „RR1/1").
Es wurde konsistent festgestellt, daß der monoklonale Antikörper RR1/1 die PMA-stimulierte Aggregation des LFA-1-expressierenden Zellstamms JY unterbindet. Der monoklonale RR1/1-Antikörper unterband die Z jsammenballung im gleichen Maße oder etwas geringer als einige monoklonale Antikörper zu den LFA-1-Alpha- oder -Beta-Untereinheiten. Der monoklonale Kontrollantikörper gegen HLA dagegen, der auf JY-Zellen reichlich expressiert wird, unterband die Aggregation nicht. Das durch den monoklonalen Antikörper RR1/1 gebundene Antigen wird als interzellulares Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) bezeichnet.
Verwendung von monoklonalen Antl-ICAM-1-Antikörpern zur Charakterisierung des ICAM-1-Molekuls Um die Natur von ICAM-1 bestimmen zu können und um insbesondere feststellen zu können, ob ICAM-1 von LFA-1 verschieden ist, wurden un ir Verwendung des mcnoklonalen Antikörpers RR1 /1 Zellproteine immunoausgefällt. Die Immunoausfällung wurde nach der Methode von Rothlein, R. u. a. (J. Immunol. 137:1270-1274 [1986)), durchgeführt. JY-Zellen wurden mit 5 x 107 Zellen/ml in 1 % Triton X-100,0,14m NaCI, 1OmM Tris, pH-Wert 8,0, mit frisch zugesetztem 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 Einheiten je ml Trypsininhibitoraprotinin (Lysepuffer) 20 Minuten lang bei 4°C lysieri. Die Lysate wurden 10min bei 10000 x g zentrifugiert und mit 50μΙ einer 50%igen Suspension von CNBr-aktivierter, glyzin-abgeschreckter Sepharose C1-4B eine Stunde lang bei 4°C vorgeklärt. Ein Milliliter des Lysats wurde mit 20 μΙ einer 50%igen Suspension des monoklonalen Antikörpers RR1/1, gekoppelt an Sepharose C1-4B (1 mg/ml), über Nacht bei 4°C immunoausgefällt (Springer, T. A. u.a., J.Exper.Med.160:1901 [1984)). Sepharosegebundener Antikörper (monoklonal) wurden unter Einsatz der CNBr-Aktivierung von Sepharose CL-4B in Karbonatpuffer nach der Methode von March, S.u.a. (Anal.Biochem.60:149 [1974]), hergestellt. Die gewaschenen Immunoausfällungen wurden einer SDS-PAGE und Silberfärbung nach dem Verfahren von Morrissey, J.H., Anal.Biochem.117: 307 (1981), unterzogen.
Nach der Eluierung der Profine mit SDS-Probenpuffer (Ho, M.K.u.a., J.BIol.Chem.258: 636 [1983]), bei 1000C wurden die Proben in zwei Hälften geteilt und der Elektrophorese (SDS -8% PAGE) unter reduzierenden (Abb. 5A) oder nichtreduzierenden Bedingungen (Abb. 5B) unterzogen. Bänder mit Molekulargewichten von 50kd und 25 kd entsprachen der schweren und der leichten Kette von Immunoglobulinen von der monoklonalen Antikörper-Sepharose (Abb. 5 A, Bahn 3). Beobachtet wurden auch veränderliche Mengen anderer Bänder im Gewichtsbereich von 25 bis EOkd, sie konnten aber nicht in den Ausfällungen von Haarleukämiezellen beobachtet werden, die nur ein Molekulargewichtsband von 90kd ergaben. Es wurde festgestellt, daß die Alpha-Untereinheit zu 177kd und die Beta-Untereinheit zu 95kd von LFA-1 sowohl unter reduzierenden (Abb. 5A, Bahn 2), als auch unter nichtreduzierenden (Abb. 5 B, Bahn 2) Bedingungen von ICAM-1 unterschiedlich wandern. Um die Wirkung des monoklonalen Antikörpers RR1/1 auf die PHA-Lymphoblast-Aggregation zu bestimmen, wurde die qualitative Aggregationsuntersuchung angewendet, dio im Beispiel 2 beschrieben wurde. So wurden T-Zellen-Blastzellen 4 Tage lang mit PHA stimuliert, gründlich gewaschen und anschließend 6 Tage lang bei Vorhandensein eines IL-2-konditionierten Mediums gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß PHA während dieser 6-Tage-Kultur im Inner ί blieb und nicht zur Aggregationsuntersuchung beitrug. In drei unterschiedlichen Untersuchungen mit verschiedenen T-Zellen-Blastpräparaten unterbanden monoklonale ICAM-1-Antikörper konsistent die Aggregation (Tabelle 2).
Unterbindung der PMA-stimulierten PHA-Lymphoblastaggregation durch den monoklonalen RR1/1-Antikörper"
Exp. PMA MAb % Aggregation % Unterbindung"
-14d 39 39 2'
78 36
-14 -19
96
51
1 Die Aggregation von PHA-induzierten Lymphoblasten, die mit 50ng/ml PMA stimuliert worden waren, wurde indirekt quantitativ bestimmt durch
mikroskopiscnes Zählen der Anzahl der nichtzusammengeballten Zellen, wi-3 das im Beispiel 2 beschrieben wurde. b Prozentale Unterbindung im Verhältnis zu den mit PMA und dem monoklonalen Antikörper X63 behandelten Zellen. c Aggregation wurde eine Stunde nach dem gleichzeitigen Zusatz des monoklonalen Antikörpers und von PMA gemessen. Die Zellen wurden mit175 U/min geschüttelt.
d Eine negative Zahl gibt die prozentuale Zunahme der Aggregation an
' Aggregation wurde eine Stunde nach dem gleichzeitigen Zusatz des monoklonalen Antikörpers und von PMA gemessen. Die Zellen wurden mit200 χ g für die Dauer von 1 min pelletiert, bei 37'C für die Dauer von 15min inkubiert, vorsichtig wieder suspergiert und 45min mit 10üU/min
geschüttelt
' Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37X mit PMA vorbehandelt. Nach dem Zusatz des monoklonalen Antikörpers wurden die Röhrchen 20minlang stationär bei 37°C inkubiert und 100min lang bei 75U/min geschüttelt.
| Kontrolle | 9 |
| Kontrolle | 51 |
| HLA-A,B | 58 |
| LFA-1 Alpha | 31 |
| ICAM-1 | 31 |
| Kontrolle | 10 |
| Kontrolle | 78 |
| LFA-1 Beta | 17 |
| ICAM-1 | 50 |
| - | 7 |
| Kontrolle | 70 |
| HLA-A,B | 80 |
| LFA-3 | 83 |
| LFA-1 Alpha | 2 |
| LFA-1 Beta | 3 |
| ICAM-1 | 34 |
Monoklonal LFA-1 -Antikörper waren konsistent stärker unterbindend als monoklonal ICAM-1 -Antikörper, während monoklonale HLA-A-, -B- und LFA-3-Antikörper ohne Wirkung waren. Diese Ergebnisse zeigen, daß von den getesteten monoklonalen Antikörpern nur diejenigen, welche sich an LFA-1 oder an ICAM-1 binden können, in der Lage sind, die Zelladhäsion zu unterbinden.
Immunisierung
Eine Balb/C-Maus wurde intraperitoneal (i. p.) mit 0,5ml2 χ 107 JY-Zollen in RPMI-Medium 103 Tqge und 24 Tage vor der Verschmelzung immunisiert. Am Tag 4 und 3 vor der Verschmelzung wurden die Mäuse i.p. mit 107 Zellen von PMA-differentierten Zellen U937 in 0,5ml RPMI-Medium immunisiert.
U937-Zellen (ATCC CRL-1593) wurden durch Inkubation bei 5 x 10Vml in RPMI-Medium mit 10% fetalem Rinderserum, 1 % Glutamin und 50Mg/ml Gentamycin (Komplettmedium), das 2 ng/ml Phorbol-12-Myristatazetat (PMA) enthielt, in einem sterilen Polypropylenbehälter differentiert. Am dritten Tag dieser Inkubation wurde die Hälfte des Volumens des Mediums abgezogen und durch frisches Komplettmedium, das PMA enthielt, ersetzt. Am Tag 4 wurden die Zellen entfernt, gewaschen und für die Immunisierung vorbereitet.
Milzzellen von den immunisierten Mäusen wurden im Verhältnis von 4:1 mit Myelomzellen P3 χ 63 Ag8.653 nach Galfre, u.a. (Nature 266:550 [1977]), verschmolzen. Nach der Fusion wurden die Zellen in Flachboden-Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 106 Milzzellen/Vertiefung plattiert.
Nach einer Woche wurden 50μΙ der obonaufsciiwimmenden Schicht in der qualitativen Aggregationsuntersuchung nach Beispiel 2 unter Verwendung von JY und SKW-3 als aggregierenden Zellstämmen „screeniert". Die Zellen aus den obenaufschwimmenden Schichten, welche die Aggregation von JY-Zellen, nicht aber die der SKW-3-Zellen unterbanden, wurden ausgewählt und unter Einsatz der begrenzenden Verdünnung zweifach Moniert.
Dieses Experiment führte zur Identifizierung und Klonierung von drei getrennten Hybridomstämmen, die anti-ICAM-1 -monoklonale Antikörper produzieren. Die durch diese Hybridomstämme produzierten Antikörper waren lgG2a, lgG2b bzwl IgM. Der Hybridomzellstamm, welcher den Anti-ICAM-1 -Antikörper IgG2, produzierte, erhielt die Bezeichnung R6'5'D6'E9'B2. Der Antikörper, der durch den bevorzugten Hybridomzellstamm produziert wurde, erhielt die Bezeichnung R 6'5'D6'E9'B 2 (nachstehend als „R6-5-D6" bezeichnet).
Die Expression und Regulierung von ICAM-1
Um die ICAM-1-Expression zu messen, wurde eine Radioimmununtersuchung entwickelt. Bei dieser Untersuchung wurde gereinigter RR1 /1 unter Verwendung von Jodogen auf eine spezifische Aktivität von 10μΟί/μρ jodiert. In Platten mit 96 Vertiefungen wurden Endothelzellen gezogen und so behandelt, wie das für die einzelnen Experimente beschrieben wurde. Die Platten wurden auf 40C gekühlt, wozu sie für die Dauer von 0,5 bis 1 Stunde in einen Kühlraum gegeben wurden, nicht direkt auf Eis. Die Monoschichten wurden dreimal mit kalten Komplettmedien gewaschen und dann 30 min bei 4°C mit 125I-RR1/1 inkubiert. Dann wurden die Monoschichten dreimal mit Kompleftmedium gewaschen. Das gebundene 126I wurde unter Verwendung von 0,1 N NaOH freigesetzt und gezählt. Die spezifische Aktivität von '26I-RR1/1 wurde unter Verwendung von nichtmarkiertem RR1/1 abgestimmt, um über dem Bereich von Antigendichten, der bei dieser Untersuchung vorkommt, ein lineares Signal zu erhalten. Die nichtspezifische Bindung wurde bei Vorhandensein eines tausendfachen Überschusses an unmarkiertem RR1/1 bestimmt und von der Gesamtbindung subtrahiert, was die spezifische Bindung ergibt.
Die ICAM-1-Expression, gemessen unter Anwendung der oben beschriebenen Radioimmununtersuchung, erhöht sich bei menschlichen Nabelvenenendothelzellen (HUVEC) und Endothelzdllen der menschlichen Vene saphenus (HSVEC) durch IL-I, TNF, LPS und IFN-Gamma (Tabelle 3). Endothelzellen der Vene saphenus wurden in dieser Untersuchung dazu genutzt, die Ergebnisse von Nabelvenenendothelzellen in gezüchteten Endothelzellen der großen Vene, die vom Gewebe Erwachsener abgeleitet wurden, zu bestätigen. Die Basalexpression von ICAM-1 ist bei Endothelzeilen der Vene Saphenus um das zweifache höher als bei Nabelvenenendothelzellen. Werden Nabelvenenendothelzellen rekombinantem IL-I Alpha, IL-1 Beta und TNF Gamma ausgesetzt, erhöht sich die ICAM-1-Expression um das 10- bis 20fache. IL-1 Alpha, TNF und LPS waren die mächtigsten Induktoren, IL-1 - war auf Gewichtsbasis und auch bei Sättigungskonzentrationen für die Reaktion weniger stark (Tabelle 3). IL-I Beta erhöhte bei einer Konzentration von 100 ng/ml die ICAM-1-Expression auf HUVEC um das 9fache und auf HSVEC um das 7,3fache bei einer halbmaximalen Steigerung bei 15ng/ml. Bei einer Konzentration von 50ng/ml erhöhte rTNF die ICAM-1-Expression auf HUVEC auf das 16fache und auf HSVEC um das 11 fache mit halbmaximalen Wirkungen bei 0,5ng/ml. Interferon-Gamma produzierte einen signifikanten Anstieg in der ICAM-1-Expression um das 5,2fache auf HUVEC oder das 3,5fache auf HSVEC bei 10000 Einheiten/ml. Die Wirkung von LPS war bei einer Konzentration von ^g/ml in der Größenordnung der von rTNF ähnlich. Paarweise Kombinationen dieser Mediatoren ergaben additive oder leicht unter den additiven liegende Wirkungen auf die ICAM-1 -Expression (Tabelle 3). Eine Kreuztitrierung von rTNF mit rlL-1 Beta oder rlFiM Gamma ergab keinen Synergismus zwischen diesen bei suboptimalen oder optimalen Konzentrationen.
Da LPS die ICAM -1-Expression auf Endothelzellen auf einer Ebene verstärkte, wie sie manchmal bei Kulturmedien gefunden wird, wurde die Möglichkeit untersucht, daß die ICAM-I-Basalexpression auf LPS zurückzuführen sein könnte. Bei der Prüfung verschiedener Serumposten wurde festgestellt, daß das niedrige Endotoxinserum eine um 25% niedrigere ICAM-1-Basalexpression ergab. Alle hier angegebenen Ergebnisse beziehen sich auf Endotheizellen, die in niedrigem Endotoxinserum gezogen wurden. Die Einbeziehung des LPS-neutralisierenden, antibioischen Polymyxins B bei einor Konzentration ve η lOpg/ml verringerte aber nur die ICAM-1-Expression um weitere 25% (Tabelle 3). Die Zunahme der ICAM-1-Expression bei Behandlung mit IL-I oderTNF wurde nicht durch das Vorhandensein von 1ÖMg/ml Polymyxin B bewirkt, was mit den Niedrig-Endotoxin-Pegeln bei diesen Präparaten übereinstimmt (Tabelle 3).
Tabelle 3 Antl-ICAM-monoklonale Antikörper
| Zustand (16h) | '"!•spezifisch gebunden (CPM) | _ | 9x | HSVEC | _ | 7,3 x | - |
| HUVEC | 16X | 1132 + 31 | 11,2x | ||||
| Kontrolle | «03±11 | 16X | 8 320 ±766 | 9,2x | |||
| IOOng/nilrlL-1 Beta | 5 680 ±633 | 15x | - | 3,5x | |||
| 50ng/mlrlL-1 Alpha | 9910 ±538 | 5;2x | 12 690 ±657 | 14x | |||
| 50 ng/mlrTNF Alpha | 9 650 ±1500 | 24 x | 10 459 ±388 | 10x | |||
| 10ng/mlLPS | 9530 ±512 | 23X | 4 002 ±664 | 7,4 x | |||
| 10ng/mlrlFN Gamma | 3120 ±308 | 13X | 16269 ±660 | 14x | |||
| rlL-1-Beta + rTNF | 1469 ±1410 | 24X | 10 870 ±805 | 12x | |||
| rlL-1 Beta + LPS | 13 986 ±761 | 22X | 8401 ±390 | 10x | |||
| rlL-1 Beta + rlFN Gamma | 7 849 ±601 | 17X | 16141 ±1272 | - | |||
| rTNF + LPS | 15364±1241 | - | 13 238 ±761 | - | |||
| rTNF + rlFN Gamma | 13480 ±1189 | 11X | 10987 + 668 | - | |||
| LPS+ IFN Gamma | 10 206 ±320 | 2Ox | - | - | |||
| Polymyxin B (10 Mg/ml) | 480 ±23 | 13X | - | ||||
| Polymyxin B + rlL-1 | 5 390 ±97 | 1,1x | - | ||||
| Polymyxin B + rTNF | 9 785 ±389 | - | |||||
| 1 Mg/ml LPS | 7 598 ±432 | ||||||
| Polymyxin B + LPS | 510±44 | ||||||
Die Hochregulierung von ICAM-1-Expression auf HVEC und HSVEC-HUVEC oder HSVEC wurde in Platten mit 96 Vertiefungen im Verhältnis von 1:3 aus einer konfluenten Monoschicht eingebracht und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Dann wurden die Zellen mit den angegebenen Materialien oder Medien 16 Stunden behandelt, und es wurde RIA wie bei den Methoden vorgenommen. Alle Punkte wurden vierfach bestimmt.
Kinetik dar lnterleukln-1- und Gamma-Intorferon-Induzlerung von ICAM-1
Die Kinetik der lnterleukin-1- und Gamma-Interferon-Wirkungen auf die ICAM-1-Expression auf Hautfibroblasten wurde unter Anwendung der '"l-Ziegen-Antimaus-lgC-Bindungsuntersuchung von Dustin, M. L., u. ε. (J.Imiviunol. 137:245 bis 254 (19861), untersucht, und dieser Literaturhinweis wird als Verweis einbezogen. Um diese Bindungsuntersuchung durchzuführen, wurden menschliche Hautfibroblasten in einer Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen bis zu einer Dichte von 2,8 x 104 Zellen/Vertiefung (0,32cm2) gezogen. Die Zellen wurden zweimal mit Medium RPM11640, das wie im Beispiel 1 ergänzt war, gewaschen. Zusätzlich wurden die Zellen einmal mit einer ausgewogenen Hanks-Salzlösung (HBSS), 1OmM HEPES, 0,05% NaN3 und 10% wärmeinaktiviertem, fetalen Rinderserum gewaschen. Das Waschen mit diesem Bindungspuffer erfolgte bei 40C. Jeder Vertiefung wurden 50μΙ der entsprechenden obenaufschwimmenden Hybridomschicht mit X63 und W6/32 als negtiver bzw. positiver Kontrolle und 50μΙ des oben beschriebenen Bindungspuffers zugesetzt. Nach einer Inkubation bei 4°C unter sanftem Rühren und für die Dauer von 30mir. wurden die Vertiefungen zweimal mit dem Bindungspuffer gewaschen und der zweite Antikörper, I26l-Ziege-Antimaus IgG, wurde mit 5OnCi in lOOplzugosetzt. Der 12Sl-Ziege-Antimaus-Antikörper wurde unter Einsatz von Jodogen (Pierce) nach der Methode von Fraker, P. J., u.a. (Biochem.Biophys.Res.Commun.80:84 (1978)), hergestellt. Nach 30min bei 4°C wurden die Vertiefungen zweimal mit 200μΙ Bindungspuffer gewaschen, und die Zellschicht wurde durch den Zusatz von 100μΙ von 0,1 N NaOH solubilisiert. Diese und eine ΙΟΟμΙ-Waschung wurden in einem Beckman-Gamma-Zähler 5500 ausgezählt. Die spezifischen gebundenen Zählungen je Minute wurden als (cpm mit dem monoklonalen Antikörper) - (cpm mit X63) berechnet (cpm = Zählung/min). Alle Schritte, einschließlich der Induzierung mit speziellen Reagentien, wurden vierfach ausgeführt.
Die Wirkung von Interleukin 1 mit einer Halbwertszeit für die Induziorung von ICAM-1 von 2 Stunden war schneller als die von Gamma-Interfercn mit einer Halbwertszeit von 3,75 Stunden (Abb. 6). Der Zeitablauf des Rückgangs auf Ruhepegel von ICAM-1 schien vom Zellzyklus oder von der Rate des Zellwachstums abhängig zu sein. Bei ruhenden Zellen sind die Wirkungen von Interleukin 1 und Gamma-Interferon über 2 bis 3 Tago stabil, während die ICAM-1-Expression bei log-Phasen-Kulturen nach der Entfernung dieser induzierenden Mittel etwa 2 Tage in der Nähe der Grundlinie bleibt.
Die Dosisreaktionskurven für die Induzierung von ICAM-1 durch rekombinantes Mäuse- und menschliches Interleukine und für rekombinantes menschliches Gamma-interferon werden in der Abb. 7 gezeigt. Es wurde festgestellt, daß Gamma-Interferon und Interleukin ähnliche Konzentrationsabhängigkeiten mit annähernd identischen Wirkungen bei 1 ng/ml haben. Das rekombinante menschliche und Mäuse-Interleukin 1 haben auch ähnliche Kurven, sie sind jedoch weit weniger effektiv als menschliche lnterleukin-1 -Präparate bei der Induzierung der Expression von ICAM-1.
Zyklohexamid, ein Hemmer der Proteinsynthese, und Aktinomyzin D, ein Hemmer der mRNA-Synthese, heben die Wirkungen von Interleukin 1 und Gamma-Interferon auf die Expression von ICAM-1 auf Fibroblasten auf (Tabelle 4). Außerdem unterband Tunikamycln, ein Hemmer der N-vernettten Glykosylation, die Wirkung von Interleukin 1 nur um 43%. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Protein- und mRNA-Synthese, nicht aber die N-vernetzte Glykosylation, für Steigerungen der Expression von ICAM-1, die durch Interleukin 1 und Gamma-Interferon stimuliert werden, erforderlich sind.
