CN1357046A - 几丁质酶几丁质－结合片段 - Google Patents

几丁质酶几丁质－结合片段 Download PDF

Info

Publication number
CN1357046A
CN1357046A CN99805990A CN99805990A CN1357046A CN 1357046 A CN1357046 A CN 1357046A CN 99805990 A CN99805990 A CN 99805990A CN 99805990 A CN99805990 A CN 99805990A CN 1357046 A CN1357046 A CN 1357046A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chitinase
chitin
leu
polypeptide
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99805990A
Other languages
English (en)
Inventor
P·W·格雷
L·W·祖克尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icos Corp
Original Assignee
Icos Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corp filed Critical Icos Corp
Publication of CN1357046A publication Critical patent/CN1357046A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)

Abstract

本发明提供了人几丁质酶的几丁质－结合片段、片段类似物、编码所述片段和类似物的纯化和分离的多核苷酸序列,以及用于重组生产人几丁质片段产物的物质和方法,所述片段产物预期可用于检测几丁质,结合几丁质并治疗真菌感染或者开发用于治疗所述疾病的产物。

Description

几丁质酶几丁质-结合片段
本申请是1998年3月12日申请的美国系列申请09/039,198的接续申请。
技术领域
本申请主要涉及含人几丁质酶之几丁质-结合片段和所述片段类似物的物质。更具体地讲，本发明涉及编码所述片段产物的新纯化的和分离的多核苷酸，由所述多核苷酸编码的几丁质酶片段产物，用于重组生产所述几丁质酶片段产物的物质和方法以及所述几丁质酶片段产物的治疗和诊断用途。
发明背景
几丁质是β-(1，4)-连接的N-乙酰氨基葡糖残基的线性同聚物。该多糖仅次于纤维素，是最丰富的有机物质。节肢动物的外骨骼是由几丁质组成的。另外，真菌和其他寄生虫在其细胞外壁中含几丁质，其中几丁质起重要的结构和保护作用。破坏真菌细胞壁和膜已是一种有用的对抗真菌和寄生虫的治疗方法。例如，两性霉素B和氟康唑通过影响膜类固醇来发挥其抗真菌活性。尽管有抗真菌治疗剂，但人类的真菌感染已越来越成为引起威胁生命的疾病。参见，Georgopapadakou等微生物趋势(Trends Microbiol.)3：98-104(1995)。引起这些疾病的真菌和寄生虫主要是念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、球孢子菌属和肺囊虫属。在无免疫应答的个体，例如患AIDS的患者、进行化疗的患者以及免疫抑制器官移植患者中，这些病原体是特别危险的。
通过几丁质酶可降解几丁质。在植物、微生物和动物中均发现了几丁质酶。细菌几丁质酶为细菌生长提供了碳源。昆虫产生几丁质酶以便在每次蜕皮时消化其外皮。在植物中，认为几丁质酶提供抵御寄生性真菌的保护作用。已从许多细菌(例如粘质沙雷氏菌，Jones等，EMBO J.，5：467-473(1986))、植物(例如烟草，Heitz等，Mol.Gen.Genet.，245：246-254(1994))和昆虫(例如黄蜂，Krusgnandeng，生物化学杂志(J.Biol.Chem.，)269：20971-20976(1994))中克隆了几丁质酶，并根据序列相似性将其分为两个不同的家族，命名为18家族和19家族(Henrissat和Bairoch，生物化学杂志(Biochem，J.)293：781-788)。尽管18家族酶的催化区域在许多种间于很大程度上是保守的，但对于几丁质-结合结构域而言，种间只有很有限的序列相似性。多个家族18几丁质-结合结构域的唯一共有特征是存在多个半胱氨酸残基。
