JPH06145199A - Ｉｃａｍ−１のｍａｃ−１結合部位 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 炎症疾患及びウイルス疾患の治療に有益な細
胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）及びそれらの官能性誘導
体を提供することにある。 【構成】 Ｍａｃ−１に実質的に結合できないが、ＬＦ
Ａ−１に実質的に結合できるＩＣＡＭ−１官能性誘導
体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞間接着分子、ＩＣ
ＡＭ−１、及び白血球接着レセプターＭａｃ−１に結合
するその能力に関する。更に、本発明は炎症を治療する
ためにＩＣＡＭ−１−Ｍａｃ−１結合能力の使用に関す
る。本発明は一部政府の援助によりなされた。政府は本
発明に或る種の権利を有する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】

Ｉ．細胞接着 免疫系は、動物を細菌、ウイルス、等の如き外来の侵入
物から保護する責任を負う。防御系の優れた総説がEise
n,H.W により示されている(Microbiology 、第３編、Ha
rper＆Row 、フィラデルフィア、PA(1980)、290 〜295
頁及び381 〜418 頁を参照のこと) 。外来の侵入物に対
して動物を保護する免疫系の能力は、白血球として知ら
れる血液細胞の存在及び機能に大部分依存する。

【０００３】病原菌に対する免疫系の応答に於ける主要
な出来事は、好中球を炎症部位に循環することの補強で
ある。内皮への接着は、損傷の末梢部位への溢血に前も
って必要な生理工程である。好中球の局在化は、血流及
び好中球の表面の同族タンパク質から好中球が出ること
を促進する出来事の順序と、この相互作用を調整する内
皮細胞の両方を規定することが分子レベルで調べられ
た。

【０００４】動物またはヒトを保護する白血球の能力
は、細胞基質及び細胞外の基質への免疫系細胞の接着を
必要とすることがわかった。例えば、白血球は内皮細胞
に付着できることが必要であり、その結果、それらは循
環から炎症を受けている部位へ移行できる。更に、それ
らは、通常の免疫応答が起こり得るように抗原提供細胞
に付着する必要がある。また、それらは、ウイルス感染
細胞（または腫瘍細胞）の溶解が起こり得るように適当
な標的細胞に付着し得る必要がある。更に、白血球は、
微生物及び細胞のデブリを有効に食作用し浄化し得るよ
うに、種々の活性タンパク質（例えば、iC3b−補体の第
三成分の活性形態）に付着し得る必要がある。こうし
て、白血球接着は、正常に機能する宿主防御系の前もっ
て必要なものである。この防御系の抑制は移植の如き場
合に所望される。何となれば、宿主は移植組織を異物と
して認識しその組織に対して免疫応答を開始するからで
ある。それ故、白血球接着はまた移植された組織及び器
官の拒絶に関与する。こうして、白血球接着の理解は、
感染と戦う動物の能力を増大させ、または移植組織を拒
絶する動物の能力を抑制することを可能にし得る。

【０００５】白血球接着を媒介するのに関与する白血球
表面分子は、ハイブリドーマ技術を使用して同定され
た。簡単に言えば、ヒトＴ細胞に対して送られるモノク
ローナル抗体（Davignon,D. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA78:4535-4539(1981)) 及びマウス脾臓細胞に対して送
られるモノクローナル抗体(Springer,T.ら、Eur.J.Immu
nol.9:301-306(1976))が同定され、これらは白血球表面
に結合し上記の付着に関連する機能を抑制した(Springe
r,T.ら、Fed.Proc.44:2660-2663(1985))。これらの抗体
により認識された分子は、接着レセプター分子の“リン
パ球機能に関連する抗原−１系統群”（即ち、“ＬＦＡ
−１系統群”）として知られている白血球接着レセプタ
ーの組を含む。

【０００６】接着レセプター分子のＬＦＡ−１系統群は
三種の高度に関連する細胞表面糖タンパク質：“ＬＦＡ
−１”（CD11a/CD18) 、“Ｍａｃ−１”（CD11b/CD18)
、及び"p150,95" （CD11c/CD18) を含む。これらの糖
タンパク質は、タンパク質の系統群の員である白血球イ
ンテグリンであり、これらは免疫系の接着機能に重要で
ある（Springerら、Ann.Rev.Immunol.,5:223-252,(198
7))。

【０００７】ＬＦＡ−１は殆どの白血球の表面に見られ
る(Springer,T.A.ら、Immunol.Rev.68:111-135(1982))
が、Ｍａｃ−１及びp150,95 は主にマクロファージ、顆
粒球及びその他の大きな顆粒リンパ球に見られる(Sprin
ger,T.A.ら、Immunol.Rev.68:111-135(1982);Keizer,G.
ら、Eur.J.Immunol.15:1142-1147(1985)) 。接着レセプ
タータンパク質のＬＦＡ−１系統群は、特異なα鎖と非
共有結合で混在する共通のβ鎖を有するヘテロダイマー
である。その系統群のα−サブユニットは互いに異なっ
ていることがわかり、夫々CD11a 、CD11b 、及びCD11c
と称される。グリコシル化されたα−サブユニットは、
夫々ほぼ175kd 、160kd 、及び150kd の分子量を有す
る。対照的に、接着レセプターのＬＦＡ−１系統群のβ
−サブユニット（“CD18" と称される) は同一であり、
95kdの分子量を有することがわかった(Sanchez-Madrid,
F.ら、J.Exper.Med.158:1785-1803(1983);Keizer,G.D.
ら、Eur.J.Immunol.15:1142-1147(1985);Springer,T.、
Fed.Proc.44:2660-2663(1985) ;Sanchez-Madrid,F.ら、
J.Exper.Med.158:586-602(1983))。

【０００８】糖タンパク質のα−サブユニットはβ−サ
ブユニットにより共有される広範な相同性を示さない
が、精密分析はそれらの間にかなりの類似性があること
を明らかにした。接着分子糖タンパク質系統群のα−サ
ブユニット及びβ−サブユニットの間の類似性の総説が
Sanchez-Madrid,F. らにより示されている(J.Exper.Me
d.158:586-602(1983);J.Exper.Med.158:1785-1803(198
3);Miller,L.J.ら、J.Immunol.138:2381-2383(1987))。

【０００９】レセプターのＬＦＡ−１系統群の重要性
は、接着依存性の白血球機能を抑制するモノクローナル
抗体（これらは特定のα−サブユニットまたは共通のβ
−サブユニットに結合できる）の能力を示す研究で最初
に認識された（Sanchez-Madrid,F. ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA79:7489-7493(1982);Beller,D.I.ら、J.Expe
r.Med.156:1000-1009(1982))。

【００１０】白血球インテグリンの重要性は、臨床上の
症候群である“白血球接着欠乏" 症候群("ＬＡＤ”）の
発見により確認され、それは共通のβ（CD18) 鎖の先天
性の欠乏または不在を特徴とし、減少されたpus 形成、
異常な創傷治癒、及び発熱性の感染に対する重大な感受
性を与える（Anderson,D.C. ら、Fed.Proc.44:2671-267
7(1985);Anderson,D.C. ら、J.Inf.Dis.152:668-689(19
85);Anderson,D.C. ら、Ann.Rev.Med.38:175-194(198
7);Amaout,M.A.ら、J.Clin.Invest.74:1291-1300(198
4)) だけでなく、試験管内の接着依存性の白血球機能の
異常を与える（Anderson,D.C. ら、Ann.Rev.Med.38:175
-194(1987);Todd,R.F.ら、Hem.Onc.ClinicsN.A.2:13-31
(1988)) 。

【００１１】ＬＡＤ患者からの白血球は、正常な個人の
白血球がＬＦＡ−１系統群の員に特異的な抗体により拮
抗作用を受けた場合に観察された欠損と同様であった試
験管内の欠損を示す。ＬＡＤ患者は、正常な免疫応答を
取り得ないことがわかった。この欠乏は、ＬＡＤ患者の
白血球が細胞基質及び細胞外の基質に接着し得ないこと
のためであることがわかった（Anderson,D.C. ら、Fed.
Proc.44:2671-2677(1985);Anderson,D.C. ら、J.Inf.Di
s.152:668-689(1985))。これらの研究は、白血球がそれ
らの細胞表面の機能性接着分子の欠如のために正常な方
法で接着し得ない場合に炎症反応が軽減されることを示
す。

【００１２】 II. ＬＦＡ−１系統群の白血球接着タンパク質の性質 三種の白血球接着タンパク質、Ｍａｃ−１、p150,95 及
びＬＦＡ−１は、機能及び白血球のサブ集団(subpopula
tion) に関する発現を異にする。Ｍａｃ−１及びp150,9
5 は好中球、及び単球に関して発現される(Springer,T.
A.ら、Biochemistry of Macrophages(CIBA Symposium 1
18);Pitman, ロンドン、102-126 頁(1986)) 。組織マク
ロファージへの血液単球の分化中に、p150,95 の発現は
大幅に増大され、Ｍａｃ−１発現は減少される(Schwart
ing,R.ら、Blood 65:974-983(1985);Hogg,N.ら、Eur.J.
Immunol.16:240-248(1986)) 。また、p150,95 は或る種
の活性Ｔリンパ球及びＢリンパ球に関して発現される
が、血液中のこれらの細胞に関して発現されない（Kali
garis-Cappio,F. ら、Blood 66:1035-1042(1985);Mille
r,L.J.ら、J.Immunol.137:2891-2900(1986);Keizer,G.
D. ら、J.Immunol.138:3130-3136(1987))。

【００１３】ＬＦＡ−１はマクロファージのサブセット
を除いた全ての白血球に存在する。モノクローナル抗体
阻止研究は、ＬＦＡ−１がＴリンパ球媒介の死滅、Ｔヘ
ルパーリンパ球の応答、自然死滅、及び抗体依存性の死
滅に重要であることを示した(Springer,T.A.ら、Ann.Re
v.Immunol.,5:223-252,(1987))。標的細胞への接着は、
ＬＦＡ−１の抗体により阻止される工程である。機能試
験は、ＬＦＡ−１が幾つかのリガンド( その一つがＩＣ
ＡＭ−１である) と相互作用することを示唆した(Rothl
ein,R.ら、J.Immunol.137:1270-1274(1986))。

【００１４】Ｍａｃ−１及びp150,95 は、循環する好中
球及び単球中の細胞間の胞状区画中で発現され、これは
炎症媒介物質により細胞表面に移動される(Todd,R.F.
ら、J.Clin.Invest.74:1280-1290(1984);Springer,T.A.
ら、Biochemistry of Macrophages(CIBA Symposium 11
8);Pitman, ロンドン、102-126 頁(1986);Lainer,L.L.
ら、Eur.J.Immunol.15:713-718(1985);Yancey,K.B.ら、
J.Immunol.135:465-470(1985))。この移動は増大された
接着性と相関関係がある( Anderson,D.C. ら、Ann.Rev.
Med.38:175-194(1987)) 。Ｍａｃ−１α−サブユニット
メッセージが血液単球及びPMA 誘導骨髄細胞系中で検出
されたが、Ｍａｃ−１タンパク質表面発現と相関関係が
あるＴ系列またはＢ系列の細胞中で検出されなかった。

【００１５】或る種の細胞毒性Ｔリンパ球クローンが同
様の量のp150,95 及びＬＦＡ−１を発現することがわか
った。ＬＦＡ−１及びp150,95 のα−サブユニットのモ
ノクローナル抗体は、このようなＣＴＬクローンによる
死滅を同様の程度に抑制し、それらの抑制効果の添加剤
である（Keizer,G.D. ら、J.Immunol.138:3130-3136(19
87))。更に、p150,95 α−サブユニットの抗体は内皮へ
の単球付着を抑制することが示された（Keizer,G.D.
ら、Eur.J.Immunol.17:1317-1322(1987)) 。

【００１６】Ｍａｃ−１またはp150,95 のモノクローナ
ル抗体は、好中球の凝集並びに内皮細胞、タンパク質被
覆表面、細菌、原生動物寄生虫、及び菌類への接着を抑
制する(Harlan,J.M.ら、Blood 66:167-178(1985);Sprin
ger,T.A.ら、Biochemistry of Macrophages(CIBA Sympo
sium 118);Pitman, ロンドン、102-126 頁(1986);Dana,
N.ら、J.Immunol.137:3259(1986);Bullock,W.D. ら、J.
Exper.Med.165:195-210(1987);Mosser,D.M. ら、J.Immu
nol.135:2785-2789(1985))。

【００１７】Ｍａｃ−１(CD11b/CD18)は、細胞−細胞接
着相互作用及び細胞−基質接着相互作用に於けるその役
割の他に、iC3b(Beller,D.I.ら、J.Exper.Med.156:1000
-1009(1982))、フィブリノーゲン(Altieri,D.C. ら、J.
Cell.Biol.107:1893-1900(1988);Wright,S.D. ら、Pro
c.Nat'l.Acad.Sci.(U.S.A.)85:7734-7738(1988)) 、及
び第Ｘ因子(Altieri,D.C. ら、J.Biol.Chem.863:7007-7
015(1988))を含む多重リガンドを結合することが実証さ
れた白血球接着糖タンパク質である。洗剤可溶性のＭａ
ｃ−１及びp150,95 はiC3b−セファロースに結合し得る
ることが示された（Micklem,K.J.ら、Biochem.J.231:23
3-236(1985))。

【００１８】Ｍａｃ−１のα−サブユニットは、長い細
胞外の領域(1092 残基) 及び19のアミノ酸の細胞質テイ
ルを有する1137の残基の膜内外のタンパク質である。そ
の細胞外の領域は三つの推定の二価のカチオン結合配列
と19の潜在性のＮ−グリコシル化部位を含む。Ｍａｃ−
１αのアミノ酸配列は、それがインテグリンスーパーフ
ァミリーの一員であることを示す。Ｍａｃ−１αは白血
球接着糖タンパク質p150,95 のα−サブユニットに対し
て63％の同一性を示し、細胞外のマトリックスレセプタ
ー血小板糖タンパク質IIb/IIIaのα−サブユニット、フ
ィブロネクチンレセプター及びビトロネクチンレセプタ
ーに対して25％の同一性を示す。Ｍａｃ−１α−サブユ
ニットの推定の二価のカチオン結合部位及びフランキン
グ領域は、p150,95 α−サブユニット( アミノ酸レベル
で87％の同一性) 及びインテグリンα−サブユニットの
残部(38 ％) の両方に対して高度の同一性を示す。p15
0,95 α−サブユニットのようなＭａｃ−１のα−サブ
ユニットは、その他のインテグリンには存在しない細胞
外の領域中に187 のアミノ酸の領域を含む。この挿入領
域、即ち"I" 領域はバン・ウィルブランド(van Willebr
and)因子のＡ領域に相同性であり、このＡ領域は順にC3
結合タンパク質因子Ｂ及びC2の領域に相同性である。こ
れらの知見は、iC3bの潜在的な結合部位としてのＭａｃ
−１のこの領域に注意を喚起する。

【００１９】Ｍａｃ−１の機能上の役割は、マクロファ
ージ及び多形核白血球へのiC3b被覆赤血球のロゼット形
成(rosetting) を阻止する抗Ｍａｃ−１α−サブユニッ
トモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の能力により最初に説
明され(Beller,D.I.ら、J.Exper.Med.156:1000-1009(19
82))、Ｍａｃ−１が補体レセプター型３（ＣＲ３）から
区別し得ないことを実証した。続いて、炎症プロセスに
於けるＭａｃ−１の関与が、抗Ｍａｃ−１α−サブユニ
ット及び抗β−サブユニット特異的ＭＡｂによる好中球
凝集及び内皮細胞への接着の抑制により明らかにされた
(Anderson,D.C.ら、J.Immunol.137:15-27(1986);Dana,
N. ら、J.Immunol.137:3259-3263(1986);Vedder,N.B.
ら、J.Clin.Invest.81:672-682(1988)) 。最近のエピト
ープ遺伝地図作製の研究は、iC3b結合に関与する部位が
好中球凝集及びタンパク質被覆プラスチックへの接着に
関与する部位と異なることを示唆した(Anderson,D.C.
ら、J.Immunol.137:15-27(1986);Dana,N. ら、J.Immuno
l.137:3259-3263(1986);Rosen,H.ら、J.Exper.Med.166:
1685-1701(1987))。それ故、Ｍａｃ−１は少なくとも二
つの独立の接着に関係する機能を有する多価のレセプタ
ーであることが明らかである。

【００２０】Ｍａｃ−１の機能上の活性の発現は、白血
球の分化及び活性化中に調節される。骨髄球細胞系の分
化及び成熟は増大されたＭａｃ−１発現を生じ（Mille
r,L.J. ら、J.Immunol.137:2891-2900(1986))、一方、
組織マクロファージへの血液単球分化は全細胞表面のＭ
ａｃ−１の量のかなりの減少により伴われる(Hogg,N.
ら、Eur.J.Immunol.16:240-248(1986)) 。循環する好中
球及び単球の表面上のＭａｃ−１の発現は炎症性刺激に
より増加調節される(upregulated) 。Ｍａｃ−１は細胞
間の胞状区画中に貯蔵され、この区画は化学誘引物質に
より細胞表面に迅速に移動させられる(Todd,R.F.ら、J.
Clin.Invest.74:1280-1290(1984);Miller,L.J.ら、J.Cl
in.Invest.80:535-544(1987)) 。Ｍａｃ−１の増強され
た発現は増大された接着性をもたらし得るが、細胞活性
化後の質的変化がまた調節リガンド結合に重要なことが
ある(Detmers,P.A. ら、J.Cell Biol.105:1137-1145(19
87) 。質的変化及び量的変化の両方が、炎症部位で後毛
細管内皮への白血球結合の調節に重要なことがある。

【００２１】マウス及びヒトのＭａｃ−１α−サブユニ
ットのＮ−末端配列(Miller,L.J.ら、J.Immunol.138:23
81-2383(1987);Springer,T.A. ら、Nature314:540-542
(1985))及び短いＮ−末端エクソンを暗号化するマウス
ゲノムクローン（Sastre,L. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
(U.S.A.)83:5644-5648(1986))が報告されている。こう
して、要約すると、動物の健康及び生存力を維持する白
血球の能力は、それらがその他の細胞( 例えば、内皮細
胞) 及びタンパク質( 例えば、iC3b) に接着し得ること
を必要とする。この接着は、白血球の表面に存在する特
異的なレセプター分子を伴う接触を必要とすることがわ
かった。これらの細胞表面レセプター分子は互いに非常
に関連のあることがわかった。白血球がこれらの細胞表
面レセプター分子を欠いているヒトは、慢性感染及び断
続的な感染を示すだけでなく、その他の臨床上の症候を
示す。

【００２２】白血球接着は、外来組織が同定され拒絶さ
れるプロセスに関与するので、このプロセスの理解は器
官移植、組織移植、アレルギー及び腫瘍学の分野で重要
な価値がある。

【００２３】

【課題を解決するための手段】本発明は、細胞接着分
子、ＩＣＡＭ−１、及び白血球細胞表面接着レセプター
分子、Ｍａｃ−１に関するものであり、特に、ＩＣＡＭ
−１に関するＭａｃ−１結合部位の同定に関するもので
ある。この結合部位の配列及び構造の知識は、炎症の治
療にＭａｃ−１及びＩＣＡＭ−１の官能性誘導体を使用
することを容易にする。

【００２４】ＩＣＡＭ−１の領域欠失突然変異体及びア
ミノ酸置換突然変異体を用いる従来の研究は、ＬＦＡ−
１及びヒト・ライノウイルスの結合部位を第一のNH₂-末
端Igのような領域に局在化した(Staunton,D.E.ら、Cell
61:243-254(1990)) 。また、ＬＦＡ−１に密接に関連す
る白血球インテグリンＭａｃ−１がＩＣＡＭ−１に結合
することが示された(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.8
3:2008-2017(1989)) 。

【００２５】本発明は、ＩＣＡＭ−１に関するＭａｃ−
１結合部位の局在化に一部由来する。予期しないこと
に、明確な結合部位が第三のNH₂-末端Igのような領域中
に見出され、この領域中のその二つのグリコシル化部位
はＭａｃ−１に接着するＩＣＡＭ−１の能力を著しく変
化させた。詳細には、本発明は、Ｍａｃ−１に実質的に
結合し得ないが、ＬＦＡ−１に実質的に結合し得るＩＣ
ＡＭ−１官能性誘導体、特に可溶性の官能性誘導体に関
する。本発明は、上記のＩＣＡＭ−１官能性誘導体のう
ち、ＩＣＡＭ−１の領域１、２、３及び４を含む誘導
体、特にＩＣＡＭ−１の領域３中に突然変異を含むこの
ような誘導体を特別に含む。領域３中の特に好ましい突
然変異は、ＩＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１残基229-231 、
または254-256 中の突然変異である。