Wirkung von Zykloheximid, Aktinomycin D und Tunikamycin auf die Induzierung von ICAM-1 durch IL-I und Gamma-IFN auf menschlichen Hautfibroblasten*
| Behandlung | 125l-Ziege-Antimaus-lgG, spezifisch | Anti-ICAM-1 | Anti-HLA-A,B,C |
| gebunden (cpm) | 1524 ±140 | 11928 ± 600 | |
| 1513±210 | 10 678 ±471 | ||
| Kontrolle (4 h) | 1590 + 46 | 12 276 ±608 | |
| + Zykloheximi | 1461 ±176 | 12340 ±940 | |
| + Aktinomycin D | T «.VT -L. LIW | 12155±510 | |
| + Thunikamycin | 1619 ±381 | 12676±446 | |
| iL 1 (1OEh./iiiii{4ii/ | 1613 ±88 | . 12294±123 | |
| + Zykloheximid | 3084±113 | 13434±661 | |
| + Aktinomycin D | 4659±109 | 23 675 ±500 | |
| + Tunikamycin | 1461± 59 | 10 675 ±800 | |
| IFN-Y(10Eh/ml)(18h) | 1326 ±186 | 12 089 ±500 | |
| + Zykloheximid | |||
| + Aktinomycin D |
a Menschliche Fibroblaste wurden bis 2u einer Dichte von 8x 10' Zellen/0,32cm] Vertiefung gezogen. Die Behandlungen wurden in einem Endvolumen von 50μΙ ausgeführt, das die angegebenen Reagentien enthielt. Zykloheximid, Aktinomycin D und Tunikamycin wurden zum gleichen Zeitpunkt wie die Zytokine in einer Konzentration von 20 pg/ml, 10μΜ bzw. 2pg/ml zugesetzt. Alle Punkte sind das Mittel aus jeweils vijr Vertiefungen + SD (Standardabweichung).
Die Gewebeverteilung von ICAM-1
An gefrorenem Gewebe menschlicher Organe wurden histochemische Untersuchungen durchgeführt, um die Verteilung von ICAM-1 in Thymus, Lymphknoten, üarm, Haut, Nieren und Leber zu bestimmen. Zur Durchführung dieser Analyse wurden gefrorene Gewebesektionen {4 pm stark) von normalem menschlichen Gewebe 10min lang in Azeton fixiert und mit dem monoklonalen Antikörper TR1/1 durch eine Immunoperoxidase-Technik gefärbt, welche mit der Avidin-Biotin-Komplexmethode arbeitet (Vectort Laboratories, Burlingame, CA), die von Cerf-Bensussan, N., u.a. (J. Immunol. 130:2615 [1983]) beschrieben wurde. Nach der Inkubation mit dem Antikörper wurden die Schnitte nacheinander mit biotinyliertem Pferde-Antimaus-lgG- und avidin-biotinyliertem Peroxidasekomplex inkubiert. Abschließend wurden die Schnitte in eine Lösung getaucht, die 3-Amino-9-ethylkarbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl) enthielt, um eine Farbreaktion hervorzurufen. Dann wurden die Schnitte 5 Minuten lang in 4%igem Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Zu den Kontrollen gehören Schnitte, die anstelle des RR1/1-Antikörpers mit nichtverwandten, monoklonalen Antikörpern inkubiert worden waren.
Es wurde festgestellt, daß ICAM-1 eine Verteilung hat, welche der von Antigenen des Histokompatibilitätshauptkomplexes (MHC), Klasse II, sehr ähnlich ist. Die meisten der Blutgefäße (kleine wie auch große) in allen Geweben wiesen eine Färbung der Endothelzollen mit dem ICAM-1-Antikörper auf. Die Gefäßendothelfärbung war in den interfolikularen (parakortikalen) Abschnitten der Lymphknoten, Tonsilen und Peyerschen Plaques intensiver als in den Gefäßen der Nieren, Leber und der normalen Haut. In der Leber war die Färbung vor allem auf die sunusoidalen Auskleidungszellen beschränkt; die Hepatozyten und die Endothelzellenauskleidung des größten Teils der Protalvenen und Arterien war nicht gefärbt.
Im Thymusmark wurden eine diffuse Färbung großer Zellen und ein dendritisches Färbungsschema beobachtet. Im Krotex war das Färbungsmuster fokal und vorherrschend dendritisch. Thymozyten wurden nicht gefärbt. Im peripheren Lymphoidgewebe wurden die Keim-Mittelzellen der sekundären Lymphoidfollikel intensiv gefärbt. Bei einigen Lymphoidfollikeln war das Färbungsmuster vorwiegend dendritisch, ohne erkennbare Färbung der Lymphozyten. Außerdem wurde eine blasse Färbung der Zellen in der Mantelzone beobachtet. Daneben wurden dendritische Zellen mit zytoplasmischen Erweiterungen (ineinandergreifende Zellen des Retikulum) und eine geringe Anzahl von Lymphozyten in den Intorfollikular- oder Parakortikalabschnitten mit dem ICAM-1-bindenden Antikörper gefärbt.
Makrophagen ähnelnde Zellen wurden in den Lymphknoten und der Lamina propria des Dünndari ns gefärbt. Fibroblastähnliche (spiralförmige) Zellen und dendritische Zellen, die im Grundgewebe der meisten der untersuchten Organe verstreut waren, wurden mit dem ICAM-1-bindenden Antikörper gefärbt. Keine Färbung wurde in den Langerhansschen indeterminanten Zellen in der Epidermis festgestellt. Im glatten Muskelgewebe wurde keine Färbung entdeckt.
Die Färbung der Epithelzellen war konsistent in der Schleimhaut der Tonsilen sichtbar. Obwohl sich Hepazyten, Epithelim des Gallengangs, Epithelzellen des Darmes und rohrförmige Epithelzellen in der Niere unter den meisten Umständen nicht färbten, wiesen Schnitte von normalem Nierengewebe, die von einem Nephrektomie-Spezimen mit Renalzellenkarzinom gemacht worden waren, eine Färbung von vielen rohrförmigen Proximalzellen für ICAM-1 auf. Diese rohrförmigen Epithelzellen färbten sich auch bei einem anti-HLA-DR-bindenden Antikörper.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ICAM-1 auf nichthämotopoetischen Zellen, wie Gefäßdothelzellen, und auf hämotopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen und mitogenstimulierenden T-Lymphozytblasten, expression wird. Es wurde festgestellt, daß ICAM-1 in geringen Mengen auf peripheren Blutlymphozyten expressiert wird.
ICAM-1 wurde aus menschlichen Zellen oder Gewebe unter Anwendung der monoklonalen Antikörper-Affinitätschromatografie gereinigt. Zuerst wurde der monoklonal Antikörper RR1/1, der mit ICAM-1 reaktiv ist, gereinigt und an eine träge Koionnenmatrix gekoppelt. Dieser Antikörper wurde von Rothlein; R., u.a., J, Immunol. 137:1270-1274 (1986), und von Dustin, M. L, u.a., J. Immunol. 137:245 (1986), beschrieben. ICAM-1 wurde durch Lyse der Zellen in einem nichtionischen Reinigungsmittel, Triton X-100, bei einem annähernd neutralen pH-Wert aus Zellmembranen solubilisiert. Das Zellysat mit dem solubiiisierten ICAM-1 wurde dann durch Vorkolonnen geleitet, die dafür vorgesehen waren. Stoffe zu entfernen, die sich nichtspezifisch an das Material der Kolonnenmatrix binden, und anschließend durch die monoklonal Antikörper-Kolonnenmatrix, wodurch sich ICAM-1 an den Antikörper binden konnte. Die Antikörper-Kolonne wurde dann mit einer Reihe von reinigenden Puffer-Waschlösungen mit steigendem pH-Wert gewaschen, so daß sich der pH-Wert auf 11,0 erhöhte. Während dieser Waschungen blieb ICAM1-I an die Antikörper-Matrix gebunden, während nichtbindende und schwachbindende Verunreinigungen entfernt wurden. Das gebundene ICAM-1 wurde dann spezifisch aus der Kolonne eluiert, wobei ein Reinigungspuffer mit einem pH-Wert von 12,5 eingesetzt wurde.
Deranti-ICAM-1-monoklonale Antikörper RR1/1 wurdeaus der Aszitesflüssigkeit von hybridomtragenden Mäusen oder aus den obenaufschwimmenden Schichten der Hybridomkultur durch Standardverfahren der Ammoniumsulfatausfällung oder der Protein-1 -Affinitätschromatografie gereinigt (Ey u. a., Immunochem. 15:429 [197B]). Das gereinigte IgG oder Ratten-lgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde unter Anwendung einer Modifikation der Methode von March u.a. (Anal. Biochem. 60:149 [1974]) kovalent an Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Schweden) gekoppelt. Kurz gesagt, Sepharose CL-4B wurde in destilliertem Wasser gewaschen, mit 40mg/ml CNBr in 5M K2HPO4 (pH-Wert etwa 12) 5 Minuten lang aktiviert und dann gründlich mit 0,1 mM HCI bei 4°C gewaschen. Die gefilterte, aktivierte Sepharose wurde mit einem gleichen Volumen des gereinigten Antikörpers (2-10 mg/ml in 0,1 M NaHCOj, 0,1 M NaCI) wieder zur Suspension gebracht. Die Suspension wurde bei 4 0C 18 Stunden lang unter sanfter Rotation von einem Ende zum anderen inkubiert. Dann wurde die obenaufschwimmende Schicht durch Absorbanz bei 280nm auf ungebundene Antikörper überprüft, und die verbleibenden reaktiven Stellen an der aktivierten Sepharose wurden durch den Zusatz von Glyzin auf 0,05 M gesättigt. Die Kopplungseffektivität war in der Regel höher als 90%.
Alle Vörfahrensschritte wurden bei 4°C ausgeführt. Gefrorene menschliche Milz (Fragmente zu 200g) von Patienten mit Haarzellenleukämie wurden auf Eis in 200ml Tris-Salzlösung (5OmM Tris, 0.14M NaCI, pH-Wert 7,4 bei 40C) aufgetaut, welche 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 Einheiten/ml Aprotinin und 5 mM Jodazetamid enthielt. Das Gewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und bei 40C in einem Tekmar-Homogenisator mit Antrieb homogenisiert. Anschließend wurde das Volumen mit Tris-Salzlösung auf 300ml gebracht, und es wurden 100ml von 10%igem Tween 40 (Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat) in Tris-Salzlösung zugesetzt, was eine abschließende Konzentration von 2,5%Tween 40 ergab.
Um Membranen herzustellen, wurde das Homogenat unter Anwendung von drei Takten eines Dounce-Homogenisators oder vorzugsweise eines Potter-Elvejhen-Homogenisators aus Teflon extrahiert und dann mit 10OOx g 15 Minuten lang zentrifugiert. Die obenaufschwimmende Schicht wurde zurückbehalten, und das Pellet wurde erneut mit 200ml 2,5%igem Tween 40 in Tris-Salzlösung extrahiert. Nach einem fünfzehnminütigen Zentrifugieren bei 1000χ g wurden die obenaufschwimmenden Schichten von beiden Extraktionen kombiniert und eine Stunde lang mit 15000Ox g zentrifugiert, um die Membranen zu pelletieren. Die Membranen wurden durch erneutes Suspergieren in 200ml Tris-Salzlösung gewaschen und bei 15000Ox g eine Stunde lang zentrifugiert. Das Membranpellet wurde in 200 ml Tris-Salzlösung wieder zur Suspension gebracht und mit einem motorisierten Homogenisator und Teflon-Pistill homogenisiert, bis die Suspension gleichmäßig trüb war. Das Volumen wurde dann mit Tris-Salzlösung auf SOÜml gebracht, und es wurde N-Lauroylsarkosin bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt. Nachdem 30 Minuten lang bei 4°C gerührt worden war, wurde das unlösliche Material im Reinigungslysat durch einstündiges Zentrifugieren bei 15000Ox g entfernt. Dann wurde der obenaufschwimmenden Schicht Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 2% zugesetzt, und das Lysat wurde eine Stunde lang bei 40C gerührt.
Der EBV-transformierte R-Lymphoblastoidzellstamm JY wurde in dem Medium RPM11640 gezogen, das 10% Kalbsfötusserum (FCS) und 1OmM HePES enthielt, auf eine ungefähre Dichte vonO,8-1,0 χ 10β Zellen/ml. Um die Zeiloberflächenexpression von ICAM-1 zu steigern, wurde 8 bis 12 Stunden vor dem Ernten der Zellen Phorbol-12-MyristaM 3-Azetat (PMA) mit einer Konzentration von 25ng/ml zugegeben. Zu diesem Zeitpunkt wurde den Kulturen auch Natriumvanadat (50μΜ) zugesetzt. Die Zollen wurden durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 500x g pelletiert und durch erneutes Suspergieren und Zentrifugieren zweimal in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gewaschen. Die Zellen (etwa 5g je 5I der Kultur) wurden in 50ml Lysepuffer (0,14M NaCI, 5OmM Tris, pH-Wert 8,0,1 % Triton X-100,0,2 Einheiten/ml Aprotinin, 1 mM PMSF, 50μΜ Natriumvanadat) durch Rühren bei 4°C für die Dauer von 30 Minuten zersetzt. Nichtzersetzte Kerne und unlösliche Trümmer wurden durch Zentrifugieren mit 1000Ox g entfernt, gefolgt vom Zentrifugieren der obenaufschwimmenden Schicht mit 1500GOx g für die Dauer von einer Stunde und dem Filtern der obenaufschwimmenden Schicht durch 3-mm-Whatman-Filterpapier.
Zur großangelegten Reinigung von ICAM-1, das für strukturelle Untersuchungen verwendet wurde, wurden eine Kolonne zu 10ml von RR 1/1-Sepharose CL-4B (bei 2,5mg des Antikörpers/ml der. Gels gekoppelt) ur.d zwei 10-ml-Vorkolonnen von CNBraktivierter, glyzinabgeschreckter Sepharose CL-4 Bund Ratten-lgG, gekoppelt an Sephan.se CL-4B (2 mg/ml), verwendet. Die Kolonnen wurden in Reihe verbunden und mit 10 Kolonnenvolumen an Lysepuffer, 10 Kolonnenvolumen eines Puffers mit einem pH-Wert von 12,5 (5OmM Triethylamin, 0,1 % Triton X-100, pH-Wert 12,5 bei 4°C) vorgewaschen, gefolgt durch den Ausgleich mit 10 Kolonnenvolumen an Lysepuffer. Ein Liter des Reinigungslysats von menschlicher Milz wurde mit einer Durchflußmenge von 0,5-1 ,Oml/min eingefüllt. Die beiden Vorkolonnen wurden dazu verwendet, nichtspezifisch bindendes Material aus dem Lysat zu entfernen, bevor dieses die RR1/1 -Sepharose-Kolonne passieite.
Nach der Beschickung wurde die Kolonne von RR 1/1-Sepharose und gebundenem ICAM-1 bei einer Durchflußmenge von 1 ml/min nacheinander mit einem Minimum von 5 Kolonnenvolumen jeder der folgenden Substanzen gewaschen: 1) Lysepuffer, 2) 2OmM Tris, pH-Wert 8,0/0,14 M NaCI/0,1 % Triton X-100,3) 2OmM Glyzin, pH-Wert 10,0/0,1 % Triton X-100 und 4) 5OmM Triethylamin, pH-Wert 11,0/0,1 % Triton X-100. Alle Waschpufferlösungen enthielten 1 mM PMSF und 0,2 Einheiten/ml Aprotinin. Nach dem Waschen wurde das verbleibende gebundene ICAM-1 mit 5 Kolonnenvolumen eines Eluierungspuffers (5OmM Triethylamin/0,1 % Triton X-100, pH-Wert 12,5 bei 40C) mit einer Durchflußmenge von 1 ml/3rnin eluiert. Das eluierte ICAM-1 wurde in 1-ml-Fraktionen aufgefangen und durch den Zusatz von 0,1 ml an 1M Tris, pH-Wert 6,7, sofort neutralisiert. ICAM-1 enthaltende Fraktionen wurden durch SDS-Polyakrylamid-slektrophorese von ΙΟ-μΙ-AlJquoten identifiziert (Springer u.a.,J.Exper.Med. 160:1901 [1984]), gefolgt von einer Silberfärbung (Morrissey, J. H., Annal. Kto. ehem. 117:307 [1981 D.Unter diesen Bedingungen eluierte die Masse des ICAM-1 in etwa einem Kolonnenvolumen und war zu mehr als 90% rein, wie aus den silbergefärbten Elektropherogrammen bestimmt wurde (eine geringe Menge an IgG, aus der Af.'initätsmatrix ausgelaugt, war die Hauptkontaminante). Die Fraktionen, die ICAM-1 enthielten, wurden zusammengefaßt und etwa zwanzigfach konzentriert, wozu Mikrokonzentratoren Centricon-30 (Amicon, Danvers, MA) eingesetzt wurden. Das gereinigte ICAM-1 wurde nach der Lowry-Proteinanalyse quantitativ bestimmt, wozu ein ethanolausgefäütes Aliquot der zusammengefaßten Menge verwendet wurde: aus 200g menschlicher Milz wurden etwa 500μς reines ICAM-1 produziert.
Etwa 200pg des gereinigten ICAM-1 wurden einer zweiten Reinigungsstufe durch präparative SDS-Polyakrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Das Band, welches ICAM-1 repräsentierte, wurde durch Tränken des Gels in 1M KCI sichtbar gemacht. Der Gelbereich, der ICAM-1 enthielt, wurde dann ausgeschnitten und nach der Methode von Hunkapiller u.a., Meth. Enzymol, 91: 227-236 (1983), elektroeluiert. Das gereinigte Protein war zu mehr als 98% rein, was durch SDS-PAGE und Silberfärbung nachgewiesen wurde.
Af finitätsreinigung von ICAM-1 für fun tlonelle Untersuchungen
ICAM-1 zur Verwendung in funktioneilen Untersuchungen wurde aus Reinigungslysaten von JY-Zellen wie oben beschrieben, aber mit folgenden Modifikationen und im kleineren Maßstab (eine 1-ml-Kolonne von RR1/1-Sepharose) gereinigt. Alle Lösungen enthielten 5OmM Natriumvanadat. Nachdem die Kolonne mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 11,0, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, geweschen worden war, wurde die Kolonne noch einmal mit fünf Kolonnenvolumen des gleichen Puffers gewaschen, der anstelle von 0,1 % Triton X-1001 % n-Oktyl-beta-D-glukopyranosid (Oktylglukosid) enthielt. Das Oktylglukosidroinigungsmittel verdrängt das an ICAM-1 gebundene Triton X-100 und kann im Gegensatz zu Triton X-100 anschließend durch Dialyse entfernt werden. Danach wurde das ICAM-1 mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 12,5, der anstelle von 0,1 % Triton X-100 1 % Oktylglukosid enthielt, eluiert und wie oben beschrieben analysiert und konzentriert.
ICAM-1, das aus der menschlicher. Iz isolier, wurde, wandert in SDS-Polyakrylamidgelen als ein breites Band mit M, von 72000 bis 91000. Auch ICAM-1, das aus JV fellen isoliert wurde, wandert als ein breites Band mit M, von 76500 bis 97000. Diese M,-Werte liegen innerhalb des angegebenen Bereichs für ICAM-1, das aus unterschiedlichen Zellquellen immunoausgefällt wurde: M, = 90000 für JY-Zellen, 114000 beim myelomonolytischen Zellstamm U937 und 97000 bei Fibroblasten (Dustin, u.a., J.Immunol. 137: 245 [1986]).
Dieser breite Bereich von Μ,-Werten wurde auf ein umfassendes, aber variables Ausmaß an Glykosylation zurückgeführt. Der nichtglykosylierte Vorläufer hat einen M,-Wert von 55000 (Dustin u.a.). Das Protein, das aus JY-Zellen oder menschlicher Milz isoliert wurde, behält seine antigene Aktivität, was durch die Fähigkeit veranschaulicht wird, die ursprüngliche Affinitätskolonne erneut zu binden, und durch die Immunoausfällung mit RR 1/1-Sepharose und durch SDS-Polyakrylamid-Elektrophorese. U-Tt Peptidfragmente von ICAM-1 zu erzeugen, wurden etwa 200pg mit 2mM Dithiothreitol/2% SDS reduziert, gefolgt von der Alkylierung mit 5mM Jodessigsäure. Das Protein wurde mit Ethanol ausgefällt und in 0,1 M NH4CO3/0,1 mM CaCi2A), 1 % Zwittergent 3-14 (Calbiochem) erneut aufgelöst und bei 370C 4 Stunden lang mit 1 % (Gew./Gew.) Trypsin digeriert, gefolgt von einer zusätzlichen Digestion mit 1%igem Trypsin bei 370C für die Dauer von 12 Stunden. Die Tryptinpeptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C4-Kolonne von 0,4cm χ 15cm (Vydac) gereinigt. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten von 0% bis 60% Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert. Ausgewählte Pept Je wurden einer Sequenzanalyse auf einem Gasphasen-Mikrosequenzator (Applied Biosystems) unterzogen. Die aus 'ieser Untersuchung gewonnenen Sequenzinformationen werden in der Tabelle 5 gezeigt.
| Amino | 50 a | 50b | 46 a | Folge mit niedriger Konfldenz | 46 b | X | Peptide | K | AA | Zweideutigkeiten in der Folge; wahrscheinlichere Aminosäure wird zuerst genannt | J | U | O | M1 |
| säure- | [TA/] | A | (V/A) | Folge mit sehr niedriger Konfidenz | E | V | L | E | Hauptpeptid | A | L | V | L | |
| Test | F | S | Q | P | E | 45 | N | L | Kleineres Peptid | G | L | T | L/E | |
| 1 | L | I | T | A | L | S1 | P | D | S | G | L | P(G) | ||
| 2 | T | S | F | A | F | T | L | V | I | P | ||||
| 3 | V | L | P | P | P | V | R | L | E | G/Y | ||||
| 4 | Y | G | L | L | A | T | P | V | T | N/L | ||||
| cn | P | W | P | P | P | Y | Q | T | P | (N) | ||||
| 6 | T | P | I | I | N | G | G | C | P/V | (Q) | ||||
| 7 | S | V | G | (G) | V | — | L | S | K | (E) | ||||
| 8 | E | E | (ü) | T/l | D | E | T | (D) | ||||||
| 9 | A | S | D/P | L | S | L | S | |||||||
| 10 | G/S | V | V | - | F | F | C | |||||||
| 11 | A | T | D | K | S | E | D | |||||||
| 12 | G | V | W | P | A | -Q | ||||||||
| 13 | Q | K | T | P | ||||||||||
| 14 | V/L | S | K | |||||||||||
| 15 | i | A | ||||||||||||
| 16 | P | |||||||||||||
| 17 | X | |||||||||||||
| 18 | Q | |||||||||||||
| 19 | L | |||||||||||||
| 20 | ||||||||||||||
| 21 | ||||||||||||||
| ( ) = | ||||||||||||||
| I ] = | ||||||||||||||
| / | ||||||||||||||
| a = | ||||||||||||||
| b | ||||||||||||||
Klonleren des ICAM-1-Gens
Das Gen für ICAM-1 kann unter Anwendung eines jeden einer Reihe von Verfahren Moniert werden. Beispielsweise kann die Information über die Aminosäurefolge, die durch die Sequenzbildung von Tryptinpeptiden von ICAM-I (Tabelle 5) gewonnen wurde, dazu genutzt werden, eine Oligonukleotidfolge zu identifizieren, die dem ICAM-1-Gen entsprechen würde. Alternativ dazu kann das ICAM-1-Gen unter Verwendung eines Anti-ICAM-1-Antikörpers Moniert werden, um Klone zu bestimmen, welche ICAM-1 produzieren.