已在哺乳动物中鉴定了与细菌、昆虫和植物几丁质酶有较低同源性的蛋白质(低于40％的氨基酸同一性)，例如人软骨gp39(c-gp39)[Hakala等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：25803-25810(1993)]，人糖蛋白YKL-40[Johansen等欧洲癌症杂志()31A：1437-1442(1995)]，来自绵羊的输卵管特异性的雌激素诱导的蛋白质[DeSouza等，Endocrinology，136：2485-2496(1995)]，牛和人；以及来自激活的小鼠巨噬细胞的分泌蛋白[Chang等，GenbankM94584]。但是，尚未报道这些蛋白质的几丁质降解活性。这些蛋白质的功能是未知的，但是已认为它们与组织的再成型有关。Hakala等(同上文)报道在来自类风湿性关节炎患者的滑液和软骨样品中可检测到C-gp39，但在正常人的所述样品中则检测不到。Recklies等关节炎风湿病(Arthritis Rheumatism)36(9 SUPP L.)：S190(1993)报道了C-gp39蛋白在软骨表层不同细胞种群中的位置。Johansen等(同上文)报道YKL-40血清水平的测量值是标志转移性疾病之程度和患复发性乳腺癌患者之存活的潜在预测标记。
Escott等感染与免疫(Infect.Immun.)63：4770-4773(1995)说明了在人白细胞和人血清中几丁质酶的活性。Overdijk等糖生物学(Glycobiology)4：797-803(1994)描述了从人血清和大鼠肝中分离几丁质酶(4-甲基umbelliferyl-四-N-乙酰壳四糖苷(acetylchitotetraoside)水解酶)。Renkema等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：2198-2202(1995年2月)从高歇氏病患者的脾中制备了人壳三糖酶。其制品有几丁质酶酶活性，该文章报道了该制品蛋白质组分的少量氨基酸序列(22个氨基末端残基和胰蛋白酶片段的21个残基)。人几丁质酶的功能还是未知的，但在该文章中未说明与高歇氏病的病理生理学的关系。同一研究小组的后一篇文献[Boot等生物化学杂志270(44)：26252-26256(1995年11月)]描述了克隆编码有几丁质酶酶活性之产物的人巨噬细胞cDNA。由该研究小组在其1995年2月的文章中所报道的部分氨基酸序列与人巨噬细胞cDNA产物的推测氨基酸序列相配。另外参见国际专利公开WO96/40940，其中报道了编码50kD和39kD产物的两种不同的人壳三糖酶cDNA，这两种产物都是完全有酶活性的。Renkema等欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)244：279-285(1997)报道，人几丁质酶开始是作为50kD蛋白质在巨噬细胞中产生的，然后部分加工成在溶酶体中积累的39kD形式，还报道了可变剪接产生编码一种40kD几丁质酶的人几丁质酶特有mRNA.39kD和40kD这两种同种型都是C末端截短的并都有完全的几丁质酶酶活性，但很难结合几丁质。
就在无免疫应答个体中，越来越多的真菌感染威胁生命的情况来看，现在本领域仍需要鉴定用于诊断和治疗真菌感染的新物质和方法。
发明概述
本发明提供了编码具有几丁质结合活性但没有几丁质酶酶活性的人几丁质酶片段和其类似物的新纯化和分离的多核苷酸(即DNA和RNA，包括有义和反义链)；用于重组生产所述片段产物的方法；纯化和分离的人几丁质酶多肽片段产物；含所述片段产物的药物组合物；以及与所述片段产物结合的诊断或治疗试剂。预期所述片段产物和与其结合的诊断或治疗试剂可用于检测几丁质、结合的几丁质，治疗真菌感染或者用于开发用于治疗真菌感染的产品。
在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中列出了编码人几丁质酶的推测等位基因变体的两种人cDNA核苷酸序列，包括非编码5’和3’序列。人几丁质酶编码区对应于SEQ ID NO：1的核苷酸2-1399或SEQ ID NO：3的核苷酸27-1424，不含其信号序列的成熟分泌的人几丁质酶蛋白质的推测编码序列对应于SEQ ID NO：1的核苷酸65-1399或SEQ IDNO：3的核苷酸90-1424。在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中分别列出了由SEQ ID NOS：1和3之DNA编码的多肽的氨基酸序列。21个氨基末端氨基酸(SEQ ID NOS：2和4的位置-21至-1)含有一信号肽，裂解该信号肽后产生成熟的人几丁质酶蛋白质(SEQ ID NOS：2和4的位置1至445)。已确定人几丁质酶的72个C末端残基对于几丁质酶酶活性是不重要的。下文实施例5说明了如何生产不含人几丁质酶72个C末端残基的N末端片段；在氨基酸373的密码子后导入终止密码子产生约39kD重组几丁质酶片段，与全长重组人几丁质酶相比，该片段有相似的特异性几丁质酶酶活性。在美国系列申请08/877599(1997年6月6日申请)中详细描述了人几丁质酶cDNA的克隆和表达，以及重组人几丁质酶的生物学活性，所述申请是美国系列申请08/663618(1996年6月14申请)的接续申请，两者均全文引入本文作为参考。