【００２６】また、本発明は、ＬＦＡ−１に実質的に結
合し得ないが、Ｍａｃ−１に実質的に結合し得るＩＣＡ
Ｍ−１官能性誘導体、特に可溶性の誘導体を提供する。
このような誘導体の中に、ＩＣＡＭ−１の領域１を含ま
ない誘導体、並びにＩＣＡＭ−１の領域１、２、３、４
及び５を含むが、ＩＣＡＭ−１の領域１または２中に突
然変異を含む誘導体がある。特に好ましい突然変異は、
ＩＣＡＭ−１の領域１の一種以上のＩＣＡＭ−１残基、
E34 、Q58ED 、またはQ73 中の突然変異である。領域１
を含まない好ましいＩＣＡＭ−１官能性誘導体の中に、
ＩＣＡＭ−１の領域３及び４を含む誘導体がある。

【００２７】また、本発明は、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−
１に実質的に結合し得ないが、ヒト・ライノウイルスを
実質的に結合し得るＩＣＡＭ−１官能性誘導体を提供す
る。また、本発明は、グリコシル化部位を含まないＩＣ
ＡＭ−１官能性誘導体に関するものであり、その誘導体
はＭａｃ−１への増強された結合能力を有し得る。ＩＣ
ＡＭ−１のＩＣＡＭ−１残基N269、N240またはN358の位
置でグリコシル化部位を欠くことが、この目的に最も好
ましい。

【００２８】また、本発明は、非特異的防御系の反応に
より生じる炎症を治療し得るが、特異的防御系の反応に
より生じる炎症を実質的に抑制し得ないことを特徴とす
る抗炎症薬を提供する。特に、本発明は、ＬＦＡ−１に
実質的に結合し得ないが、Ｍａｃ−１に実質的に結合し
得るＩＣＡＭ−１官能性誘導体、特に可溶性の誘導体で
ある抗炎症薬を提供する。

【００２９】また、本発明は、特異的防御系の反応によ
り生じる炎症を治療し得るが、非特異的防御系の反応に
より生じる炎症を実質的に抑制し得ないことを特徴とす
る抗炎症薬を提供する。特に、本発明は、Ｍａｃ−１に
実質的に結合し得ないが、ＬＦＡ−１に実質的に結合し
得るＩＣＡＭ−１官能性誘導体、特に可溶性の誘導体で
ある抗炎症薬を提供する。

【００３０】Ｉ．炎症の治療 本発明は、ＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１及びそれらの“官
能性誘導体”、並びにＩＣＡＭ−１に結合でき、それに
よりＭａｃ−１に結合するＩＣＡＭ−１の能力に影響を
及ぼす抗体（及び抗体フラグメント）に関する。本発明
の一つの特徴は、ＩＣＡＭ−１がＭａｃ−１に結合し得
るという発見、及びＭａｃ−１に結合する分子の能力に
責任を負うＩＣＡＭ−１の領域の同定に関する。これら
の発見は、Ｍａｃ−１ヘテロダイマー、α−サブユニッ
トまたはβ−サブユニットに結合し得るＩＣＡＭ−１の
官能性誘導体の生産を可能にする。同様に、それらは、
ＩＣＡＭ−１に結合し得るＭａｃ−１ヘテロダイマー、
α−サブユニットまたはβ−サブユニット官能性誘導体
の生産を可能にする。

【００３１】循環する好中球及び単球の接着能力は、Ｍ
ａｃ−１レセプター分子を伴う相互作用から生じる。細
胞接着は、このような細胞が炎症の部位に移動し、且つ
／または炎症の原因となる種々のエフェクター作用を行
い得るために、必要とされるので、このような細胞接着
を抑制する薬剤は炎症を軽減し、または防止する。Ｍａ
ｃ−１レセプター分子は好中球及び単球細胞の表面に存
在する。プラスチック表面、または内皮細胞の単層への
これらの細胞の接着は、Ｍａｃ−１レセプター分子によ
り媒介される。加えて、異物を食作用する単球の能力は
Ｍａｃ−１レセプター分子により媒介されることがわか
った。また、レセプター分子は、単球のケモキネシス、
及び化学走性に役割を有するものとして関与していた。

【００３２】Ｍａｃ−１レセプター分子がその自然結合
リガンドに結合する能力を妨げる薬剤は、こうして、上
記のＭａｃ−１依存性の機能の全てを損なうことができ
る。それ故、これらの薬剤は本発明の抗炎症薬として利
用できる。このような薬剤は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ
−１の官能性誘導体、Ｍａｃ−１、Ｍａｃ−１の官能性
誘導体、及びＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を含む。こ
のような薬剤の全てが本発明に使用し得る。本発明の抗
炎症薬は、非特異的防御系の反応により生じる炎症を治
療できる。

【００３３】本明細書に使用される“細胞接着の拮抗物
質”は、細胞−細胞接着または細胞−基質接着のプロセ
スを抑制し得るあらゆる分子を意味する。内皮細胞への
単球接着のアッセイを行うことにより特別な化合物が拮
抗物質であるか否かを調べることが可能である。細胞接
着の好適なアッセイは、例えば、Keizer,G.D. ら、Eur.
J.Immunol.17:1317-1322(1987)に開示されており、この
文献は参考として本明細書に含まれる。細胞接着の拮抗
物質は、炎症の治療に抗炎症薬として使用し得る。本明
細書に使用される“炎症”という用語は、特異的防御系
及び非特異的防御系の反応を含むことを意味する。

【００３４】“非特異的防御系の反応”は、免疫記憶し
得ない白血球細胞により媒介される応答である。このよ
うな細胞は好中球及びマクロファージを含む。本明細書
に使用されるように、炎症が非特異的防御系の反応によ
り生じ、媒介され、またはそれと関連する場合に、炎症
は非特異的防御系の応答から生じると言われる。非特異
的防御系の反応から少なくとも一部生じる炎症の例は、
成人呼吸困難症候群（ARDS) 、または敗血症もしくは外
傷の二次的な多発性器官障害症候群；心筋またはその他
の組織の再環流(reperfusion) 障害；急性腎炎；反応性
関節炎；急性炎症成分による皮膚病；急性の化膿性髄膜
炎またはその他の中枢神経系炎症障害；熱傷；血液透
析；白血球搬出；潰瘍性大腸炎；クローン病；壊死性全
腸炎；果粒球輸注に関連する症候群；及びサイトカイン
誘発毒性の如き症状と関連する炎症を含む。

【００３５】対照的に、“特異的防御系の反応”は、免
疫記憶を有する白血球により媒介される反応である。炎
症が特異的防御系の反応により生じ、媒介され、または
それと関連する場合に、炎症は特異的防御系の応答から
生じると言われる。特異的防御系の反応から生じる炎症
の例は、風疹ウイルスの如き抗原に対する応答、自己免
疫疾患、Ｔ細胞により媒介される遅延型過敏症応答（例
えば、マントー試験で“陽性”を示す個人に見られ
る）、等を含む。

【００３６】好ましい実施態様に於いて、抗炎症薬はＩ
ＣＡＭ−１もしくはＭａｃ−１または最も好ましくはそ
れらの可溶性部分を含む。 II. 細胞接着 Ａ．CD11/CD18 系統群 CD11/CD18 系統群は、胚形成、細胞外基質への接着、及
び細胞分化を調節する表面レセプターの大きなインテグ
リン系統群と構造上及び遺伝上関係する（Hynes,R.O.,C
ell 48:549-554(1987);Kishimoto,T.K. ら、Adv.Immuno
l.46:149-182(1989);Kishimoto,T.K. ら、Cell 48:681-
690(1987);Ruoslahti,E.ら、Science238:491-497(198
7)) 。

【００３７】この系統群の分子、及びそれらの細胞リガ
ンドは、炎症中に細胞−細胞相互作用を媒介することが
わかった。これらのタンパク質は、免疫系の接着機能(K
ishimoto,T.K. ら、Adv.Immunol.46:149-182(1989)) ；
内皮細胞への白血球接着を阻止するＬＦＡ−１のモノク
ローナル抗体（Dustin,M.L. ら、J.Cell.Biol.107:321-
331(1988);Smith,C.W.ら、J.Clin.Invest.83:2008-201
7))及び抗原特異的CTL死滅(Kishimoto,T.K. ら、Adv.Im
munol.46:149-182(1989)、Ｔ細胞増殖(Davignon,D.ら、
J.Immunol.127:590-595(1981))、及びＮＫ細胞死滅(Kre
nsky,A.M. ら、J.Immunol.131:611-616(1983))に必要と
される複合体形成を抑制するＬＦＡ−１のモノクローナ
ル抗体；iC3b被覆粒子の結合(Beller,D.I.ら、J.Exp.Me
d.156:1000-1009(1982))、内皮細胞への骨髄細胞接着(L
o,S.K.ら、J.Immunol.143(10):3325-3329(1989);Smith,
C.W.ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017))、好中球同型凝
集及び化学走性(Anderson,D.C.ら、J.Immunol.137:15-2
7(1986))を阻止するＭａｃ−１のモノクローナル抗体；
内皮細胞への単球接着(Anderson,D.C.ら、J.Immunol.13
7:15-27(1986);Keizer,G.D. ら、Eur.J.Immunol.17:131
7-1322(1987)) 及び標的細胞とのCTL 複合体形成(Keize
r,G.D.ら、J.Immunol.138:3130-3136(1987))を阻止する
p150,95 のモノクローナル抗体に重要であることがわか
った。

【００３８】ＬＦＡ−１は、未刺激内皮細胞または刺激
内皮細胞への白血球接着を媒介することがわかり(Dusti
n,M.L.ら、J.Cell.Biol.107:321-331(1988);Smith,C.W.
ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017(1989)) 、一方、Ｍａ
ｃ−１は炎症内皮への好中球及び単球の接着を媒介する
ことがわかった(Luscinskas,F.W.ら、J.Immunol.142
(7):2257-2263(1989)) 。

【００３９】Ｂ．ＩＣＡＭ−１ ＩＣＡＭ−１（CD54) は細胞表面接着レセプターであ
り、これは免疫グロブリンタンパク質スーパーファミリ
ーの一員であり(Rothlein,R.M.ら、J.Immunol.137:1270
-1274(1986);Staunton,D.E. ら、Cell 52:925-933(198
8))、種々の造血細胞及び非造血細胞で発現され、種々
の炎症媒介物質により増加調節される(Dustin ら、J.Im
munol.137:256-254(1986))。ＩＣＡＭ−１は、低いＲＮ
Ａメッセージレベルと未刺激内皮細胞での適度の表面発
現を有する90,000-110,000Mr糖タンパク質である。LPS
、IL-1、及びTNF はＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ及び約18
〜24時間でピーク発現を有する表面発現を強く増加調節
する(Dustin,M.L.ら、J.Cell.Biol.107:321-331(1988);
Staunton,D.E. ら、Cell 52:925-933(1988))。ＩＣＡＭ
−１は五つの細胞外領域( 領域１、２、３、４、及び５
またはＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５と称される）及
び細胞内領域または細胞質領域を有する。これらの領域
の構造及び配列がStaunton,D.E. ら、Cell 52:925-933
(1988) に開示されており、この文献は参考として本明
細書に含まれる。

【００４０】ＩＣＡＭ−１は当初ＬＦＡ−１のカウンタ
ー−レセプターとして定義されていた(Springer ら、An
n.Rev.Immunol.5:223-252(1987);Marlin,S.D.,Cell 51:
813-819(1987);Simmons,D.ら、Nature331:624-627(198
8);Staunton,D.E.,Nature339:61-64(1989);Staunton,D.
E. ら、Cell 52:925-933(1988))。ＬＦＡ−１−ＩＣＡ
Ｍ−１相互作用は特に内皮細胞へのリンパ球接着（Dust
in,M.L. ら、J.Cell.Biol.107:321-331(1988);Mentzer,
S.J.ら、J.Cell.Physiol.126:285-290(1986)) 、単球接
着(Amaout,M.A.ら、J.Cell.Physiol.137:305(1988);Men
tzer,S.J. ら、J.Cell.Physiol.130:410-415(1987);te
Velde,A.A.ら、Immunology61:261-267(1987)) 、及び好
中球接着(Lo,S.K.ら、J.Immunol.143(10):3325-3329(19
89);Smith,C.W.ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017(198
9)) の責任を負う。

【００４１】Ｃ．細胞接着のプロセス モノクローナル抗体阻止研究は、未刺激内皮細胞及びサ
イトカイン刺激内皮細胞の両方への好中球接着に於ける
Ｍａｃ−１の役割をもっともらしく実証していた(Lo,S.
K.ら、J.Exp.Med.169:1779-1793(1989);Lo,S.K. ら、J.
Immunol.143(10):3325-3329(1989);Luscinskas,F.W.
ら、J.Immunol.142(7):2257-2263(1989);Smith,C.W.
ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017(1989)) が、内皮細胞
表面の一種以上のレセプターの同定は殆ど確かではない
ままであった。ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−２は、Ｍａ
ｃ−１接着分子のために二つの候補リガンドを含んでい
た。

【００４２】本発明の成果により、ＩＣＡＭ−１または
Ｍａｃ−１が移入されたＣＯＳ細胞が精製Ｍａｃ−１ま
たはＩＣＡＭ−１基質に結合すること、及びＩＣＡＭ−
１のモノクローナル抗体が内皮細胞（Smith,C.W.ら、J.
Clin.Invest.83:2008-2017(1989)) またはＩＣＡＭ−１
を含む平面状の膜(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.83:2
008-2017(1989)) への好中球接着を抑制することを実証
することが可能になった。こうして、本発明によれば、
内皮細胞へのＬＦＡ−１依存性接着はＩＣＡＭ−１(Dus
tin ら、J.Cell Biol.107:321-331(1988);Smith,C.W.
ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017(1989)) 及びＩＣＡＭ
−２により生じる。更に、本発明は、ＩＣＡＭ−１がＭ
ａｃ−１のカウンター−レセプターであることを明らか
にする。

【００４３】III.ＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１及びそれら
の官能性誘導体の生産 Ｍａｃ−１レセプター分子のα−サブユニット及びβ−
サブユニットの核酸配列及びタンパク質配列が米国特許
出願第07/321,239号及び同第07/019,440号に夫々開示さ
れている。両出願は参考として本明細書に含まれる。Ｉ
ＣＡＭ−１の核酸配列及びタンパク質配列がStaunton
ら、Cell 52:925-933(1988) に開示されている。その文
献は参考として本明細書に含まれる。これらの開示は、
ＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１及びそれらの官能性誘導体を
生産するために組換えＤＮＡ技術の使用を可能にする。

【００４４】本発明の抗炎症薬及び抗ウイルス物質は、
自然法( 例えば、動物、植物、菌類、細菌、等を誘導し
てＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリン拮抗物質を生産する
ことにより、または動物を誘導してＩＣＡＭ−１に結合
し得るポリクローナル抗体を生産することによる方法)
；合成法（例えば、ポリペプチドを合成するためのメ
リーフィールド法を使用してＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１
もしくはそのいずれかの官能性誘導体、またはＩＣＡＭ
−１、もしくはＭａｃ−１のタンパク質拮抗物質（免疫
グロブリンまたは非免疫グロブリン）を合成することに
よる方法）；ハイブリドーマ技術（例えば、ＩＣＡＭ−
１に結合し得るモノクローナル抗体を生産するため）；
または組換え技術（例えば、種々の宿主（例えば、酵
母、細菌、菌類、培養哺乳類細胞、等）中で、または組
換えプラスミドもしくはウイルスベクター（Kishimoto,
T.K.ら、Cell 48:681-690(1987) 、この文献は本明細書
に参考として含まれる) から本発明の抗炎症薬を生産す
るため) により得ることができる。どの方法を使用する
かの選択は、便宜、所望の収率、等の如き因子に依存す
る。特別な抗炎症薬を生産するため、上記の方法、プロ
セス、または技術の一つのみを使用することは必要とさ
れない。特別な抗炎症薬を得るため、上記のプロセス、
方法、及び技術が組み合わされてもよい。

【００４５】本明細書に使用されるＩＣＡＭ−１の“官
能性誘導体" は、Ｍａｃ−１ヘテロダイマー、またはＭ
ａｃ−１ヘテロダイマーのフラグメントに結合でき、し
かもＩＣＡＭ−１の生物活性と実質的に同様である生物
活性( 機能上または構造上の生物活性) を更に有する化
合物である。生物活性の例は、糖タンパク質のＬＦＡ−
１系統群の一員に結合する能力、ＩＣＡＭ−１への抗Ｉ
ＣＡＭ−１抗体の結合を競合的に抑制する能力、または
ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１もしくはp15
0,95 分子の結合を競合的に抑制する能力を含む。

【００４６】Ｍａｃ−１の“官能性誘導体" は、Ｍａｃ
−１ヘテロダイマー、Ｍａｃ−１α−サブユニット、ま
たはＭａｃ−１ヘテロダイマーのフラグメントから誘導
することができ、更にＩＣＡＭ−１、またはそのフラグ
メントに結合し得る化合物である。“官能性誘導体" と
いう用語は、分子の“フラグメント" 、“変異体" 、
“類縁体" 、または“化学誘導体" を含むことを意味す
る。ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の如き分子の“フラ
グメント" は、分子のあらゆるポリペプチドサブユニッ
トを表すことを意味する。ＩＣＡＭ−１活性を有し、且
つ可溶性である( 即ち、膜に結合されない) ＩＣＡＭ−
１のフラグメントが特に好ましい。同様に、ＩＣＡＭ−
１に結合し得るＭａｃ−１の可溶性のフラグメントが好
ましい。

【００４７】ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の如き分子
の“変異体" は、その全分子、またはそのフラグメント
に構造及び機能が実質的に似ている分子を表すことを意
味する。ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の如き分子の
“類縁体" は、その全分子、またはそのフラグメントに
機能が実質的に似ている分子を表すことを意味する。二
つの分子が実質的に同様の構造を有する場合、または二
つの分子が同様の生物活性を有する場合に、分子は別の
分子に“実質的に似ている" と言われる。こうして、二
つの分子が同様の活性を有することを条件として、それ
らは変異体と考えられる。何となれば、一つの分子の構
造が他の分子に見られない場合、またはアミノ酸残基の
配列が同じでない場合であっても、その用語が使用され
るからである。

【００４８】本明細書に使用されるように、分子が通常
その分子の一部ではない更に別の化学的部分を含む場合
に、分子は他の分子の“化学誘導体" であると言われ
る。このような部分は、分子の溶解性、吸収、生物半減
期、等を改善し得る。また、これらの部分は、その分子
の毒性を低下でき、その分子の望ましくない副作用、等
を排除または軽減し得る。このような効果を媒介し得る
部分がRemington's Pharmaceutical Science(1980)に開
示されている。“毒素誘導体化された" 分子は“化学誘
導体" の特別な類を構成する。“毒素誘導体化された"
分子は、毒素部分を含む分子( 例えば、ＩＣＡＭ−１ま
たはその官能性誘導体の一つ) である。細胞へのこのよ
うな分子の結合は、毒素部分を細胞に接近させ、それに
より細胞の死滅を促進する。あらゆる好適な毒素が使用
し得る。しかしながら、例えば、リシン毒素、ジフテリ
ア毒素、放射線同位元素毒素、膜−溝形成（membran-ch
annel-forming)毒素、等の如き毒素を使用することが好
ましい。このような毒素を分子にカップリングさせる操
作は当業者に公知である。

【００４９】ＩＣＡＭ−１の“ペプチド擬態物質(pepti
domimetic)" は、三次構造がＩＣＡＭ−１の三次構造に
実質的に似ているＩＣＡＭ−１の官能性誘導体である。
同様に、Ｍａｃ−１の“ペプチド擬態物質" は、三次構
造がＭａｃ−１の三次構造に実質的に似ているＭａｃ−
１の官能性誘導体である。本発明の範囲は、更に、或る
種のアミノ酸残基を含まないか、または変性されたアミ
ノ酸残基を含むＩＣＡＭ−１及びＭａｃ−１の官能性誘
導体が細胞接着を増進または抑制する能力を示す限り、
このような官能性誘導体を含むことが意図される。この
ような官能性誘導体は化学的手段または組換え手段によ
り生産し得る。