Klonleren des Gens für ICAM-1 unter Verwendung von Ollgonükleotldsonden Unter Anwendung des genetischen Codes (Watson, J. D., in: Molecular Biology of the Gene [Molekularbiologie des Gens), 3. Aufl., W. A. Benjamin Inc., Menlo Park, CA M 977]) können ein oder mehrere verschiedene Oligonukleotide identifiziert werden, die alle in der Lage wären, die ICAM-1-Tryptinpeptide zu codieren. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid tatsächlich die eigentliche ICAM-1-Codierungsfolge darstellt, kann durch Betrachtung von a-normalen Basispaarungsböziehungen und der Häufigkeit, mit der ein bestimmter Kodon tatsächlich genutzt wird (um eine bestimmte Aminosäure zu codieren) in eukaryotischen Zellen, bestimmt werden. Diese »Kodonnutzungsregeln" werden von Lathe, R., u. a„ J.Molec. BIoI. 183:1-12 (1985) beschrieben. Unter Anwendung der .Kodonnutzungsregeln" von Lathe wird ein einzelnes Oligonukleotid oder eine Reihe von Oligonukleotiden identifiziert, welche eine theoretisch „wahrscheinlichste" Nukleotidfolge (d.h., die Nukleotidfolge mit der geringsten Redundanz) enthalten, die in der Lage sind, die ICAM-1-Tryptinpeptidfolgen zu codieren.
Das Oligonukleotid oder der Satz von Oligonukleotiden, welche die theoretisch .wahrscheinlichste" Folge enthalten, welche die ICAM-1-Fragmente codieren kann, wird zur Identifizierung der Folge eines komplementären Oligonukleotids oder Satzes von Oligonukleotiden verwendet, die in der Lage sind, auf die .wahrscheinlichste" Folge oder den Satz von Folgen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid, das eine solche komplementäre Folge enthält, kann als Sonde verwendet werden, um das ICAM-1 -Gen zu identifizieren und zu isolieren (Maniatis, T., u.a., „Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY [1982]).
Wie oben im Abschnitt C beschrieben wurde, ist es möglich, das ICAM-1-Gen von eukaryotischen DNA-Präparaten zu klonieren, von denen angenommen wird, daß sie dieses Gen enthalten. Um das Gen, welches das ICAM-1 -Protein codiert, zu identifizieren und zu klo nieren, wird eine DNA-Bibliothek auf ihre Fähigkeit gesichtet, mit den oben beschriebenen Oligonukleotiden zu hybridisieren. Da es wahrscheinlich ist, daß in einer normalen Diploidzelle nur zwei Kopien des Gens für ICAM-1 enthalten sind, und da es möglich ist, daß das ICAM-1-Gen große, nichttranskribierte, intervenierende Folgen (Introns) aufweist, deren Klonierung nicht erwünscht ist, ist es vorteilhaft, ICAM-I-Codierungsfolgen aus einer cDNA-Bibliothek zu isolieren, die aus der mRNA einer ICAM-1 -produzierenden Zelle erarbeitet wurde, statt von der genomischen DNA auszugehen. Geeignete DNA- oder cDNA-Präparate werden enzymatisch gespalten oder willkürlich geschnitten und in Rekombinantvektoren ligiert. Die Fähigkeit dieser Rekombinantvektoren, auf die oben beschrieben Oligonukleotidsonden zu hybridisieren, wird dann gemessen. Verfahren für die Hybridisierung werden beispielsweise bei Maniatis, T., .Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Moleculares
Kk.tieren. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982), oder bei Haymes, B.T., u.a., „Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach" (Nukleir.säurehybridisierung. Fin praktisches Verfahren), IRL Press, Oxford, England (1985), beschrieben. Vektoren, die als für eine solche Hybridisierung geeignet ermittelt wurden, werden dann analysiert, um Umfang und Natur der ICAM-1-Folgen tu bestimmen, welche in ihnen enthalten sind. Von rein statistischen Erwägungen ausgehend, könnte ein Gen wie das, welches das ICAM-1 -Molekül codiert, unter Verwendung einer Oligonuc1 lotidsonde mit nur 18 Nuklootiden (über Hyhridisierungssichtuna) eindeutig identifiziert werden.
So kann also zusammenfassend gesagt wer Jen, daß die tatsächliche Identifizierung der ICAM-1 -Peptidfolgen die Identifizierung einer theoretisch „wahrscheinlichsten* DNA-Folge oder eines Satzes solcher Folgen ermöglicht, die in der Lage sind, ein solches Peptid zu codieren. Durch den Aufbau eines zu dieser theoretischen Folge komplementären Oligonukleotids (oder durch den Aufbau eines Satzes von Oligonukleotiden, die komplementär zum Satz der „wahrscheinlichsten" Oiigonukleotide sind) erhält man ein DNA-Molekül oder einen Satz von DNA-Molekülen, der (dta) als Sonde dienen kann (können), um das ICAM-1-Gen zu identifizieren und zu isolieren.
Unter Anwendung der ICAM-1 -Peptidfolgen aus Tabelle 5 wurde die Folge der „wahrscheinlichsten" Sequenz eines Oligonukleotids bestimmt, das in der Lage ist, die AA- und die J-Pepiide zu codieren (Tabelle 6 bzw. 7). Oiigonukleotide, die zu diesen Folgen komplementär sind, wurden synthetisier! und zur Verwendung als Sonden gereinigt, um ICAM-1-Gensequenzen zu isolieren. Geeignete, nach der Größe ausgewählte cDNA-Bibliothekon wurden aus der PoIy(A)+-RNA von PMA-induzierten HL-oO-Zellen und aus PS-stimulierten Nabelvenenendothelzellen geschaffen. Eine nach der Größe ausgewählte cDNA-ßibüothek wurde unter Verwendung von Pol .A)+-RNA aus PMA-induzierten HL-60-Zellen nach der Methode von Gubler, U., u. a., G ene25: 263-269 [1983]) und Corbi, A., u. a. (EMBO J. β: 4023-4028 [198?]) erarbeitet, wobei diese Literaturangaben hier als Refe, ciz einbezogen werden.
Eine größenselektierte cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von PoIy(A)+-RNA von Nabelvenenendothelzelleri, die 4 Stunden lang mit δμρ/ηιΙ PS stimuliert worden waren, erarbeitet. Die RNA wurde durch Homogenisieren der Zellen in 4 M Guanidiniumisothiozyanat und durch Ultrazentrifigieren der obenaufschwimmenden Schicht durch einen CsCI-Gradienten (Chirgwin, J. M., u. a., Blechern. 18:5294-5299 [1979]) extrahiert. PoIy(A)+-RNA wurde au-5 dem Gemisch aller RNA-Spezies unter Anwendung der Oligo-(dT)-Zellulose-Chromatografie (Typ 3, Collaborative Research) (Aviv, H., u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-1412 [1972]) isoliert.
| Aminosäurerest | ICAM-I-AA- | Wahrscheinlichste | Komplemen |
| von ICAM-1 | Peptid | Folge zur Codie | täre Folge |
| rung des AA-Peptids | |||
| 5' | 3' | ||
| 162 | GIu | G | C |
| A | T | ||
| G | C | ||
| 163 | Leu | C | G |
| T | A | ||
| Gf | C | ||
| 164 | Asp | G | C |
| A | T | ||
| C | G | ||
| 165 | Leu | C | G |
| T | A | ||
| G | C | ||
| 166 | Arg | C | G |
| G | C | ||
| G | C | ||
| 167 | Pro | C | G |
| C | G | ||
| C | G | ||
| 168 | GIn | C | G |
| A | T | ||
| G | C | ||
| 169 | GIy | G | C |
| G | C | ||
| C | G | ||
| 170 | Leu | C | G |
| T | A | ||
| G | C | ||
| 171 | GIu | G | C |
| A | T | ||
| G | C | ||
| 172 | Leu | C | G |
| T | A | ||
| G | C |
Fortsetzung der Tabelle 6
| Aminosäurerest | ICAM-1-AA- | Wahrscheinlichste | Komplemen |
| vonlCAM-1 | Poptid | FolgezurCodie- | täre Folge |
| rungdesAA-Peptids | |||
| 173 | Phe | τ · | A |
| T | A | ||
| T | A | ||
| 174 | GIu | G | C |
| A | T | ||
| G | C | ||
| 3' | 5' | ||
| 175 | As η | A | T |
| A | T | ||
| C | G | ||
| 176 | Thr | A | T |
| C | G | ||
| C | G | ||
| 177 | Ser | U . | A |
| C | G | ||
| A | |||
| 3' | CJl |
Der wahrscheinlichsten Nukleotidfolge komplementäres Oligonukleotid, das in der Lage ist, das ICAM-1-J-Peptid zu codieren
| Aminosäurerest | !CAM-1-AA- | Wahrscheinlichste | Komplemen |
| von ICAM-1 | Peptid | Folge zur Codie | täre Folge |
| rung von AA-Pept id | |||
| 5' | 3' | ||
| 19 | VaI | G | C |
| T | A | ||
| G | C | ||
| 20 | Thr | A | T |
| A | G | ||
| C | G | ||
| 21 | Cys | T | A |
| G | C | ||
| c' | G | ||
| 22 | Ser | T | A |
| C | G | ||
| c | G | ||
| 23 | Thr | A | T |
| C | G | ||
| C | G | ||
| 24 | Ser | T | A |
| C | G | ||
| C | G | ||
| 25 | Cys | T | Q |
| G | C | ||
| T | A | ||
| 26 | Asp | G | C |
| A | T | ||
| C | G | ||
| 27 | Gin | C | G |
| A | T | ||
| G | C | ||
| 28 | Pro | C | G |
| C | G | ||
| C | G | ||
| 29 | Lys | A | T |
| A | T | ||
| 3' | CJl |
Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung von 8 %g PoIy(A)+-RNA, Vogelmyeloblastosevirus-Umkehrtranskriptase (Life Sciences) und eines O!igo(dT)-Starters synthetisiert. Der DNA-RNA-Hybrid wurde mit RNase H (BRL) digeriert, und der zweite Strang wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (New England Biolabs) synthetisiert. Das Produkt wurde mit Eco-R 1-Methylase (New England Biolabs) methyliert, mit dem glatten Ende an Eco-R 1 -Linker (New England Biolabs) ligiert, mit Eco R1 verdaut und auf einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt größenselektiert. cDNA, die größer als 500bp war, wurde an Xgt 10 ligiert, das vorher mit Eco R1 verdaut und dephosphoryliert (Strategene) worden war. Das Ligationsprodukt wurde dann verpackt (Strategene gold).
Anschließend wurden die Nabelvenenendothelzellen- und die HL-60-cDNA-Bibliotheken mit einer Konzentration von 20000 PFU/150mm Platte plattiert. Rekombinant-DNA wurde in duplikater Form auf Nitrozellulosfilter übertragen, in 0,5M NaOH/1,5M NaCI denaturiert, in 1 M Tris, pH-Wert 7,5/1,5M NaCI neutralisiert und bei 8O0C zwei Stunden lang gebacken. (Siehe Benton, W.D. u.a., Science 196: 180-182 (1977)). Die Filter wurden in 5x SCC, das 5X Denhardt-Lösung, 5OmM NaPO4 und 1 pg/ml Lachssamenzellen-DNA enthielt, vorhybridisiert und hybridisiert. Die Vorhybridisierung erfolgte eine Stunde lang bei 45°C.
Die Hybridisierung erfolgte unter Verwendung der nicht codogenen Oligonukleotide mit 32 bp ('5-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) oder 47bp (5'-
GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGOCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC), in der oben beschriebenen Weise auf den ICAM-1 Tryptinpeptiden J bzw. AA basierend (Tabelle 6 und 7) (Lathe, R„ J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)). Die Oligonukleotide wurden mit Y-(32P)ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und unter Anwendung der vom Hersteller (New England Biolabs) empfohlenen Bedingungen endmarkiert. Nach der H/bridisierung über Nacht wurden die Filter bei 450C für die Dauer von 30 Minuten zweimal mit 2x SCC/0,1 % SDS gewaschen. Phage von den Plaques wurden isoliert, die Hybridisierung aufwiesen, und sie wurden durch aufeinanderfolgendes erneutes Plattieren Und „Screenieren" gereinigt.
Klonierung des Gens für ICAM-1 unter Anwendung eines Anti-ICAM-1-Antikörpers Alternativ dazu kann das Gen für ICAM-1 auch unter Verwendung eines Anti-ICAM-1-Antikörpers kloniert werden. DNA, vorzugsweise cDNA, wird aus einer Zelle, die ICAM-1 expressieren kann, extrahiert und gereinigt. Die gereinigte cDNA wird fragmentiert (durch Scheren, endonukleaseverdauung usw.), um einen Pool von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu schaffen. DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden dann in einem Expressionsvektor kloniert, um eine genomische Bibliothek von Expressionsvektoren zu schaffen, deren Elemente jedes ein einzigartiges, kloniertes DNA- oder cDNA-Fragment enthalten.
Anylse der cDNA-Klone
Phag-DNA von positiven Klonen wurde mit Eco R1 verdaut und unter Verwendung einer cDNA von einem Klon als Sende nach der Southern-Analyse untersucht. cDNA-lnserts von maximaler Größe wurden in die Eco R1 -Stelle des Plasmidvektors pGEM 4 Z (Progema) subkloniert, da sie querhybridisierten. HL-60-Subklone, welche die cDNA in beiden Orientierungen enthielten, wurden durch Exonuklease-Ill-Verdauung deletiert (Henikoff, S., Gene 28: 351-35911984|), wobei die Empfehlungen des Herstellers (Erase-a-Base, Progema) angewendet wurden. Progressiv deletierte cDNA wurden dann kloniert und einer Dideoxynukleotid-Kettenterminationssequenzierung (Sanger, F., u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)) nach den Empfehlungen des Herstellers (Sequenase, US Biochemical) unterzogen. Die HL-60-cDNA-5'- und Codierungsbereiche wurden an beiden Strängen vollständig sequenziert, und der 3'-Boreich wurde an beiden Strängen etwa zu 70% sequenziert. Eine repräsentative Endothel-cDNA wurde über dem größten Teil der Länge durch „Shotgun"-Klonierung von 4-bp-Erkennungsrestriktionsenzymfragmenten sequenziert.
Die cDNA-Folga einer HL-60- und einer Endothelzellen-DNA wurde ermittelt (Abb.8). Die aus 3023bp bestehende Folge enthält einen kurzen, 5'-untranslaterierten Bereich und einen 1,3kb-3'-untranslaterierten Bereich mit einem Konsensus-Polyadenylierungssignal in Position 2966. Das längste offene Leseraster beginnt mit dem ersten ATG bei Position 58 und endet mit einem TGA-terminierenden Triplett bei Position 1653. Die Identität zwischen der transferierten Aminosäurefolge und den Folgen, die von 8 verschiedenen Tryptinpeptiden ermittelt wurden, was insgesamt 91 Aminosäuren ergab (di° in der Abb.8 unterstrichen sind), bestätigte, daß authentische ICAM-1 -cDNA-Klone isoliert worden waren. Die Aminosäurefolgen von ICAM-1 Tryptinpeptiden werden in der Tabelle 8 gezeigt.
Aminosäurefolgen von ICAM-1-Tryptinpeptiden
Peptid Reste Folge
J 14-29 XGSVL VTCSTSCDQPK
U 30-39 L L G I E T P L IP) (K)
50 78-85 (T) F L T V Y X T
X 89-95 VELAPLP
AA 161-182 X ELDLRPQGLE —
LFEXTS APXQL
K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK
45 282-295 SFPAP NV (T/l) LXKPQ (V/L)
— gibt an, daß die Folge auf der nächsten Zeile fortgesetzt wird.
Unterstrichene Folgen wurden zur Herstellung von Oligonukleotidsonden verwendet.
Die Hydrophobizitätsanalyse (Kyte, J., u.a., J. Molec. Biol. 157:105-132 (1982)) läßt vermuten, daß 27 Restsignalfolgen vorhanden sind. Die Zuweisung von +1-Glutamin stimmt mit der Unfähigkeit überein, an 3 verschiedenen ICAM-1-Proteinpräparaten eine N-Terminalsequenz zu erhalten; Glutamin kann zu Pyroglutaminsäure zyklisieren, was zu einem blockierten N-Terminus führt. Die translaterierte Folge von 1 bis 453 ist vorwiegend hydrophil, gefolgt von einem 24er Rest eines hydrophoben, mutmaßlichen Transmembranbereichs. An die Transmembrandomäne schließen sich unmittelbar mehrere geladene Reste an, die in ei lern 27er Rest einer vermutlich zytoplasmischen Domäne enthalten sind.
Die vorhergesagte Größe der reifen Polypeptidkette beträgt 55219 Dalton, sie stimmt ausgezeichnet mit der beobachteten Größe von 55000 für deglykosyliertes ICAM-1 überein (Dustin, M. L, u.a., J.Immunol. 137:245-254 (1986)). Vorausgesagt werden acht N-vernetUe Glykosylationsstellen. Das Fehlen von Asparagin in den Tryptinpeptidfolgen von 2 dieser Stellen bestätigt deren Glykosylation und deren extrazellulare Orientierung. Nimmt man 2 500 Dalton je hohem mannose-N-vernetzten Kohlehydrat an, wird für den ICAM-1 -Vorläufer eine Größe von 75000 Dalton vorhergesagt, dem eine sechsfache Beobachtung von 73000 Da'ton gegenübersteht (Dustin, M.L, u.a., J.Immunol. 137:245-254(1986]). Nach der Umwandlung dieser Mannose in komplexes Kohlehydrat ist das reife ICAM-1 -Glykoprotein, in Abhängigkeit vom Zelltyp, 76 bis 114 kd groß (Dustin, M. L, u. a., J. Immunol. 137: 245-254 [1986]). Folglich ist ICAM-1 ein stark glykosyliertes, andererseits aber typisches integrales Membranprotein.
ICAM-1 ist ein integrlnbindendes Element der Immunoglobulin-Super-Gen-Famllie Zur Ausrichtung der ICAM-1-Innenwiederholungen wurde das Proteinausrichtungsprogramm Microgenie angewendet (Queen, C, u. a., Nucl. Acid. P.ss. 12: 581-59911984)), gefolgt von einer Inspektion. Die Ausrichtung von ICAM-1 auf IgM, N-CAM und MAG wurde unter Anwendung der Programme Microgenie und ALIGN durchgeführt (Dayhoff, M. O., u. a., Method. Enzymol. 91: 524-545 (19331). Vier Proteinsequenz-Datenbasen, die von der National Biomedical Research Foundation unterhalten werden, wurden unter Anwendung des Programms FASTP von Williams und Pearson (Lipman, D. J., u.a., Science 227:1435-143911985)) auf Proteinsequenzähnlichkeiten untersucht.
Da ICAM-1 ein Ligand von Integi in ist, war es unerwartet, daß es ein Glied der Immunoglobulin-Supergen-Familie sein sollte. Die Inspektion der ICAM-1 -Folge zeigt jedoch, daß sie alle Kriterien für die Zugehörigkeit zur Immunoglobulin-Supergen-Familie erfüllt. Diese Kriterien werden unten behandelt.
Die gesamte extrazellulare Domäne von ICAM-1 wird aus 5 homologen, immunoglobulinartigen Domänen gebildet, die ausgerichtet in der Abb. 9 A gezeigt werden. Die Domänen 1 bis 4 sind 88,97,99 bzw. 99 Reste lang und haben damit die typische Größe der Ig-Domäne; Domäne 5 wird innerhalb von 68 Resten verkürzt. Die Durchsuche der NBRF-Daienbasis unter Anwendung des Programms FASTP erbrachte signifikante Homologien mit Gliedern der Immunoglobulin-Supergen-Familie, einschließlich der IgM- und IgG-C-Domänen, der variablen Domäne der T-Zellenrezeptor-Alpha-Untereinheit und des Alpha-1-Beta-Glykoproteins (Abb. 9 B-D).
Unter Verwendung der obigen Informationen wurde die Aminosäurefolge von ICAM-1 mit den Aminosäurefolgen von anderen Gliedern der Immunoglobulin-Supergen-Familie verglichen.