本发明是以如下意想不到的发现为基础：即人几丁质酶的基本上全部几丁质结合活性均包含在该445个氨基酸酶的99个C末端氨基酸残基内。本发明具体提供几丁质结合、几丁质酶失活的多肽产物。优选的几丁质酶片段产物含有人几丁质酶之54个C末端氨基酸内的几丁质-结合片段，包括由人几丁质酶的约99个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO：2的约残基347至445)，由人几丁质酶的约72个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO：2的约残基374至445)，由人几丁质酶的约54个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO：2的约残基392至445)，由人几丁质酶的约49个C末端氨基酸组成的片段(SEQID NO：2的约残基397至445)。本发明还提供了包括编码所述多肽片段之DNA的纯化的分离的多核苷酸；含所述DNA的载体，特别是其中所述DNA与表达控制DNA序列有效相连的表达载体；用所述DNA以可在人几丁质酶片段产物的宿主细胞中进行所述表达的方式稳定转化或转染的宿主细胞；生产人几丁质酶多肽片段产物的方法，包括在营养培养基中培养所述宿主细胞，然后从所述宿主细胞或所述营养培养基中分离所述多肽；由该方法生产的纯化的、分离的多肽；含有与异源肽或多肽融合的所述多肽的融合蛋白，异源肽或多肽包括酶例如分泌的碱性磷酸酶(SEAP)；含所述人多肽片段产物的组合物；含有与抗真菌剂结合的人几丁质酶多肽片段产物的组合物以及通过施用所述组合物，优选同时施用其他非几丁质酶抗真菌剂来治疗真菌感染的方法；含与可检测标记(包括放射性同位素、荧光团、染料、电子致密化合物和酶)结合的几丁质酶多肽片段的组合物，利用所述组合物确定样品中是否存在几丁质或确定几丁质含量的方法，所述方法包括：(a)将样品与结合有可检测标记的人几丁质酶多肽片段产物接触，(b)确定与几丁质结合的标记片段产物的数量，用于诊断样品中是否存在几丁质的试剂盒；特异性结合人几丁质酶的几丁质结合、几丁质酶失活片段的单克隆抗体，包括特异性与SEQ ID NO：2中所列人几丁质酶的54个C末端氨基酸内表位结合的抗体；优选的单克隆抗体243Q和243M，与243Q和243M竞争的抗体或者结合与243Q和243M一样之表位的抗体。
本发明的几丁质酶多肽片段产物包括基本上保持了几丁质结合活性而没有保留主要几丁质酶酶活性的人几丁质酶片段或其等位基因变体，所述片段的类似物，含所述片段或类似物的融合蛋白。几丁质酶多肽片段产物用于如下文所述的治疗和诊断应用。
本发明设想的“几丁质-结合结构域”片段是由SEQ ID NO：2的氨基酸残基X至Y代表并且保留了几丁质结合活性的其部分，其中X是从347至397的连续整数，Y是445。一个优选的片段由人几丁质酶的99个C末端氨基酸组成(SEQ ID NO：2的残基347-445)；在实施例7中已列出了该片段，该片段保留了成熟几丁质酶的80％的几丁质结合活性。其他优选片段是人几丁质酶的54个C末端氨基酸(SEQ IDNO：2的残基392-445)，和人几丁质酶的49个C末端氨基酸(SEQ IDNO：2的残基397-445)，已在实施例7中说明所述片段保留了几丁质结合活性。如实施例7中所说明的，含人几丁质酶的99个C末端氨基酸的融合蛋白含有该蛋白质的几丁质-结合结构域。用所述99个氨基酸之区域的N末端和C末端截短以及含这些截短物之融合蛋白的几丁质结合活性来定义几丁质-结合结构域的边界。这些截短物包括N末端从氨基酸残基347、374、392、395、397、400或409开始，C末端在氨基酸残基431、443或445的片段。
类似物可含有几丁质酶片段类似物，其中可缺失或取代一个或多个特定的(即天然编码的)氨基酸或者其中增加一个或多个非特定的氨基酸：(1)没有丢失一种或多种几丁质酶特异性的生物活性(包括几丁质结合活性)或者免疫学特征；或(2)几丁质酶的特定生物活性有残缺。本发明设想可以对本领域已知的保守氨基酸进行取代而不会影响所述片段的生物活性。
本发明优选的DNA序列包括基因组和cDNA序列以及编码没有几丁质酶酶活性的人几丁质酶之几丁质-结合片段的全部或部分化学合成的DNA序列，其类似物，以及含所述片段或类似物的融合蛋白。本发明设想的核苷酸序列是编码SEQ ID NO：2之位置X至Y的氨基酸序列的那些，其中X是从347-392的连续整数，Y是445。SEQ ID NO：1的核苷酸1238-1399(编码SEQ ID NO：2的残基392至445)是本发明特别优选的DNA序列。本发明还设想了该DNA序列和在标准严紧条件下与其非编码链杂交或者可以杂交但遗传密码丰余并编码几丁质酶之几丁质-结合片段的其他DNA序列。举证性的严紧条件如下：42℃，在50％甲酰胺中杂交，60℃，用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤。本领域技术人员应理解，根据待杂交序列的长度和GC核苷酸碱基的含量可改变这些条件。本领域的准则性标准适用于确定精确的杂交条件。参见Sambrook等，9.47-9.51分子克隆(Molecular Cloning)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)。