【００５０】約100 個までの残基を有する官能性誘導体
が試験管内合成により都合よく調製し得る。所望によ
り、このようなフラグメントは、精製タンパク質または
粗タンパク質の標的アミノ酸残基を選択された側鎖また
は末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させるこ
とにより修飾し得る。得られる共有結合誘導体は、生物
活性に重要な残基を同定するのに使用し得る。最も普通
には、システイニル残基がクロロ酢酸またはクロロアセ
トアミドの如きα−ハロアセテート（及び相当するアミ
ン）と反応させられてカルボキシメチル誘導体またはカ
ルボキシアミドメチル誘導体を得る。また、システイニ
ル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−
β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチ
ルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ
−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジス
ルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−ク
ロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ
−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール
との反応により誘導体化される。

【００５１】ヒスチジル残基は、pH5.5 〜7.0 でジエチ
ルプロカーボネートとの反応により誘導体化される。何
となれば、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特
異的であるからである。また、パラ−ブロモフェナシル
ブロミドが有効である。その反応は0.1 Ｍのナトリウム
カコジレート中でpH6.0 で行われることが好ましい。リ
シニル残基及びアミノ末端残基は無水コハク酸またはそ
の他の無水カルボン酸と反応させられる。これらの薬剤
による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にする効果
を有する。α−アミノを含む残基を誘導体化するのに適
したその他の試薬は、メチルピコリンイミデートの如き
イミドエステル；ピリドキサルホスフェート；ピリドキ
サル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホ
ン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオ
ン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒
による反応を含む。

【００５２】アルギニル残基は、一種または数種の通常
の試薬、中でも、フェニルグリオキサル、２，３−ブタ
ンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒ
ドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘
導体化は、そのグアニジン官能基の高pKa のため反応が
アルカリ条件で行われることを必要とする。更に、これ
らの試薬は、リシンの基と反応するだけでなく、アルギ
ニンε−アミノ基と反応し得る。

【００５３】チロシル基それ自体の特別な修飾は広く研
究されており、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラ
ニトロメタンとの反応によりスペクトルラベルをチロシ
ル残基に導入することが特に重要である。最も普通に
は、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタン
が夫々Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を
生成するのに使用される。チロシル残基は¹²⁵Iまたは
¹³¹Iを使用してヨウ素化されてラジオイムノアッセイ用
のラベルされたタンパク質を調製し、クロラミンＴ法が
好適である。

【００５４】カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたは
グルタミル）は、カルボジイミド(R'-N-C-N-R') 、例え
ば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４
−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４ア
ゾニア４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの
反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル残
基及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応に
よりアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換さ
れる。

【００５５】二官能の薬剤による誘導体化は、ＩＣＡＭ
−１またはＭａｃ−１の官能性誘導体融合ポリペプチド
を開裂して開裂ポリペプチドを遊離、回収する方法に使
用するために、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の官能性
誘導体分子を水不溶性の担体マトリックスまたは表面に
架橋するのに有益である。普通使用される架橋剤は、例
えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニル
エタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエ
ステル、ホモ二官能イミドエステル（３，３’−ジチオ
ビス（スクシンイミジルプロピオネート）の如きジスク
シンイミジルエステルを含む）、及び二官能マレイミ
ド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを
含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］
プロピオイミデートの如き誘導体化薬剤は、光の存在下
で架橋を形成し得る光活性化可能な中間体を生じる。ま
た、臭化シアンで活性化された炭水化物の如き反応性の
水不溶性マトリックス並びに米国特許第3,969,287 号、
同第3,691,016 号、同第4,195,128 号、同第4,247,642
号、同第4,229,537 号、及び同第4,330,440 号明細書に
記載された反応性基質がタンパク質固定化に使用され
る。

【００５６】グルタミニル残基及びアスパラギニル残基
は、しばしば相当するグルタミル残基及びアスパルチル
残基に脱アミド化される。また、これらの残基は温和な
条件下で脱アミド化される。これらの残基の両形態は本
発明の範囲内にある。その他の修飾は、プロリン及びリ
シンのヒドロキシル化、セリル残基またはテオニル残基
のヒドロキシル基のホスホリル化、リシン、アルギニ
ン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(T.
E.Creighton,Proteins:Structure and Molecule Proper
ties,W.H.Freeman ＆Co. 、サンフランシスコ、79-86
頁(1983))、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及び或る場
合にはＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。 ま
た、変更されたアミノ酸配列を有するＩＣＡＭ−１また
はＭａｃ−１の官能性誘導体は、ＩＣＡＭ−１またはＭ
ａｃ−１を暗号化するＤＮＡ中の突然変異により調製し
得る。化学突然変異原または放射線突然変異原が、この
目的に使用される。化学突然変異原は、塩基類縁体（例
えば、５−ブロモウラシル、または２−アミノプリ
ン）；脱アミノ剤（例えば、亜硝酸、ヒドロキシルアミ
ン、等）；アルキル化剤（例えば、メチルメタンスルホ
ネート、ニトロソグアニジン、等）；またはインターカ
レート剤（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチリジ
ウム、プソラン、等）を含む。放射線誘発突然変異は、
紫外線、γ線、Ｘ線、等の如き手段により生じることが
できる。核酸分子を突然変異させる技術は、Miller,J.
H. 著、Experiments in Molecular Biology,Cold Sprin
g Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1972)、
及びSilhavy,T.J.ら著、Experiments with Gene Fusion
s,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo
r,NY(1984) に見られる。

【００５７】このような薬剤は、ＩＣＡＭ−１またはＭ
ａｃ−１を暗号化するＤＮＡをランダムに突然変異させ
るのに使用し得る。その後、突然変異遺伝子はＩＣＡＭ
−１またはＭａｃ−１タンパク質を発現することが可能
にされ、そのタンパク質がＭａｃ−１( またはＩＣＡＭ
−１) に結合するその能力について測定される。Ｍａｃ
−１に結合し得るＩＣＡＭ−１誘導体は、“官能性誘導
体" の一つの類を含む。ＩＣＡＭ−１に結合し得るＭａ
ｃ−１誘導体は、“官能性誘導体" の第二の類を含む。

【００５８】また、更に好ましくは、部位特異的突然変
異誘発が、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１分子を暗号化
する核酸の所望の部位で特異的な突然変異を生じるのに
使用でき、それにより官能性誘導体を暗号化するＤＮＡ
を生産でき、その後、ＤＮＡを組換え細胞培養中で発現
できる。官能性誘導体は典型的には天然産の類縁体と同
質の生物活性を示す。しかしながら、それらは通常生産
されるＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１分子に関してこの
ような特性を実質的に異にすることがある。

【００５９】アミノ酸配列変化を導入するための部位は
前もって決められるが、突然変異それ自体は前もって決
められる必要がない。例えば、所定の部位に於ける突然
変異の実施を最適化するため、ランダムな突然変異誘発
を標的コドンまたは標的領域で行うことができ、発現Ｉ
ＣＡＭ−１官能性誘導体または発現Ｍａｃ−１官能性誘
導体が所望の活性の最適の組み合わせに関してスクリー
ニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ中の前もって
決めた部位で置換突然変異を行う技術は公知であり、例
えば、部位特異的突然変異誘発が知られている。

【００６０】本発明のＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の
官能性誘導体分子の調製は、先に調製された官能性誘導
体またはタンパク質の非変異体変種を暗号化するＤＮＡ
の部位特異的突然変異誘発により行われることが好まし
い。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮ
Ａ配列を暗号化する特定のオリゴヌクレオチド配列の使
用によるだけでなく、トラバースされる欠失接合部の両
側で安定な二重らせんを形成するのに充分なサイズ及び
配列複雑さ(complexity)を有するプライマー配列を与え
るのに充分な数の隣接ヌクレオチドの使用により官能性
誘導体の生産を可能にする。

【００６１】簡単に言えば、部位特異的な突然変異誘発
は、一般に所望の特定のＤＮＡ配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドの合成を伴う。典型的には、長さ約20〜25
個のヌクレオチドのプライマーが好ましく、その配列の
接合部の両側の約５〜10個の残基は変性されている。こ
のようなオリゴヌクレオチドの合成法は、Itakura,K.
ら、Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)) 、Adelman
ら、DNA2:183(1983)) 、及びCreaら、Proc.Natl.Acad.S
ci.(USA)75:5765(1978))に開示されており、これらの開
示は参考として本明細書に含まれる。

【００６２】ＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１またはこれらの
官能性誘導体を暗号化する核酸分子は、一般に二本鎖ベ
クター、例えばM13 、φX174、等にサブクローン化さ
れ、その一本鎖が互いに分離し得る(Messingら、Third
Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombin
ant DNA 、編集者A.Walton,Elsevier 、アムステルダム
(1981)、その開示が参考として本明細書に含まれる) 。
これらのファージは市販されており、それらの使用は一
般に当業者に公知である。また、複製の一本鎖ファージ
原を含むプラスミドベクター(Veira ら、Meth.Enzymo
l.153:3(1987)) が一本鎖ＤＮＡを得るのに使用し得
る。

【００６３】次いでベクターの一本鎖が合成オリゴヌク
レオチドの存在下でインキュベートされる。オリゴヌク
レオチドのＤＮＡは調節して形成されるので、ＩＣＡＭ
−１またはＭａｃ−１を暗号化する核酸のいずれかの領
域と塩基対を形成し得るオリゴヌクレオチドをつくるこ
とが可能である。塩基対の形成がオリゴヌクレオチドと
一本鎖プラスミドの間で一旦起こると、ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用してオリゴヌクレオチドを延長して二本鎖Ｄ
ＮＡ分子をつくることが可能であり、次いでこれをＤＮ
Ａリガーゼによりシールし得る。この二本鎖ＤＮＡ分子
が細胞（好ましくはJM101 細胞) に導入される場合、半
保存的ＤＮＡ複製は、オリゴヌクレオチドフラグメント
のＤＮＡ配列がＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１を暗号化
する配列に移入された子孫分子の生産をもたらす。

【００６４】こうして、生成後に、ヘテロ二重鎖ベクタ
ーが、その後、JM101 細胞の如き適当な細胞を変換する
のに使用され、突然変異配列配置を有する組換えベクタ
ーを含むクローンが選択される。このようなクローンが
選択された後、突然変異タンパク質領域は除去され、タ
ンパク質生産に適したベクター、一般に、適当な宿主の
形質転換に使用し得る型の発現ベクターに入れることが
できる。

【００６５】こうして、点突然変異、及び外来性ＤＮＡ
配列を、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１を暗号化する配
列中の特定の部位に導入することが所望される場合、ま
たはこのような配列中に通常存在するヌクレオチドの欠
失をつくることが所望される場合、その突然変異または
配列を含んだ（または欠いた）オリゴヌクレオチドフラ
グメントが設計され、次いで上記の操作が進められる。
このような突然変異または外来性ＤＮＡ配列をＭａｃ−
１サブユニットを暗号化する核酸の特別な領域に導入す
るために、突然変異誘発が所望される領域のＤＮＡ配列
に相補的であるフランキングＤＮＡ配列で突然変異また
は外来性ＤＮＡ配列を包囲することが必要である（Jenk
ins,F.ら、Bioessays 5:244-247(1986);Doerfler,W.,An
gew.Chem.Int.Ed.Engl.23:919-931(1984);Kaina,B.,Bio
l.Zentralbl.99:513-531(1980);Kunkel,Proc.Natl.Aca
d.Sci.(USA)82:488-492(1985);Nisbet,I.T.ら、Gene An
al.Tech.2:23-29(1985);Hines,J.C. ら、Gene11:207-21
8(1980);Messing,J. ら、Nucl.Acad.Res.9:309(198
1))。

【００６６】また、突然変異は組換えＤＮＡ技術のその
他の適用により生じることができる。例えば、ＩＣＡＭ
−１またはＭａｃ−１を暗号化する核酸分子のヌクレオ
チド配列を走査して制限エンドヌクレアーゼにより認識
されるオリゴヌクレオチド部位を同定することができ
る。次いで、このようなエンドヌクレアーゼを使用して
核酸配列を認識部位で特異的に開裂することができる。
ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１を暗号化する配列中で二
つの部位を認識する( 且つその部位で開裂する)制限エ
ンドヌクレアーゼを使用することにより、この配列のフ
ラグメントを切除することが可能である。また、この目
的に二つの異なるエンドヌクレアーゼを使用することが
可能である。開裂分子をＤＮＡリガーゼの存在下でイン
キュベートすることにより、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ
−１を暗号化する配列を再シールして単一配列( 切除フ
ラグメントを含まない) を形成することが可能である。
適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位がＩＣＡＭ−１
またはＭａｃ−１を暗号化する配列中に存在しない場
合、このような部位は上記の部位特異的突然変異誘発操
作により配列中に導入し得る。

【００６７】また、突然変異は、ＩＣＡＭ−１またはＭ
ａｃ−１を暗号化する配列を開裂し、自由末端をエキソ
ヌクレアーゼで“ニブリング(nibbling)" することによ
り導入し得る。このような処理により、欠失を導入する
だけでなく、フレームシフト及びその他の型の突然変異
を導入することが可能である。更に、この技術は新規な
制限エンドヌクレアーゼ部位を暗号配列に導入し得る。
制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及びエキソ
ヌクレアーゼを使用する方法は、例えば、Maniatis,T.
ら著、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(198
2) に開示されている。

【００６８】また、組換えＤＮＡ技術は、ＩＣＡＭ−１
またはＭａｃ−１タンパク質( またはその官能性誘導
体) 及び新規ポリペプチドを含む融合タンパク質を生産
するのに使用し得る。この新規タンパク質は特別なポリ
ペプチドに限定されず、単一アミノ酸またはアミノ酸の
いずれかの組もしくはペルミューテーション(permutati
on) を含んでもよい。このような融合分子は、新規ポリ
ペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を、フレームシフト突
然変異を導入しない方法で、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ
−１( またはその官能性誘導体) を暗号化するＤＮＡ配
列につなぐことにより生産し得る。ＩＣＡＭ−１遺伝子
またはＭａｃ−１サブユニット( またはその官能性誘導
体) の遺伝子に融合し得る好ましいポリペプチドの例
は、真核もしくは原核の信号配列(Gilbert,W. ら、米国
特許第4,411,994 号;Casadaban,M. ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.(USA)76:4530-4533(1979)) 、またはＩＣＡＭ−
１もしくはＭａｃ−１( またはその官能性誘導体) の安
定性、生物半減期、もしくは能力を伸ばす( または低下
する) ポリペプチドを含む。ＩＣＡＭ−１もしくはＭａ
ｃ−１分子またはＩＣＡＭ−１官能性誘導体と免疫グロ
ブリン（またはそのフラグメント）との融合タンパク質
が特に好ましい。遺伝子融合の方法の優れた総説がSilh
avy,T.J.らにより示されている(Experiments with Gene
Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,NY(1984)) 。

【００６９】上記の方法を使用して、ＩＣＡＭ−１また
はＭａｃ−１の変異体をつくることができる。このよう
な変異体は、例えば、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の
アミノ酸配列からの欠失、またはその配列内の残基の挿
入もしくは置換を含む。アミノ酸配列の欠失は、一般に
約１〜30個の残基、更に好ましくは１〜10個の残基の範
囲であり、典型的には連続である。アミノ酸配列の挿入
は、一つの残基から実質的に未制限長さのポリペプチド
へのアミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合
を含むだけでなく、単一または複数のアミノ酸残基の配
列間挿入を含む。配列間挿入（即ち、完全なＩＣＡＭ−
１またはＭａｃ−１分子配列内の挿入）は、一般に約１
〜10個、更に好ましくは１〜５個の残基の範囲であって
もよい。末端挿入の例は、組換え宿主からの官能性誘導
体の分泌を促進するため、宿主細胞に異種または同種の
信号配列の、その分子のＮ−末端への融合を含む。ま
た、欠失、挿入、及び置換のあらゆる組み合わせをつく
って最終構成物を得てもよいが、ただし最終構成物が所
望の活性を有することを条件とする。明らかに、変異体
を暗号化するＤＮＡ中で行われる突然変異は、その配列
を読取り枠からはずれて置いてはならず、好ましくは二
次ｍＲＮＡ構造を生産し得るような相補領域を生じない
（欧州特許出願公開第75,444号を参照のこと) 。

【００７０】上記の方法を使用して、ＩＣＡＭ−１また
はＭａｃ−１分子中の少なくとも一つ、好ましくは唯一
のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場に挿入
された官能性誘導体を生産することが可能である。この
ような置換は、ＩＣＡＭ−１またはＭａｃ−１分子の特
性を微細に変調することが所望される場合に、表１に従
って行われることが好ましい。

【００７１】表１ 最初の残基 置換の例 Ａｌａ gly;ser Ａｒｇ lys Ａｓｎ gln;his Ａｓｐ glu Ｃｙｓ ser Ｇｌｎ asn Ｇｌｕ asp Ｇｌｙ ala;pro Ｈｉｓ asn;gln Ｉｌｅ leu;val Ｌｅｕ ile;val Ｌｙｓ arg;gln;glu Ｍｅｔ leu;tyr;ile Ｐｈｅ met;leu;tyr Ｓｅｒ thr Ｔｈｒ ser Ｔｒｐ tyr Ｔｙｒ trp;phe Ｖａｌ ile;leu 機能上または免疫学上の同一性の実質的な変化は、表１
中の置換よりも保存性ではない置換を選択することによ
り、即ち、(a) 置換の領域中のポリペプチド主鎖の構
造、例えば、シートまたはらせん立体構造としての構
造、(b) 標的部位に於ける分子の電荷または疎水性、ま
たは(c) 側鎖の嵩高さを維持することに関するそれらの
効果をかなり異にする残基を選択することによりつくら
れる。一般に予想される置換は、次のような置換であ
る。(a) グリシン及び／またはプロリンが別のアミノ酸
により置換され、または欠失もしくは挿入される。(b)
親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが疎水性
残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラ
ニル、バリル、またはアラニルに代えて( または、それ
らにより) 置換される。(c) システイン残基がその他の
残基に代えて( または、それらにより) 置換される。
(d) 電気的に陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシ
ル、アルギニル、またはヒスチジルが電気的に負の電荷
を有する残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチル
に代えて( または、それらにより) 置換される。または
(e) 嵩高の側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニ
ンがこのような側鎖をもたない残基、例えば、グリシン
に代えて( または、それらにより) 置換される。

【００７２】殆どの欠失及び挿入、及び特に置換は、Ｉ
ＣＡＭ−１またはＭａｃ−１分子の特性に著しい変化を
生じないと予想される。しかしながら、置換、欠失、ま
たは挿入の正確な効果を、そうする前に予想することが
困難である場合には、当業者はその効果がルーチンのス
クリーニングアッセイにより評価されることを認める。
例えば、官能性誘導体は典型的には天然のＩＣＡＭ−１
またはＭａｃ−１を暗号化する核酸の部位特異的突然変
異誘発、組換え細胞培養中の変異体核酸の発現、及び、
必要により、細胞培養からの精製（例えば、抗ＩＣＡＭ
−１分子抗体カラム（官能性誘導体を少なくとも一種の
残りの免疫エピトープに結合することにより官能性誘導
体を吸収するため）による免疫アフィニティ吸着によ
る）によりつくられる。

【００７３】細胞溶解産物または精製ＩＣＡＭ−１分子
官能性誘導体の活性は、その後、所望の特性に適したス
クリーニングアッセイでスクリーニングされる。例え
ば、所定の抗体に対する親和性の如き官能性誘導体の免
疫特性の変化は、競合型イムノアッセイにより測定され
る。免疫修飾活性の変化は適当なアッセイにより測定さ
れる。酸化還元安定性または熱安定性、生物半減期、疎
水性、タンパク質加水分解に対する感受性、または担体
と凝集する傾向もしくは多量体に凝集する傾向の如き、
タンパク質の性質の修飾は、当業者に公知の方法により
測定される。

【００７４】IV. Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１の結合に
影響し得る抗体の生産 抗体（特にモノクローナル抗体）は、本発明のＩＣＡＭ
−１分子のフラグメントによる免疫化に応答して誘発し
得る。このような抗体は、Ｍａｃ−１に結合するＩＣＡ
Ｍ−１の能力を特異的に損ない得る抗体を同定すること
について分析し得る。これらの抗体は、このような結合
を阻止または軽減するのに使用でき、こうして非特異的
防御系の炎症反応の治療に使用し得る。加えて、このよ
うな抗体は、ＩＣＡＭ−１へのウイルス（特に主要な血
清型のライノウイルス）の結合を阻止または軽減するの
に使用し得る。