Unterschieden wurden drei Typen von Ig-Superfamilien-Domänen, V, C1 und C 2. Sowohl die V- als auch die C-Domänen werden aus 2-ß-Bögen konstruiert, die durch die Disulfidbindung innerhalb der Domäne miteinander verbunden werden; V-Domänen enthalten 9 antiparallelo ß-Stränge, während C-Domänen 7 haben. Konstante Domänen wurden auf der Grundlage der charakteristischen Reste, die in der Abb. 9 A gezeigt werden, in C1- und C2-Sätze unterteilt. Der Ci-Satz schließt Proteine ein, die in die Antigenerkennung einbezogen sind. Der C2-Satz schließt verschiedene Fc-Kezeptoren und Proteine ein, die in die Aufruf-Adhäsion eingegliedert sind, einschließlich CD2, LFA-1, MAG und NCAM. Es wurde festgestellt, daß die ICAM-1-Domänen mit den Domänen des C2-Satzes am stärksten homolog sind, welche ICAM-1 in diesen Satz bringen; das widerspiegelt sich in der stärkeren Ähnlichkeit der erhaltenen Reste in den C2-Domänen gegenüber der in den CI-Domänen, was für die ß-Ctränge in der Abb.9 gezeigt wird, ß-Stränge B-F. Außerdem richteten sich die ICAM-1-Domänen viel besser mit den ß-SträngenAundG der C2-Domäne als mit diesen Strängen in den V- und CI -Domänen aus; das ermöglichte eine gute Ausrichtung über die gesamte Stärke der C2-Domäne. Ausrichtungen mit der C2-Domäne von NCAM, MAG und Alpha-1 -Beta-Glykoprotein werden in den Abbildungen 9B und 9C gezeigt; die Identität betrug zwischen 28% und 33%. Ausrichtungen mit einem T-Zellenrezeptor V„ mit einer Identität von 27% und der IgN-C-Domäne 3 mit 34% Identität werden ebenfalls gezeigt (Abbildungen 9 B, 9 D). Eines der wichtigsten Charakteristik von Immunoglobulindomänen sind die disulfidgebundenen Zysteine, welche die B-und F-ß-Stränge überbrücken, die die ß-Bogen-Schichtkonstruktion stabilisieren; bei ICAM-1 sind die Zysteine in allen Fällen mit Ausnahme von Strang f in Domäne 4 erhalten, wo ein Leuzin vorhanden ist, das in die Schichtkonstruktion hinein gerichtet sein und den Kontakt stabilisieren kann, wie das für einige andere V- und C2-Satzdomänen vorgeschlagen wird. Der Abstand zwischen den Zysteinen (43, 50, 52 und 37 Reste) entspricht dem für den C2-Satz beschriebenen.
Um das Vorhandensein von Zwischenkettendisulfidbindungen in ICAM-1 zu prüfen, wurde Endothelzellen-ICAM-1 unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen einer SDS-PAGE unterzogen. Endothelzellen-ICAM-1 wurde verwendet, weil es weniger Glykosylationsheterogenität als JY- oder Haarzellenmilz-ICAM-1 aufweist und eine größere Sensitivität gegenüber Verschiebungen in M, ermöglicht. Daher wurde ICAM-1 aus Endothelzellkulturen von Nabeivanen, die 16 Stunden lang mit LPS (5pg/ml) stimuliert worden waren, durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt, wie das oben beschrieben wurde. Azetonausgefälltes ICAM-1 wurde in einem Prohenpuffer (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970) mit 0,25% 2-Merkaptoethanol oder 25mM Jodazetamid erneut zur Suspension gebracht und für die Dauer von 5min auf 1000C gebracht. Die Proben wurden SDS-PAGE 4670 und einer Silberfärbung 4613 unterzogen. Endothelzellen-ICAM-1 hatte einen scheinbaren M,-Wert von 100kd unter reduzierenden und von 96kd unter nichtreduzierenden Bedingungen, was stark das Vorhandensein von Zwischenkettendisulfiden im ursprünglichen ICAM-1 vermuten läßt.
Die Anwendung der Primärfolge zur Vorhersage der Sekundärstruktur (Chou, P. Y., u.a., Biochem. 13:211-245 (19741) zeigte die 7 erwarteten Stränge β in jeder ICAM-1-Domäne, die oben in der Abb. 9 A mit a-g bezeichnet sind, womit genau die Vorhersage für eine Immunoglobulindomäne erfüllt wird und was den Positionen A-H in Immunoglobulinen entspricht (Abb.9 A, unten). In der Domäne 5 fehlen die A- und C-Stränge, aber das diese Ränder der Bögen bilden, konnten sich diese Bögen trotzdem bilden, wobei vielleicht der Strang D den Platz von Strang C einnimmt, wie das für einige andere C2-Domänen vorgeschlagen wurde; und die charakteristische Disulfidbindung zwischen den B- und F-Strängen bliebe unbeeinflußt. Folglich erfüllen die Kriterien der
Größe der Domäne, der Sequenzhomologie, der erhaltenen Zysteine, welche die mudnaßliche Zwischendomänen-Disulfidbindung bilden, und die vorhergesagte ß-Bogenstruktur alle die Bedingungen für die Zugehörigkeit von ICAM-1 zur Immunoglobulin-Supergen-Familie.
Es wurde festgestellt, daß ICAM-1 am stärksten homolog mit den NCAM- und MAG-Glykoproteinen des C2-Satzes ist. Das ist besonders interessant, da sowohl NCAM als auch MAG die Zell-Zell-Adhäsion vermitteln. NCAM ist bei Wechselwirkungen zwischen Neuronen und bei neuro-muskulären Wechselwirkungen wichtig (Cunninghan, B. A.,. a., Science 236:799-806 (19871), während MAG bei Neuron-Oligodendrozyt- und Oligodendrozyt-Oligodendrozytwechselwirkungen während der Myelinierung wichtig ist (Poltorak, M., u.a., J.Cell Biol. 105:1893-1899 [1987]). Die Zeiloberflächenexpression von NCAM und MAG wird entwicklungsmäßig während der Bildung des Nervensystems bzw. der Myelinierung analog zur regulierten Induzierung von ICAM-1 bei Entzündung reguliert (Springer, T.A., u.a., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 [1987]). ICAM-1, NCAM (Cunningham, B.Α., u.s.. Science 236: 799 bis 806 119871) und MAG (Salzer, L. J., u.a., J. Cell BIoI. 104:957-965 [1987)) sind ähnlich in der Gesamtstruktur sowie homolog, da jedes ein integrales Membranglykoprotein ist, das aus 5 C2-Dämonen konstruiert wird, die den N-terminalen extrazellularen Bereich bilden, obwohl bei NCAM einige nicht-lg-ähnliche Folgen zwischen der letzten C2-Dämone und der Transmembrandomäne vorhanden sind. ICAM-1 richtet sich bei der gesamten Länge, einschließlich der Transmembran- und der zytoplasmischen Domänen, bei einer Identität von 21 % mit MAG aus; die gleiche prozentuale Identität stellt man beim Vergleich der 5 Domänen von ICAM-1 und NCAM-1 fest. Ein schematischer Vergleich der Sekundärs'rukturen von ICAM-1 und MAG wird in der Abb. 10 gezeigt. Vergleiche von einer Domäne zur anderen zeigen, daß der Pegel de' Homogenität zwischen Domänen innerhalb der ICAM-1-und der NCAM-Moleküle(x ± s.d. 21 ± 2,8% bzw. 18,6 ± 3,8%) der gleiche ist wie der Pegel der Homogenität beim Vergleich von ICAM-1-Domänen mit NCAM- und MAG-Domänen (20,4 ± 3,7 bzw. 21,9 ± 2,7). Obwohl es Anzeichen für eine alternative Spleißung in den C-Tei minalbereichen von NCAM gibt (Cunningham, B. Α., u. a., Science 236:799-806 [1987J; Bartheis, D., u. a., EMBO J. 6:907-914 [1987]) und von MAG (Lai, C, u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 4377-4341 [1987]), konnten hei der Sequenzierung von Endothel- oder HL-60-ICAM-1-Klonen oder bei der Untersuchung am ICAM-1-Protein-Hauptkörper und Vorläufer an einer Vielzahl von Zelltypen keine Anzeichen dafür gefunden werden (Dustin, M.L., u.a., J.lmmunol. 137: 245-254 [1986]).
ICAM-1 fungiert bei Lymphozytwechselwirkungen als Ligand für LFA-1 mit einer Reihe unterschiedlicher Zelltypen. Lymphozyten binden sich an ICAM-1, die in künstliche Membranbischichten eingelagert sind, und das bedingt LFA-1 an den Lymphozyten, was direkt dia Wechselwirkung von LFA-1 mit ICAM-1 demonstriert (Marlin, S.D., u.a., Cell 51: 813-819 [1987]). LFA-1 ist ein Leukozytintegrin und hat keine immunoglobulinähnlichen Merkmale. Die Leukozytintegrine umfassen eine Integrin-Unterfamilie. Die beiden anderen Unterfamilien vermitteln Zell-Matrix-Wechselwirkungen und erkennen die Sequenz RGD innerhalb der Liganden, zu denen Fibronektin, Vitronektin, Collagen und Fibrinogen gehören (Hynes, R.O., Cell 48: 549-554 [1987]; Ruoslathi, E., u.a., Science 238:491-497 [1987]). Die Leukozytintegrine werden nur auf Leukozyten expressiert, sind in Wechselwirkungen zwischen den Zellen einbezogen, und die einzigen bskannten Liganden sind ICAM-1 und iC3b, ein Fragment der Komplementkomponente C3, welches keine immunoglobulinähnlichen Merkmale aufweist und von Mac-1 erkannt wird (Kishimoto, T.M., u.a., in: Leucocyte Typing III (Leukozytentypisierung III), McMichael, Hsg., Springer-Verlag, New York [1987]; Springer,T.A., u.a., Ann Rev. Immunol. 5:223-252 [1986]; Anderson, D.C, u.a., Ann. Rev. Med. 38:175-194 [1987]). Ausgehend von der Sequenzanalyse, werden mögliche Peptide innerhalb der ICAM-1 -Sequenz, die durch LFA-1 erkannt wird, in der Tabelle 9 gezeigt.
Peptide Innerhalb der ICAM-1-Sequenz, die möglicherweise von LFA-1 erkannte v/erden
-L-R-G-R-L-R-L-
-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-
-L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E-
-P-R-G-G-S-
-P-G-N-N-R-K-
-Q-E-D-S-E-P-M-
-T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S-
-R-R-D-H-H-G-A-N-F-S-
-D-L-R-P-Q-o-L-E-
ICAM-1 ist das erste Beispiel für ein Glied der Immunoglobulin-Supergen-Familie, das sich an ein Integrin bindet. Obwohl diese Familien beide eine wichtige Rolle in der Zelladhäsion spielen, war bisher eine Wechselwirkung zwischen ihnen nicht erwartet worden. Wechselwirkungen innerhalb der Immunoglobulin-Gen-Superfamilie dagegen sind ziemlich gebräuchlich. Es ist durchaus möglich, daß weitere Beispiele für Wechselwirkungen zwischen der Integrin- und der Immunoglobulinfamilie festgestellt werden. LFA-1 erkennt einen von ICAM-1 verschiedenen Liganden (Springer, T. A., u. a., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 [1987]), und das Leukozytintegrin Mac-1 erkennt einen von C3bi verschiedenen Liganden in der Adhäsion zwischen neutrophilen (Anderson, D.C, u.a., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 [1987]). Außerdem binden sich gereinigte, MAG-enthaltende Bläschen an Neurii&n, die MAG sind, und folglich muß MAG zur heterophilen Wechselwirkung mit einem verschiedenartigen Rezeptor fähig sein (Poltorak, M„ u.a., J. Cell Biol. 105:1893 bis 1899 [1987]). Die Rolle von NCAM bei Wechselwirkungen zwischen Nerven und Nsrven und zwischen Nerven und Muskeln wurde auf homophile NCAM-NCAM-Wechselwirkungen zurückgeführt (Cunningham, B. Α., u. a„ Science 236:799-806 [1987]). Die wichtige Rolle von MAG bei Wechselwirkungen zwischen benachbarten Windungsschleifen von Schwann-Zellen, welche während der Myelinhüllenbildung Axone umschließen, könnte auf eine Wechselwirkung mit einem andersartigen Rezeptor oder auf homophile MAG-MAG-Wechselwirkungen zurückzuführen sein. Die Homologie mit NCAM und das häufige Auftreten von Wechselwirkungen von Domäne zu Domäne innerhalb der Immunoglobulin-Supergen-Familie wirft die Möglichkeit auf, daß ICAM-1 sowohl in homophile Wechselwirkungen als auch in heterophile ICAM-1-LFA-i-Wechselwirkungen eingreifen könnte. Die Bindung von B-Lymphoblastzellen, welche ähnliche Dichten von LFA-1 und ICAM-1 ko-expressieren, an ICAM-1 in
künstlichen oder zellularen Monoschichten kann jedoch durch Vorbehandlung des B-Lymphoblasts mit LFA-1-MAb vollständig unterbunden werden, während die Haftung durch eine Vorbehandlung der B-Lymphoblaste mit ICAM-1 -MAb unbeeinflußt bleibt. Eine Vorbehandlung der Monoschicht mit ICAM-1 -MAb beseitigt die Bindung vollständig (Dustin, M.L., u.a., J. Immunol. 137: 245-254 [1986); Marlin, S.D., u.a.. Cell 51:813-819 [19871). Diese Ergebnisse zeigen, daß ICAM-1-homophile Wechselwi. .ungen, wenn sie überhaupt auftreten, schwächer als die heterophilen Wechselwirkungen mit LFA-1 sein müssen. Die Möglichkeit, daß die Leukozytintegrine Liganden auf eine grundsätzlich andere Weise erkennen, stimmt mit dem Vorhandensein einer Sequenz von 180 Resten in den Alpha-Untereinheiten überein, die bei der Ligandbindung wichtig sein kann und bei den RGD-erkennenden Integrinen nicht vorhanden ist (Corbi, A., u.a., EMBO J. 6:4023-4028 [1987]). Obwohl ausgeführt wurde, daß Mac-1 die RGD-Sequenz erkennt, die in iC3b 5086 vorhanden ist, ist in ICAM-1 keine RGD-Sequenz vorhanden (Abb.8). Das stimmt damit überein, daß das Fibronektinpeptid GRGDSP und das Steuerungspeptid GRGESP nicht die Adhäsion von ICAM-1 und LFA-1 unterbinden (Marlin, S. D., u. a.,Cell 51: 813-819(1987)) Verwandte Folgen aber, wie PRGGS und RGEKE, sind in ICAM-1 in Bereichen vorhanden, von denen gesagt wird, daß sie eine Schleife zwischen den ß-Strängen a und b von Domäne 2 bzw. c und d von Domäne 2 bilden (Abb. 9) und damit für die Erkennung zugänglich sind. Es ist interessant, daß das homologe MAG-Molekül ein RGD-Sequenz zwischen den Domänen 1 und 2 enthält (Poltorak, M., u.a., J.Cell Biol. 105:1893 bis 1899 [1987I); Salzer, J.L., u.a., J.Cell. BIoI. 104: 957-965 [1987)).
Southern- and Northem-Blo'
Southern-Blots wurden unter Verwendung von 5 \ig genomischer DNA durchgeführt, die aus drei Zellstämmen extrahiert wurde:
BL2, einem Burkitt-Lymphom-Zellstamm (ein Geschenk von Dr. Gilbert Lenoir); JY und Er-LLC, EBV-transformierten B-Lymphoblastoidzellstämmen.
Die DNA wurde mit dem fünffachen der von den Herstellern empfohlenen Mengen an Bam-H1- und Eco-R1-Endonukleasen (New England Biolabs) verdaut. Nach der Elektrophorese durch ein 0,8%iges Agarose-Gel wurde die DNA auf eine Nylon-Membran (Zeta-Sonde, BioRad) übertragen. Der Filter wurde nach Standardverfahren vorhybridisiert und hybridisiert, wobei ICAM-cDNA von HL-CO verwendet wurde, die durch zufälliges Starten mit Alpha-(32P)d-XTP markiert worden war (Boehringer, Mannheim).
Northern-ßlots wurden unter Verwendung von 20ug der Gesamt-RNA oder von 6μg von PoIy(A)+-RNA ausgeführt. Die RNA wurde denaturiert und durch ein 1%igesAgaros?-Formaldehyd-Gelelektrophoretisiert und auf die Zetasondeelektrotransferiert.
Die Filter wurden in der oben beschriebenen Weise vorhybridisiert und hybridisiert (Staunton, D. E., u. a., EMBO J. 6: Γ,695-3701 [1987)1, wobei die HL-60-cDNA-Sone von 32P-markierten Oligonukleotidsonden (die oben beschrieben wurden) verwendet wurden.
Die Southern-Blots unter Verwendung der 3-kb-cDNA-Sonde und die mit Barn H1 und Eco RI verdaute DNA wiesen einzelne vorhe, rschende Hybridisierungsfragmente von 20 bzw. 8kb auf, was auf ein einzelnes Gen und darauf schließen läßt, daß der größte Teil der Codierungsinformation innerhalb von 8kb vorhanden ist. In Blots von 3 verschiedenen Zellstämmen gibt es keine Anzeichen für einen Restriktionsfragmentpolymophismus.
Expression des Gens ICAM-1
Ein „Expressionsvektor" ist ein Vektor, der (aufgrund des Vorhandenseins von geeigneten Transkriptions- und/oder Translaterialssteuersequenzen) in der Lage ist, ein DNA- oder ein cDNA-Molekül auszudrücken, das in den Vektor kloniert worden ist, und auf diese Weise ein Polypeptid oder Protein zu erzeugen. Die Expression von kionierten Sequenzen erfolgt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Wenn mit einem prokaryotischen Expressionsvektor gearbeitet wird, dann wäre eine geeigne'te Wirtszelle jede prokaryotischen Expressionsvektor gearbeitet wird, dann wäre eine geeignete Wirtszelle jede prokaryotische Zelle, die in der Lage ist, die kionierten Sequenzen zu expressieren. Ebenso wäre, wenn mit einem eukaryotischen Expressionsvektor gearbeitet wird, jede eukaryotische Zelle, die in der Lage ist, die kionierten Sequenzen zu expressieren, eino geeignete Wirtszelle. Da eukaryotische DNA intervenierende Sequenzen enthalten kann und da diese Sequenzen in prokaryotischen Zellen nicht korrekt verarbeitet werden können, ist es wichtig, daß vorzugsweise cDNA von einer Zelle verwendet wird, die ICAM-1 expressieren kann, um eine Bibliothek prokaryotischer genomischer Expressionsvektoren zu schaffen. Verfahren für die Herstellung von cDNA und für Hie Erarbeitung einer genomischen Bibliothek werden von Maniatis, T., u.a. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual [Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch)), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982|) offengelegt.
Die oben beschriebene Bibliothek genomischer Expressionsvektoren wird dazu verwendet, eine Bank von Wirtszellen (die jeweils ein Glied der Bibliothek enthalten) zu schaffen. Der Expressionsvektor kann auf jede einer Vielzahl von Möglichkeiten in die Wirtszelle eingeführt werden (d. h„ Transformation, Transfektion, Protoplastverschmelzung, Elektroporation usw.). Die Bai κ der die Expressionsvektoren enthaltenden Zellen wird durch Klonierung vermehrt, und ihre Glieder werden (unter Anwendung einer Immunoanalyse) einzeln analysiert, um festzustellen, ob sie ein Protein erzeugen, das zur Bindung an einen Anti-ICAM-' Antikörper geeignet ist.
Die Expressionsvektoren der Zellen, die ein Protein erzeugen, welches einen Anti-ICAM-1 -Antikörper binden kann, werden dann weiter analysiert, um festzustellen, ob sie das gesamte ICAM-1 -Gen expressieren (und damit enthalten), ob sie nur ein Fragment des ICAM-1-Gens expressieren (und damit enthalten) oder ou sie ein Gen expressieren (und damit enthalten), dessen Produkt zwar immunologisch mit ICAM-1 verwandt, das aber nicht ICAM-1 ist. Eine solche Analyse kann mit jedem geeigneten Verfahren durchgeführt werden, vorteilhaft aber ist es, die Nukleotidfolge des DNA- oder cDNA-Fragmentes zu bestimmen, das in den Expressionsvektor kloniert worden ist. Diese Nukleotidfolgen werden dann dahingehend untersucht, oh sie in der Lage sind, Polypeptide zu codieren, welche dieselbe Aminosäurefolge wie die Tryptinverdauungsfragmente von ICAM-1 haben (Tabelle 5). Ein Expressionsvektor, der ein DNA- oder ein cDNA-Molekül enthält, welches das Gen ICAM-1 codiert, kann daher erkannt werden anhand (i) der Fähigkeit, die Expression eines Proteins zu steuern, das sich an den Anti-ICAM1-Antikörper binden kann, und (ii) des Vorhandenseins einer Nukleotidfolge, die in der Lage ist, jedes der Tryptinfragmente von ICAM-1 zu codieren. Das klonierte DNA-Molekül eines solchen Expressionsvektors kann aus dem Expressionsvektor entfernt und in reiner Form isoliert werden.
Funktionelle Aktivitäten von gereinigtem ICAIVM
In Zellen wirkt ICAM-1 normalerweise als Oberflächenprotein, das der Zellmembran zugeordnet ist. Die Funktion des gereinigten ICAM-1 wurde daher getestet, nachdem das Molekül durch Auflösung des Proteins in mit Reinigungsmitteln solubilisierten Lipiden in künstliche Lipidmembranen (Liposome oder Bläschen) rekonstituiert worden war, gefolgt von der Entfernung des Reinigungsmittels durch Dialyse. ICAM-1, das in der oben geschriebenen Weise aus JY-Zellen gereinigt und in Reinigungsmittel-Oktylglukosid eluiert worden war, wurde in Bläschen rekonstituiert, und die ICAM-1-haltigen Bläschen wurden auf Glasdeckplatten oder Plastkulturvertiefungen verschmolzen, um die Feststellung der Zellen zu ermöglichen, die sich an das Protein binden.