本发明多核苷酸的用途是用作杂交探针，以鉴定和分离编码与人几丁质酶同源之蛋白质的几丁质结合区的非人基因组DNA和cDNA；鉴定表达所述蛋白质之几丁质结合部分的那些细胞以及可表达所述蛋白质的生物条件。
在另一方面，本发明包括本发明DNA序列的生物复制物(即在体内或体外制造的分离的DNA序列的拷贝)。提供了自主复制重组构建体例如掺入了编码人几丁质酶之几丁质结合片段的多核苷酸(包括上述任何DNA)的质粒和病毒DNA载体。优选的载体包括其中掺入的编码几丁质酶片段的cDNA与内源或异源表达控制序列和转录终止子有效相连的表达载体。所述表达载体还包括与编码几丁质酶的DNA序列有效相连的编码多肽的DNA序列，可表达所述载体以产生含所需多肽的融合蛋白。
根据本发明的另一方面，用本发明的多核苷酸序列以可以在其中表达所需几丁质酶产物的方式稳定转化或转染原核或真核宿主细胞。表达几丁质酶片段产物的宿主细胞可用于各种有用的目的。所述细胞成为免疫原的有价值的来源，所述免疫原用于开发与几丁质酶发生特异性免疫反应的抗体物质。本发明的宿主细胞用于大规模生产几丁质酶片段产物的方法，其中使所述细胞在适宜的培养基中生长，然后例如通过免疫亲和沉淀从细胞和细胞生长的培养基中分离所需的多肽。
编码人几丁质酶之几丁质结合部分的DNA序列的知识使得可以对细胞进行修饰以允许或提高几丁质结合部分的表达。通过将全部或部分异源启动子掺入基因内的适宜位置可修饰细胞(例如通过同源重组)以提高人几丁质酶几丁质结合部分的表达。可将异源启动子以将其与编码人几丁质酶之几丁质结合部分的DNA序列有效相连的方式插入。参见例如PCT国际公开WO94/12650、WO92/20808和WO91/09955。可将可扩增的标记DNA和/或内含子DNA与异源启动子DNA一起插入。
几丁质酶片段产物可从天然细胞作为分离物获得或者用化学方法合成，但优选通过利用本发明原核或真核宿主细胞的重组方法生产。还预期哺乳动物宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、平截、脂化(lipidation)以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因此，可根据需要赋予本发明重组表达产物以最佳生物活性。
本发明还包括将几丁质酶片段产物用于筛选特异性结合人几丁质酶之几丁质-结合结构域或者调节人几丁质酶与几丁质或人细胞外基质蛋白例如透明质酸之结合的蛋白质或其他分子(例如小分子)。用从血浆分离的几丁质酶片段、重组几丁质酶片段产物或者表达所述产物的细胞可以鉴定与几丁质酶特异性结合的蛋白质或其他分子(例如小分子)。将与几丁质酶的几丁质-结合结构域结合的蛋白质或其他分子用于调节其活性。与几丁质酶的几丁质-结合结构域特异性结合的结合蛋白是由本发明构思的并包括抗体物质(例如单克隆和多克隆抗体，单链抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，以及CDR-移植抗体，包括含特异性识别本发明之多肽的CDR序列的化合物)。所谓“与几丁质酶的几丁质-结合结构域特异性结合”指所述结合蛋白仅仅识别几丁质酶的几丁质-结合结构域，而没有几丁质酶的催化活性部分。反过来，结合蛋白用于免疫组合物以及纯化几丁质酶，并用于用已知免疫学方法检测或定量分析体液和组织样品中的几丁质酶。还构思了几丁质酶抗体物质特异性的抗个体型抗体。
与几丁质-结合结构域特异性结合的抗体用于例如在夹心ELISA检测中检测或定量分析几丁质-结合结构域的存在，并用于例如通过加入与酵母或真菌结合的几丁质-结合结构域，然后加入几丁质-结合结构域特异性的标记抗体来检测或定量分析酵母或真菌的存在。检测人血(血浆或血清)样品中的几丁质-结合结构域还与涉及几丁质酶的疾病，例如高歇氏病的诊断标准指标有关。目前优选的抗体是分别由杂交瘤243Q(保藏号：)和243M(保藏号：)产生的单克隆抗体243Q和243M，以及与243Q和243M竞争或者与由243Q和243M识别的相同表位结合的抗体。
本发明DNA和氨基酸序列的公开所产生的科学价值是显而易见的。由于一系列的实施例、几丁质酶cDNA序列的知识使得有可能通过DNA/DNA杂交或者聚合酶链反应(PCR)分离编码其他哺乳动物几丁质酶的基因组DNA序列等。另外预期在本领域的标准严紧度条件下，用本发明DNA序列完成的DNA/DNA杂交或PCR方法使得可以分离编码几丁质酶的人等位基因变体的DNA，同样具有几丁质酶的几丁质结合特性的其他结构相关的人蛋白质。由本发明提供的DNA序列信息使得还可以通过同源重组或“剔除试验”策略[参见例如Kapecchi，科学(Science)244：1288-1292(1989)]开发不能表达功能性几丁质酶、过表达几丁质酶或者表达几丁质酶变体的动物。可将所述动物用作研究几丁质酶的体内活性或者几丁质酶调节剂的模型。对本发明多核苷酸进行适当标记后，可用于杂交实验以检测细胞合成几丁质酶的能力。本发明的多核苷酸还是诊断方法的基础，所述方法用于鉴定处于疾病状态的几丁质酶座位中的遗传改变。本发明还提供了反义多核苷酸，所述反义多核苷酸与调节正常表达几丁质酶之细胞的几丁质酶表达有关。