【００７５】このようなモノクローナル抗体を得るあら
ゆる方法が使用し得るが、Rothlein,R. ら(J.Immunol.1
37:1270-1274(1986)) により記載された経路及びスケジ
ュールを使用してBALB/Cマウスを、ＬＦＡ−１欠乏の個
人からのエプスタイン- バーウイルスで形質転換された
末梢血単核細胞で免疫化することによりＩＣＡＭ−１結
合モノクローナル抗体を得ることが好ましい。このよう
な細胞は、Springer,T.A. ら著、J.Exper.Med.160:1901
-1918(1984) に開示されている。

【００７６】ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体の発生及び
検出に好ましい方法に於いて、マウスが免疫アフィニテ
ィで精製されたＩＣＡＭ−１で免疫化される。その動物
からの脾臓細胞が取り出され、非分泌ミエローマ細胞と
融合され、抗体生産ハイブリドーマ細胞に発育させられ
る。次いで抗体が図６に示されるように精製Ｍａｃ−１
及びＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞接着の抑制に
関して試験される。これは、ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−
１及びＭａｃ−１結合を差別的に抑制するモノクローナ
ル抗体を同定する。

【００７７】Ｖ．本発明の分子の抗炎症薬としての用途 Ａ．ＩＣＡＭ−１及びＭａｃ−１、並びにそれらの官能
性誘導体 ＩＣＡＭ−１は、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１の両方の結
合パートナーである。このようなものとして、ＩＣＡＭ
−１またはその官能性誘導体は、疾患の治療に於いてＭ
ａｃ−１またはＬＦＡ−１に結合し得る抗体と互換可能
に使用し得る。こうして、可溶化形態で、このような分
子は、Ｍａｃ−１を発現する細胞とＩＣＡＭ−１を発現
する細胞との相互作用により生じる炎症を抑制するのに
使用し得る。同様に、Ｍａｃ−１またはその官能性誘導
体（好ましくは、Ｍａｃ−１の可溶化形態）は、ＩＣＡ
Ｍ−１を発現する細胞とＭａｃ−１を発現する細胞との
相互作用により生じる炎症を抑制するために、ＩＣＡＭ
−１に結合し得る抗体と互換可能に使用し得る。このよ
うな炎症は一般に非特異的防御系の反応により媒介され
る。同様に、このような誘導体はまたＩＣＡＭ−１を発
現する細胞とＬＦＡ−１を発現する細胞との相互作用に
より生じる炎症を抑制するのに使用し得る。このような
炎症は一般に特異的防御系の反応により媒介される。

【００７８】本発明は、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の間
の相互作用の部位がＭａｃ−１と相互作用するＩＣＡＭ
−１の部位と切断できることを開示する。こうして、Ｌ
ＦＡ−１またはＭａｃ−１に実質的に結合し得るが、Ｍ
ａｃ−１またはＬＦＡ−１に実質的に結合し得ないＩＣ
ＡＭ−１の新規な官能性誘導体を生産することができ
る。また、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を実質的に結合し
得ないが、ヒト・ライノウイルスに実質的に結合し得る
ＩＣＡＭ−１の誘導体を生産することができる。本発明
の好ましい官能性誘導体の中に、ＩＣＡＭ−１の領域
１、２、３、４及び５を含む官能性誘導体（特に可溶性
誘導体）がある。

【００７９】こうして、ＩＣＡＭ−１の特に好ましい可
溶性誘導体は、ＬＦＡ−１を発現する細胞のＬＦＡ−１
に実質的に結合し得るが、Ｍａｃ−１に実質的に結合し
得ない分子である。このような分子の例は、領域１、ま
たは領域１と２、または領域１と２と４を有するが領域
３を含まないＩＣＡＭ−１分子を含む。別の例は、領域
３を含むが、分子をＭａｃ−１を実質的に結合し得なく
する突然変異を領域３中に含むＩＣＡＭ−１誘導体を含
む。領域３中の特に好ましい突然変異は、ＩＣＡＭ−１
のＩＣＡＭ−１残基229-231 、または254-256 中の突然
変異である。このような突然変異は、ＩＣＡＭ−１を、
Ｍａｃ−１を実質的に結合し得なくする。このような誘
導体は、非特異的防御系の炎症反応に影響しないで特異
的防御系の炎症反応を治療したい状況で望ましい。

【００８０】同様に、本発明は、Ｍａｃ−１を発現する
細胞のＭａｃ−１に実質的に結合し得るが、ＬＦＡ−１
に実質的に結合し得ないＩＣＡＭ−１の新規な官能性誘
導体を生産することを可能にする。このような分子の例
は、ＩＣＡＭ−１の領域１を含まないＩＣＡＭ−１分
子、並びにＩＣＡＭ−１の領域１、２、３、４及び５を
含むが、ＩＣＡＭ−１の領域１または２中に突然変異を
含むＩＣＡＭ−１分子を含む。特に好ましい突然変異
は、ＩＣＡＭ−１の領域１の一種以上のＩＣＡＭ−１残
基E34 、Q58ED 、またはQ73 中の突然変異である。領域
１を含まない好ましいＩＣＡＭ−１官能性誘導体の中
に、ＩＣＡＭ−１の領域３と４を含む官能性誘導体があ
る。このような誘導体は、特異的防御系の炎症反応に影
響しないで非特異的防御系の炎症反応を治療したい状況
で望ましい。

【００８１】特異的防御系の炎症反応に影響しないで非
特異的防御系の炎症反応を治療するのに使用し得るＩＣ
ＡＭ−１誘導体を得ることができる第二の方法は、ＬＦ
Ａ−１よりむしろＭａｃ−１に結合する誘導体の相対能
力を高めることによる。この目標を実現する一つの手段
は、一つ以上のグリコシル化部位を含まないＩＣＡＭ−
１官能性誘導体を生産することによる。このような誘導
体は、Ｍａｃ−１への結合能力を高めることができる。
ＩＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１残基N269、N240またはN358
に於けるグリコシル化部位の欠如がこの目的に最も好ま
しい。

【００８２】本明細書に使用されるように、分子の官能
性誘導体は、他の分子に結合するその能力が同分子を結
合するその誘導体の天然前駆体の能力とほぼ同じである
場合に他の分子に“実質的に結合し得る”と言われる。
こうして、例えば、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体は、そ
の誘導体がＩＣＡＭ−１それ自体とほぼ同じようなＭａ
ｃ−１（またはＬＦＡ−１）結合能力を有する場合にＭ
ａｃ−１（またはＬＦＡ−１）に“実質的に結合し得
る”と言われる。

【００８３】本明細書に使用されるように、分子の官能
性誘導体は、他の分子に結合するその能力が同分子を結
合するその誘導体の天然前駆体の能力と実質的に異なる
（例えば、50％未満) 場合に他の分子に“実質的に結合
し得ない”と言われる。こうして、例えば、ＩＣＡＭ−
１の官能性誘導体は、その誘導体が、ＩＣＡＭ−１それ
自体が有するＭａｃ−１( またはＬＦＡ−１) 結合能力
の50％未満を有する場合に、Ｍａｃ−１（またはＬＦＡ
−１）に“実質的に結合し得ない”と言われる。

【００８４】上記の可溶化誘導体は、細胞の膜に結合さ
れない誘導体である。このような誘導体は、膜内外領域
を含まないトランケート分子を含んでもよい。また、そ
れらは、膜内外領域を含むとしても、細胞の膜に結合
（または安定に結合）される能力を欠いている天然分子
の突然変異体形態を含んでもよい。ＩＣＡＭ−１の領域
構造、ＩＣＡＭ−１の可溶性誘導体及びそれらの調製
は、Marlin,S.D. 著、Nature344:70-72(1990) に開示さ
れており、この文献が参考として本明細書に含まれる。

【００８５】好ましい分子の更に別の型は、ＩＣＡＭ−
１を発現する細胞のＩＣＡＭ−１に実質的に結合し得る
が、ＩＣＡＭ−１への分子のＬＦＡ−１系統群の別の員
の結合を実質的に阻止し得ないＭａｃ−１の可溶性誘導
体である。このような分子の例は、ＩＣＡＭ−１の領域
１に結合するＬＦＡ−１の能力を損なわないＭａｃ−１
分子を含む。このような分子は、それらが特異的防御系
の反応に影響しないで非特異的防御系の炎症反応に影響
し得るので望ましい。このようなＭａｃ−１官能性誘導
体は、例えば、潜在的なＭａｃ−１官能性誘導体をＬＦ
Ａ−１に結合するＩＣＡＭ−１の能力をそれが損ない得
ないことに関してスクリーニングすることにより同定し
得る。

【００８６】ＩＣＡＭ−１、またはその官能性誘導体
は、治療薬または診断薬の免疫原性を低下するために、
抗Ｍａｃ−１抗体と同様に使用し得る。同様に、Ｍａｃ
−１、またはその官能性誘導体は、治療薬または診断薬
の免疫原性を低下するために、抗ＩＣＡＭ−１抗体と同
様に使用し得る。ＩＣＡＭ−１、もしくはＭａｃ−１、
またはこれらの官能性誘導体は、表面でＭａｃ−１また
はＩＣＡＭ−１を発現する腫瘍細胞の転移または増殖を
阻止するのに使用し得る。種々の方法が、この目的を達
成するのに使用し得る。例えば、或る種の細胞の移動
は、ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１結合を必要とする。ＩＣ
ＡＭ−１またはＭａｃ−１を結合し得る毒素誘導体化さ
れた分子が患者に投与し得る。このような毒素誘導体化
された分子が、分子のＬＦＡ−１系統群のＩＣＡＭ−１
またはＭａｃ−１α員を発現する腫瘍細胞に結合する場
合、毒素の存在は腫瘍細胞を死滅させ、それにより腫瘍
の増殖を抑制する。

【００８７】Ｂ．ＩＣＡＭ−１を結合し得る抗体 ＩＣＡＭ−１に結合でき、それによりＭａｃ−１へのＩ
ＣＡＭ−１の結合を阻止し得るモノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体は、哺乳類患者の抗炎症薬として非
常に適している。モノクローナル抗体がこのような用途
に特に好ましい。重要なことに、このような薬剤は、そ
れらが接着を選択的に抑制でき、しかも通常の薬剤に見
られるような腎毒性の如きその他の副作用を生じないと
いう点で、一般の抗炎症薬と異なる。このようなモノク
ローナル抗体は、非特異的防御系の反応により生じる炎
症を治療するのに使用し得る。

【００８８】ＬＦＡ−１を欠乏しているＬＡＤ患者は炎
症応答を増大しないので、ＬＦＡ−１の天然リガンド、
ＩＣＡＭ−１の拮抗作用はまた炎症応答を抑制すると考
えられる。炎症を抑制するＩＣＡＭ−１の抗体の能力
は、慢性炎症疾患及び自己免疫疾患、例えばエリテマト
ーデス、自己免疫性甲状腺炎、実験的アレルギー性脳脊
髄炎（ＥＡＥ）、多発硬化症、或る種の形態の糖尿病レ
イナウド（Reynaud's)症候群、慢性関節リウマチ、等の
治療に於けるそれらの治療上の使用の基礎を与える。ま
た、このような抗体は乾癬の治療に於ける治療薬として
使用し得る。一般に、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノク
ローナル抗体は、ステロイド治療薬により現在治療し得
る疾患の治療に使用し得る。

【００８９】ＩＣＡＭ−１（またはそれらの官能性誘導
体）の抗体が本発明に特に重要であり、これらはＭａｃ
−１へのＩＣＡＭ−１の結合を実質的に抑制または阻止
し得るが、ＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１の結合を実質的
に抑制または阻止し得ない。このような抗体は、特異的
防御系の反応に影響しないで非特異的防御系の炎症を治
療するのに使用し得る。このような抗ＩＣＡＭ−１抗体
の例はモノクローナル抗体CBRIC1/1である。このモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系が、1990
年11月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、ATCC登録番号HB10597 を与えられ
た。

【００９０】また、ＩＣＡＭ−１（またはそれらの官能
性誘導体）の抗体が本発明に特に重要であり、これらは
ＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１の結合を実質的に抑制また
は阻止し得るが、Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１の結合を
実質的に抑制または阻止し得ない。このような抗体は、
非特異的防御系の反応に影響しないで特異的防御系の炎
症を治療するのに使用し得る。このような抗体の例は、
抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体RP1/1(Rothlein,R.
M. ら、J.Immunol.137:1270-1274(1986))、LB2(Clark,
E.A.ら、Hum.Immunol.16:100-113(1986)) 、84H10(Makg
oba,M.W.ら、Nature331:86-88(1988))、及びCBRIC1/4で
ある。

【００９１】抗ＩＣＡＭ−１抗体Ｒ6.5(Smith,C.W.ら、
J.Clin.Invest.82:1746-1756(1988)) は、Ｍａｃ−１及
びＬＦＡ−１の両方がＩＣＡＭ−１に結合することを阻
止し得る。こうして、それは特異的防御系及び非特異的
防御系の両方を伴う好ましい抗体炎症反応である。上記
のように、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
の両方が本発明に従って使用し得る。ヒト中で生産され
る抗体、または組換えもしくはその他の技術により“ヒ
ューマナイズされる(humanized)"( 即ち、ヒト中で非免
疫原性である) 抗体が、特に好ましい。このような抗体
は本明細書に開示されたモノクローナル抗体及びポリク
ローナル抗体の均等物であるが、それ程免疫原性ではな
く、患者により良く許容されるヒューマナイズされた抗
体は、例えば、抗体の免疫原性部分を相当する非免疫原
性部分( 即ち、キメラ抗体) で置換することにより生産
し得る(Robinson,R.R.ら、国際特許国際公開PCT/US86/0
2269;Akira,K. ら、欧州特許出願第184,187 号;Tanigut
i,M.、欧州特許出願第171,496 号;Morrison,S.L.ら、欧
州特許出願第173,494 号;Neuberger,M.S. ら、国際特許
出願第WO 86/01533;Cabilly,S.ら、欧州特許出願第125,
023 号;Better,M.ら、Science240:1041-1043(1988);Li
e,A.Y. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443(198
7);Lie,A.Y. ら、J.Immunol.139:3521-3526(1987);Sun,
L.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218(1987);Nis
himura,Y. ら、Canc.Res.47:999-1005(1987);Wood,C.R.
ら、Nature314:446-449(1985);Shawら、J.Natl.Cancer
Inst.80:1553-1559(1988) 、これらの文献の全てが参考
として本明細書に含まれる) 。" ヒューマナイズされ
た" キメラ抗体の全般の総説が、Morrison,S.L. 著、Sc
ience,229:1202-1207(1985) 及びOi,V.T. ら著、BioTec
hniques 4:214(1986) に示されており、これらの文献が
参考として本明細書に含まれる。

【００９２】好適な" ヒューマナイズされた" 抗体はま
たＣＤＲまたはＣＥＡ置換により生産し得る(Jones,P.
T. ら、Nature321:552-525(1986);Verhoeyan ら、Scien
ce239:1534(1988);Beidler,C.B.ら、J.Immunol.141:405
3-4060(1988) 、これらの文献の全てが参考として本明
細書に含まれる) 。 VI. 本発明の分子の投与 Ｍａｃ−１は、内皮組織に結合し得る細胞で発現される
ので、患者へのＩＣＡＭ−１、またはＩＣＡＭ−１の官
能性誘導体の投与は内皮組織を映像化または視覚化する
手段を与える。同様に、患者へのＭａｃ−１の投与はＩ
ＣＡＭ−１発現の部位を視覚化させ、それにより炎症の
部位の検出を可能にする。更に、このような操作は、Ｍ
ａｃ−１レセプター分子の結合リガンドまたは視覚化さ
れた組織に存在するＩＣＡＭ−１の結合リガンドの量及
び分布に関する診断情報を与える。

【００９３】このような使用に際して、本発明の投与分
子は、放射線同位元素、アフィニティラベル（例えば、
ビオチン、アビジン、等）、蛍光ラベル、常磁性原子、
等の使用により検出可能にラベルされる。このようなラ
ベリングを行う操作は当業界で公知である。抗体（また
はそのフラグメント）は、放射線同位元素、酵素ラベ
ル、蛍光ラベル、常磁性ラベル、電子−濃密ラベル、等
の使用により検出可能にラベルし得る。個人へのこのよ
うなラベルされた分子の投与は炎症の部位を同定する。
また、このような検出可能なラベルが患者の免疫系の状
態を分析するのに使用できる。診断造影に於ける抗体の
臨床上の適用は、Grossman,H.B.,Urol.Clin.North Ame
r.13:465-474(1986) 、Unger,E.C.ら、Invest.Radiol.2
0:693-700(1985)、及びKhaw,B.A. ら、Science209:295-
297(1980)に概説されている。

【００９４】炎症の部位に自然に移行する単球の能力は
Ｍａｃ−１に依存する(Keizer,G.D.ら、Eur.J.Immunol.
17:1317-1322(1987)) 。このような移行は、ＩＣＡＭ−
１、またはＩＣＡＭ−１の官能性誘導体を患者に投与す
ることにより抑制し得る。同様に、内皮細胞に接着する
単球様細胞の能力、及び化学走性、ケモキネシス、また
は食作用を受ける単球様細胞の能力は、Ｍａｃ−１に依
存することがわかった(Keizer,G.D.ら、Eur.J.Immunol.
17:1317-1322(1987)) 。本発明の抗炎症薬のいずれもが
このような活性を抑制するのに使用し得る。

【００９５】本発明の分子は、それらを含む製剤がこれ
らの生産物と一緒に通常、自然にみられる物質を実質的
に含まない場合に、" 天然の汚染物質を実質的に含まな
い"と言われる。本発明は、ＩＣＡＭ−１に結合し得る
抗体、及びその生物活性フラグメント（ポリクローナル
またはモノクローナル）に及ぶ。このような抗体は、動
物、もしくは組織培養、または組換えＤＮＡ手段により
生産し得る。

【００９６】ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、またはそ
のフラグメントを患者に与える際に、またはＩＣＡＭ−
１、Ｍａｃ−１（またはそのフラグメント、変異体、ま
たは誘導体）を受容患者に与える場合に、投与薬剤の投
薬量は患者の年齢、体重、身長、性別、全般の医療条
件、過去の病歴、等に応じて変化する。一般に、約１pg
/kg 〜10mg/kg(患者の体重) の範囲である抗体の投薬量
を受容体に与えることが望ましいが、それより少ない投
薬量または多い投薬量が投与されてもよい。ＩＣＡＭ−
１もしくはＭａｃ−１分子またはそれらの官能性誘導体
を患者に与える場合、このような分子を、また約１pg/k
g 〜10mg/kg(患者の体重) の範囲の投薬量で投与するこ
とが好ましいが、それより少ない投薬量または多い投薬
量がまた投与されてもよい。以下に説明されるように、
抗ＩＣＡＭ−１抗体が更に抗ＬＦＡ−１抗体、またはそ
の均等物と一緒に投与される場合には、治療有効投薬量
を少なくすることができる。

【００９７】本明細書に使用されるように、両化合物が
患者の血清中に同時に検出し得るような接近した時間で
二つの化合物が投与される場合、一つの化合物は更に第
二の化合物と一緒に投与されると言われる。本発明の分
子は、患者に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腸内
投与、または非経口投与することができる。このような
分子を注射により投与する場合、その投与は連続輸注に
よるものであってもよく、また単一もしくは複数の巨丸
剤によるものであってもよい。

【００９８】本発明の抗炎症薬は、炎症を抑制するのに
充分な量で受容患者に与えられることを目的とする。そ
の薬剤の投薬量、投与経路、等が炎症を軽減または阻止
する場合に、量が炎症を”抑制”するのに充分であると
言われる。本発明の抗炎症薬は、単独で投与されてもよ
く、または一種以上の別の免疫抑制剤（特に器官または
組織移植の受容体に対して）と組み合わせて投与されて
もよい。このような一種以上の化合物の投与は、”予
防”目的または”治療”目的のためであってもよい。予
防で与えられる場合、一種以上の化合物は炎症応答また
は症候の前に与えられる。一種以上の化合物の予防上の
投与は、その後の炎症応答を阻止または軽減するのに役
に立つ。治療上投与される場合、一種以上の化合物は実
際の炎症の症候の開始（または直後）に与えられる。一
種以上の化合物の治療上の投与は、実際の炎症を軽減す
るのに役に立つ。こうして、本発明の抗炎症薬は、炎症
の開始の前（推測される炎症を抑制するため）または炎
症の開始後に投与し得る。