PrSparlerung von Planmembranen und plastgebundenen Bläschen
Bläschen wurden nach der Methode von Gay u. a., (J. Immunol. 136: 2'026 (1986)) hergestellt. Kurz formuliert, es wurden Phosphatidylcholin und Cholesterin vom Ei in Chloroform aufgelöst und in einem Molverhältnis von 7:2 gemischt. Das Lipidgemisch wurde zu einem Dünnfilm getrocknet, wobei es unter einem Strom von Stickstoffgas rotierte, anschließend wurde es eine Stunde lang lyophiliert, um alle Spuren von Chloroform zu beseitigen. Dann wurde der Lipidfilm in 1 % Oktylglykosid/ 0,14 M NaCI/20mM Tris (pH-Wert 7,2) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM Phosphatidylcholin aufgelöst. Jedem Milliliter der aufgelösten Lipide wurden etwa 10pg gereinigtes ICAM-1 oder menschliches Glykophorin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) alstSteuerungsmembranglykoprotein zugesetzt. Anschließend wurde die Protein-Lipid-Reinigungslösung bei 4°C anhand von drei Wechseln eines 200-Volumens von 2OmM Tris/0,14 M NaCI, pH-Wert 7,2, und eines Wechsels von HBSS dialysiert. Planmembranen wurden nach der Methode von Bria, u.a., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 81: 6159 (1984) hergestellt. Glasdeckscheiben (11 mm Durchmesser) wurden 15 Minuten lang in «jiner 1:6-Verdünnung von 7X-Reinigungsmittel (Linbro) gekocht, über Nacht in destilliertem Wasser gewaschen, in 70%igem Ethanol getränkt und luftgetrocknet. Ein δΟμΙ-Tropfen von Bläschensuspension, die entweder ICAM-1 oder Glykophorin enthielt, wurde auf den Boden einer Reihe eingelassener Vertiefungen in einer Platte von 24 Vertiefungen gebracht, und auf diese wurden obenauf vorsichtig die vorbereiteten Glasdeckscheiben geschoben. Nach 20 bis 30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die eingelassenen Vertiefungen mit HBSS gefüllt, und die Deckscheiben wurden umgekehrt, um die Planmembranen mit der Vorderseite nach oben zu bringen. Anschließend wurden die eingelassenen Vertiefungen gründlich mit HBSS gewaschen, um ungebundene Bläschen zu entfernen. Die Oberfläche der Planarmembranen wurde niemals der Luft ausgesetzt.
Im Verlauf der Experimente mit Planmembranen, die auf Glasoberflächen verschmolzen worden waren, wurde festgestellt, daß Bläschen, die ICAM-1 enthalten, sich direkt an die plastische Oberfläche der mit mehreren Vertiefungen versehenen Gewebekulturplatten binden und ihre funktioneile Aktivität behalten, wie das durch die spezifische Zellbindung veranschaulicht wird. Diese Bläschen werden nachstehend als .,plastegebundene Bläschen" (PBV) bezeichnet, da die Art der an die Plaste gebundenen Lipidbläschen nicht bestimmt worden ist. Plastegebundene Bläschen werden hergestellt durch den Zusatz von 30μΙ der Bläschensuspension direkt auf den Boden von eingelassenen Vertiefungen in Gewebekulturschalen mit 96 eingelassenen Vertiefungen (Falcon), an den sich Inkubation und Waschen anschließen, wie das für Planmembranen beschrieben wurde.
Zelladhäslonsuntersuchungen
Zeiladhäsionsuntersuchungen wurden unter Verwendung von Planmembranen oder plastgebundenen Bläschen im wesentlichen auf die gleiche Art und Weise ausgeführt, allerdings wurden die Anzahl der Zellen und die Volumen bei der PBV-Untersuchung auf ein Fünftel der Werte bei Planmembranuntersuchungen reduziert.
T-Lymphozyten von normalen Kontrollen und von einem Patienten mit Leukozytenadhäsionsdefekt (LAD-Patient), dessen Zellen kein LFA-1 express:eren (Anderson, D. C, u.a., J.Infect. Dis. 152:668 [1985]), wurden durch dreitägiges Züchten von peripheren mononuklearen Blutzellen mit 1 pg/ml Konkanavalin-1 (Con A) in RPM11640-Medium plus 20% FCS mit einer Konzentration von 5 χ 105 Zellen/ml hergestellt. Die Zellen wurden dann zweimal mit RPMI und einmal mit 5mM Methyl-Alpha-D-Mannopyranosid gewaschen, um das restliche Lectin aus der Zelloberfläche zu entfernen. Die Zellen wurden in RPMI/20% FCS gezüchtet, das 1 ng/ml Rekombinant-IL-2 enthielt, und sie wurden 10 bis 22 Tage nach Beginn der Kultur verwendet. Um die Zellbindung an Planmembransn oder PBV festzustellen, wurden Con-A-Blaste, T-Lymphom-SKW-3- und die EBV-transformierten B-Lymphoblastoidzellstämme JY (LFA-1-positiv) und der LFA-1-defizienteLymphoblastoidzellstamm (BBN) (abgeleitet von Patient 1, Springer, T.A.,u.a., J.Exper.Med. 160: 1901-1908 |19861) durch Inkubation von 1 χ 107 Zellen in 1 ml RPM11640/10% FCS mit 10OpCi von Na51CrO4 für die Dauer von einer Stunde bei 370C radiomarkiert, gefolgt von vier Waschungen mit RPM11640, um nichteinbezogenes Markierungsmaterial zu entfernen. Bei monoklonalen Antikörperblockierungsexperimenten wurden Zellen oder plastegebundene Bläschen mit 20pg/ml gereinigtem Antikörper in RPM11640/10% FCS bei 4°C 30 Minuten lang vorbehandelt, gefolgt von 4 Waschungen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Bei Experimenten zur Wirkung von zweiwertigen Kationen auf die Zellbindung wurden die Zellen einmal mit Ca2*, Mg2+-freiem HBSS plus 10% dialysiertem FCS gewaschen, und den angegebenen Konzentrationen wurden CaCI und MgCI zugesetzt. Bei allen Experimenten wurden die Zellen und Planmembranen oder PBV bei einer entsprechenden Temperatur (40C, 220C oder 370C) in dem entsprechenden Analysepuffer voräquilibriert.
Um die Zellbindung an gereinigtes ICAM-1 zu bestimmen, wurden s'Cr-markierte Zellen (5 x 105 EBV-Transformanten in Planmembrananalysen; 1 χ 106 EBV-Transformanten oder SKW-3-Zellen, 2 χ 105 Con-A-Blaste in PBV-Analysen) 2 Minuten lang bei 25 x g auf Planmembranen oder PBV zentrifugiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 40C, 22°C oder 370C. Nach der Inkubation wurden ungebundene Zellen durch acht Zyklen von Einfüllen und Ansaugen mit Puffer, der auf die entsprechende Temperatur voräquilibriert war, entfernt. Gebundene Zellen wurden quantitativ bestimmt durch Solubilisierung des Inhalts der eingelassenen Vertiefungen mit 0,1 N NaOH/1 % Triton X-100 und Zählen in einem Gamma-Zähler. Die p-'uentuale Zelibindung wurde durch Division des cpm-Wertes von gebundenen Zeilen durch den den Eingangszellen zugeordneten cpm-Wert bestimmt. Bei Planmembranbestimmungen wurde der Eingangs-cpm-Wert entsprechend dem Verhältnis der Oberfläche der Deckplatten im Vergleich zur wirksamen Oberfläche der Kulturvertiefungen korrigiert.
Bei diesen Untersuchungen banden sich EBV-transformierte B-Lymphoblastoidzellen, SKW-3-T-Lymphomzellen und Con-A-T-Lymphoblaste spezifisch an ICAM-1 in künstlichen Membranen (Abbildungen 11 und 12). Die Bindung war spezifisch, da sich die Zellen an Kontrollmembraiien oder Bläschen, die äquivalente Mengen eines anderen menschlichen Zelloberflächenglykoproteins, Glykophorin, enthielten, nur sehr schlecht banden. Außerdem wurde die Bindung bei LFA-1-positiven EBV-Transformanten und Con-A-Blasten hergestellt, während bei deren LFA-1 -negativen Gegenstücken keine Bindung im signifikanten Maßstab auftrat, was unterstreicht, daß die Bindung vom Vorhandensein von LFA-1 auf den Zellen abhängig war.
Sowohl dio Spezifizität der Zellbindung als auch die Abhängigkeit von zellularem LFA-1 wurden in monoklonalen Antikörperblockierungsexperimenten bestätigt (Abb. 13). Die Bindung der JY-Zellen konnte um 97% unterbunden werden, wenn die ICAM-1-haltigen PBV mit dem monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1 vorbehandelt wurden. Die Vorbehandlung der Zellen mit dem gleichen Antikörper hatte kaum Wirkung. Umgekehrt unterband der monoklonaleAnti-LFA-1-Antikörper TS1/18 die Bindung um 96%, aber nur bei Behandlung der Zellen, nicht aber von PBV. Ein Kontrollantikörper, TS2/9, der reaktiv mit LFA-3 ist (einem anderen Lymphozytenoberflächenantigen), hatte keine signifikante Hemmwirkung, weder bei der Vorbehandlung der Zellen, noch der von PBV. Dieses Experiment zeigt, daß ICAM-1 selbst in den künstlichen Membranen und nicht irgendein geringfügiges Kontaminans die beobachtete Zelladhäsion vermittelt und daß die Adhäsion von LFA-1 abhängig ist, das an der Bindungszelle vorhanden sein nuß.
Die Bindung von Zellen an ICAM-1 in künstliche Membranen zeigte auch zwei andere Charakteristika des LFA-1-abhängigen Adhäsionssystems auf: Temperaturabhängigkeit uiid f?dc.-f an zweiwertigen Kationen. Wie in der Abb. 14 gezeigt wird, banden sich Con-A-Blaste bei 370C am wirksamsten, bei 220C teilweise und bei 40C sehr schlecht an ICAM-1 in PBV. Wie in der Abb. 15 gezeigt wird, war die Bindung vollständig vom Vorhandensein von zweiwertigen Kationen abhängig. EJei physiologischen Konzentrationen war Mg2+ allein für eine maximale Zellbindung ausreichend, während Ca2' allein nur einen sehr niedrigen Bindungswert bewegen konnte. Dagegen war Mg2+ bei nur einem Zehntel der normalen Konzentration, kombiniert mit Ca2*, synergistisch und ergab eine maximale Bindung.
Zusammenfassend kann gesagt werden, die Spezifizität der Zellbindung an gereinigtes ICAM-1, das in künstliche Membranen einbezogen ist, die spezifische Hemmung bei monoklonalen Antikörpern und die Anforderungen von Temperatur und Vorhandensein von zweiwertigen Kationen demonstrieren, daß ICAM-1 ein spezifischer Ligand für das LFA-1 -abhängige Adhäsionssystem ist.
Hautbiopsien von fünf normalen Personen wurden auf ihre Expression von ICAM-1 und HLA-DR untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Endothelzeilen in einigen Blutgefäßen zwar in der Regel ICAM-1 expressierten, auf Keratinozyten von normaler Haut aber kein ICAM-1 expression wurde. Auf Keratinozyten von normalen Hautbiopsien wurden keinerlei Färbung für HLA-DR festgestellt. Die Kinetik der Expression von ICAM-1 und Antigenen der Klasse Il wurde dann an Zellen in Biopsien von sücrgischen und toxischen Hautläsionen untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Hälfte von sechs untersuchten Personen Keratinozyten hatte, die ICAM-1 expressierten, nachdem vier Stunden vorher das Hapten aufgebracht worden war (Tabelle 10). Mit der Einwirkungszeit des Haptens trat eine Zunahme des Prozentsatzes der Personen auf, bei denen ICAM-1 auf den Keratinozyten expression wurde, sowie eine Intensivierung der Färbung, was auf eine stärkere ICAM-1 -Expression je Keratinozyt bis zu 48 Stunden hinweist. Tatsächlich färbte sich zu diesem Zeitpunki ein Teil der Keratinozyten in allen Biopsien positiv nach ICAM-1. Nach 72 Stunden (24 Stunden nach Entfernung des Haptens) wurde bei sieben der acht Personen noch ICAM-1 auf den Keratinozyten expression, während die Expression von ICAM-1 bei einer Person in der Zeitspanne zwischen 48 und 72 Stunden verschwand.
| Zeit nach der Fleck | Anzahl d. | Nur | Nur | ICAM-1 und |
| aufbringung (h) | Biopsien | ICAM-1 | HLA-DR | HLA-DR |
| Normale Haut | 5 | 0 | 0 | 0 |
| Allergischer | ||||
| Flecktest | ||||
| 4 | 6 | 3' | 0 | 0 |
| 8 | 9 | 3 | 0 | 0 |
| 24 | 8 | 7 | 0 | 0 |
| 48" | 8 | 5 | 0 | 3 |
| 72 | 8 | 6 | 0 | 1 |
a Proben wurden als positiv betrachtet, wenn wenigstens kleine Trauben von Keratinozyten gefärbt waren, b Alle Flecken wurden zu diesem Zeitpunkt entfernt.
HistologLch hatte des Färbungsschema für ICAM-1 auf Keratinozyten von Biopsien, die vier Stunden nach der Aufbringung des Haptens genommer, wurden, in der Regel die Form von kleinen Trauben oder Bündeln. Nach 48 Stunden wurde ICAM-1 auf der Oberfläche der Mehrzahl der Keratinozyten expression, wobei kein Unterschied zwischen der Mitte und dem Rand der Läsion feststellbar war. Die Intensität der Färbung nahm ab, wenn sich die Keratinozyten der Stratum corneum näherten. Das wurde in Biopsien festgestellt, die sowohl von der Mitte als auch vom Rand der Läsionen genommen wurden. Zu diesem Zeitpunkt war auch der Flecktest positiv (Infiltration, Erythemie und Bläschen). Es wurden keine Unterschiede in der ICAM-1-Expression festgestellt, wenn unterschiedliche Haptene auf sensitive Personen aufgebracht wurden. Neben den Keratinozyten expressierten auch einige mononukleare Zellen und Endothelzellen an der Stelle der Läsion ICAM-1.
Die Expression von HLA-DR auf den Keratinozyten von allergischen Hautläsionen war seltener als die von ICAM-1. Keine der untersuchten Personen hatte Läsionen mit Keratinozyten, die sich innerhalb von 24 Stunden nach Aufbringung des Haptens
positiv für HLA-DR färbten. Tatsächlich hatten nur 4 Biopsieproben Keratinozyten, die HLA-DR expressierten, und keine Biopsiehatte Keratinozyten, die sich positiv boi HLA-DR und nicht für ICAM-1 färbten (Tabelle 10).
induziert wurde, Keratinozyten, die auf ihrer Oberfläche zu jedem der getesteten Zeitpunkte nur wenig, wenn überhaupt, ICAM-1aufwiesen (Tabelle 11). Tatsächlich hatte 48 Stunden nach der Fleckaufbringung, dem optimalen Zeitpunkt für die
auf den Keratinozyten von toxischen Flecktestläsionen kein HLA-DR expressiert.
expressiert wird, und folglich kann die Expression von ICAM-1 dazu genutzt werden, zwischen Entzündungen auf Immun- undauf toxischer Basis zu unterscheiden, beispielsweise bei akutem Nierenversagen bei Patienten mit Nierentransplantation, beidenen es schwierig ist festzustellen, ob das Versagen auf Abstoßung oder Nephrotoxizität des immunosupressiven,therapeutischen Mittels zurückzuführen ist. Nierenbiopsie und Bestimmung der Regulierung der Expression von ICAM-1ermöglichen dann die Unterscheidung zwischen Abstoßung auf Immunbasis und solcher durch Toxizitätsreaktionen, dio nichtauf Immunbasis erfolgen.
| Zeit nach der Fleck | Anzahl d. | Nur | Nur | ICAM-1 und |
| aufbringung (h) | Biopsien | ICAM-1 | HLA-DR | HLA-DR |
| 4 | 4 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 3 | 1- | 0 | 0 |
| 24 | 3 | 1 | 0 | 0 |
| 48b | 14 | 1 | 0 | 0 |
| 72 | 3 | 1 | 0 | 0 |
a Proben wurden als positiv betrachtet, wenn wenigstens kleine Bündel von Keratinozyten gefärbt waren, b Alle Flecken wurden zu diesem Zeitpunkt entfernt.
die Expression von ICAM-1 und HLA-DR untersucht. Ein Teil der Keratinozyten in Biopsien von allergischem Kontaktekzem,
einem Muster, das dem bei allergischen Flecktestbiopsien nach 48 Stunden ähnlich oder sogar noch stärker war (Tabelle 12). In
mononuk!" jrer Zellinfiltration beobachtet werden. Außerdem waren 8 der 11 getesteten Biopsien von Liehen planus positiv beider Expression von HLA-DR auf Keratinozyten.
ausgeprägt. Nur vier von sieben Patienten, die bei diesen Erkrankungen getestet wurden, hatten Keratinozyten, die ICAM-1 ander Läsionsstelle expressierten. Eine Expression von HLA-DR wurde nur bei einem Patier.ten und das in Verbindung mit der
expressierten ICAM-1 im unterschiedlichen Ausmaß.
| Diagnose | Anzahl d. | Nur | Nur | ICAM-1 und |
| Fälle | ICAM-1 | HLA-DR | HLA-DR | |
| Allergisches | ||||
| Kontaktekzem | 5 | 31 | 0 | 2 |
| Liehen planus | 11 | 3 | 0 | 8 |
| Pemphigoid/ | ||||
| Pemphigus | 2 | 2 | 0 | 0 |
| Exanthem | 3 | 2 | 0 | 0 |
| Urticaria | 4 | 1 | 0 | 1 |
a Proben wurden als positiv betrachtet, wenn wenigstens kleine Bündel von Keratinozyten gefärbt waren.
gewonnen. Die Biopsien wurden nacheinander vor und während der angegebenen Zeit der PUVA-Bohandlung genommen.
genommen, außerdem wurden Biopsien von klinisch normaler Haut bei vier der Patienten gemacht.
oder in Aluminiumfolie eingewickelt und bis zum Färben bei -8O0C aufbewahrt.
Beim Färben wurde folgende Methode angewendet. Schnitte wurden mit monoklonalem Antikörper inkubiert und nach einer dreistufigen Immunoperoxidase-Methdoe (Stein, H., u.a., Adv. Cancer Res.42 67-147 [1984)) unter Verwendung eines Diaminobenzidin-HjO2-Substrats gefärbt. Tonsillen und Lymphknoten wurden als positive Kontrollen für die Anti-ICAM-1- und HLA-DR-Färbung verwendet. Bei Fehlen von primären Antikörpern gefärbtes Gewebe diente als negative Kontrolle. Die monoklonalen Antikörper gegen HLA-DR wurden von Becton Dickinson (Mountainview, Kalifornien) bezogen. Der monoklonale Anti-ICAM-1-Antikörper warR6-5-D6. Peroxidaso-konjugiertesKaninchen-Anitmaus-IG und peroxidasekonjugiertes Schweine-Antikaninchen-IG wurden bei DAKAPATTS, Kopenhagen, Dänemark, erworben. Das Diaminobenzidintetrahydrochlorid wurde von Sigma (St. Louis, Mo.) bezogen.
Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, daß die Endothelzellen in einigen Blutgefäßen sowohl bei erkrankter als auch bei normaler Haut ICAM-1 expressieren, die Intensität der Färbung und die Anzahl der Blutgefäße aber, welche ICAM-1 expressieren, bei psoriatischen Hautläsionen erhöht ist. Außerdem variierte das Muster einer Expression von ICAM-1 in Keratinozyten von unbehandelten psoriatischen Hautläsionen bei den untersuchten fünf Patienten zwischen nur kleinen Bündeln gefärbter Zellen bis zu zahlreichen gefärbten Keratinozyten. Im Verlauf der PUVA-Behandlung wies die ICAM-1 -Expression be; zwei der Patienten (Pationten 2 und 3) einen merklichen Rückgang auf, die der klinischen Remission vorausging oder gleichzeitig mit dieser auftrat (Tabelle 13). Bei den Patienten 1,4 und 5 traten während der PUVA-Behandlung Verringerungen und Steigerungen der Expression von ICAM-1 auf, was in Korrelation mit klinischen Remissionen und Rückfällen stand. An den Keratinozyten von normaler H?.dt wurden vor oder nach der PUVA-Behandlung keine Expression von ICAM-1 festgestellt. Das weist daraufhin, daß PUVA-Bchandlungen nicht die Expression von ICAM-1 an Keratinozyten von normaler Haut induzieren. Beachtenswert war auch die Beobachtung, daß die Dichte des mononuklearen Zellinfiltrats im Zusammenhang mit der Menge der Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten stand. Das betraf sowohl die verringerte Anzahl von mononuklearen Zellen in Läsionen während der PUVA-Behandlung, wenn auch die Expression von ICAM-1 verschwindend gering wurde, als auch die erhöhte Zahl mononuklearer Zellen während der PUVA-BehancHung, wenn die Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten ausgeprägter war. Endothelzellen und mononukleare Hautzellen sind auch ICAM-1 -positiv. Bei klinisch normaler Haut war die Expression von ICAM-1 auf Endothelzellen ohne Markierung der Keratinozyten begrenzt.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß diese Ergebnisse zeigen, dad die Expression von ICAM-1 auf Keratinozyten vor der Behandlung ausgeprägt war und in Korrelation mit einem dichten, mononuklearen, zellularen Zellinfiltrat stand. Während der PUVA-Behandlung geht parallel mit der klinischen Besserung eine ausgeprägte Verringerung der ICAM-1-Färbung einher. Histologisch nimmt auch das Dermalinfiltrat erheblich ab. Wenn während der Behandlung ein klinischer Rückfall offensichtlich ist, erhöhen sich auch die Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten sowie die Dichte des Dermalinfiltrats. Wurde während der Behandlung eine klinische Remission beobachtet, trat gleichzeitig eine Verringerung der ICAM-1-Färbung an den Keratinozyten auf, und es verringerte sich auch das Dermalinfiltrat.