本发明提出，可将几丁质-结合片段产物与异源多肽融合。例如可将所述产物与免疫球蛋白的一部分，例如恒定区融合以用于治疗目的。作为另一实例，可将所述产物与用作可检测标记或标记物的多肽融合，所述多肽例如具有酶活性的多肽或者携带特异性可检测表位例如myc表位或FLAG表位标记(Eastman Kodak)的多肽。
还可将几丁质-结合片段与另一所需蛋白质融合以便有利于经与几丁质基质的亲和结合来纯化所需的蛋白质。然后通过从柱上洗脱可得到所述融合蛋白或者从几丁质-结合结构域裂解所需蛋白质，然后洗脱裂解的蛋白质。参见Chong等基因(Gene)192：271-281(1997)。
本发明的人几丁质酶片段产物还可用作几丁质特异性试剂用于特异性地鉴定样品中几丁质的存在。根据本发明的该方面，将具有几丁质结合活性的几丁质酶片段产物与可检测标记例如放射性同位素、荧光团、染料、电子密集的化合物或酶结合，与待测样品接触，定性或定量分析几丁质的存在。本文所用“结合”指通过共价键相连。所述技术是熟知的并在例如美国专利5587292(该文献引入本文作为参考)中作了说明。由此测得的几丁质量可作为感染患者体内真菌的指标。用于该方法的两个优选片段是由SEQ ID NO：2所列人几丁质酶氨基酸序列的氨基酸残基392至445组成的54个氨基酸的几丁质-结合结构域以及由SEQ ID NO：2所列人几丁质酶氨基酸序列的氨基酸残基397至445组成的49个氨基酸的几丁质-结合结构域。
本发明还提供了含结合几丁质的几丁质酶片段和成象剂的结合物，所述成象剂例如用于放射性核成象的γ-和发射正电子的放射性同位素(例如157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、56Fe、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、201Tl、99Tn、90Y)；用于MRI成象的顺磁金属螯合剂，硝酰基自旋标记的化合物或其他试剂(例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(III)、Co(III)、Fe(III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)和V(IV)、GdDTPA/二葡甲胺[MagnevistTM]；用于X射线为基础的成象，包括CT扫描的造影增强剂(例如含溴-或碘-的化合物)；本领域已知的其他试剂。预期所述结合物与酵母菌细胞壁的几丁质结合，由此可用于检测或定位哺乳动物体内的酵母菌的方法。
本发明构思了为了改善因含几丁质寄生虫例如真菌引起的疾病，给哺乳动物，特别是人施用含所述产物的几丁质酶片段产物和治疗剂。真菌感染(真菌病)例如念珠菌病、曲霉病、球孢子菌病、芽生菌病、巴西芽生菌病、组织胞浆菌病、隐球菌病、着色真菌病、孢子丝菌病、毛霉菌病和皮真菌病可以是急性或慢性疾病。在无免疫应答的宿主中，致病真菌引起严重的，常常是致命的疾病。进行过化疗的癌症患者、免疫抑制个体和HIV感染个体对由念珠菌、曲霉、卡氏肺囊虫和其他真菌引起的真菌病敏感。两性霉素B和氟康唑可用于治疗真菌感染，但与这些药物有关的毒性引起严重的副作用，从而限制了其应用。尽管可用两性霉素治疗，但全身性念珠菌病的死亡率仍高于50％。在下文实施例9-15中说明了有关真菌感染的动物模型，这些模型在现有技术中已有描述。
本发明具体构思了含几丁质酶片段产物的组合物，该组合物用于治疗对真菌感染敏感或者患有真菌感染之哺乳动物的方法。根据构思，可将几丁质酶片段产物与其他常规抗真菌剂结合，所述抗真菌剂包括两性霉素B和结构上相关的化合物制真菌素和多马徽素；5-氟胞嘧啶；吡咯衍生物例如氟康唑，酮康唑，特康唑，依他康唑和噻康唑；丙烯胺-硫代氨甲酸酯类，例如发癣退，纳呋替芬和特比萘芬；灰黄霉素；环吡酮胺；氯丙炔碘；十一烯酸；和苯甲酸。[参见例如Goodman&Gilman，治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第9版，McGraw-Hill(1996)]。根据本发明的该方面，几丁质-结合片段产物作为载体将已知的杀真菌或抑制真菌的化合物靶向致病的携带几丁质的真菌，由此，可能通过使真菌对所述抗真菌的作用更敏感来提高这些常规抗真菌剂的效力。发挥所需治疗作用所需要的常规抗真菌剂数量的减少使得可以以较低的毒性水平使用所述药物。用几丁质-结合结构域片段来选择性靶向真菌或酵母的能力使得可以施用与细胞毒性试剂结合的所述片段，所述细胞毒性试剂本身没有抗真菌选择性。本发明的该方面构思将结合几丁质的几丁质酶片段与本领域已知的包括放射性同位素(例如90Y、188Re、186Re、199Au、64Cu、67Cu、131I)、毒素和化疗剂的任何细胞毒性试剂结合，从而有效地抵御酵母。用本领域已知的方法很容易鉴定适宜的细胞毒性试剂。为了达到该目的，利用人几丁质酶几丁质-结合结构域比使用其他种的几丁质酶的几丁质-结合结构域更有利，因为预期人多肽在人中是非免疫原性的。