【００９９】組成物は、その投与が受容患者により許容
される場合に”薬理学上許される”と言われる。このよ
うな組成物は、その投与量が生理学上有意である場合
に”治療有効量”で投与されると言われる。薬剤は、そ
の存在が受容患者の生理学上の検出可能な変化を生じる
場合に生理学上有意である。本発明の分子は、製薬上有
効な組成物を調製するための既知の方法により製剤化で
き、その方法により、これらの物質、またはそれらの官
能性誘導体が製薬上許される担体ビヒクルと混合され
る。好適なビヒクル及びそれらの配合物（その他のヒト
・タンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）が、
例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(第16
編、Osol,A. 編集、Mack,Easton PA(1980)) に記載され
ている。有効投与に適した製薬上許される組成物を生成
するために、このような組成物は、適当な量の担体ビヒ
クルと一緒に有効量の抗ＩＣＡＭ抗体、またはＩＣＡＭ
−１もしくはＭａｃ−１分子を含む。

【０１００】別の製薬方法が、作用の期間を調節するの
に使用し得る。制御放出製剤は、本発明の治療薬と錯生
成し、またはそれを吸収するポリマーの使用により得る
ことができる。調節された送出は、放出を調節するため
に適当な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ
酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニルコポリ
マー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、またはプロタミンスルフェート）及び巨大分子の濃
度並びに混入方法を選択することにより行うことができ
る。制御放出製剤により作用の期間を調節するのに可能
な別法は、抗ＩＣＡＭ−１抗体もしくはＩＣＡＭ−１分
子、またはそれらの官能性誘導体をポリマー物質、例え
ばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸
またはエチレン酢酸ビニルコポリマーの粒子に混入する
ことである。また、これらの薬剤をポリマー粒子に混入
することに代えて、例えば、コアセルベーション技術ま
たは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例え
ば、夫々ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル
またはゼラチンマイクロカプセル及びポリメチルメタク
リレートマイクロカプセル中、またはコロイド薬剤送出
系、例えば、リポソーム、アルブミン微小球、ミクロエ
マルション、ナノパーチクル、及びナノカプセル中、ま
たはマクロエマルション中にこれらの物質を閉じ込める
ことが可能である。このような技術がRemington's Phar
maceutical Sciences(1980) に開示されている。

【０１０１】本発明を全般に説明したが、本発明は以下
の実施例を参考にして更に容易に理解される。これらの
実施例は説明のために示されるものであり、特に断らな
い限り、本発明を限定することを目的とするものではな
い。

【０１０２】

【実施例】実施例１ Ｍａｃ−１とＩＣＡＭ−１の相互作用を調べる方法 Smith,C.W.らによる最近の研究(J.Clin.Invest.83:2008
-2017(1989);J.Clin.Invest.82:1746-1756(1988)、これ
らは本明細書に参考として含まれる) は、ＬＦＡ−１及
びＭａｃ−１が内皮細胞への好中球接着に協力し、未刺
激好中球が主として表面ＬＦＡ−１により結合し、一
方、fMLP活性化好中球が殆どＭａｃ−１により付着する
ことを本発明者に示唆した。ＩＣＡＭ−１のモノクロー
ナル抗体は未刺激内皮細胞へのCD18依存性のfMLP刺激好
中球の接着を充分に阻止するので、Ｍａｃ−１及びＬＦ
Ａ−１の両方はＩＣＡＭ−１と相互作用している可能性
がある(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.82:1746-1756(1
988)) 。また、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１のモノクロー
ナル抗体はＩＣＡＭ−１を含む平面状の膜への好中球付
着を阻止する(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.83:2008-
2017(1989)) ことから、Smith らの研究は内皮細胞への
好中球接着が部分的にＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１及びＩ
ＣＡＭ−１−Ｍａｃ−１依存性であるという結論を支持
した。

【０１０３】対照的に、Lo,S.K. ら(J.Immunol.143(1
0):3325-3329(1989)) は、フォルボールエステルで刺激
された好中球が未刺激内皮細胞に接着する場合に、Ｍａ
ｃ−１及びＬＦＡ−１が関与するが、ＬＦＡ−１のみが
ＩＣＡＭ−１と相互作用することを開示していた。その
他に、彼らは、マクロファージをＩＣＡＭ−１基質に塗
布する場合に、ＬＦＡ−１のみが細胞表面の先端部分か
ら減少変調される（down-modulated) ことを見出した。
これらの結果は、Ｍａｃ−１がＩＣＡＭ−１に結合する
のではなく、性質決定されていない内皮細胞表面レセプ
ターと相互作用するという結論を支持した。

【０１０４】このパラドックスを解決するため、免疫ア
フィニティ精製されたＭａｃ−１及びＩＣＡＭ−１、並
びにＩＣＡＭ−１、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１を発現す
る形質移入細胞を使用して、相互接着研究を行った。 モノクローナル抗体 ヒト抗原に対する下記のマウス・モノクローナル抗体は
腹水からのものであった。LPM19c( 抗CD11b,IgG2a);Uci
echowski,P. ら、Leukocyte Typing IV:WhiteCell Diff
erentiation Antigens,W.Knapp 編集、Oxford Universi
ty Press,Oxford、543-551 頁(1989)) 、W6/32(抗HLA
A, B, C, IgG2a)(Barnstable,C.J. ら、Cell 14:9-20(1
978)) 、TS1/22( 抗CD11a,IgG1)(Sanchez-Madrid,F.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7489-7493(1982))、YF
C51.1(抗CD18,rate IgG2b)(Uciechowski,P. ら、Leukoc
yte Typing IV:White Cell Differentiation Antigens,
W.Knapp 編集、Oxford University Press,Oxford、543-
551 頁(1989)) 、CBRIC2/1及びCBRIC2/2( 抗ICAM-2,IgG
2a) 及びTS2/I6( 抗CD29,IgGI)(Sanchez-Madrid,F.ら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7489-7493(1982))。下記の
ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を精製IgG として使用
した。CL203(Maio,M. ら、J.Immunol.143:181-188(198
9))、LB-2(Clark,E.A. ら、Hum.Immunol.16:100-113(19
86)) 、84H10(Makgoba,M.W.ら、Nature331:86-88(198
8))。

【０１０５】RR1/1 Fab₂ (IgGI)(Rothlein,R.M. ら、、
J.Immunol.137:1270-1274(1986))をプロテインＡアフィ
ニティクロマトグラフィー後のペプシン消化により調製
した(Parham,P., Immnological Methods in Biomedical
Sciences,Weir,D.M. ら編集、Blackwell,Oxford(198
3)) 。R6.5(IgG2a)(Smith,C.W.ら、J.Clin.Invest.82:1
746-1756(1988))IgG及びFab をBoeringer Ingelheim Ph
armceuticals,Ridgefield,CTから得た。

【０１０６】モノクローナル抗体CBRIC1/1、CBRIC1/2、
CBRIC1/3、CBRIC1/4( 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗
体) 、M1/42(抗H-2 、ラットIgG2a)(Springer,T.A.、Mo
noclonal Antibodies,Kennett,R.H.ら編集、Plenum Pre
ss, ニューヨーク、185-217頁(1980)) 及びX63(非結合
抗体、IgG1) を組織培養上澄液として使用した。抑制ア
ッセイのため、腹水を1/400 希釈で使用し、精製IgG を
20〜25μg/mlで使用し、Fab₂を20μg/mlで使用し、Fab
を50μg/mlで使用し、組織培養上澄液を1/2 で使用し
た。プロテインＡ精製TS1/18( 抗CD18,IgG1)(Sanchez-M
adrid,F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7489-7493(19
82))及びLM2/1(抗CD11b 、IgGI)(Miller,L.J. ら、J.Im
munol.137:2891-2900(1986))をヨウ素化し、Dustin,M.
L. ら(Nature341:619-624(1989)、この文献は参考とし
て本明細書に含まれる) により記載された部位密度測定
に使用した。TSI/18は無傷のα／βヘテロダイマーのみ
を認識する。

【０１０７】タンパク質精製：Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１
及びＩＣＡＭ−１ Ｍａｃ−１を、Dustin,M.L. ら(Nature341:619-624(198
9)) 及びMiller,L.J.ら(Immunol.138:2381-2383(1987))
(これらの文献は参考として本明細書に含まれる) の操
作の改良法により白血球溶解産物から精製した。簡単に
言えば、精製官能性ヘテロダイマー500 μg を得るため
に、凍結末梢血白血球10g を溶解緩衝液(100ミリモルの
トリスHCl pH8.0 、150 ミリモルのNaCl、２ミリモルの
MgCl₂ 、１％のトリトン(Triton)X-100 、５ミリモルの
ヨードアセトアミド、0.025 ％のNaN₃、１ミリモルのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド、１ミリモルのジイ
ソプロピルフルオロホスフェート、0.2TIU/ mlのアプロ
チニン)200ml中で４℃で穏やかに攪拌しながら１時間で
可溶化した。得られる溶解産物を10,000xgで４℃で２時
間遠心分離した。上澄液をデカントし、次いで100,000x
g (Ti45 、ベックマン) で１時間超遠心分離した。

【０１０８】浄化した溶解産物を、セファロース(Sepha
rose)CL-4BにカップリングしたヒトIgG で前もって透明
にした。IgG-セファロースの1:1 スラリー40μl を溶解
産物１ml当たりに添加し、４℃で一夜回転させた。セフ
ァロースをペレットにし、前もって透明にした溶解産物
を、その後、LM2/1(抗CD11b;IgG1) 免疫アフィニティカ
ラム( 床容積６ml、３mg／mlのLM2/1)に通した。これ
を、プロテインＡ精製LM2/1 を臭化シアン活性化セファ
ロースに付着することにより調製した(March,S.C. ら、
Anal.Biochem.60:149-152(1974))。

【０１０９】そのカラムを、50ミリモルのトリスHCl pH
8.0 、150 ミリモルのNaCl、２ミリモルのMgCl₂ 、0.1
％のトリトンX-100 の10床容積で予備平衡させ、前もっ
て透明にした溶解産物を10ml/ 時間で装填した。そのカ
ラムを、中和緩衝液(10 容量％の１モルのトリスHCl pH
7.4)と一緒に、50ミリモルのトリスHCl pH8.0 、150ミ
リモルのNaCl、２ミリモルのMgCl₂ 、１％のn-オクチル
β−Ｄ−グルコピラノシドの10床容積で20ml/ 時間で連
続してチューブ中に洗浄した。ピーク画分を溜め、アリ
コートとし、-80 ℃で活性の損失なしに３〜６ケ月貯蔵
した。

【０１１０】末梢血白血球溶解産物を置換した以外は、
Dustin,M.L. ら(Nature341:619-624(1989)) により記載
されたようにして免疫アフィニティクロマトグラフィー
によりＬＦＡ−１を精製した。ＩＣＡＭ−１を、Marli
n,S.D. ら(Cell 51:813-819(1987)) により記載された
ようにして免疫アフィニティクロマトグラフィーにより
精製した。

【０１１１】SDS-PAGE タンパク質試料を５％のベータ−メルカプトエタノール
を含むポリアクリルアミド(Laemmli,U.K.,Nature227:68
0-685(1970))還元ゲルで７〜10％のドデシル硫酸ナトリ
ウムの存在下で流し、Morrissey,J.H.(Anal.Biochem.11
7:307-310(1981) により記載されたようにして銀染色し
た。

【０１１２】組織培養、形質移入、及び細胞調製 COS 細胞を、10％の牛胎児血清、５ミリモルのグルタミ
ン及び50μg/mlのゲンタマイシンを含むRPMI 1640 中で
10または15cmの組織培養処理プレート( ファルコン(Fal
con)) で増殖させた。細胞を、４〜６μg のCsCl精製し
た(Maniatis,T.ら、Molecular Cloning:A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spri
ng Harbor,NY(1982) 、この文献は参考として本明細書
に含まれる) ＩＣＡＭ−１ ＤＮＡ(Staunton,D.E.ら、
Cell 61:243-254(1990))で10cmのプレート中で約50〜60
％の集密度(confluency)で形質移入し、またはDEAE- デ
キストラン法(Aruffo,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
4:8573-8577(1987);Kingston,R.E.著Current Protocols
in Molecular Biology,Greene Publishing Associates
、9.0.1-9.9.6 頁(1987)) により37℃で４時間にわた
って６μg のＭａｃ−１またはＬＦＡα＋６μg のβｃ
ＤＮＡ（Hibbs,M.L.ら、J.Clin.Invest85:674-681(199
0);Larson,R.S. ら、Cell Reg.1:359-367(1990)) で同
時形質移入した。72時間後に、機能アッセイの前に、細
胞をPBS(リン酸緩衝食塩水) 、５ミリモルのEDTAで37℃
で５分間で組織培養プレートから溶離した。

【０１１３】安定なＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞を、Chen,C.
A. ら(BioTechniques6(7):632-637(1988)、この文献は
参考として本明細書に含まれる) に記載されたようにし
て発生させた。簡単に言えば、マウスＬ細胞(tk-) を６
cmの組織培養皿に接種し、２日間にわたって10〜20％の
集密度まで増殖させた。プラスミドCDM8(Staunton,D.E.
ら、Cell 61:243-254(1990) 中のＩＣＡＭ−１ cＤＮＡ
(10 μg)及びチミジンキナーゼ選択マーカーを含むプラ
スミド(100mg) を0.2 mlのCaCl₂ 及び0.2 mlの50ミリモ
ルのN-N-ビス-2−アミノ−エタンスルホン酸、280 ミリ
モルのNaCl、1.5ミリモルのNa₂HPO₄ 、pH6.95と混合
し、室温で10〜20分間インキュベートした。リン酸カル
シウム−ＤＮＡ溶液(0.4ml) を、塗布した細胞に滴下し
て添加し、３％のCO₂ のインキュベーター中で35℃でイ
ンキュベートした。24時間後、細胞をレギュラーDMEM培
地で洗浄し、３日目まで５％のCO₂ のインキュベーター
中で37℃で増殖させ、その時HAT(100 μM のヒポキサン
チン、400nM のアミノプテリン、16μM のチミジン) 選
択を開始した。

【０１１４】高いＩＣＡＭ−１発現の細胞を、クローニ
ングシリンダーによる単一コロニーピックス(picks) の
後に、フロー・サイトメトリにより同定した。ＩＣＡＭ
−１ ⁺ Ｌ細胞を、10％の熱失活牛胎児血清、５ミリモル
のグルタミン、50μg/mlのゲンタマイシンからなり、HA
T を補給した選択培地中に保った。形質移入されなかっ
たＬ細胞を、HAT を含まないDMEM中に保った。

【０１１５】ヒトのさい帯静脈内皮細胞(HUVEC) を、20
％の熱失活牛胎児血清、100 μg/mlのヘパリン、100 μ
g/mlのゲンタマイシンを補給したM199培地中で、フィブ
ロネクチン(50 μg/ml) で前もって塗布した組織培養プ
レートで低継代数( ２〜５）まで培養した（Dustin,M.
L. ら、J.Cell.Biol.107:321-331(1988))。細胞を回収
する24時間前に、１μg/mlのE.coliリポ多糖（内毒素)
を添加することにより、LPS 処理を行った。５U/mlのrI
L/1 β(Genentech,CA)の添加によりサイトカイン刺激を
行った。

【０１１６】二色蛍光研究用のHUVEC を溶離するため、
細胞をPBS 、５ミリモルのEDTAで37℃で５〜10分間処理
した。健康なボランティアの全血からデキストラン沈降
により好中球を単離した。フィコール勾配遠心分離、及
び低張性溶解を、English,D.ら(J.Immunol.Methods5:24
9(1974))により記載されたようにして行った。実験操作
の前に、好中球をハンクス平衡塩溶液、10ミリモルのHE
PES pH7.3 、0.5 ％のヒト血清アルブミン(HHHSA) 中で
室温で貯蔵する。 細胞接合実験 二重蛍光細胞複合体アッセイを、Luce,G.G. ら(BioTech
niques 3:270-272(1985)、この文献は参考として本明細
書に含まれる) のプロトコルの改良法により行った。

【０１１７】簡単に言えば、10⁸ 個の好中球をHHHSA 中
で２回洗浄し、HHHSA 中の40μg/mlのヒドロエチジン(H
E,Polysciences) の濾過(0.2μm)溶液10ml中で再度懸濁
させ、試料を穏やかに揺動させながら37℃で35分間イン
キュベートした。HUVEC(2X10 ⁷)をT150cmのフラスコから
PBS 、５ミリモルのEDTAで溶離し、RPMI 1640 、20ミリ
モルのHEPES pH7.3 、５％の熱失活牛胎児血清(RPMTHF
S) 中で３回洗浄し、スルホフルオレセインジアセテー
ト(SFDA,Molecular Probes) の200 μM 溶液10ml中で再
度懸濁させ、37℃で30分間インキュベートした。続い
て、細胞をRPMI 1640 、10ミリモルのHEPES pH7.3 、0.
5 ％のHSA 、５％の熱失活牛胎児血清中で４回洗浄し、
以下のように再度懸濁させた。好中球１X10⁷個の細胞/
ml;HUVEC,2X10⁶個の細胞/ ml。Fcレセプターがモノクロ
ーナル抗体で架橋することを防止するための熱失活ヒト
血清(5％) の存在下でアッセイを行った。適当な抗体を
両細胞型に添加し、室温で25分間プレインキュベートし
た。

【０１１８】好中球(150μl)及びHUVEC(250 μl)を24ウ
ェルプレート( ファルコン) に添加し、下記の実験プロ
トコルを使用した。旋回振とう器(New Brunswick Scien
tific,NJ) で75rpm で振とうしながら、全インキュベー
ションは37℃であった。５分間のプレインキュベーショ
ン、1X10^-7M のfMLP添加、10分間のインキュベーショ
ン。溶液を３回ピペットに通した（小凝集物は沈降し得
る）後、複合体を回収し、EPICS V(Coulter,Hialeah,F
L) またはFACScan(Becton Dickinson) を備えたフロー
サイトメトリにより二つの着色複合体中に存在するHUVE
C の比率( ％) として定量した。

【０１１９】精製タンパク質への細胞結合 精製したＭａｃ−１またはＬＦＡ−１を、0.1 ％〜0.01
％の範囲のオクチルグルコシド洗剤濃度を含む20ミリモ
ルのトリスpH7.4 、150 ミリモルのNaCl、２ミリモルの
MgCl₂ 中でタンパク質含量(SDS-PAGE 及びラジオイムノ
アッセイ(Dustin,M.L.ら、Nature341:619-624(1989) に
より判断した) に応じて1/8 から1/120まで希釈し、35m
mのペトリ皿の全表面上に、60mmのペトリ皿上の40μl
の境界を定めたスポットとして、または96ウェルプレー
ト(Linbro-Itertek)の夫々ウェルについて50μl 中に室
温で90分間にわたって塗布した(Staunton,D.E.,Nature3
39:61-64(1989)) 。プレート及び皿を遮断し、続いてPB
S,２ミリモルのMgCl₂ 、0.5 ％のHSA(PBSMH)で３回洗浄
し、続いてPBSMH 中で37℃で２時間インキュベートし
た。Ｍａｃ−１へのCOS 細胞接着アッセイに関して、Ｍ
ａｃ−１の低部位密度(<500 部位/ μm²) を使用して、
COS 細胞表面のＭａｃ−１の内因性リガンドの発現によ
るバックグラウンド細胞結合を避けた。この部位密度
は、ＩＣＡＭ−１を発現するCOS 細胞が接着することを
可能にしたが、ベクター単独で形質移入されたCOS 細胞
の結合を支持しなかった。