Die Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten entsprach also der Dichte des mononuklearen zellularen Infiltrats in der Dermis. Diese Daten zeigen, daß die klinische Reaktion auf PUVA-Behandlung zu einer ausgeprägten Verringerung der Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten, parallel mit einor etwas schwächeren Abnahme der mononuklearen Zellen, führte. Das weist daraufhin, daß die Expression von ICAM-1 an den Keratinozyten für die Initiierung und auch die Aufrechterhaltung des Dermalinfiltrats verantwortlich ist und daß eine PUVA-Behandlung die Expression von ICAM-1 nach unten reguliert, was wiederum das Dermalinfiltrat und die entzündliche Reaktion abschwächt. Aus den Daten geht auch hervor, daß während der PUVA-Behandlung die Expression von HLA-DR auf den Keratinozyten variabel ist. Die Expression von ICAM-1 auf den Keratinozyten von psoriatischen Läsionen steht im Zusammenhang mit der klinischen Schwere der Läsion sowie mit der Größe des Dermalinfiltrats. ICAM-1 epielt damit eine entscheidende Rolle bei der Psoriasis, und die Unterbindung seiner Expression und/oder die Unterbindung seiner Wechselwirkung mit dem Komplex CD 18 auf mononuklearen Zellen stellt eine wirksame Behandlung der Krankheit dar. Außerdem ist die Überwachung der Expression von ICAM-1 auf Keratinozyten ein wirksames Instrument der Diagnose und Prognose sowie zur Beurteilung des Therapieverlaufs bei Psoriasis.
33- 285 C11
Sequentielle Expression von ICAM-1 durch die Keratinozyten bei psoriatischen Hautläsionen (PS) und klinisch normaler Haut (N) vor und während einer PUVA-Behandlung
Zeit vor und während der PUVA-Behandlg.
Patient Nr
1 2
PS PS
3 PS
4 PS
5 PS
0 1Tag
1 Woche
2 Wochen
3 Wochen
4 Wochen 5-6 Wochen 7 Wochen 10Wochen
* 0
+ + + Viele positive Keratinozyten
+ + Ein Anteil positiver Keratinozyten
+ Fokale positive Keratinozyten
(+) Einige wenige, gestreute positive Keratinozyten
- Keine positive Färbung
• Klinische Remission
0 Klinischer Rückschlag
Im Gegensatz zu Läsionen von gutartigen Hautkrankheiten war die Expression von ICAM-1 auf Keratinozyten von bösartigen Hautläsionen viel variabler (Tabelle 14). Bei den untersuchten 23 Fällen von cutanen T-Zellen-Lymphomen wurden nur in 14 Fällen ICAM-1-positive Keratinozyten identifiziert.
Keratinozyten von Biopsien von Läsionen von Pilzmykosen wiesen die Tendenz auf, daß mit einem Fortschreiten der Krankheit in entwickeltere Phasen die Expression von ICAM-1 verlorenging. Dagegen wurde die Expression von ICAM-1 auf einem unterschiedlichen Anteil von mononuklearem Zellinfiltrat von den meisten der kutanen T-Zellenlymphomläsionen beobachtet.
Bei den restlichen untersuchten Lymphomen hatten vier von acht Keratinozyten, die ICAM-1 expressierten. Bei den untersuchten 29 Patienten mit bösartigen Hautkrankheiten hatten 5 Keratinozyten, die HLA-DR expressierten, ohne auch ICAM-' zu expressieren (Tabelle 14).
Expression von ICAM-1 und HLA-DR auf den K'.ratinozyten von bösartigen Hautkrankheiten
| Diagnose | Anzahl d. | Nur | Nur | ICAM-1 und |
| Fälle | ICAM-1 | HLA-DR | HLA-DR | |
| CTCL,MFI | 8 | 1· | 0 | 4 |
| CTCL, MFII-III | 10 | 1 | 2 | 5 |
| CTCL, SS | 3 | 1 | 0 | 2 |
| CTCL, Große Zelle | 2 | 0 | 2 | 0 |
| CBCL | 2 | 0 | 0 | 1 |
| Hautleukämie | 3 | 1 | 1 | 1 |
| Histiozytose X | 1 | 0 | 0 | 0 |
a Proben wurden als positiv betrachtet, wenn wenigstens kleine Bündel von Keratinozyten gefärbt waren.
Wirkung von Anti-ICAM-1-Antikörpern auf das Wuchern von menschlichen, perlpheren, mononuklearen Blutzellen Menschliche, periphere, mononukleare Blutzellen werden durch das Vorhandensein und die Erkennung von Antigenen oder Mitogenen zum Wuchern induziert. Bestimmte Moleküle, wie das Mitogen, Concanavalin A oder der T-Zellenbindende Antikörper OKT3, bewirken eine nichtspezifische Wucherung von peripheren, mononuklearen Blutzellen. Menschliche, periphere, mononukleare Blutzellen sind insofern heterogen, als sie aus Subpopulationen von .{eilen zusammengesetzt sind, die in der Lage sind, spezifische Antigene zu erkennen. Wenn eine periphere, monon jkleare Blutzelle, die ein bestimmtos spezifisches Antigen erkennen kann, auf dieses Antigen trifft, wird die Wucherung dieser Subpopulation der mononuklearen Zelle induziert. Das Tetanustoxoid und Napfschnecken-Hämozyanin sind Beispiole für Antigene, die durch Subpopulationen von peripheren, mononuklearen Zellen, nicht aber von allen peripheren, mononuklearen Zellen in sensitivierten Personen erkannt werden.
Es wurde die Fähigkeit des monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörpers R6-5-D6, proliferate Reaktionen von menschlichen, peripheren, mononuklearen Blutzellen in Systemen, von denen bekannt ist, daß sie eine Zell-Zell-Adhäsion brauchen, zu unterbinden, getestet.
Periphere, mononukleare Blutzellen wurden auf Ficoll-Paque-Gradienten (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Nach dem Auffangen der Grenzfläche wurden die Zellen dreimal mit dem Medium RPM11640 gewaschen und in Flachboden- Mikrotiter-Platten mit 96 eingelassenen Vertiefungen bis zu einer Konzentration von 106 Zellen/ml in RPMI-Medium, ergänzt durch 10%iges Rinderfötusserum, 2mM Glutamin und Genamicin (50Mg/ml), gezogen.
Antigen, entweder das T-Zellenmitogen, Concanavalin A (0,25pg/ml); der T-Zellenbindende Antikörper, OKT3 (0,001 pg/ml); Napfschnecken-Hämozyanin (10g/ml) oder Tetanustoxoid (1:100 Verdünnung von Quelle), wurden den Zellen zugesetzt, die in der oben beschriebenen Weise gezüchtet worden waren, wobei der Anti-ICAM-Antikörper (R6-5-D6; Endkonzentration von 5g/ml) entweder vorhanden oder nicht vorhanden war. Die Zellen wurden 3,5 Tage (Experiment mit Concanavalin A), 2,5 Tage (Experiment mit O1K3) bzw. 5,5 Tage (Experiment mit Hämazyanin der Napfschnecke und Tetanustoxoid) gezüchtet, bevor die Untersuchungen durchgeführt wurden.
Achtzehn Stunden vor Beendigung der Untersuchung wurde den Kulturen 2,5 \iC\ von 3H-Thymidin zugesetzt. Die Zellwucherung wurde durch Messen der Einbeziehung von Thymidin in die DNA durch die peripheren, mononuklearen Blutzellen untersucht.
Das einbezogene Thymidin wurde aufgefangen und in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt (Merluzzi u.a.,
J. Immunol. 139:166-168 [1987]). Die Ergebnisse dieser Experimente werden in der Abb. 16 (Experiment mit Concanavalin A), Abb. 17 (Experiment mit OTK3), Abb. 18 (Experiment mit Napfschnecken-Hämozyanin) und in der Abb. 19 (Experiment mit dem Tetanustoxoid) gezeigt.
Es wurde festgestellt, daß der Anti-ICAM-1-Antikörper proliferative Reaktionen auf das nichtspezifische T-Zellenmitogen, ConA, das nichtspezifische T-zellenzugeordnete Antigen OKT 3 und die spezifischen Antigene Napfschnecken-Hämozyanin und Tetanustoxoid in mononuklearen Zellen unterbindet. Die Hemmung durch den Anti-ICAM-1 -Antikörper war mit der des Anti-LFA-1-Antikörpers vergleichbar, was vermuten läßt, daß ICAM-1 ein funktioneller Ligand von IFA-1 ist und daß der Antagonismus von ICAM-1 spezifische Reaktionen des Abwehrsystems unterbindet.
Wie oben ausgeführt wurde, ist ICAM-1 für wirksame zellulare Wechselwirkungen während einer Immunreaktion, die durch LFA-1-abhängige Zelladhäsion vermittelt wird, notwendig. Die Induzierung von ICAM-1 bei Immunreaktionen oder entzünd':hen Erkrankungen ermöglicht die Wechselwirkung von Leukozyten mit Endothelzellen und von Leukozyten untereinander.
Wenn Lymphozyten von zwei nicht miteinander verwandten Personen bei Vorhandensein der jeweils anderen gezüchtet werden, werden Blasttransformation und Zellwucherung der Lymphozyten beobachtet. Diese Reaktion einer Population von Lymphozyten auf das Vorhandensein einer zweiten Population von Lymphozyten ist als die gemischte Lymphozytenreaktlon (MLR) bekannt und ist der Reaktion von Lymphozyten auf den Zusatz von Mitogenen analog (Immunology. The Science of Self-Nonself Discrimination (Immunologie. Die Wissenschaft von der Unterscheidung zwischen Selbst und Nichtselbst], Klein, J., John Wiley & Sons, NY [1982], S.453-458).
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkung von monoklonalen Anti-ICAM-Antikörpern auf des gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) des Menschen zu bestimmen. Diese Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt.
Peripheres Blut wurde von normalen, gesunden Spendern gewonnen, dazu wurde die Venenpunktur angewendet. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen aufgefangen und bei Zimmertemperatur im Verhältnis von 1:1 mit der ausgewogenen Salzlösung (BSS) von Puck G (GIBCO) verdünnt. Das Blutgemisch wurde in einer Menge von 20ml über 15ml eines Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten (Pharmacia, Dichte = 1,078, Zimmertemperatur) geschichtet und mit 1000 χ g 20 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde die Grenzschicht aufgenommen und dreimal in Pucks G gewaschen. Die Zellen wurden auf einem Hämazytometer gezählt und in einem Kulturmedium RPM11640 (GIBCO), das 0,5% Gentamicin, 1 mM L-Glutamin (GIBCO) und 5% wärmeinaktivierte (56°C, 36 Minuten) menschliche AB-Seren (Flow Laboratories) (nachfolgend als RPMI-Kulturmedium bezeichnet) enthielt, wieder zur Suspension gebracht.
Bei diesen Experimenten wurde Mäuse-Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) verwendet. Alle monoklonalen Antikörper (aus den Asziten von den Jackson Immuno Research Laboratorie, Boston, MA, hergestellt) wurden als gereinigte IgG-Präparate verwendet.
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden im Medium bis zu einer Konzentration von 6,25 x 105 Zellen/ml in Rundboden-Mikroliterflaschen von Linbro (Nr. 76-013-05) gezogen. Stimulatorzellen von einem gesonderten Spender wurden mit 100OR bestrahlt und mit den Responderzellen bei derselben Konzentration gezüchtet. Das Gesamtvolumen je Kultur betrug 0,2 ml. Als Kontrollen wurden reine Responderzellen und eine Stimulatorzelle verwendet. Die Kulturplatten wurden bei 37°C in einer mit 5% CO2-befeuchteten Luftatmosphäre 5 Tage lang inkubiert. Die Vertiefungen wurden einer Impulsbehandlung mit 5μθί tritiertem Thymidin (3HT) (New England Nuclear) über die letzten 18 Stunden der Kultur unterzogen. In einigen Fällen wurde eine Zweiweg-MLR durchgeführt. Es wurde nach dem gleichen Protokoll gearbeitet, nur wurden die Zellen des zweiten Spenders nicht durch Bestrahlung inaktiviert.
Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter unter Verwendung einer automatischen Mehrfach-Proben-Erntevorrichtung (Skatron, Norwegen) geerntet, wobei mit Wasser und Methanol gespült wurde. Die Filter wurden ofengetrocknet und in Aquasol in einem Beckman-FIUssigkeitsszintillationszähler (LS-3801) gezählt. Die Ergebnisse werden als CPM-Mittelwert ± Standardfehler für 6 einzelne Kulturen angegeben.
Tabelle 15 zeigt, daß gereinigte, mononukleare Anti-ICAM-1-Antikörper die MLR in dosisabhängiger Weise unterbanden, wobei t-ei 20ng eine signifikante Unterdrückung sichtbar wurde. Gereinigte Mäuse-lgG hatte nur geringe oder keine unterdrückende Wirkung. Die Unterdrückung der MLR durch den monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper erfolgt, wenn der Antikörper innerhalb der ersten 24 Stunden der Kulturen zugesetzt wird (Tabelle 16).
Wirkung des Anti-ICAM-1-Antikörpers auf die Einweg-Lymphozytenre.iktion
| Responder- zellen' | Stimulator- ze!lenb | Antikörper* | 3HT-Einbeziehung CPM-Wert) |
| + | + | - | 445H i 143 140 ± 17 698 ± 72 |
| + | + | - | 42626 ±1579 |
| + + + | + + + | mlgG (10 0Mg) mlflG (0,4 μg) mlgG (0,02Mg) | 36882 ±1823(14%) 35500 ±1383(17%) 42815 ±124Γ (0%) |
| + + + | + + + | R6-5-D6 (10,0 μρ) R6-5-D6 (0,4Mg) R6-5-D6 (0,03Mg) | 8250 ± 520(81%) 16142 ± 8F,8(62%) 28844 ±1780(32%) |
a Responderzellen (6,25 χ 1OVmI)
b Stimulatorzellen (6,25 x IOVml, bei 1000Rbestrahlt)
c Gereinigter monoklonaler Antikörper zu ICAM-1 (R6-5-D6) oder gereinif (es MSuse-lgG (mlgG) mit einer
Endkonzentration in den angegebenen Werten (pg/ml) d Mittel ± Standardfehler von fünf bis sechs Kulturen, Zahlen in Klammern geben die prozentuale Unterbindungder MLR an.
Zeitpunkt des Zusatzes von Anti-ICAM-1
R/ S^ Zusätze" 3HT-Einbeziehung (CPM)
Zeitpunkt des Zusatzes von Medium oder Antikörper TagO Tag1 Tag 2
Medium 205d ± 14 476 ± 132 247 ± 75 - + Modium 189 ± 16 nd' nd + - Medium 1860 ±615 nd nd + + Medium 41063 ±2940 45955 ±2947 50943 ±3072 + + R6-5-D6 17781 ±1293 38409 ±1681 47308 ±2089 (57%)f (16%) (7%)
a Responderzellen (6,25 x lOVml)
b Stimulatorzeller (6,25 χ lOVml, bei 1000R bestrahlt)
c Kulturmedium oder gc jlnigter, monoklonaler Antikörper zu ICAM-1 (R6-5-D6) mit einer Konzentration von
10pg/ml wurde am Tag 0 und in Abständen von 24 Stunden zugesetzt d Mittel ± Standardfehler von 4-6 Kulturen end = nicht ausgeführt f Prozentuale Unterbindung
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Fähigkeit des Antikörpers zu ICAM-1, die MLR zu unterdrücken, seigt, daß der monoklonal Anti-ICAM-1 -Antikörper von therapeutischem Nutzen bei der akuten Transplantationsabstoßung ist. Monoklonal ICAM -1 -Antikörper sind auch bei verwandten, durch Immunreaktionen ausgelösten Störungen von Nutzen, die von LFA-I/ICAM-1 regulierten Wechselwirkungen zwischen den Zellen abhängig sind.
Die hier beschriebenen Experimente zeigen, daß der Zusatz des monoklonalen Antikörpers zu ICAM-1 die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) unterbindet, wenn der Zusatz während der ersten 24 Stunden der Reaktion erfolgt. Außerdem wird ICAM-1 auf menschlichen peripheren Blutmonozyten bei der In-vitro-Kultur nach oben reguliert.
Außerdem wurde festgestellt, daß ICAM-1 nicht auf ruhenden menschlichen peripheren BlutiymphozyMin oder -monozyten expressiert wird. ICAM-1 wird auf ilen Monozyten von Zellen, die allein gezogen wurden, oder von Zellen, die mit Zellen eines nicht-verwandten Spenders zusarr.men gezogen wurden, in einer gemischten Lymphozytenreaktion unter Anwendung herkömmlicher strömungszytometrischcr Analysen (Abb. 20) nach oben reguliert. Diese Hochregulierung von iCAM-1 auf !vionozyten kann als Hinweis auf eine Entzündung betrachtet werden, insbesondere dann, wenn ICAM-1 auf frischen Monozyter.
von Personen mit akuter oder chronischer Entzündung expressiert wird.
Die Spezifizität von ICAM-1 für aktivierte Monozyten und die Fähigkeit des Antikörpers *u ICAM-1, eine MLR zu unterbinden, legen die Vermutung nahe, daß monoklonal ICAM-1-Antikörper ein diagnostisches und therapeutisches Potential haben können bei der akuten Abstoßung von Transplantaten und bei verwandten, durch Immunrtaktion ausgelösten Störungen, bei denen Wechselwirkungen zwischen den Zellen notwendig sind.
Wie im Beispiel 27 gezeigt wird, wird die MLR durch den Anti-ICAM-1 -Antikörper unterbunden. Die MLR wird gegebenenfalls auch durch den Anti-LFA-1-Antikörper unterbunden. Um festzustellen, ob die kombinierte Verabreichung von Anti-ICAM-1- und Anti-LFA-1 -Antikörpern eine e .höhte oder synergistische Wirkung haben würde, wurde oine MLR-Analyse (die wie im Beispiel 27 ausgeführt wurde/ bei Vorhandensein von unterschiedlichen Konzentrationen der beiden Antikörper durchgeführt.
Diese MLR-Untersuchung zeigte, daß die Kombination von Anti-ICAM-1- und Anti-LFA-1-Antikörper;ι bei Konzentrationen, bei denen keiner der Antikörper allein die fviLR drastisch unterbindet, weit stärker in der Unterbindung der M'.R Reaktion ist (Tabelle 17). Aus diesem Ergobnis geht hervor, daß Therapien, welche die gemeinsame Verabreichung d'js Anti-ICAM-1-
Antikörpers (oder von dessen Fragmenten) und des Anti-LFA-1-Antikörpers (oder dessen Fragmenten) beinhalten, eine verbesserte Therapie gegen Entzündungen darstellen. Eine solche verbesserte Therapie ermöglicht die Verabreichung von niedrigeren Dosen des Antikörpers, als sie sonst therapeutisch wirksam wären, und ist vor allem unter solchen Umständen von Bedeutung, unter denen hohe Konzentrationen von einzelnen Antikörpern eine anti-idiotype Reaktion hervorrufen.
Tebelle 17
Wirkung von verschiedenen Dosen von Anti-ICAM-1 ur.d (R3.1) Anti-LFA-1 auf die gemischte Lymphozytenreaktion
| Anti-IC/ ·\1-1 | Prozentuale Unterbindung | 0,02 | 0,1 | 0,5 | 2,5 | |
| Konzentration | (R6-5-D6) | 31 | 54 | 69 | 70 | |
| (Mg/ml) | 0 | 28 | 48 | 62 | 71 | |
| Anti-LFA-1 | 0 | 0,004 | 30 | 50 | 64 | 72 |
| 0,0 | 1 | 7 | 64 | 75 | 84 | 86 |
| 0,0008 | 0 | 7 | 91 | 92 | 92 | 92 |
| 0,0004 | 29 | 13 | 90 | 92 | 93 | 91 |
| 0,02 | 92,6 | 38 | ||||
| 0,1 | 93 | 90 | ||||
| 0,5 | 90 | |||||
Additive Wirkungen der kombinierten Verabreichung von suboptimalon Dosen von Anti-ICAM-1 und anderen Immunosuppressiven Mitteln bei der MLR
Wie im Beispiel 28 gezeigt wurde, wird die MLR durch Kombinationen von Anti-ICAM-1- und Anti-LFA-1-Antikörpern unterbunden. Um festzustellen, ob die kombinierte Verabreichung von Anti-ICAM-1 und anderen immunosuppressiven Mitteln (wie beispielsweise Dexamethason, Azathioprin, Zykiosporin A oder Steroiden, wie beispielsweise Prednison usw.) ebenfalls verstärkend j Wirkungen haben würde, wurden MLR-Untersuchungen unter Anwendung suboptimaler Konzentrationen (d. h., von Konzer.trationen, die niedriger als die optimale Konzeniration sind, bei welcher das Mittel allein einer Person verabreicht würde) von R6-5-D6 in Verbindung mit anderen immunsuppressiven Mitteln nach dem Protokoll in Beispiel 27 durchgeführt. Die Daten zeigen, daß die hemmenden Wirkungen von R6-5-D6 zumindest additiv mit den hemmenden Wirkungen von suboptimalen Dosen von Dexamethason (Tabelle 18), Azathioprin (Tabelle 19) und Zykiosporin A (Tabelle 20) sind. Das impliziert, daß die Anti-ICAM-1-Antikörper bei der Senkung der notwendigen Dosen der bekannten Immunosuppressanten wirksam sein können und damit deren toxischen Nebenwirkungen verringert werden können. Bei der Verwendung eines Anti-ICAM-1 Antikörpers (oder von dessen Fragment) zur Erzielung dieser ImmununterdrücAung ist es möglich, die Verabreichung des Antikörpers (oder von dessen Fragment) entweder mit einem einzigen zusätzlichen Immunosuppressanten oder mit einer Kombination von mehr als einem zusätzlichen immunosuppressiven Mittel zu kombinieren.