几丁质-结合结构域片段本身通过酵母细胞壁的破坏性交联而具有抗真菌作用，并且可以单独或与其他抗真菌剂一起施用。本发明构思了可特别用于该目的的多聚体几丁质-结合结构域片段，包括已通过化学和重组生产的多肽而共价交联的多聚体片段，所述多聚体含串联连接的多个几丁质-结合结构域。施用单体或多聚体几丁质-结合结构域片段可减少发挥所需治疗作用所需要的共施用的抗真菌剂的量。
因此，本发明构思了几丁质酶片段产物在制备用于预防或治疗真菌感染的药物中的用途。
由本发明构思的治疗/药物组合物包括可与另一治疗剂结合的几丁质酶片段产物，和可药用稀释剂或载体，还可包括其他抗真菌剂。所标明的剂量应足以补充内源几丁质酶活性。有关一般剂量考虑，参见(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)。剂量可在约1μg/kg-100mg/kg体重间变化，优选约0.1-约20mg几丁质酶/kg体重。本发明的治疗组合物可经各种途径施用，这取决于待治疗的感染，所述途径包括经皮下、肌肉内、静脉内、肺内、经皮、局部、经口或栓给药。
本发明还认为，在高歇氏病或在炎症位点(例如类风湿性关节炎)过表达几丁质酶对细胞外基质有不利影响，而且在所述疾病的发作中，几丁质酶活性抑制剂，包括几丁质酶片段产物本身或者由上述筛选方法鉴定的几丁质酶-结合抑制剂通过减少细胞基质的再成形或破坏所述细胞外基质来提供治疗效果。
已从巨噬细胞cDNA文库中分离了人几丁质酶cDNA。已知巨噬细胞与类风湿性关节炎损伤有非常密切的关系[Feldman等细胞(Cell)85：307-310(1996)]，而巨噬细胞产物例如TNF-α与疾病的发展有关。已在类风湿性关节炎患者的滑膜和软骨中检测到与人几丁质酶同源的蛋白质，C-gp39。尽管人几丁质酶的天然底物可能是来自致病生物体的几丁质，但是该酶还对形成天然细胞外基质的内源大分子有活性。例如，已表明透明质酸(一种主要的细胞外基质)含有几丁质寡聚体的核。[Semino等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93：4548-4553(1996)；Varki，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93：4523-4525(1996)]。因此，在象类风湿性关节炎这样的疾病中几丁质酶与细胞外基质的降解有关。通过测量几丁质酶水平和/或施用几丁质酶的作用或者从关节炎关节分离的滑膜液中的几丁质酶抑制作用可确定几丁质酶的作用。通过酶检测或用抗体可测量内源几丁质酶的水平。在几丁质酶处理前后，可测量滑膜液的粘度；与几丁质酶有关的粘度降低应与内源几丁质酶底物一致。由此几丁质酶活性的调节可调节类风湿性关节炎中关节破坏的发展。
本发明还构思了筛选几丁质酶活性抑制剂的方法，该方法可以在前段描述的方式使用。在1995年12月21日公开的WO95/34678中包括了用于筛选样品以鉴定抑制几丁质酶之试剂的方法。发明详述
在考虑了下列说明性实施例后，将能够理解本发明的其他方面和优点。实施例1描述了从人巨噬细胞cDNA文库中分离人几丁质酶cDNA克隆。实施例2描述了在各种人组织中几丁质酶基因表达的图谱。实施例3描述了在原核细胞中重组表达人几丁质酶基因并纯化所得的酶。实施例4提供了用于在酵母中重组生产人几丁质酶的工具。实施例5描述了在哺乳动物细胞中重组表达人几丁质酶基因并纯化所得蛋白。实施例6描述了通过肽合成或重组生产方法生产人几丁质酶多肽类似物和片段。实施例7描述了具有几丁质-结合活性的人几丁质酶片段和其类似物的生产。实施例8提供了用于产生与人几丁质酶发生特异性免疫反应的单克隆抗体的工具。实施例9描述了用于测量几丁质酶催化活性的实验。实施例10描述了在体外确定试验药物的抗真菌活性。实施例11描述了在体内小鼠模型中确定试验药物的抗真菌活性，实施例12至15描述了侵袭性曲霉病、传播的念珠菌病、念珠菌眼炎和念珠菌心内膜炎的兔模型。实施例16将全长人几丁质酶的几丁质-结合和几丁质水解活性与C末端平截片段的所述活性进行了比较。实施例17描述了几丁质-结合片段与其他部分的结合。
                    实施例1
           几丁质酶cDNA克隆的分离
按Tjoelker等自然(Nature)，374：549-552(1995)中所述，从外周血单核细胞衍生的巨噬细胞制备cDNA文库。随机筛选来自该文库的克隆，从每个克隆纯化质粒DNA。在自动测序仪(Model 373，Applied Biosystems，Foster City，CA)上，用引物JHSP6确定来自每个克隆的自DNA末端起约300-500个碱基的序列，所述序列与cDNA克隆位点相邻的质粒载体pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)杂交：
JHSP6：5’-GACACT ATAGAATAGGGC-3’(SEQ ID NO：5)