【０１２０】96ウェルプレートアッセイに関して、刺激
されなかったHUVEC 、IL-1ベータで18時間またはLPS で
24時間刺激したHUVEC を、PBS 、５ミリモルのEDTAで組
織培養プレートから溶離し、HHHSA 中で２回洗浄し、10
⁶ 個の細胞/ mlまで再度懸濁させ、50μCi/ mlのCr(San
chez-Madrid ら、J.Exp.Med.158:1785-1803(1983))で37
℃で１時間にわたってラベルし、HHHSA 中で２回洗浄
し、PBSMH+0.2 ％のグルコース中で２回洗浄し、そして
Ｍａｃ−１処理プレートと一緒に、適当な抗体と共に室
温で25分間プレインキュベートした。HUVEC(10⁶ 個の細
胞/ ml、50μl)を夫々のウェルに添加し、結合アッセイ
を室温で１時間行った。未結合の細胞を、26ゲージニー
ドルを使用する強力アスピレーション洗浄操作(Dustin,
M.L.ら、Nature341:619-624(1989))により除去した。結
合細胞を0.2MのNaOHまたはPBS 、25ミリモルのEDTAで溶
離し、γ線により定量した。結合緩衝液としてRPMI 164
0 、20ミリモルのHEPES pH7.3 、５％のFCS 、0.1 ％の
HSA に代え、細胞をＭａｃ−１基質上に300rpmで５分間
遠心分離し、インキュベーションを37℃で行い、２回の
みのアスピレーション洗浄を行った以外は、同じプロト
コルをＬ細胞について使用した。

【０１２１】35mm及び60mmのペトリ皿アッセイに関し
て、形質移入されたCOS 細胞またはＬ細胞を、PBS 、５
ミリモルのEDTAまたはRPMI、10ミリモルのEDTAで組織培
養プレートから溶離した。COS 細胞をHHHSA 中で２回洗
浄し、HHHSA 中で8X10⁵ 個の細胞/ mlまで再度懸濁さ
せ、50μCi/ mlのCr(Sanchez-Madrid ら、J.Exp.Med.15
8:1785-1803(1983))で１時間にわたってラベルした。過
剰のラベルを洗浄して除き、細胞をPBS 、1.5 ミリモル
のMgCl₂ 、0.5 ミリモルのCaCl₂ 、0.2 ％のグルコー
ス、0.5 ％のHSA 中で8X10⁵ 個の細胞/ mlまで再度懸濁
させた。Ｌ細胞をPBS、２ミリモルのMgCl₂ 、５％のFCS
、0.1 ％のHSA で３回洗浄した。細胞を適当な抗体と
共に室温で30分間プレインキュベートし、ペトリ皿に添
加し、37℃で50分間インキュベートした。未結合のCOS
細胞またはＬ細胞を、結合緩衝液１mlを添加して連続３
回洗浄して除去し、次いでプレートを横切って穏やかに
回転させた。COS 細胞実験の場合、洗浄した後、プレー
トを結合細胞に関して目視検査し、定性的に評価し、接
着集団を１mlのPBS 、25ミリモルのEDTAで溶離し(37 ℃
で15分間) 、γ線により定量した。Ｌ細胞実験に関し
て、洗浄した後、結合細胞を、夫々の実験箇所で４〜５
の高出力の光学顕微鏡フィールド中で細胞の数を目視で
数えることにより定量した。この数を割ってフィールド
当たりの細胞のインプット数とし、細胞結合率（％）を
得た。

【０１２２】フローサイトメトリ HHHSA 50μl 中の0.5-1.0X10⁵ 個の細胞を、抗体上澄液
50μl または抗体腹水の1/200 希釈液50μl を含むＶ形
底部のマイクロタイタ・プレートに添加した。そのプレ
ートをテープでシールし、ダイナテク(Dynatech)プレー
トシェーカーで４℃で45分間振とうした。細胞をペレッ
トにし(2000rpm、２分間、４℃) 、HHHSA で３回（150
μl)洗浄し、HHHSA 中の精製FITC接合ヤギ抗マウスIgG
Ｌ鎖＋Ｈ鎖抗血清(Zymed,CA)の1/20希釈液100 μl 中で
再度懸濁させた。プレートを再度シールし、４℃で30分
間振とうした。細胞をHHHSA 中で２回洗浄し、PBS 、５
％のFCS 中で１回洗浄し、PBS200μl 、2.5 ％のFCS 、
１％のパラホルムアルデヒド中で再度懸濁させた。試料
をEPICS V フローサイトメトリで分析した。

【０１２３】試薬 全ての化学試薬は最高の等級のものであり、下記のもの
を除いてSigma Chemical Co.( セントルイス、MO) から
購入した。rIL-1 β(Genentech,CA)、HE(Polysciences,
ワリントン、PA) 、SFDA(Molecular Probes)、Na₂ ⁵¹CrO
₄ 及びNa¹²⁵I(Amersham,IL) 、デキストラン-500(Pharm
acia, スウェーデン) 、牛胎児血清(Flow Laboratories
またはJR Scientific)、内皮細胞増殖因子(Chemicon In
ternational,ロサンジェルス、CA) 、HSA(Alpha Corpor
ation,ロサンジェルス、CA) 、FITCヤギ抗マウスAb(Zym
ed,CA)、プロテインＡ(Pharmacia, スウェーデン) 、ヨ
ードゲン(Pierce)、トリトンX-100(DuPont、ウィルミン
トン、DE) 、CsCl (BRL)、ヒポキサンチン(GIBCO,NY)。

【０１２４】実施例２ 精製ＩＣＡＭ−１へのＭａｃ−１形質移入体及びＬＦＡ
−１形質移入体の接着 本発明者に好中球のＭａｃ−１がＩＣＡＭ−１に結合す
ることを示唆したSmith,C.W.らの研究(J.Clin.Invest.8
3:2008-2017(1989))は、好中球の複数の接着レセプタ
ー、例えば好中球発現に有意な量のＬＦＡ−１及びＭａ
ｃ−１の両方の存在により複雑にされる。上記の研究は
精製タンパク質形質移入体細胞結合アッセイを使用し、
この場合、夫々のリガンド対が接着に関して独立に調べ
られた(Larson,R.S.ら、Cell Reg.1:359-367(1990)、こ
の文献は参考として本明細書に含まれる) 。

【０１２５】共通のβ−サブユニット及びＭａｃ−１ま
たはＬＦＡ−１のα−サブユニットに関してｃＤＮＡで
同時形質移入されたCOS 細胞を、上記の方法を使用し
て、プラスチック基質に塗布された精製ＩＣＡＭ−１へ
の結合について分析した。表面発現は、免疫蛍光フロー
サイトメトリにより測定して、ＩＣＡＭ−１の場合には
平均30％であり、ＬＦＡ−１の場合には平均40％であっ
た。Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１を発現する形質移入され
たCOS 細胞は精製ＩＣＡＭ−１に結合したが( 図１）、
β鎖単独で形質移入された細胞は結合しなかった。ＬＦ
Ａ−１、Ｍａｃ−１及びＩＣＡＭ−１のモノクローナル
抗体は付着を抑制したので接着は特異的であり、一方、
CD29のサル相同体を結合する対照モノクローナル抗体は
結合を抑制しなかった。

【０１２６】図１に於いて、ＬＦＡ−１またはＭａｃ−
１のα鎖及び共通のβ鎖のｃＤＮＡで同時形質移入され
たCOS 細胞を、⁵¹Crでラベルし、次いで細胞及びＩＣＡ
Ｍ−１被覆基質の両方を下記のモノクローナル抗体で前
処理した。対照(TS2/16)、ＬＦＡ−１(TS1/22)、Ｍａｃ
−１(LPM19c)、ＩＣＡＭ−１(R6.5 及びRR1/1)。続い
て、細胞をＩＣＡＭ−１で被覆した35mmのペトリ皿の上
に37℃で１時間にわたって沈降させた。プレートをピペ
ット操作により４回洗浄し、結合細胞を取り出し、γ線
で定量した。⁵¹Crでラベルする前に、小比率の細胞をＬ
ＦＡ−１(TS1/22)モノクローナル抗体またはＭａｃ−１
(LM2/1) モノクローナル抗体で染色し、陽性細胞の比率
( ％) をフローサイトメトリにより測定した。そのデー
タを、結合細胞の比率を陽性細胞の比率で割ることによ
り表面発現に関して規格化した。規格化しないと、β鎖
単独、Ｍａｃ−１、及びＬＦＡ−１で形質移入されたCO
S 細胞は、夫々細胞の７％、30％、及び40％で発現に関
して陽性であった。そのデータは三つの別々の実験の平
均であり、誤差バーは平均の標準偏差を表す。

【０１２７】Ｍａｃ−１形質移入体の接着は弱く（ＬＦ
Ａ−１形質移入体の場合の75％に較べて44％の結合) 、
37℃で起こったが23℃では起こらず、一方、ＬＦＡ−１
で形質移入されたCOS 細胞は23℃でＩＣＡＭ−１に結合
した。実施例３ 官能性Ｍａｃ−１の免疫アフィニティ精製 Ｍａｃ−１とＩＣＡＭ−１の間の相互作用の確証を更に
得るため、上記の相互アッセイを使用してＩＣＡＭ−１
を有する細胞が精製Ｍａｃ−１に結合するか否かを測定
した。官能性である形態のＬＦＡ−１を得るのに使用し
た操作の改良型（この場合、α鎖及びβ鎖は非共有結合
で混在したままである）(Dustin,M.L.ら、Nature341:61
9-624(1989))を使用してＭａｃ−１を上記のようにして
精製した。

【０１２８】末梢血白血球をMg²⁺の存在下でトリトンX-
100 に溶解し、Ｍａｃ−１α／β複合体を上記のように
してLM2/1 モノクローナル抗体アフィニティカラムに結
合した。トリトンX-100 を透析可能な洗剤オクチル−β
−Ｄ−グルコシドと交換した。種々の塩、２価カチオン
濃度及びpHの溶離条件を試験し、収率及びヘテロダイマ
ーを再沈する能力について最適化した。最適の緩衝液は
50ミリモルのトリエチルアミンpH10.0、300 ミリモルの
NaCl、及び２ミリモルのMg²⁺を含んでいた。この操作に
より得られたＭａｃ−１は実質的に純粋であり、160,00
0 及び95,000のMrの二つのバンドで還元SDS-PAGEで移動
し、これは従来の観察(Mller,L.J. ら、Immunol.138:23
81-2383(1987))と一致した。精製物の抗βモノクローナ
ル抗体TS1/18による免疫沈澱はヘテロダイマーを生じ、
これは溶離後に二つの鎖が混在したままであったことを
示す。この物質は補体レセプター３活性を有していた。
何となれば、それはiC3b被覆赤血球に特異的に結合した
が、抗Forsmann抗体(Diamond,M.S. ら、Leukocyte Typi
ng IV,Knapp.W.ら編集、オクスフォード大学、ロンド
ン、570-574 頁(1989)、この文献は参考として本明細書
に含まれる) のみで被覆された赤血球に結合しなかった
からである。約500 μg の無傷のＭａｃ−１を白血球10
g から回収した。

【０１２９】実施例４ 精製Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ｃＤＮ
Ａで形質移入された細胞の接着 ＩＣＡＭ−１を有する細胞がＭａｃ−１と相互作用する
か否かを試験するために、COS 細胞をＩＣＡＭ−１ｃＤ
ＮＡで形質移入し、Ｍａｃ−１被覆基質上に沈降させ
た。形質移入されたCOS のＩＣＡＭ−１の表面発現は平
均50〜60％であり、一方、ベクターで形質移入されたCO
S 細胞は発現を示さなかった。これを、ベクター単独ま
たはＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡで形質移入されたCOS 細胞、
またはＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡで形質移入されなかったＬ
細胞もしくはＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡで形質移入されたＬ
細胞の蛍光強度を分析することにより測定した。細胞を
ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（RR1/1)、FTTCヤギ−
抗マウスIgG と共にインキュベートし、フローサイトメ
トリにかけた。ＩＣＡＭ−１を発現するCOS 細胞は精製
Ｍａｃ−１に接着したが、一方、ベクター単独で形質移
入された細胞は接着しなかった。これを実証するため、
COS 細胞をＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡまたはベクター単独で
形質移入し、35mmのペトリ皿中で37℃で50分間で精製Ｍ
ａｃ−１のスポットの上に沈降させた。細胞及び皿を対
照のモノクローナル抗体(TS2/16)、Ｍａｃ−１のモノク
ローナル抗体(LPM19c)、またはＩＣＡＭ−１のモノクロ
ーナル抗体(R6.5 及びRR1/1)で20分間前処理した。イン
キュベートした後、プレートをパスツールピペットで３
回洗浄して未結合の細胞を除去した。結合はＭａｃ−１
αのモノクローナル抗体(LPM19c)またはＩＣＡＭ−１の
モノクローナル抗体(R6.5及びRR1/1)で完全に阻止され
たので、結合は特異的であった。

【０１３０】Ｍａｃ−１とＩＣＡＭ−１の間の相互作用
の強さを更に定量的に測定するため、投薬量応答分析を
行った。ＩＣＡＭ−１を発現するCOS 細胞の比率（％）
に於ける実験間の変化及び細胞間のＩＣＡＭ−１発現の
レベルの不均一性のために、細胞間でヒトＩＣＡＭ−１
発現を発現する安定な形質移入体、マウスＬ細胞中でヒ
トＩＣＡＭ−１を発現する安定な形質移入体を、Chen,
C.A. ら著、BioTechniques 6(7):632-637(1988)( この
文献は参考として本明細書に含まれる) に記載されたよ
うにして発生させた。

【０１３１】100 ％のＬ細胞が多量のヒトＩＣＡＭ−１
を発現するコロニーを選択した。滴定実験を行い、この
場合ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞を広範囲のＭａｃ−１部位密
度で塗布した基質に結合させた（図２）。図２に於い
て、ＩＣＡＭ−１⁺ のＬ細胞またはＩＣＡＭ−１^- のＬ
細胞（形質移入されなかったもの）を⁵¹Crでラベルし
た。抗体阻止試験のために、ウェルプレート及び細胞の
両方を下記のモノクローナル抗体で前処理した。対照(M
1/42)、Ｍａｃ−１(LPM19c)、及びＩＣＡＭ−１(R6.
5)。細胞をＭａｃ−１を塗布したウェルに添加し、37℃
で45分間インキュベートした。未結合の細胞を、４回洗
浄した後、微小ニードルアスピレーション（26ゲージ)
により除去した。結合細胞を0.2 ＮのNaOHで取り出し、
γ線で定量した。部位密度を平行して測定し、¹²⁵I-LM2
/1によるラジオイムノアッセイにより定量した。全ての
実験を３回行い、示されたデータは三つの別々の実験の
平均である。誤差バーは標準偏差を表す。

【０１３２】ＩＣＡＭ−１を発現するＬ細胞は投薬量に
依存する様式でＭａｃ−１に接着し、有意な接着がみら
れる前に約250 の部位/ μm²の限界値を有していた。Ｍ
ａｃ−１αのモノクローナル抗体(LPM19c)で前処理され
たプレート、ＩＣＡＭ−１のモノクローナル抗体(RR1/1
及びR6.5) で前処理された細胞、及び形質移入されなか
ったＬ細胞は付着しなかったので、その接着は特異的で
あった。

【０１３３】低緊縮性の洗浄プロトコルを使用すること
のために、ＬＦＡ−１を塗布した基質及びＭａｃ−１を
塗布した基質に関して平行実験を行って相対的な結合活
性の相違を調べた( 図３）。基質に結合したＭａｃ−１
及びＬＦＡ−１の量を、共通β鎖のモノクローナル抗体
によるラジオイムノアッセイにより測定した。結合率
（％）を、下記の方法で測定した。ＩＣＡＭ−１⁺ のＬ
細胞を、Ｍａｃ−１（図３中、白丸）及びＬＦＡ−１
（図３中、黒丸）のスポットで塗布された60mmのペトリ
皿に37℃で50分間にわたって添加した。未結合の細胞を
３回の洗浄によりパスツール・ピペットで除去した。結
合細胞を、夫々の実験箇所に関して４〜５の高出力の光
学顕微鏡中で細胞の数を目視で数えることにより定量し
た。この数を割って細胞のインプット数とし、細胞結合
率（％）を得た。インテグリンを塗布したスポットの外
側の結合は１〜３％の間で変化した。¹²⁵I-TSI/18(抗CD
18) を使用して部位密度を測定した。二つの実験の内の
一つの代表的な実験が図示され、誤差バーは標準偏差を
表す。

【０１３４】ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞は、わずかに高い結
合活性でＬＦＡ−１基質に接着した。何となれば、精製
Ｍａｃ−１に関する結合等温線は高い部位密度にシフト
されたからである。Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細
胞の結合は、ＬＦＡ−１への結合よりもさらに温度感受
性であった（図４）。図４に於いて、ＩＣＡＭ−１⁺Ｌ
細胞を、示された温度で10分間プレインキュベートし、
次いでＭａｃ−１及びＬＦＡ−１のスポットを含む60mm
のペトリ皿に添加した。皿を適当な温度で50分間インキ
ュベートし、パスツール・ピペットにより３回洗浄し、
高出力の倍率で接着細胞を目視で数えた。¹²⁵I-TSI/18
(抗CD18) によるラジオイムノアッセイにより測定し
て、ＬＦＡ−１の部位密度は803 部位/ μm²であり、Ｍ
ａｃ−１の部位密度は738 部位/ μm²であった。結合率
は上記のようにして測定した。図４中に、二つの実験の
内の一つの代表的な実験が示され、そのデータは二つの
実験の平均であり、誤差バーは標準偏差を表す。＊印
は、ＩＣＡＭ−１形質移入体が４℃で精製Ｍａｃ−１に
結合しなかったことを示す。

【０１３５】基質に対するＬＦＡ−１及びＭａｃ−１の
均等な部位密度にもかかわらず、細胞は室温でＬＦＡ−
１に強く接着するが、Ｍａｃ−１に弱く接着し、一方、
37℃では量的な接着に殆ど差がないか、または全く差が
なかった。実施例５ 精製Ｍａｃ−１へのHUVEC の接着 刺激されたHUVEC がＩＣＡＭ−１に依存性の様式でＭａ
ｃ−１に接着したことを確かめるために、Ｍａｃ−１基
質に結合するそれらの能力を試験した。HUVECは、IL-1
βまたはLSP で18〜24時間刺激された場合、高緊縮性の
洗浄条件下で精製Ｍａｃ−１に結合することがわかった
( 図５）。

【０１３６】図５に於いて、IL-1β(5U/ml、18時間) 及
びLSP(1 μg/ml、24時間) で刺激され、または刺激され
なかったHUVEC を⁵¹Crでラベルし、Ｍａｃ−１を塗布し
た96ウェルプレートに添加し、１時間インキュベートし
た。未結合の細胞を微小ニードルアスピレーションによ
り高緊縮性で洗浄した。結合細胞を回収し、γ線により
定量した。細胞及びプレートを下記のモノクローナル抗
体と共に室温で25分間プレインキュベートすることによ
り抗体阻止を行った。対照(W6/32) 、Ｍａｃ−１(LMP19
c)、ＩＣＡＭ−１(R6.5 及びRR1/1)。これらの実験を３
回行い、図示されたデータは三つの別々の実験の平均で
ある。誤差バーは標準偏差を示す。

【０１３７】接着はＩＣＡＭ−１のモノクローナル抗体
（LPS に関して82％、IL-1βに関して66％) 及びＭａｃ
−１のモノクローナル抗体( 両方の場合とも>95 ％) に
より抑制され、対照モノクローナル抗体により抑制され
なかったので、接着は特異的であり、主にＩＣＡＭ−１
依存性であった。少量のＩＣＡＭ−１を発現した未刺激
のHUVEC(Dustin,M.L. ら、J.Immunol.137:245-254(198
6))はこの緊縮性の洗浄で精製Ｍａｃ−１に殆ど付着し
なかった。

【０１３８】実施例６ Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１への接着の阻止に於けるＩＣ
ＡＭ−１モノクローナル抗体間の相違 上記の相互接着アッセイは、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１
の両方がＩＣＡＭ−１に結合し得ることを示した。この
結果は、ＩＣＡＭ−１のどのエピトープがＬＦＡ−１及
びＭａｃ−１との相互作用に関与するかという疑問をか
りたてた。この疑問を解くため、ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞
ＩＣＡＭ−１をＭａｃ−１のリガンドとして試験した。

【０１３９】これを行うため、ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞
を、飽和濃度の示されたＩＣＡＭ−１モノクローナル抗
体で４℃で20分間前処理した。次いで細胞を、Ｍａｃ−
１またはＬＦＡ−１でスポットされた60mmのペトリ皿に
添加し、37℃で50分間インキュベートした。未結合の細
胞を、パスツール・ピペットを使用して３回の洗浄で除
去した。細胞結合率を上記のようにして測定した（図
６）。そのデータは二つの別々の実験の平均であり、誤
差バーは標準偏差を示す。