Wirkung von Anti-ICAM-1 und Dexamethason auf die menschliche gemischte Lymphozytenreaktion
| Gruppe | Inhibitor . (ng/ml) | HT-Einbeziehung (CPM) | Prozentuale Unterbindung |
| Medien Simulatoren (S) Respondoren(R) RxS | I I I I | 156 101 4461 34199 | I I I I |
| RxS | R6-5-D6 | 26224 | 23 |
| RxS | Dex(50) | 14153 | 59 |
| RxS | R6-5-D6(8)4-Dex(50) | 7759 | 77 |
Dax: Dexamethason
Wirkung von Anti-ICAM-1 und Azathioprin auf die menschliche gemischte Lymphozytenreaktion
| Gruppe | Inhibitor (ng/ml) | 3HT-Einbeziehung (CPM) | Prozentuale Unterbindung |
| Medien Simulatoren (S) Respondorei. (R) RxS | I I I I | 78 174 3419 49570 | I I I I |
| RxS | R6-5-D6(8) | 44374 | 11 |
| RxS | Azathioprin (1) | 42710 | 14 |
| RxS | R6-5-D6 (8) + Azathioprin (1; | 34246 | 31 |
| Gruppe | Inhibitor (ng/ml) | 3HT-Einbeziohung (CPM) | Prozentuale Unterbindung |
| Medien Simulatoren (S) Respondoren(R) RxS | - | 87 2Q6 987 31640 | I I I I |
| RxS | R6-5-D6(8) | 26282 | 17 |
| RxS | CyA(IO) | 23617 | 25 |
| IxS | R6-5-D6(8) +CyA(IO) | 19204 | 39 |
CyA: Zyklosporin A
Wirkung dos Antl-ICAM-1-Antikörpers bei der Unterdrückung der Abstoßung von transplantierten allogenen Organen Um die Wirkung des Anti-ICAM-1-Antikörpers bei der Unterdrückung der Abstoßung von allogenen transplantierten Organen nachzuweisen, wurden bei Cynomolgus-Affen allogene Nieren nach der Methode von Cosimi u. a. (Transplant. Proc. 13:499-503 [1981 J) mit der Modifikation transplanted, daß Valium und Ketamin als Anästhetika eingesetzt wurden. Die Nierentransplantation wurde im wesentlichen nach folgendem Schema ausgeführt. An 3 bis 5kg schweren Cynomolgus-Affen wurden heterotrope Nieren-Allo-Verpflanzungen vorgenommen, wie das im wesentlichen von Marquet beschrieben wurde (Marquet u. a., Medical Primatology [Medizinische Primatologie], Teil II, Basel, Karger, S. 125 [1972)), nachdem mit Valium und Ketamin die Anästhesie herbeigeführt worden war. Es wurden End-Seit-Anastomosen der Spendernierengefäße an einem Flecken der Aorta oder Vena cava unter Verwendung von Prolenfaden 7-0 ausgeführt. Dio Spenderharnröhre wurde spatuliert und durch extravesikulares Herangehen in die Blase implantiert (Taguchi, Y., u.a., in Dausset u.a. (Hsg.): „Advances in Transplantation" [Fortschritte in der Transplantation), Baltimore, Williams & Wilkins, S.393 (19861). Die Nierenfunktion wurde anhand wöchentlicher oder zweiwöchentlicher Bestimmungen des Serumkreatins beurteilt. Außerdem wurden häufig Biopsien des Allo-Transplantats für die histopathologische Untersuchung vorgenommen und komplette Autopsien bei den nichtÜberlebenden Empfängern vorgenommen. Bei den meisten Empfängern wurde zum Zeitpunkt der Transplantation eine bilaterale Nephrektomie vorgenommen und der nachfolgende uremische Tod wurde als Endpunkt des Überlebens der AlloTransplantate betrachtet. Bei einigen Empfängern wurde zum Zeitpunkt der Transplantation eine unilaterale native Nephrektomie und kontralaterale Ureteralligation durchgeführt. Wenn eine Abstoßung des Allo-Transplantats erfolgte, wurde die Ligatur zum autologen Harnleiter entfernt, was zur Wiederherstellung der normalen Nierenfunktion und zu der Möglichkeit fühlte, die immunologische Überwachung des Empfängertieres weiterzuführen.
Der monoklonal Antikörper R6-5-D6 wurde mit einer Dosis von 1-2 mg/kg/Tag über 12 Tage hinweg täglich verabreicht, beginnend zwei Tage vor der Transplantation. Die Serumpegel von Kreatinin wurden regelmäßig überprüft, um die Abstoßung zu überwachen. Die Wirkung des Anti-ICAM-1 -Antikörpers auf die Abstoßung der allogenen Nieren durch das Immunsystem wird in der Tabelle 21 gezeigt.
Aktivität von R6-5-D6 bei der Verlängerung des Überlebens von Nieren-AlloTransplantaten bei prophylaktischen Protokollen in Cynomolgus-Affen"
| Affe | Dosierung von R6-5-D6 | Überlebenstage/ |
| (mg/kg) | Nachbehandlung | |
| Kontrolle 1 | _ | 8 |
| Kontrolle 2 | - | 11 |
| Kontrolle 3 | - | 11 |
| Kontrolle 4 | - | 10 |
| Kontrolle 5 | - | 9 |
| Kontrolle 6 | - | 10 |
| M15 | 1,0 | 20 |
| M19 | 1,0 | 7b |
| M17 | 1,0 | 30 |
| M 25 | 1,5 | 29 |
| M 23 | 1,0 | 11C |
| M 27 | 2,0 | 34 |
| M7 | 0,5 | 22 |
| M11 | 0,5 | 26 |
| M10 | 0,5 | 22 |
| M8 | 0,5 | 26" |
β Den Affen wurde R6-5-D6 Ober 12 aufeinanderfolgende Tage, beginnend 2 Tage vor der Transplantation, verabreicht.
b Todesursache ist unbekannt. Es gab Anzeichen für latente Malaria, c Starben Niereninfarkt, d Lebteam 15.August 1988noch.
Die Ergebnisse zeigen, daß R6-5-D6 bei der Verlängerung des Lebens von Affen, die allogene Nierentransplantate erhalten hatten, wirksam ist.
Wirkung des Antl-ICAM-1-Antikörpers bei der Unterdrückung der akuten Abstoßung von transplantlerten Organen Um zu zeigen, daß die Anti-ICAM-1-Antikörper wirksam bei einem akuten Modell der Transpiantatabstoßung sind, wurde R6-5-Ü6 auch in einem therapeutischen oder akuten Nierenabstoßungsmodell getestet. Bei diesem Modell wurden Affennieren (unter Anwendung des im Beispiel 30 gegebenen Protokolls) transplantiert, dabei wurden perioperativ 15mg/kg Zyklosporin A (CyA) Intramuskulär verabreicht, bis eine stabile Nieronfunktion erreicht wurde. Die Dosis an CyA wurde dann zweiwöchentlich in Schritten von 2,5mg/kg verringert, bis die Abstoßung erfolgte, was durch einen Anstieg im Blutkreatininpegel angezeigt wurde. Zu di'.sem Zeitpunkt wurde über 10 Tage R6-5-D6 verabreicht, und es wurde die Dauer des Überlebens beobachtet. Es ist wichtig festzustellen, daß bei diesem Protokoll die CyA-Dosis suboptimal bleibt, da sie nicht mehr verändert wird, sobald das akute Abstoßungsereignis eintritt. Bei diesem Modell haben frühere Kontrollen (N = 5), bei denen nicht auf Antikörper zurückgegriffen wurde, 5 bis 14 Tage nach Beginn des Abstoßungsereignisses überlebt. Bisher wurden sechs Tiere nach diesem Protokoll unter Verwendung von R6-5-D6 getestet 'Tabelle 22). Zwei dieser Tiere leben immer noch (M 12 - 31 Tage und M 5 47 Tage nach der Verabreichung von R6-5-D6). Zwei Tiere lebten 38 und 55 Tage nach Beginn der Therapie mit R6-5-D6, und zwei Tiere starben aus anderen Gründen als akuter Abstoßung (ein Tier starb an CyA-Toxizität, und das andere starb, weil die Therapie mit H6-5-D6 unter Anästhesie begonnen wurde). Dieses Modell kommt der klinischen Situation näher, in der R6-5-D6 zuerst genutzt würde.
Aktivität von R6-5-D6 bei der Verlängerung des Überlebens von Nieren-AlloTransplantaten in therapeutischen Protokollen in Cynomolgus-Affen1
| Affe | Tag des Abstoßungs | Überlebenstage/ |
| ereignisses11 | Nachbehandlung | |
| Kontrollen' | 14-98 | 5-14 |
| M 24 | 41 | 38 |
| M21 | 34 | 4" |
| M3 | 41 | 55 |
| M9 | 12 | 11' |
| M12 | 37 | >31' |
| M5 | 26 | >47' |
a Affen erhielten über 10 aufeinanderfolgende Tage nach Beginn der Abstoßung
1-2 mg/kg, b Tag.andemsichderKreatininpegelimErgebniederVerringerungder
CyA-Dosierung erhöhte, und an dem die Therapie mit R6-5-D6 begann, c Fünf Tiere wurde unter Anwendung des oben beschriebenen therapeutischen
Kreatininpegel zu steigen begonnen hatte, d Starb unter Anästhesie. Kreatininpegel waren zu niedrig, e Starb an CyA-Toxizität. Kreatininpegel waren zu niedrig, f Lebte noch am 15. August 1988.
Genetische Konstruktion und Expression von verkürzten Derivaten von ICAM-1 ICAM-1 ist in seinem natürlichen Zustand ein an die Zellmembran gebundenes Protein, das einen extrazellularen Bereich von 5 immunoglobulinartigen Domänen, eine Transmembrandomäne uind eine zytoplasmische Domäne enthält. Es war wünschenswert, funktionell Derivate von ICAM-1 zu konstruieren, denen die Transmembrandomäne und/oder die zytoplasmische Domäne fehlen, um so eine lösliche, sekretierte Form von ICAM-1 erzeugen zu können. Diese funktioneilen Derivate wurden durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese des ICAM-1-Gens, an die sich die Expression in Affenzellen nach der Transfektion mit dem mutanten Gen anschloß, konstruiert.
Mutationen im ICAM-1-Gen, die zu Aminosäuresubstitutionen und/oder verkürzten Derivaten führen, wurden nach der Methode von Kunkel, T., (Proc. Netl. Aced. Sei. USA 82:488 bis492 (1985)) hergestellt. ICAM-1 -cDNA, die in deroben beschriebenen Weise hergestellt worden war, wurde mit den Restriktionsendunukleasen Sa11 und Kpn 1 verdaut, und das resultierende 1,8-kb-DNA-Fragment wurde in den Plasmidvektor CDM8 subkloniert (Seed, B., u.a., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 84:3365-3369 [1987J). Anschließend wurde mit dieser Konstruktion, dio als pCD1.8C bezeichnet wurde, ein dut", ung~-Stamm von E.coli (BW313/P3) transformiert. Von den Transformanten wurde durch Infektion mit dem Helfer-Phag R408 (Stratagene®) eine einzelsträngige, urazilhaltige Matrize gewonnen. Mutante ICAM-1-cDNAs wurden dann durch Starten einer zweiten Strangsynthese mit einem üligonukleotiden erzeugt, der fehlangepaßte Basen enthielt, und durch anschließende Transformation eines ung+-Wirtes (MC1061/P3) mit dem resultierenden Heteroduplex. Mutanten werden durch „Screenieren" mit neu geschaffenen Endonukleaserestriktionsstellen, die durch das mutante Oligonukleotid eingeführt wurden, isoliert. Das mutante ICAM-1 -Protein wurde durchTransfektion von Cos-7-Zellen mit der mutanten DNA im eukaryotischen Expressionsvektor CDM8 unter Anwenden des DEAE-Dextran-Standardverfahrens expressiert (Seiden, R. F., u.a., in: Current Protocols in Molecular Biology (Laufende Protokolle in der Molekularbiologie), Ausubel, F. M., u. a., Hsg., S. 9.2.1-9.2.6 (1987]).
Es wurde ein verkürztes, funktionelles Derivat von ICAM-1 hergestellt, dem die Transmembran- und zytoplasmischen Domänen fehlen, das aber den extrazellulären Bereich mit allen 5 immunoglobulinartigen Domänen enthält. Ein mutantes Oligonukleotid zu 30bp (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) wurde dazu verwendet, Kodone für die Aminosäuren Tyrosin (Y) und Glutaminsäure (E) in den Positionen 452 bzw. 4E3 in einen Phenylalanin- (F) und einen Translationsstopp-Kodon (TAG) zu transformieren. Der Mutant wurde anhand der einzigartigen Xba 1-Restriktionsstelle isoliert und als Y452EZFJAG bezeichnet. Um das mutante Protein zu expressieren, wurden COS-Zellen mit drei mutanten Subklonen (N°2, N°7 und N°8) transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion mit den drei mutanten Subklonen wurden die obenaufschwimmenden Schichten der Kulturen und das Zellysat durch Immunoausfällung mit dem monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper RR1 /1 und SDS-PAGE analysiert. ICAM-1
isfi;
ausgefällt, nicht aber aus den Reinigungslysaten dieser Zellen. Das Molekulargewicht der ICAM-1', das in der ' obenaufschwimmenden Kulturschicht gefunden wurde, war um etwa 6kd niedriger als die Membranform von ICAM-1, was mit der aus aer mutanten DNA vorhergesagten Größe übereinstimmt. Folglich wird dieses funktioneile Derivat von ICAM-1 als lösliches Protein exkretiert. Im Gegensatz dazu wurde ICAM-1 nicht aus den obenaufschwimmenden Schichten von Kontrollkulturen von Zellen immunoausgefällt, die mit nativem ICAM-1 transfiziert worden waren, was nachweist, daß die Membranform von ICAM-1 nicht von Cos-Zellen abgegeben wird. Außerdem wurde kein ICAM-1 von obenaufschwimmenden Kulturschichten oder Zellysaten von negativen, pseudotransfizierten Zellen als Kontrolle immunoausgefällt. Das verkürzte ICAM-1, das aus transfizierten Zellen sekretiert wurde, wurde durch Immunoaffinitätschromatografie mit einem ICAM-1-spezifischen Antikörper (R6-5-D6) gereinigt und auf seine funktionell Aktivität in einer Zeilbindungsuntersuchung getestet. Nach dom Reinigen bei Vorhandensein des Reinigungs-Oktylglykosids wurden Präparate, welche natives ICAM-1 oder die verkürzte, sekretierte Form enthielten, auf eine Endkonzentration von 0,25% Oktylglukosid verdünnt (eine Konzentration unter der kritisohon Mizellkonzentration des Reinigungsmittels). Diese Präparate von ICAM-1 konnten sich an die Oberflächen von Plastplatten mit 96 eingelassenen Vertiefungen (Nunc) binden, um an eine feste Phase gebundenes ICAM-1 zu produzieren. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Materials waren etwa 75-80% bzw. 83-88% von SKW-3-Zellen, die LFA-1 auf ihren Oberflächen auswiesen, spezifisch an die nativen bzw. verkürzten Formen von ICAM-1 gebunden. Diese Daten zeigen, daß die sekretierte, verkürzte, lösliche Form des funktioneilen ICAM-1 -Derivats sowohl die immunologische Reaktivität als auch die Fähigkeit bewahrte, die ICAM-1-abhängige Adhäsion zu vermitteln, die charakteristisch für natives ICAM-1 ist.
Nach ähnlichen Methoden wurde ein funktionelles Derivat von ICAM-1 hergestellt, dem nur die zytoplasmische Domäne fehlte. Ein Oligonukleotid zu 25bp (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) wurde dazu verwendet, den Kodon für die Aminosäure 476 (Y) in einen TAG-Translationsstoppkodon umzuwandeln. Der Mutant wurde als Y476ZTAG bezeichnet. Die Immunoausfällungsanalyse und SDS-PAGE von Cos-Zellen, die mit dem Mutanten transfiziert worden waren, stellten eine membrangebundene Form von ICAM-1 mit einem Molekulargewicht fest, das etwa um 3kd kleiner als die native Form von ICAM-1 ist. Die indirekte Immunofluoreszenz der mutantentransfizierten Cos-Zellen zeigte ein Punktat-Färbemuster ähnlich dem von nativem ICAM-1, das auf LPS-stimulierten Endothelzellen des Menschen expressiert wird. Schließlich waren die mit der mutanten DNA transfizierten Zellen spezifisch an gereinigtes LFA-I auf Plastflächen in einer ähnlichen Weise wie Cos-Zellen gebunden, die mil natürlicher ICAM-1-DNA transfiziert worden waren (Tabelle 23).
Fähigkeit von ICAM-1-t.<pressierenden Zellen oder eines funktioneilen Derivats von ICAM-1, LFA-1 zu binden
| Transfektion | % der ICAM-1 -expressierenden Zellen, die LFA-1 binden bei Vorhandensein von: |
| keinem Antikörper RR1/1 | |
| Pseudotransfektion Natives ICAM-1 Y47VTAG | 0 0 20 0 20 0 |
Untersuchungen von ICAM-1 haben gezeigt, daß das Molekül 7 Domänen aufweist. Fünf dieser Domänen sind extrazellular (Domäne 5 befindet sich am nächsten der Zelloberfläche, Domäne 1 ist am weitesten von der Zelloberfläche entfernt), eine Domäne ist eine transmembrane Domäne und eine Domäne ist zytoplasmisch (d. h., sie liegt innerhalb der Zelle). Um festzustellen, welche Domänen an der Fähigkeit von ICAM-1 beteiligt sind, sich an LFA-1 zu binden, wurden Epitopkartierungsuntersuchungen durchgeführt. Zur Durchführung solcher Untersuchungen werden verschiedene Deletionsmutanten hergestellt und nach ihrer Fähigkeit charakterisiert, sich an LFA-1 zu binden. Als alternative Möglichkeit können die Untersuchungen unter Verwendung des Anti-ICAM-Antikörpers durchgeführt werden, von dem bekannt ist, daß er die Fähigkeit von ICAM-1, LFA-1 zu binden, beeinträchtigt. Zu den Beispielen für solche geeignete Antikörper gehören RR1/1 (Rothlein, R., u.a., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986]), R6.5 (Springer, T.A., u.a., US-PA, laufende N°07/250446), LB-2 (Clark, E. A., u. a., in: Leukocyte Typing I (Leukozytentypisierung l|, A. Bernard u. a., Hsg., Springer-Verlag, S. 339-346 [1984]) oder CL203 (Staunton, D. E., u.a., Cell 56: 849-853 [1989]).
Deletionsmutanten von ICAM-1 können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. Vorteilhaft ist es jedoch, derartige Mutanten über stellengerichtete Mutagenese oder durch andere rekombinante Mittel (wie beispielsweise die Konstruktion von ICAM-1-expressierenden Gensequenzen, bei denen die Sequenzen, welche bestimmte Proteinbereiche codieren, deletiert worden sind) herzustellen. Verfahren, die zur Herstellung solcher Mutanten angewendet werden können, sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Unter Anwendung dieser Verfahren wurden drei ICAM-1-Deletionsmutanten hergestellt. Dem ersten Mutanten fehlen die Aminosäurereste F185 bis einschließlich P284 (d. h„ Deletion von Domäne 3). Dem zweiten Mutanten fehlen die Aminosäurereste P284 bis einschließlich R451 (d. h„ Deletion von Domäne 4 und 5). Dem dritten Mutanten fehlen die Aminosäurereste nach Y476 (d. h., Deletion der zytoplasmischen Domäne). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß die Domänen 1,2 und 3 dominierend an ICAM-1-Wechselwirkungen mit Anti-ICAM-1 -Antikörpern und LFA-1 beteiligt sind.
Die Fähigkeit von ICAM-1, mit LFA-1 in Wechselwirkung zu treten und dieses zu binden, wird durch ICAM-1-Aminosäurereste vermittelt, die in den Domänen 1 des ICAM-1 -Moleküls vorhanden sind (Abbildungen 8,9 und 1 ü). Derartige Wechselwirkungen werden jedoch durch Anteile von Aminosäuren unterstützt, dia in den Domänen 2 und 3 von ICAM-1 vorhanden sind. So gehören zu den bevorzugten funktionellen Derivaten der vorliegenden Erfindung lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, welche die Domänen 1,2 und 3 von ICAM-1 enthalten. Noch mehr bevorzugt werden lösliche Fragmente von Molekül ICAM -1, die die Domänen 1 und2von ICAM-1 enthalten. Am meisten bevorzugt werden lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten. Verschiedene Aminosäurereste innerhalb der ersten ICAM-1-Domäne sind an der Wechselwirkung von ICAM-1 und LFA-1 beteiligt. Substitutionen dieser Aminosäuren durch andere Aminosäuren ändern die Fähigkeit von ICAM-1, LFA-1 zu binden. Diese Aminosäurereste und die Substitutionen werden in der Abb. 25 gezeigt. Abb. 25 zeigt die Wirkungen solcher Mutationen auf die Fähigkeit des resultierenden, mutanten ICAM-1-Moleküls, sich an LFA-1 zu binden. In den Abbildungen 23 bis 25 werden Reste unter Bezugnahme auf den Einbuchstabencode für Aminosäuren beschrieben, gefolgt von der Position des Restes im ICAM-1-Molekül. So bezeichnet beispielsweise „E90" den Glutaminsäurerest in der Position 90 von ICAM-1. Ebenso bezeichnet „90 V das Dipeptid, das sich aus dem Glutaminsäurerest in die Position 90 und dem Valinrest in der Position 91 zusammensetzt. Die Substitutionssequenz wird rechts vom Schrägstrich angegeben ("/"). Die Reste V4, R13, Q27, Q58 und D60S61 von ICAM-1 sind an der LFA-1-Bindung beteiligt.