将这些cDNA克隆的核苷酸和推测的氨基酸序列与核苷酸和肽序列数据库中的序列进行比较以确定与已知基因的相似性。用Altschul等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990)的排列算法，通过国家生物技术信息中心的BLAST Network Service完成序列比较。克隆MO-911与数个不同的序列有显著的同源性，所述序列包括小鼠巨噬细胞分泌蛋白YM-1前体(Genbank登录号M94584)，人软骨gp-39(Hakala等，同上文)，来自绵羊，牛和人的输卵管糖蛋白(DeSouza等，同上文)，以及寄生虫(盘尾属，Genbank登录号U14639)，黄蜂，(Chelonus，Genbank登录号U10422)，植物(Nicotiana，Genbank登录号X77111)，和细菌(沙雷氏菌属，Genbank登录号Z36295)的几丁质酶；观察到的最大同源性是与编码具有几丁质酶同源性但没有确定的几丁质酶活性之蛋白质的哺乳动物基因。对MO-911进行进一步的序列分析表明，它含有人几丁质酶同系物的部分编码区。
在SEQ ID NO：1列出了克隆pMO-218(于1996年6月7日根据布达配斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美国，保藏号为98077)的DNA序列，其编码的氨基酸序列于SEQ ID NO：2中列出。MO-218似乎含有人几丁质酶cDNA的完整编码区(SEQ ID NO：1的核苷酸2 to 1399)，它含有21个氨基酸的推测的信号序列，然后是445个编码氨基酸(SEQ ID NO：2的残基1-445)。推测的信号序列后的22个氨基酸与Renkem等(同上文)报道的纯化人壳三糖酶的氨基末端序列完全匹配。Renkema等还描述了来自人壳三糖酶的胰蛋白酶片段的21个氨基酸的序列，该序列对应于MO-218的残基157-177(SEQ ID NO：2)。Boot等(同上文)报道了人壳三糖酶cDNA的克隆，该cDNA与MO-218的编码序列基本相同。MO-218的序列不同于Boot等的序列，前者在5’末端还有14个核苷酸，并在编码区的核苷酸330位置有个一核苷酸改变。
为了证实MO-218确实含有所述cDNA的完整编码区，制备32P-标记的探针P-1(TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT，SEQ ID NO：6)，该探针对应于MO-218的核苷酸2-52的互补序列(SEQ ID NO：1)。设计P-1探针以使其与至少与MO-218一样长的克隆在5’末端杂交。在42℃，在40％甲酰胺和杂交缓冲液(5 xSSPE，10 x Denhardt’s，100μg/ml变性的鲑精DNA和2％SDS)中将该探针与上述人巨噬细胞cDNA文库的一部分(约30,000个克隆)杂交。洗涤滤纸并选择杂交的3个克隆进行序列分析。将最长的克隆命名为pMO-13B(于1996年6月7日根据布达配斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美国，保藏号为98078)。在SEQ ID NO：3中列出了pMO-13B的DNA序列，在SEQ ID NO：4中列出了编码的氨基酸序列。与MO-218相比，该克隆在5’末端还含有25个核苷酸；另外，MO-13B(SEQ ID NO：3)在核苷酸330(对应于MO-218，SEQ ID NO：1的核苷酸305)含有一核苷酸取代，所述取代将成熟蛋白质位置80上的甘氨酸(SEQ ID NO：2)变为丝氨酸(SEQ ID NO：4)。
                     实施例2
            人组织中的几丁质酶基因表达图
进行Northern印迹分析以鉴定其中表达人几丁质酶的组织。在标准严紧度条件下(按照Clontech的实验室手册)，将多个人组织Northern印迹(Clontech，Palo Alto CA)与MO-218的完整编码区杂交。观察到的最大程度的杂交是肺组织(+++)和卵巢(+++)，在胸腺和胎盘中的杂交水平最低(+)。肺、卵巢及胸腺的杂交mRNA为2.0kb，与克隆的cDNA(1.6kb，或约1.8kb包括polyA尾)的大小非常匹配。杂交的胎盘mRNA相当小，约1.3kb。在脾、前列腺、睾丸、小肠、结肠、外周血白细胞、心、脑、肝、骨骼肌、肾或胰腺中未观察到几丁质酶杂交。几丁质酶在肺中的表达与抵御含几丁质病原体生物的保护作用一致，因为肺是真菌病原体进入的主要途径。
                      实施例3
            用细菌细胞生产重组人几丁质酶