【０１４０】モノクローナル抗体阻止データ（図６）
は、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１に対するＩＣＡＭ−１の
相互作用の部位に関する相違を示唆する。モノクローナ
ル抗体R6.5) のみが、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１で塗布
された基質へのＩＣＡＭ−１形質移入されたＬ細胞の結
合をかなり抑制できたが、一方、ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ
−１作用（Lo,S.K. ら、J.Immunol.143:3325-3329(198
9);Makgoba,M.W.ら、Nature331:86-88(1988);Marlin,S.
D.,Cell 51:813-819(1987);Rothlein,R. ら、J.Immuno
l.137:1270-1274(1986);Smith,C.W.ら、J.Clin.Invest.
82:1746-1756(1988)) を阻止するその他のモノクローナ
ル抗体(RR1/1、LB-2、84H10 、CBRIC1/4) はＭａｃ−１
への結合を減少しなかった。

【０１４１】更に、一つの新規なモノクローナル抗体(C
BRIC1/1)はＭａｃ−１−ＩＣＡＭ−１接着を部分的に阻
止した。別の証拠は、Ｍａｃ−１とＬＦＡ−１はＩＣＡ
Ｍ−１と同等には相互作用しないことを示す。Larsonら
(Cell Reg.1:359-367(1990) 、この文献は参考として本
明細書に含まれる) は、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１を発
現するCOS 細胞形質移入体がＩＣＡＭ−１塗布基質に接
着され、高緊縮性条件下で微小ニードルアスピレーショ
ンにより洗浄される場合に、ＬＦＡ−１⁺ 細胞のみが付
着したままであることを示していた。しかしながら、本
明細書に記載した実験は、細胞が更に穏やかに洗浄され
る場合に、Ｍａｃ−１が形質移入されたCOS 細胞及びＬ
ＦＡ−１が形質移入されたCOS 細胞の両方が結合された
ままであることを明らかにする。こうして、ＬＦＡ−１
とＩＣＡＭ−１の相互作用は、より一層剪断抵抗性であ
ることが明らかである。この現象は、一部、結合活性の
相違により説明し得る。Ｍａｃ−１またはＬＦＡ−１へ
のＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞結合について平行接着アッセイ
を行う場合、Ｍａｃ−１より少量のＬＦＡ−１が細胞接
着を支持することがわかる。注意すべき点は、共通のβ
−サブユニットのモノクローナル抗体がＭａｃ−１及び
ＬＦＡ−１の密度を定量するのに使用され、そしてその
モノクローナル抗体が、混在されているが自由ではない
β−サブユニットと反応する（Kishimoto,T.K.ら、Cell
50:193-202(1987))が、プラスチック上にあってＩＣＡ
Ｍ−１に結合し得る活性立体構造のタンパク質の比率が
確かではないことである。

【０１４２】実施例７ HUVEC との接合に及ぼす好中球の走化性刺激の効果 好中球の走化性刺激は、未刺激の好中球の基準の複合体
形成よりもHUVEC との接合にかなりの増加をもたらした
( 表２）。刺激後の好中球と接合されるHUVECの数は３
〜４倍増加した。抗ＬＦＡ−１αモノクローナル抗体で
あるTS1/22を添加した場合、複合体の形成はわずかであ
るが統計上有意に抑制されなかった。Ｍａｃ−１αモノ
クローナル抗体のモノクローナル抗体を添加した場合、
刺激細胞複合体のかなりの抑制(73 ％) があった。抗Ｌ
ＦＡ−１モノクローナル抗体と抗Ｍａｃ−１モノクロー
ナル抗体の組み合わせまたは共通ベータ鎖の抗体は、最
大の抑制(88 ％〜98％) を示した。R6.5Fab フラグメン
ト及びRR1/1 Fab₂フラグメントは複合体形成を48.3％減
少した。この抑制はＬＦＡ−１抗体単独の抑制より大き
かったので、これらの結果は、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−
１の両方がＩＣＡＭ−１と相互作用したことを示す。CD
18依存性の接着はＩＣＡＭ−１のモノクローナル抗体だ
けでは抑制し得なかったので、ＬＦＡ−１及び／または
Ｍａｃ−１は別のリガンドと相互作用していることが明
らかであった。ＬＦＡ−１に関して、ＩＣＡＭ−１は有
力な可能性があるが、Ｍａｃ−１がＩＣＡＭ−２に結合
することは明らかではなく、こうしてその他の一種以上
の内皮細胞表面カウンター−レセプターが関与し得る。

【０１４３】表２に於いて、HEで赤に染色された好中球
(1.5X10⁶) 及びSFDAで緑に染色されたHUVEC(6X10⁵)を再
度懸濁させ、下記のモノクローナル抗体で別々に前処理
した。対照(W6/32) 、ＩＣＡＭ−２(CBRIC2/1)、ＬＦＡ
−１(TS1/22)、Ｍａｃ−１(LPM19c)、CD18(YFC51.1) 、
ＩＣＡＭ−１(R6.5 Fab 及びRR1/1 Fab'₂)。細胞を24ウ
ェルプレート中で混合し、37℃でプレインキュベートし
た。fMLP(10 ^-7 M) を添加し、細胞を37℃で75rpm で10
分間攪拌した。得られた懸濁液を直ちにフローサイトメ
トリにより分析した。そのデータは好中球との異型複合
体中に見られるHUVEC の比率( ％) として表され、刺激
好中球の接合の抑制はfMLPで刺激されなかった複合体の
基準レベルに対して表される。プールＴ試験を使用して
有意差を測定した。ＮＳは、これらの値が対照と統計上
異なった(p>0.05)ことを意味する。括弧内の数値は標準
偏差を示す。

【０１４４】 表２ fMLPで刺激された好中球と24時間LPS 培養されたHUVEC の間の複合体形成 モノクローナル抗体 fMLP 複合体中のHUVEC(％) ｎ 接着抑制率( ％) ナシ − 12±3 6 − CD18 − 9±1 3 25.0 NS ナシ ＋ 42±6 5 − 対照 ＋ 41±5 7 0.3 NS ＩＣＡＭ−２ ＋ 44±6 5 0.6 NS ＬＦＡ−１ ＋ 38±6 5 14.4 NS Ｍａｃ−１ ＋ 21±6 7 73.0(p<0.005) CD18 ＋ 16±5 5 88.0(p<0.0005) Mac-1 + LFA-1 ＋ 13±3 5 98.3(p<0.0005) ＩＣＡＭ−１ ＋ 27±3 8 48.3(p<0.0005) 実施例８ Ｍａｃ−１とＩＣＡＭ−１との間の相互作用に関する結
論 上記の実験は、精製Ｍａｃ−１がＩＣＡＭ−１依存性の
細胞接着を媒介したことを実証し、また逆に、精製ＩＣ
ＡＭ−１がＭａｃ−１依存性の細胞接着を媒介したこと
を実証することにより、Ｍａｃ−１がＬＦＡ−１(Marli
n,S.D.,Cell 51:813-819(1987)) のようにＩＣＡＭ−１
のカウンター・レセプターであることを立証する。

【０１４５】推定のカウンター・レセプターの特異的な
ｃＤＮＡで形質移入された細胞を使用して、別のレセプ
ター−リガンド相互作用に関連する複雑な問題を排除し
た。これらの結果は、ＩＣＡＭ−１⁺ 形質移入体及びＭ
ａｃ−１⁺ 形質移入体が夫々精製されたＭａｃ−１及び
ＩＣＡＭ−１を結合することを示す。これらの結果が実
験系の人工物であるという可能性を除外するために、刺
激された内皮細胞と精製Ｍａｃ−１との間のＭａｃ−
１、ＩＣＡＭ−１依存性の接着を実証した。

【０１４６】そのようにしてＩＣＡＭ−１⁺ HUVEC と接
合された細胞からの刺激されたＭａｃ−１⁺ 末梢血好中
球はＭａｃ−１モノクローナル抗体及びＩＣＡＭ−１モ
ノクローナル抗体で抑制されたので、細胞−細胞状況下
のＭａｃ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用がまた示された。
Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１の両方へのＩＣＡＭ−１の結
合は、免疫グロブリンのような分子が一種より多くのイ
ンテグリンに接着し得ることを示した。しかしながら、
二種の姉妹白血球インテグリンとＩＣＡＭ−１の間の相
互作用は同一ではない。

【０１４７】ＬＦＡ−１とＭａｃ−１の相互作用を区別
するその他の特徴は、接着に及ぼす温度の顕著な効果で
ある。ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞及びCOS 細胞は室温で精製
固相ＬＦＡ−１に強く結合するが( 図４）、精製Ｍａｃ
−１にかなり接着するのには厳守すべき37℃の温度要件
がある( 図４）。また、ＩＣＡＭ−１を有する細胞と精
製Ｍａｃ−１との相互作用は、ＬＦＡ−１との相互作用
よりもエネルギー依存性であることが明らかである(Sta
unton,D.E.,Nature339:61-64(1989)) 。Ｍａｃ−１とＩ
ＣＡＭ−１の相互作用の温度及びエネルギー依存性は、
細胞表面で、より大きなＩＣＡＭ−１のクラスター形成
(clustering)がなされることの必要なため、または、よ
り一層緊密な細胞−基質の付着の必要なことのためであ
り得る。ＬＦＡ−１との強い相互作用と一致して、ＩＣ
ＡＭ−１を発現する形質移入細胞は、Ｍａｃ−１基質よ
りもＬＦＡ−１塗布基質上で、より一層広がり平らにな
ることが観察される。

【０１４８】ＩＣＡＭ−１へのＭａｃ−１の結合は、Ｍ
ａｃ−１が内皮細胞表面カウンター−レセプターと相互
作用することを直接実証する。この知見は、内皮細胞へ
の好中球接着がＭａｃ−１のモノクローナル抗体により
抑制されること(Anderson,D.C.ら、J.Immunol.137:15-2
7(1986);Harlan,J.M. ら、Blood66:167-178(1985);Zimm
erman,G.A.ら、J.Clin.Invest.81:531-537(1988)、並び
に未刺激の内皮細胞(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.8
2:1746-1756(1988)) またはＩＣＡＭ−１を含む平面状
の膜(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.83:2008-2017(198
9)) へのfMLPで刺激された好中球のＭａｃ−１及びＬＦ
Ａ−１依存性の接着がＩＣＡＭ−１のモノクローナル抗
体(R6.5)により完全に阻止されることを示す従来の研究
を説明する。

【０１４９】対照的に、ＩＣＡＭ−１はＭａｃ−１のリ
ガンドではないことが報告されていた(Lo,S.K.ら、J.Im
munol.143(10):3325-3329(1989))。その研究に於いて、
フォルボールエステルで刺激された好中球は、ＬＦＡ−
１、Ｍａｃ−１及びＩＣＡＭ−１依存性であるように未
刺激の内皮細胞に接着し、その結果は本明細書に示され
たデータと一致する。しかしながら、このグループはＬ
ＦＡ−１のみがＩＣＡＭ−１と相互作用すると結論し
た。何となれば、ＬＦＡ−１モノクローナル抗体及びＩ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体(LB-2 、84H10)による抑
制は相加性ではなく、一方、Ｍａｃ−１モノクローナル
抗体及びＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体による抑制は
相加性であるからである。先の論文の相違は、モノクロ
ーナル抗体選択の不一致により一部説明し得る。ここ
で、R6.5モノクローナル抗体はＭａｃ−１−ＩＣＡＭ−
１相互作用及びＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用の両
方を阻止したが、一方、LB2 及び84H10 モノクローナル
抗体はＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１結合のみを抑制するこ
とが示される( 図６）。

【０１５０】本明細書に示されたモノクローナル抗体阻
止データは、ＩＣＡＭ−１分子の領域を区別するための
mAb エピトープを地図作製する突然変異誘発研究(Staun
ton,D.E.ら、Cell 61:243-254(1990))と一致する。RR1/
1 及びLB-2は第一Ｎ末端免疫グロブリン領域にマッピン
グされるが、一方、R6.5は第二領域にマッピングされ
る。また、そのデータは生体内実験(Barton,R.W.ら、J.
Immunol.143:1278-1282(1989))と一致し、これらの実験
は、ＬＦＡ−１のモノクローナル抗体(R3.1)ではなくCD
18のモノクローナル抗体(R3.3)またはＩＣＡＭ−１のモ
ノクローナル抗体(R6.5)で前処理された後のフォルボー
ルエステルで炎症にされたウサギの肺中の果粒細胞浸潤
の減少を示す。これらの知見は、刺激好中球が接着のＭ
ａｃ−１−ＩＣＡＭ−１依存性経路を利用して炎症内皮
への生体内付着を媒介し得ることを示す。

【０１５１】本明細書に示された実験は、未刺激の内皮
細胞(Lo,S.K.ら、J.Immunol.143(10):3325-3329(1989))
及び刺激内皮細胞の表面に於けるＩＣＡＭ−１とは異な
るＭａｃ−１のカウンターレセプターとしての可能性と
一致する。本発明で使用したアッセイでは、内皮細胞Ｉ
ＣＡＭ−１は好中球のＭａｃ−１依存性接着の全てをそ
れ自体では相殺し得ない。高緊縮性の洗浄条件下の精製
Ｍａｃ−１への刺激HUVEC の接着は、ＩＣＡＭ−１のモ
ノクローナル抗体によりわずかに部分的に(66〜82％)
阻止された( 図５）。更に、この緊縮性では未刺激のHU
VEC はＭａｃ−１に殆ど接着しなかったが、低緊縮性で
洗浄された場合には、精製Ｍａｃ−１への非ＩＣＡＭ−
１依存性のかなりの接着があった。この結果は、未刺激
の内皮細胞へのfMLPで刺激された好中球接着がＩＣＡＭ
−１のモノクローナル抗体により84％阻止されることを
示した論文(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.82:1746-17
56(1988)) と相反する。この不一致は、Ｍａｃ−１の第
二リガンドを誘導し得る未処理のHUVEC の組織培養条件
の相違により説明し得る。

【０１５２】こうして、本発明は、ＩＣＡＭ−１とＭａ
ｃ−１の相互作用を調べるための、多重細胞結合アッセ
イ、精製されたＭａｃ−１及びＩＣＡＭ−１、並びにＭ
ａｃ−１及びＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡで形質移入された
細胞系の使用を記載する。ＩＣＡＭ−１の高い表面密度
を発現する刺激HUVEC は、Ｍａｃ−１及びＩＣＡＭ−１
のモノクローナル抗体により抑制されることがわかるよ
うに人工基質に吸着された免疫アフィニティ精製Ｍａｃ
−１に結合する。ヒトＩＣＡＭ−１を発現する形質移入
されたマウスＬ細胞またはサルCOS 細胞は、特異的な投
薬量依存性の様式で精製Ｍａｃ−１に結合した。Ｍａｃ
−１への付着は、ＬＦＡ−１への付着と較べて、温度感
受性であり、結合活性が低く、異なる系列のＩＣＡＭ−
１モノクローナル抗体により阻止されることがわかっ
た。相互アッセイに於いて、Ｍａｃ−１またはＬＦＡ−
１のα鎖及びβ鎖ｃＤＮＡで同時形質移入されたCOS 細
胞は、免疫アフィニティ精製ＩＣＡＭ−１基質に付着し
た。この接着はＩＣＡＭ−１及びＭａｃ−１またはＬＦ
Ａ−１のモノクローナル抗体により阻止された。二色蛍
光細胞複合体実験は、fMLPで刺激された好中球がＩＣＡ
Ｍ−１、Ｍａｃ−１、及びＬＦＡ−１に依存する様式で
LPS で刺激されたHUVEC に24時間で結合することを示し
た。細胞Ｍａｃ−１及び精製Ｍａｃ−１は細胞ＩＣＡＭ
−１及び精製ＩＣＡＭ−１と相互作用したので、ＩＣＡ
Ｍ−１はＭａｃ−１のカウンターレセプターであるこ
と、及びこのレセプターは刺激好中球と刺激内皮細胞の
間の接着に一部責任を負うことが結論された。

【０１５３】上記の研究は、ＩＣＡＭ−１がＬＦＡ−１
のカウンターレセプターであるだけでなく、Ｍａｃ−１
のカウンターレセプターであることを示す。細胞−細胞
結合研究は、好中球Ｍａｃ−１がHUVEC で発現されたＩ
ＣＡＭ−１と相互作用することを実証する。また、これ
らの知見は、Ｍａｃ−１が内皮細胞の表面のＩＣＡＭ−
１以外の少なくとも一種の別の細胞リガンドと相互作用
することを示す。

【０１５４】実施例９ Ｍａｃ−１結合部位の地図作製 上記のモノクローナル抗体阻止データは、予期しないこ
とに、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１がＩＣＡＭ−１の同じ
結合部位を共有しないことを示唆した。この点を調べる
ため、ＩＣＡＭ−１のアミノ酸置換及び領域欠失を行っ
た。

【０１５５】オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発を、
Kunkel,T.A.(Proc.Natl Acad.Sci.USA,82:488-492(198
5))により記載されたようにして、またPetersonら(Natu
re,329:842-846(1987))により改良されたようにして行
い、これを使用してＩＣＡＭ−１欠失置換を生じた(Sta
unton,D.E.ら、Cell 61:243-254(1990) 、この文献は参
考として本明細書に含まれる) 。

【０１５６】50％の集密度のCOS 細胞を、野生型または
突然変異型のＩＣＡＭ−１を含むベクターまたはベクタ
ー単独６μg を使用してDEAE- デキストラン法(Kingsto
n,R.E.著、Current Protocols in Molecular Biology,G
reene Publishing Associates 、9.0.1-9.9.6(1987))に
より形質移入した。COS 細胞を、アッセイの１日前にト
リプシン−EDTAを使用して懸濁させ、３日目に再度接種
した。精製されたＭａｃ−１もしくはＬＦＡ−１への結
合アッセイまたは免疫蛍光染色のため、形質移入した細
胞を食塩加入リン酸緩衝液(PBS) 、５ミリモルのEDTAで
溶離し(5分間、37℃) 、PBS 、１ミリモルのMgCl₂ 、0.
5nM のCaCl₂ 、0.2 ％のグルコース、0.25％のヒト血清
アルブミンで３回洗浄した。

【０１５７】間接免疫蛍光染色を、モノクローナル抗体
RR1/1(Rothlein,R.M. ら、J.Immunol.137:1270-1274(19
86))、R6.5(Rothlein ら、J.Immunol.141:1665-1669(19
88))、及びCL203(Maio,M. ら、J.Immunol.143:181-188
(1989))を使用して行った。COS 細胞(5X10⁵) を、免疫
アフィニティ精製されたＭａｃ−１及びＬＦＡ−１の分
画スポットで塗布された50mmのペトリ皿に添加し、37℃
で45分間接着させた。未結合の細胞をトランスファーピ
ペットで４回洗浄して除去し、プレートに符号を付け、
結合細胞を３回の独立の観察により計数した。ＬＦＡ−
１及びＭａｃ−１へのＩＣＡＭ−１突然変異体の結合
を、インサートを含まないベクターで形質移入したCOS
細胞への結合(mock)について修正し、モノクローナル抗
体RR1/1 またはCL203(欠失に依存する) によるCOS 細胞
染色率( ％) 及び野生型で得られた結合率( ％) につい
て規格化した。

【０１５８】 ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１へのＩＣＡＭ−１結合に及ぼ
すアミノ酸置換の効果を示すために、Staunton,D.E.
ら、Cell 61:243-254(1990) に記載されているような突
然変異体をつくった。結合アッセイ、免疫蛍光、及び還
元データを図７に記載したように行った。領域１及び２
中でモノクローナル抗体のエピトープの全部を発現しな
い突然変異体を、イタリック体で示し、その指定のため
に下線を施す(Staunton,D.E.ら、Cell 61:243-254(199
0))。領域１中のボールド体の(boldface)突然変異体
は、ＬＦＡ−１への結合を75％以上減少する突然変異体
に相当する。領域３中のボールド体の突然変異は、Ｍａ
ｃ−１への結合にかなりの効果(p<0.05)を有する突然変
異に相当する。小胞体グルコシダーゼインヒビターであ
るデオキシマンノジリマイシンを、精製Ｍａｃ−１への
ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞及びCOS 細胞接着に及ぼすその効
果に関して試験した（図８）。このインヒビターはゴル
ジ装置中で複合炭水化物添加を阻止し、こうしてＮ連鎖
部位を有するタンパク質は高マンノース、エンドＨ感受
性グリコシル化を保持する。細胞を40μg/mlのデオキシ
マンノジリマイシン(CalBiochem)で３日間処理し、次い
でフローサイトメトリにより表面発現について測定し、
接着について測定した。