Der Austausch dieser Aminosäuren änderte die Fähigkeit von ICAM-1, sich an LFA-1 zu binden. Beispielsweise führt der Ersatz von V4 durch G zur Bildung eines mutanten ICAM-1-Moleküls, das weniger zur Bindung an LFA-1 fähig ist (Abb. 25). Der Ersatz des Restes R13 von ICAM-1 durch E führt zur Bildung eines mutanten Moleküls mit einer wesentlich geringeren Kapazität, sich an LFA-1 zu binden (Abb. 25). Der Ersatz des Restes Q58 von ICAM-1 durch H führt zur Bildung eines mutanten Moleküls mit einer im wesentlichen normalen Kapazität, sich an LFA-1 zu binden (Abb. 25). Der Ersatz des D60S-Restes von ICAM-1 durch K führt zur Bildung eines mutanten Moleküls mit einer wesentlich geringeren Kapazität, sich an LFA-1 zu binden (Abb. 25). Glykosylationsstellen in der zweiten Domäne sind ebenfalls an der LFA-1 -Bindung beteiligt (Abb. 23). Der Ersatz von N103 durch K oder von A155N durch SV führt zur Bildung eines mutanten ICAM-1-Moleküls, das im wesentlichen unfähig ist, sich an LFA-1 zu binden. Dagegen schien der Ersatz der Glykosylationsstelle N175 durch A die Kapazität des mutanten ICAM-1, sich an LFA-1 zu binden, nicht wesentlich zu beeinflussen
Mutationen in der dritten ICAM-1-Domäne änderten die ICAM-I-LFA-I-Bindung nicht merklich (Abb.24).
Multimere Formen von ICAM-1 mit erhöhter biologischer Halbwertszeltaffinität und Leerungsfähigkeit Es werden schimärische Moleküle konstruiert, in denen die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 an den Gelenkbereich der schweren Immunoglobulinkette angefügt sind. Bevorzugte Konstruktionen heften den C-Terminus von ICAM-1 -Domäne 2 an ein Segment des schweren Immunoglobulinkettengens, unmittelbar N-terminal zum Gelenkbereich, an, wodurch die Segmentflexibilität durch den Gelenkb6reich übertragen wird. Damit ersetzen die ICAM-Domänen 1 und 2 das Fab-Fragment eines Antikörpers. Das Anheften an die schweren Ketten der IgG-Klasse und die Produktion tierischer Zellen führen zur Produktion eines schimärischen Moleküls. Die Produktion von Molekülen, die schwere Ketten enthalten, die von IgA oder IgM abgeleitet wurden, führt zur Produktion von Molekülen von höherer Multimerizität, die zwischen 2 und 12 ICAM-1 -Moleküle enthalten. Die Koexpression des J-Kettengens in den tierischen Zellen, welche die schweren, schimärischen ICAM-1-Moleküle expressieren, ermöglicht die angemessene Zusammenstellung von IgA- und IgM-Multimeren, die vorwiegend zu IgA-Molekülen führen, die 4 bis 6 ICAM-1-Moleküle und im Fall von IgM etwa 10 ICAM-1-Moleküle enthalten. Diese schimärischen Moleküle haben verschiedene Vorteile. Erstens sind Ig-Moleküle für eine hohe Beständigkeit im Kreislauf aufgebaut, und das kann die biologische Halbwertszeit verbessern.
Außerdem erlaubt es die muitimere Natur dieser konstruierten Moleküle ihnen, mit höherer betonter Affinität mit dem Rhinovirus sowie mit der Zelloberflächen LFA-1, in Abhängigkeit vom therapeutischen Zusammenhang, in Wechselwirkung zu treten, wodurch sich die Menge des rekombinanten Proteins, die zur Erzielung einer wirksamen Dosis verabreicht werden muß, stark verringert. IgA und IgM sind stark glykosylierte Moleküle, die normalerweise in den Sekretionen an Schleimhautstellen, wie in der Nase, vorhanden sind. Ihr stark hydrophiler Charakter trägt dazu bei, Bakterien und Viren, an welche sie sich binden, aus der Schleimhaut herauszuhalten, wodurch das Anheften on Zellen odor die Überquerung der Epithelzellmembranbarriere verhindert werden. Sie können daher eine erhöhte therapeutische Effektivität haben. IgM und insbesondere IgA sind in einer Schleimhautumgebung stabil, und sie können die Stabilität von ICAM-1-Konstruktionen vergrößern. Wenn ein solches funktionelles ICAM-1-Derivat in den Blutstrom eingeführt wird, kann es auch die biologische Halbwertszeit verlängern. IgA fixiert nicht das Komplement und wäre damit ideal für solche Anwendungen, in denen das schädlich wäre. Wenn eine IgG-H-Ketten-Schimärizität gewünscht wird, wäre es möglich, Bereiche zu mutieren, die am Anheften des Komplements sowie an Wechselwirkungen mit Fc-Rezeptoren beteiligt sind.
Erzeugung von ICAM-1-Mutanten
Der Codierungsbereich einer ICAM-1-cDNA in einem 1,8-kb-Sal' -Kpni-Fragment wurde in den Expressionsvektor CDMB subkloniert (Seed, B., u.a., Proc. Natl. Acad. ScI. USA 84:3365-^1369 (1987]). Ausgehend von der Methode von Kunkel, T. (Proc.
Natl. Acad. ScI. USA 82:488-492 [1985]), und den Modifikationen von Staunton, D., u.a. (Staunton, D.E., u.a., Cell 52: 925-933 (1988)), wurde diese Konstruktion (pCD1.8) c'azu verwendet, eine einzelsträngige, urazilhaltige Matrize zu erzeugen, die in der oligonukleotidgerichteten Mutagenese eingesetzt werden kann.
Kurz gesagt, der E. coli-Stamm XS127 wurde mit pCD1.8 transformiert. Einzelne Kolonien wurden in 1 ml Luria-Brühmedium (LB-Medium) (Difco) mit 13Mg/ml Ampicillin u.iil b^.g/ml Tetrazyklin bis annähernd zur Sättigung gezogen. Es wurden 10Opg der Kultur mit dem Helfer-Phag R408 (Strategene) mit einer Infektionsmultipliziis! (MOI) von 10 infiziert, und es wurden 10ml des LB-Mediums mit Ampicillin und Tetrazyklon für eine 16stündige Kultur bei 370C zugesetzt. Nach einem einminütigen
Zentrifugieren mit lOOOOU/rnin und dem Filtern der obenaufschwimmenden Schicht durch 0,22Mm wurde die Phag-Suspension zum Infizieren von E. coil BW313/P3 verwendet, die dann auf LB-Agar-Platten (Difco) plattiert wurden, welche mit Ampicillin und Tetrazyklen ergänzt worden waren. Kolonien wurden herausgegriffen, in 1 ml LB-Medium mit Ampicillin und Tetrazyklin annähernd bis Sättigung gezogen und mit dem Helfer-Phag bei einer MOI von 10 infiziert. Das Kulturvolumen wurde dann auf 250ml erhöht, und die Zellen wurden über Nacht gezogen. Durch Standard-Phag-Extraktion wurde einzelsträngige DNA isoliert. M Uta nt β Oligonukleotide wurden phosphoryliert und mit der pCDI .8-MaUiUe in einer zweiten Strangsynthesereaktion eingesetzt (Staunton, D.E., u.a.. Cell 52: 925-933 (1988)).
COS-Zellen wurden so in 10-cm-Gewebekulturplatten eingepflanzt, daß sie in 16 bis 24 Stunden zu 50% konfluent waren. Dann wurden die COS-Zellen einmal mit TBS gewaschen und 4 Stunden lang mit 4ml RPMI-Medium inkubiert, das 10% Nu-Seren (Collaborative), 5pg/ml Chloroquin, 3pg des mutanten Plasmids und 200Mg/ml DEAE-Dextransulfat enthielt. Dann wurden die Zellen mit 10% DMSO/PBS, gefolgt von PBS, gewaschen und 16 Stunden lang in Kulturmedien gezogen.
Die Kulturmedien wurden durch frische Medien ersetzt und 48 Stunden nach der Transfektion wurden die COS-Zellen durch Trypsin/EDTA-Behandlung (Gibco) zur Suspension gebracht und auf zwei 10-cm-Platten sowie Gewebekulturplatten mit 24 eingelassenen Vertiefungen zur HRV-Bindung aufgetpilt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen von den 10-cm-Platten mit 5mM EDTA/HBSS geerntet und für die Haftung an LFA-1-beschichteten Plasten und Immunofluoreszenz verarbeitet.
LFA-1 wurde aus SKW-3-Lysaten durch Immunoaffinitätschromatografie auf Sepha0roseTS2/4 LFA-1-mAb gereinigt und bei einem pH-Wert von 11,5 bei Vorhandensein von 2mM MgCI2 und 1 % Oktylglykosid eluiert. LFA-1 (10pg je 200μI je 6-cm-Platte) wurde durch Verdünnung von Oktylglukosid in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) auf 0,1 % mit 2mM MgCI2 an bakteriologische Petrischalen gebunden und über Nacht bei 4°C inkübiert. Die Platten wurden mit 1 % BSA (Rinderserumalbumin) blockiert und in PBS gelagert, das 2 mM MgCI2,0,2% BSA, 0,025% Azid und 50 Mg/ml Gentamyzin enthielt. 61Cr-markierte COS-Zellen in PBS, das 5% FCS (Kalbsfötusserum), 2 mM MgCI2,0,025% Azid (Puffer) enthielt, wurden mit oder ohne 5pg/ml RR1/1 und R6.5 in LFA-1-beschichteten Mikrotiterplatten bei 250C eine Stunde lang inkubiert. Nichtanhaftende Zellen wurden durch 3 Waschungen mit Puffer entfernt. Anhaftende Zellen wurden durch den Zusatz von EDTA 7U 1OmM eluiert und einer Gammazählung unterzogen.
Ergebnisse
Es wurden Anti-ICAM-1-Antikörper wie RR1/1, R6.5, LB-2 oder CL2°3 identifiziert. Wenn diese Antikörper in der Lage sind, die ICAM-1 -Funktion zu unterbinden, müssen sie in der lage sein, sich an eine bestimmte Stelle im ICAM-1 -Molekül tu binden, die auch für die ICAM-1-Funktion wichtig ist. Folglich ist es durch die Herstellung der oben beschriebenen Deletionsrnutanten von ICAM-1 und die Bestimmung des Umfangs, in welchem sich die Anti-ICAM-1 -Antikörper an die Deletion binden können, möglich festzustellen, ob die deletierten Domänen für die Funktion wichtig sind.
ICAM-1 ist ein integrales Membranprotein, für das vorhergesagt wird, daß die extrazellulare Domäne aus 5 Ig-ähnlichen C-Domänen zusammengesetzt ist. Um die Domänen zu identifizieren, die an der Bindung von LFA-1 beteiligt sind, wurden die Domäne 3 und die Domänen 4 und 5 (Karboxylterminal) durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese deletiert und nach der Expression in COS-Zellen funktionell getestet. Außerdem wurde die gesamte zytoplasmische Domäne deletiert, um deren potentiellen Einfluß auf ICAM-1-Wechselwirkungen zu bestimmen. Wie erwartet, ergab die Deletion des zytoplasmischen Bereichs, Y476/· keinen Verlust an RR1/1-, R6.5-, LB-2- und CL203-Reaktivität, während die Deletion von Domäne 3, F185-R451 zu einer Verringerung und zum Verlust der CL203-Reaktivität führt (Abb. 20). Folglich scheint sich der CL203-Epitop in der Domäne 4 zu befinden, während RFU/1, R6.5 und LB-2 in den zwei,Aminoterminaldomänen zu liegen scheinen.
Alle drei Deletionsmutanten weisen eine Haftung an LFA-1 entsprechend dem Wildtyp auf (Abb. 21). Es wurden auch Aminosäuresubstitutionen in den vorgesagten Beta-Windungen in den Domänen 1,2 und 3 erzeugt und nach der Expression in COS-Zel!en funktionell getestet. Das Epiiop R6.5 wurde so an die Folge E111GGA in der Domäne 2 lokalisiert und kann auch E39 in der Domäne 1 einschließen, während RR1 /1 und LB-2 beide von R13 in der Domäne 1 abhängig sind (Abb. 22). Außerdem wird die RR1/1-Bindung durch Mutationen in der Sequenz D71GQS verringert. Mutationen, welche N-vernetzteGlykosylationsstellen bei N103 und N165 ausschalten, führen zu einer verringerten flR1/1-, R6.5- und LB-2-LFA-1-HRV-Bindung. Diese Mutationen scheinen die Verarbeitung so zu beeinflussen, daß ICAM-1-Dimere erzeugt werden.
Andere Mutationen in den Domänen 2 oder 3 führten nicht zu einer geänderten LFA-1-Adhäsion (Abbildungen 23 und 24). Die Aminosäuren in der Domäne 1, R13 und D60, sind beide an der Bindung von LFA-1 beteiligt (Abb. 25).
Folglich scheint die LFA-1- und HRV-Bindung eine Funktion der aminoterminale n, Ig-ähnlichen Domäne von ICAM-1 zu sein.
Abb. 26 zeigt eine Ausriß htung der ICAM-Aminoterminaldomänon.
Die Erfindung wurde zwar in Verbindung mit spezifischen Ausführungsbeispielen beschrieben, es ist jedoch selbstverständlich, daß weitere Modifikationen möglich sind, und die vorliegende Anmeldung soll alle Varianten, Anwendungen oder Adaptionen der Erfindung einschließen, die im allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, und auch solche Abweichungen von der vorliegenden Offenlegungsschrift einschließen, die innerhalb des Gebietes der Erfindung bekannt oder allgemeine Praxis werden und wie sie auf die wesentlichen dargestellten Merkmale Anwendung finden können, wie sie im Rahmen der beigefügten Ansprüche dargelegt sind.
-42- 285 Bildunterschriften und Legenden
Abb. 1 - Adhäsion zwischen normaler Zelle und LFA-1-dofizienter Zelle. Abb. 2 - Adhäsion zwischen normalen Zellen.
Normal cell - Normale Zelle
Abb. 3 -Aggregation -Zusammenballung
Time - Zeit
Abb. 4 - Cells in aggregate - Zellen in der Zusammenballung
EBVtransformed B-cells - EBV-transformierte B-Zellen
Abb. 6 - "6l-specific binding - '"l-spezifische Bindung
Time (hours) - Zeit (Stunden)
Abb. 7 - '"-!-specific binding - '"!-spezifische Bindung
Cytokine concentration - Zytokinkonzentration
Abb. 11 - LFA-1-positive, EBV-transformierte B-Lymphoblastoidzellen binden sich in Planmembranen an ICAM-1.
Cells bound - Gebundene Zellen
Abb. 12 - LFA-1-positive, EBV-transformierte B-Lymphoblastoidzellen binden sich in Planmembranen an ICAM-1.
Cells bound - Gebundene Zellen
Glycophorin - Glykophorin
Ab. 13 - Unterbindung der Bindung von JY-B-Lymphoblastoidzellen an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen durch Vorbehandlung der Zellen oder Bläschen mit monoklonalen Antikörpern.
Cells bound - Gebundene Zellen
Pretreatment - Vorbehandlung
None - Keine
Protein in vesicles - Protein in Bläschen
Cells - Zollen
Vesicles - Bläschen
Abb. 14 - WirkungderTemperaturaufdieBindung vonT-LymphoblastenanlCAM-1 in plastgebundenen Bläschen.
Cells bound - Gebundene Zellen
Temperature - Temperatur
Protein in vesicles - Protein in Bläschen
Glycophorin - Glykophorin
Abb. 15 - Bedarf an zweiwertigen Kationen für die Bindung von T-Lymphoblasten an ICAM-1 in plastgebundenen Bläschen.
Bound - Gebunden
Cone. - Konzentration
Protein in vesicles . - Protein in Bläschen
Glycophorin - Glykophorin
Abb. 16 - Wirkung des Antiadhäsionsantikörpers auf die OKT3-induziette Wucherung von menschlichen, peripheren, mononuklearen Blutzellen.
None - Keine
Control mlgG - Kontroll-mlgG
Abb. 17 - WirkungdesAntiadhäsionsantikörpersaufdieconcanavalin-A-induzierteWucherung von menschlichen, peripheren, mononuklearen Blutzellen.
None - Keine
Abb. 18 - Wirkung des Antiadhäsionsantikörpers auf die KLH-induzierte Wucherung von menschlichen, peripheren, mononuklearen Blutzellen.
No treatment - Keine Behandlung
Abb. 19 - Wirkung des Antiadhäsionsantikörpers auf die tetanustoxoid-induzierte Wucherung von menschlichen, peripheren, mononuklearen Blutzellen.
Notreatment - Keine Behandlung
Abb. 20 - Mab-binding to ICAM-1- - Mab-Bindung an ICAM-1 -
deletion mutants Deletionsmutanten
Abb. 21 - Bindung der ICAM-1 -Deletionsmutanten an LFA-1.
Wild type bound - Nach dem Wildtyp gebunden
Abb. 22 - ICAM-1-Mab-Epitope.
positive - positiv
Abb. 23 - Bindung der ICAM-1-Mutanten von Domäne 2 an LFA-1.
Wild type bound - Nach dem Wildtyp gebunden
Abb. 2·' - Bindung der ICAM-1-Mutanten von Domäne 3 an LFA-1.
Wildtypebound - Nach dem Wildtyp gebunden
Abb.25 - BindungderlCAM-1-MutantenvonDomänoi anLFA-1.
Wildtypebound - Nach dem Wildtyp gebunden
Abb. 26 - Homologie der ICAM-Aminoterminaldomänen.
Claims (17)
1. Lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1.
2. Derivat von ICAM-1 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fragment von ICAM-1 oder eine Variante, ein Analog oder ein chemisches Derivat eines solchen Fragments ist.
3. Derivat von ICAM-1 nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ihm die zytoplasmische Domäne von ICAM-1 fehlt.
4. Derivat von ICAM-1 nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ihm die Transmembrandomäne von ICAM-1 fehlt.
5. Derivat von ICAM-1 nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es Domäne 1 oder Domänen 1 und 2 oder Domänen 1,2 und 3 enthält.
6. Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Entzündungen, die aus einer Reaktion des spezifischen oder nichtspezifischen Abwehrsystems resultieren eingesetzt wird.
7. Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Unterdrückung der Metastase eine hämatopoetischen Tumorzelle, wobei diese Zelle ein funktionelles Glied der LFA-1-Familie zur Wanderung braucht, eingesetzt wird.
8. Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Unterbindung des Wachstums einer LFA-1-expressierendan Tumorzelle eingesetzt wird.
9. Entzündungshemmendes Mittel zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zusammen mit einer immunosuppressiven Droge einzusetzen ist, welche vorzugsweise aus Dexamethason, Azathioprin und Zyklosporin A ausgewählt wird, um eine Entzündung zu behandeln, die aus einer Reaktion des spezifischen Abwenrsystems resultiert, dadurch gekennzeichnet, daß dieses entzündungshemmende Mittel ausgewählt wird aus einem Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann; einem Fragment eines Antikörpers, wobei sich das Fragment an ICAM-1 binden kann; ICAM-1; einem funktionalen Derivat von ICAM-1 und einem Nichtimmunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
10. Entzündungshemmendes Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
11. Entzündungshemmendes Mittel zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Entzündung, die aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems resultiert, welches zusammen mit einem zweiten Mittel einzusetzen ist, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird aus einem Antikörper, der sich an LFA-1 binden kann; einem funktioneilen Derivat eines Antikörpers, wobei sich das funktioneile Derivat an LFA-1 binden kann; und einem Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von LFA-1; wobei das entzündungshemmende Mittel ausgewählt wird aus einem Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann; einem Fragment eines Antikörpers, wobei sich das Fragment an ICAM-1 binden kann; ICAM-1; einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 und einem Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
12. Entzündungshemmendes Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch
a) ein entzündungshemmendes Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus einem Antikörper, der sich an ICAM-1 binden kann; einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragmentsich an ICAM-1 binden kann; ICAM-1; einem funktioneilen Derivat von ICAM-1 und einem Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 besteht, und
b) wenigstens ein immunosuppressives Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Dexamethason, Azathioprin und Zyklosporin / „esteht.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch
a) ein lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und
b) ein herkömmliches Trägermittel oder einen Exzipienten.
15. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage is*, ein lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zu expressieren.
16. Verfahren zur Herstellung eines löslichen, funktioneilen Derivates von ICAM-1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtsorganismus kultiviert wird, dor durch einen rekombinanten Vektor transformiert wird, welcher ein lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bedingungen codiert, durch welche das Derivat in das Kulturmedium expre?siert und sekretiert wird, und anschließend das Derivat isoliert wird.
17. Methode zur Diagnostizierung des Vorhandenseins und der Lage einer Tumorzelle, welche ein GMr d der LFA-1-Familie von Molekülen in einer Person expressiert, bei der eine solche Zelle vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß
a) eine Gewebeprobe der Person bei Vorhandensein einer Zusammensetzung inkubiert wird, welche ein nachweisbar markiertes, lösliches, funktionelles Derivat von ICAM-1 nach einem der
• Ansprüche 1 bis ύ enthält, und
b) dieser Bindungsligand nachgewiesen wird, der an ein Glied dor LFA-1-Familie von Molekülen gebunden ist, die in dieser Gewebeprobe vorhanden sind.
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