【０１５９】実施例10 ＩＣＡＭ−１のＭａｃ−１結合部位 上記の形質移入体試験に於いて、ＩＣＡＭ−１のモノク
ローナル抗体間の抑制のパターンがＬＦＡ−１とＭａｃ
−１との間で異なることが予期せずに観察された。ＬＦ
Ａ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用を阻止するＩＣＡＭ−１
の４種のモノクローナル抗体はＭａｃ−１への結合に影
響せず、Ｍａｃ−１への接着を低下する１種のモノクロ
ーナル抗体はＬＦＡ−１への付着を低下せず、そして唯
一のモノクローナル抗体がＭａｃ−１及びＬＦＡ−１の
両方への接着を阻止した。

【０１６０】従来、ＬＦＡ−１に関するＩＣＡＭ−１結
合は、ＩＣＡＭ−１の領域欠失形態を使用して、最初の
二つのＮ末端Ig様領域に局在化されていた。本明細書に
記載した実験では、Ｍａｃ−１に関するＩＣＡＭ−１の
結合部位を局在化した。表３は、ＬＦＡ−１及びＭａｃ
−１へのアミノ酸置換突然変異体の結合を示す。そのデ
ータは２〜３回の独立の実験の平均であり、括弧内の値
は標準偏差を表す。

【０１６１】結合部位を同定するため、オリゴヌクレオ
チド誘導突然変異誘発(Staunton,D.E.ら、Cell 52:925-
933(1988))により生じたＩＣＡＭ−１の領域欠失形態を
COS細胞に形質移入し、免疫蛍光により陽性発現につい
て測定し、精製されたＭａｃ−１及びＬＦＡ−１の分画
スポットへの接着に関して試験した( 図７）。これは、
精製ＬＦＡ−１に結合する能力がIg様領域D3-D5 の欠失
または細胞質テイルの欠失の後に保持されることを確か
めた。しかしながら、Ｍａｃ−１に関する結果は全く異
なっていた。D3が存在する場合にのみ、Ｍａｃ−１への
接着が保持された。D3-D4-D5- 突然変異体及びD3- 突然
変異体の両方が精製Ｍａｃ−１に結合するそれらの能力
を失っていた(>95％) 。細胞質領域の損失またはホスホ
イノシトールグリカンテイルのＩＣＡＭ−１の五つの細
胞外のIg様領域の配置は、Ｍａｃ−１への接着に殆ど影
響せず、D4及びD5の欠失はＭａｃ−１への結合をわずか
に減少した。

【０１６２】ＩＣＡＭ−１のD1がＭａｃ−１との相互作
用に必要とされないことを確かめるため、ＩＣＡＭ−１
のアミノ酸置換突然変異体(Staunton,D.E.ら、Cell 52:
925-933(1988))を、Ｍａｃ−１に接着するそれらの能力
について試験した。これらの突然変異体を、Ig様分子の
構造上の予測に従ってβ鎖を連結するループ中でつくっ
た。ループはIgスーパーファミリィ(Williams ら、Ann.
Rev.Immunol.,6:381-405(1988)) の膜中の分子間接触の
部位として作用すると仮定される。領域立体構造を変え
ないでＬＦＡ−１への結合を最も強く阻止するD1中の二
種の単一アミノ酸置換突然変異体、E34/A 及びQ73/H
は、精製Ｍａｃ−１への接着を低下しない( 表３）。三
種のその他の突然変異体、R13G/EA 、Q58EDS/AKDI 、及
びD60S/KL(これらは三つの異なるモノクローナル抗体エ
ピトープ(Staunton,D.E.ら、Cell 52:925-933(1988))の
損失により判断されるように、D1及びD2の立体構造を乱
した) は全てＬＦＡ−１への結合を阻止するが、Ｍａｃ
−１への結合に影響しなかった。D1中の全てのその他の
突然変異体はＭａｃ−１へのＩＣＡＭ−１接着に影響し
なかった。このデータは、D1がＭａｃ−１への接着に殆
ど役割をもたないことを示し、ＩＣＡＭ−１のD1にマッ
ピングされるモノクローナル抗体((RR1/1 、LB-2、84H1
0)Staunton,D.E. ら、Cell 61:243-254(1990) 、この文
献は本明細書に参考として含まれる) が、Ｍａｃ−１へ
の野生型のＩＣＡＭ−１結合を阻止しないが、それらが
ＬＦＡ−１への接着を種々の程度に低下する(Staunton,
D.E.ら、Cell 61:243-254(1990))ことの理由を説明す
る。

【０１６３】D2中のエピトープ(Staunton,D.E.ら、Cell
61:243-254(1990))を認識するＩＣＡＭ−１のR6.5モノ
クローナル抗体は、Ｍａｃ−１への野生型のＩＣＡＭ−
１接着を約90％低下することが示された。しかしなが
ら、ＩＣＡＭ−１のD2はおそらくＭａｃ−１への接着の
主要な部位を構成しない。N103/K突然変異体［これはD1
及びD2の立体構造を充分に乱してRR1/1 、LB-2、及びR
6.5の結合にかなりの低下を生じる(Staunton,D.E.ら、C
ell 61:243-254(1990))］は、ＬＦＡ−１への結合を排
除するにもかかわらず、Ｍａｃ−１への結合に影響しな
かった。また、R6.5エピトープを完全に破壊するE111GG
A/KAGS突然変異体はＭａｃ−１への接着を低下しない。
D2中のすべてのその他のアミノ酸置換突然変異体はＭａ
ｃ−１またはＬＦＡ−１への接着に殆ど変化を生じなか
った( 表３）。

【０１６４】領域欠失実験は、D3がＭａｃ−１へのＩＣ
ＡＭ−１結合に必要とされることを示す。この知見を確
かめ、展開させるために、D3中のアミノ酸置換突然変異
体をＭａｃ−１への接着に関するそれらの効果について
試験した。三種の突然変異体はＭａｃ−１への接着に顕
著な効果を有していた。D229QR/HLEはＭａｃ−１への結
合を完全に排除したが、一方、E254DE/KEKはそれを約４
倍低下した。この効果は低表面レベルにより生じなかっ
た。何となれば、D229QR/HLE及びE254DE/KEKの両方は野
生型レベルで発現され(Staunton,D.E.ら、Cell 61:243-
254(1990))、ＬＦＡ−１への結合は保持されるからであ
る。潜在的なＮ連鎖グリコシル化部位を除くN240DS/KNA
突然変異体及びN269QSQE/IQAEQ突然変異体は、予期しな
いことに結合を増加した。D3突然変異に関して注意すべ
き点は、エピトープが本明細書でマッピングされる一種
以上のモノクローナル抗体を欠いているので、これらの
突然変異のうちの幾つかが分子の立体構造を総体的に乱
さないことは確かではないことである。しかしながら、
D3中の全ての突然変異はＬＦＡ−１への接着を支持し、
D3に部分的にマッピングされる一種のモノクローナル抗
体、CBRIC1/1は、D229、E254, 及びN269中の突然変異を
含むＩＣＡＭ−１分子でそのエピトープを保持する。

【０１６５】ＬＦＡ−１への結合を阻止する突然変異と
Ｍａｃ−１への結合を阻止する突然変異の比較を行っ
た。E34/A 突然変異体及びD229QR/HLE突然変異体は、β
鎖ＣとＤ(Williams ら、Ann.Rev.Immunol.,6:381-405(1
988)) の間のループ中の、D1及びD3のIg様領域中の相同
位置の変化を生じた。ヒトＩＣＡＭ−１、マウスＩＣＡ
Ｍ−１(Horley ら、EMBO J.,8:1889-2896(1989))、及び
ヒトＩＣＡＭ−２の第一領域中には、ＬＦＡ−１とＩＣ
ＡＭ−１の接触部位として提案されるE34 残基(Staunto
n,D.E.ら、Cell 61:243-254(1990))付近のペプチド配列
に強い保存がある。D1中のこの重要な残基は、Ｍａｃ−
１への結合を阻止する突然変異D229QR/HLEの部分である
D3中の保存Q230( ヒト及びマウスＩＣＡＭ−１の間) 残
基と並んでいる。

【０１６６】突然変異、N240DS/KNA及びN269QSQE/IQAEQ
は、Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１接着を２〜４倍増強し
た。これらの効果は専らＭａｃ−１の場合に生じ、今ま
でのところ行われた突然変異はＬＦＡ−１への接着を増
大しなかった。NDS ペプチド及びNQS ペプチドは、ＩＣ
ＡＭ−１中のＮ連鎖グリコシル化の８つの共通配列のう
ちの二つである(Staunton,D.E.ら、Cell 52:925-933(19
88))。これらの配列は全てD2とD5の間で生じる。ＩＣＡ
Ｍ−１はかなりグリコシル化されていることが知られて
おり(Dustin ら、J.Immunol.,137:256-254(1986)) 、少
なくとも７個の部位がＮ−グリカナーゼによる酵素消化
により実証されている(Tomassiniら、J.Biol.Chem.,264
(3):1656-1662(1989))。N240及びN269グリコシル化部位
は、構造上の予想によれば、D229及びE254と同じβシー
トに面しており、嵩高の糖基またはかなり帯電された糖
基はＭａｃ−１の結合を立体的に阻害し、または化学的
に排斥し得る。

【０１６７】ＩＣＡＭ−１中のこれらの二つの突然変異
(N240DS/KNA 及びN269QSQE/IQAEQ)は、潜在的なＮ連鎖
グリコシル化部位を破壊し、また精製Ｍａｃ−１へのCO
S 細胞の結合を増強するので、ＩＣＡＭ−１のグリコシ
ル化の程度はＭａｃ−１への接着を調節し得ると仮定し
た。これを試験するため、解糖プロセスの一種のインヒ
ビターであるデオキシマンノジリマイシン、及び一種の
脱グリコシル化酵素であるノイラミニダーゼが精製Ｍａ
ｃ−１へのＩＣＡＭ−１発現Ｌ細胞の接着を変化させる
能力を調べた（図９）。デオキシマンノジリマイシンは
ゴルジ関連酵素マンノシダーゼＩを抑制し、培養細胞中
の複合型オリゴ糖への高マンノースの処理を抑制する(F
uhrmanら、Nature307:755-758(1984))。ノイラミニダー
ゼはＮ−及びＯ−連鎖炭水化物の末端シアル酸残基を開
裂する。示されるように、デオキシマンノジリマイシン
で３日間処理されるＩＣＡＭ−１を有するＬ細胞は、Ｉ
ＣＡＭ−１を有する未処理またはノイラミニダーゼ処理
の細胞に較べて精製Ｍａｃ−１への増強された結合を示
す。対照の未形質移入のＬ細胞はインヒビター処理また
は酵素処理の場合に結合に変化を示さない。ゴルジ中の
側鎖の修飾（高マンノースから複合型糖への変換) はＩ
ＣＡＭ−１とＭａｃ−１の相互作用を変化させ得ると結
論される。

【０１６８】本明細書に示された領域欠失実験及びアミ
ノ酸置換実験は、ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１が別個の重
ならない領域中でＩＣＡＭ−１に、夫々D1及びD3中の部
位に結合することを示す。これらの結合部位は、タンデ
ムIg様領域の複製の結果として発生したのかもしれな
い。配列の比較は、ユニットとしてのＩＣＡＭ−１のD1
及びD2が、タンデム対(D1 対D2またはD1対D4) 内の個々
の領域よりもＩＣＡＭ−１のD3及びD4またはＩＣＡＭ−
１のD1及びD2に対して相同性を有していたことを示す。
タンデム領域複製のこの現象はIg系統群の員( 例えば、
NCAM及びVCAM-1に関して) の間で共通であるが、その説
明は明らかではなかった。Igスーパーファミリィの員
は、通常、NH₂ 末端( これは単一リガンドと相互作用す
る) 付近で一つの結合部位を有すると一般に考えられて
いた。本願の結果は、更に別のIg様領域が作用し得るこ
とを示す。こうして、タンデム領域複製は更に別の結合
部位をもたらす進化の機構であり得る。そしてＩＣＡＭ
−１中では、これらの部位は異なるインテグリンを結合
するように特殊化するのに充分に相離していた。

【０１６９】突然変異誘発データ及びモノクローナル抗
体阻止データは、Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１がＩＣＡＭ
−１に、その分子の異種の領域中で結合することを強く
示唆するので、同じ細胞表面上のＬＦＡ−１分子及びＭ
ａｃ−１分子は単一のＩＣＡＭ−１分子を結合し得る。
このような結合は、内皮細胞ＩＣＡＭ−１とのそれらの
接着相互作用に於いて好中球で観察されたＭａｃ−１及
びＬＦＡ−１の協力(Smith,C.W. ら、J.Clin.Invest.8
3:2008-2017(1989)、この文献は参考として本明細書に
含まれる) と合致するようである。二種の関連するイン
テグリンが同一のカウンター構造に結合するこのような
機構は、例えば、フィブロネクチン及びVLA サブファミ
リィの員とその相互作用に更に一般に適用し得る。VLA-
4 はCS-1フラグメントに結合し、一方、VLA-5 は80kdの
結合フラグメント(Hemler,M.E.,Ann.Rev.Immunol.,8:36
5-400(1990))中のRGD 配列に付着する。

【０１７０】 表３ ＩＣＡＭ−１アミノ酸置換突然変異体の精製されたＭａｃ−１ 及びＬＦＡ−１への接着の要約 ──────────────────────────────── 突然変異体 平均（標準偏差） 平均（標準偏差） Ｍａｃ−１ ＬＦＡ−１ ──────────────────────────────── (b)領域１ Q1/T 121(80) 150(42) K8/E 110(59) 126(33) R13G/EA 109(19) 3 ( 2) D26QPK/ALPE 99(24) 80(52) E34/A 113(14) 1( 0) K39KE/ERQ 73(50) 46(33) G46NN/ASI 101(60) 140(51) R49KV/EKL 105(45) 115(11) O58EDS/AKD1 75(18) 3( 4) D60S/KL 108(25) 0( 0) Q52PM/API 110( 1) 164(19) D71/N 75(12) 97(35) Q73/H 125(59) 21(19) (c)領域２ G101K/AN 121(30) 96(23) N103/K 110 0 E111GGA/KAGS 98(16) 84 N118/Q 122(41) 164(21) R125/E 83(37) 101(41) E127/R 88( 7) 109(34) K128/R 112(36) 110(12) R149RD/EEG 102(50) 130( 5) H152HGA/EEGS 94(41) 104(42) N156/E 124 (4) 150(21) R166PQ/EPA 94 (5) 82(37) N175/A 78(41) 107(35) (d)領域３ A189T/SI 162(61) 160(22) D203TQ/TAD 139(33) 110(14) D213GL/HGV 122( 1) 145(26) D229QR/HLE 1( 2) 103(19) N240DS/KNA 205(137) 144(24) E254DE/KEK 26(23) 144(24) N269QSQI/IQAE 479（245) 108(32) ──────────────────────────────── 本発明がその特別な実施態様に関して説明されたが、そ
れは更に改良が可能であることが理解される。本願は、
一般に本発明の原理に従う本発明のあらゆる変化、使
用、または適用に及び、しかも、本発明が関係する当業
界内で既知の慣例にはいるような本開示からの逸脱、並
びに請求項の範囲に特定された必須の特徴に適用し得る
ような本開示からの逸脱を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】精製ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１及びＭａｃ−
１のCOS 細胞形質移入体の接着を示す。

【図２】精製Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞接着
の投薬量応答曲線を示す。

【図３】精製されたＭａｃ−１及びＬＦＡ−１に関する
ＩＣＡＭ−１⁺ Ｌ細胞の結合活性の比較を示す。

【図４】精製されたＭａｃ−１及びＬＦＡ−１へのＩＣ
ＡＭ−１⁺ Ｌ細胞接着の温度依存性を示す。

【図５】精製Ｍａｃ−１へのHUVEC 接着を示す。

【図６】精製されたＭａｃ−１及びＬＦＡ−１へのＩＣ
ＡＭ−１⁺ Ｌ細胞接着のモノクローナル抗体抑制研究を
示す。

【図７】ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１へのＩＣＡＭ−１の
領域欠失突然変異体の結合を示す。そのデータは３回の
独立の実験の平均であり、誤差バーは標準偏差を表す。

【図８】Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１⁺ 細胞の接着に及
ぼす小胞体グルコシダーゼインヒビターであるデオキシ
マンノジリマイシンの効果を示す。

【図９】精製Ｍａｃ−１へのＩＣＡＭ−１Ｌ細胞接着に
及ぼす側鎖グリコシル化の効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/12 (72)発明者 ドナルド イー ストーントン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02167チェスナット ヒル チェスナット ヒル ロード 124 (72)発明者 ティモシー エイ スプリンガー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02157ニュートン モナードノック ロー ド 28

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｍａｃ−１に実質的に結合できないが、
   ＬＦＡ−１に実質的に結合できるＩＣＡＭ−１官能性誘
   導体。
2. 【請求項２】 可溶性のＩＣＡＭ−１官能性誘導体であ
   る請求項１に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
3. 【請求項３】 ＩＣＡＭ−１の領域１、２、３、４及び
   ５を含む請求項２に記載の可溶性のＩＣＡＭ−１官能性
   誘導体。
4. 【請求項４】 ＩＣＡＭ−１の領域３中に突然変異を含
   む請求項３に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
5. 【請求項５】 前記の突然変異がＩＣＡＭ−１の残基22
   9-231 、及び残基254-256 の群から選ばれた残基中にあ
   る請求項４に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
6. 【請求項６】 ＬＦＡ−１に実質的に結合できないが、
   Ｍａｃ−１に実質的に結合できるＩＣＡＭ−１官能性誘
   導体。
7. 【請求項７】 可溶性のＩＣＡＭ−１官能性誘導体であ
   る請求項６に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
8. 【請求項８】 ＩＣＡＭ−１の領域１、２、３、４及び
   ５を含む請求項７に記載の可溶性のＩＣＡＭ−１官能性
   誘導体。
9. 【請求項９】 ＩＣＡＭ−１の領域１中に突然変異を含
   む請求項８に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
10. 【請求項１０】 前記の突然変異がＩＣＡＭ−１のＥ3
    4、Ｑ58ＥＤ、及びＱ73の群から選ばれた残基中にある
    請求項９に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
11. 【請求項１１】 ＩＣＡＭ−１の領域２中に突然変異を
    含む請求項８に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
12. 【請求項１２】 ＩＣＡＭ−１の領域３及び４を含む請
    求項７に記載の可溶性のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
13. 【請求項１３】 Ｍａｃ−１及びＬＦＡ−１に実質的に
    結合できないが、ヒト・ライノウイルスを実質的に結合
    できるＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
14. 【請求項１４】 Ｍａｃ−１に対する増強された結合能
    力をもつことができる、グリコシル化部位を含まないＩ
    ＣＡＭ−１官能性誘導体。
15. 【請求項１５】 前記のグリコシル部位がＩＣＡＭ−１
    のＮ269 、Ｎ240 及びＮ358 からなる群から選ばれる請
    求項14に記載のＩＣＡＭ−１官能性誘導体。
16. 【請求項１６】 非特異的防御系の反応により生じる炎
    症を治療できるが、特異的防御系の反応により生じる炎
    症を実質的に抑制できないことを特徴とする抗炎症薬。
17. 【請求項１７】 ＬＦＡ−１に実質的に結合できない
    が、Ｍａｃ−１に実質的に結合できるＩＣＡＭ−１官能
    性誘導体である請求項16に記載の抗炎症薬。
18. 【請求項１８】 可溶性のＩＣＡＭ−１官能性誘導体で
    ある請求項17に記載の抗炎症薬。
19. 【請求項１９】 特異的防御系の反応により生じる炎症
    を治療できるが、非特異的防御系の反応により生じる炎
    症を実質的に抑制できないことを特徴とする抗炎症薬。
20. 【請求項２０】 Ｍａｃ−１に実質的に結合できない
    が、ＬＦＡ−１に実質的に結合できるＩＣＡＭ−１官能
    性誘導体である請求項19に記載の抗炎症薬。
21. 【請求項２１】 可溶性のＩＣＡＭ−１官能性誘導体で
    ある請求項20に記載の抗炎症薬。