将MO-218的成熟编码区进行加工以便在大肠杆菌中表达为C末端平截的类似物。用引物经PCR产生用于表达的DNA片段，所述引物对应于MO-218几丁质酶cDNA的核苷酸65-88(5’-TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3’，SEQ ID NO：7)，该序列前有起始密码子甲硫氨酸密码子和XbaI限制核酸内切酶位点，下游引物编码MO-218的核苷酸1163-1183和之后的终止密码子和HindIII位点(5’-AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3’，SBQ ID NO：8)。下游引物在碱基25含有一腺嘌呤，而MO-218序列在对应的核苷酸位置含有鸟嘌呤。结果，所得的DNA片段在对应于MO-218序列的核苷酸1172的位置上含有胸腺嘧啶而不是胞嘧啶，在SEQ ID NO：15中列出的编码的几丁质酶片段也是在成熟氨基酸位置370含丝氨酸而不是MO-218编码的脯氨酸的类似物。用XbaI和HindIII消化所得的DNA片段，然后将其克隆到质粒pAraBAD(也称为pAraCB)。
按下列方法制备质粒pAraCB。修饰质粒pUC19以包括阿拉伯糖启动子并在其后包括AKAP79编码序列。用引物araC-2(SEQ ID NO：9)和arab-1(SEQ ID NO：10)，从鼠伤寒沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子BAD，通过PCR将阿拉伯糖启动子[Wilcox等基因(Gene)，34：123-128(1985)；Wilcox，等基因(Gene)18：157-163(1982)]和araC基因扩增为EcoRI/XbaI片段：araC-2 TACAGAA TTCTTATTCACA TCCGGCCCTG  SEQ ID NO：9arab-1 TACATCTAGACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGG SEQ IN NO：10
引物araC-2编码araC基因产物的EcoRI位点(划线部分)和终止密码子(斜体字)。引物arab-1编码推测的核糖体结合结构域(斜体字)和XbaI限制位点(划线部分)。用这些引物，PCR产生1.2kb片段，用EcoRI和XbaI消化，然后亚克隆到用两种同样的酶消化的pUC19(New England Biolabs，Beverly，MA)中。将所得质粒命名为pAraCB，该质粒在5’末端侧含有多接头区(SEQ ID NO：11)和XbaI限制位点(划线的部分)，在3’末端含有HindIII位点(斜体字)。araCB多接头                        SEQ ID NO：11
 TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
用阿拉伯糖诱导含所得表达质粒(pAraMO218)的转化体，然后在37℃生长。这些转化体产生含39kDa蛋白质的包含体，所述蛋白质是几丁质酶的平截形式(加工成含373而不是445个氨基酸)。该几丁质酶片段含4个半胱氨酸残基，而全长几丁质酶含10个半胱氨酸残基。从大肠杆菌培养物中分离所述包含体，在SDS-PAGE上电泳。将39kDa带转移到PVDF膜上，然后进行氨基末端测序。该物质的大部分(约2/3)含对应于人几丁质酶之氨基末端的序列。其余物质对应于污染大肠杆菌蛋白，孔蛋白。来自大肠杆菌的该重组几丁质酶制品可用于产生多克隆和单克隆抗体(下文实施例8描述的)。
当在25℃使含Ara-几丁质酶表达质粒的转化体生长使时，观察不到包含体，重组产物的表达从总细胞蛋白的约10％降到1％。但是在25℃产生的物质有几丁质酶催化活性。
                      实施例4
            用酵母细胞生产重组人几丁质酶
下文给出在酵母中重组表达人几丁质酶并纯化所得重组蛋白的举证性方法。用PCR或者设计的接头寡核苷酸，将人几丁质酶的编码区加工到在啤酒酵母中表达的载体，所述接头寡核苷酸编码含人几丁质酶编码区的分泌介导前导序列的融合多肽，所述前导序列对应于天然分子氨基末端。分泌信号肽包括例如具有功能信号肽酶裂解位点的SUC2或等同前导序列，或者前原α因子或者由具有KEX2裂解位点的前或信号肽以及原或间隔基区组成的其他复合物前导序列。通过寡核苷酸合成或PCR可得到编码信号序列的DNA。用含α交配因子基因的1-20核苷酸的引物和与该基因的核苷酸255-235互补的引物，通过PCR可得到编码前原α因子前导序列的DNA[Kurjan和Herskowitz，细胞(Cell)30：933-943(1982)]。将前原α前导序列的编码序列和人几丁质编码序列片段连接到含酵母醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使所述启动子指导融合蛋白的表达。按照Rose和Broach[Meth.Enz.，185：234-279，D.Goeddel，编，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1990)]的教导，所述载体还包括克隆位点下游的ADH2转录终止子，酵母“2微米”复制原点，可选择标记，例如TRP1，CUP1或者LEU2(或者LEU2-d)或者其他等同基因，酵母REP1和REP2基因，大肠杆菌β内酰胺酶基因以及大肠杆菌复制原点。β内酰胺酶和TRP1基因分别使得可以在细菌和酵母内进行选择。REP1和REP2基因编码与质粒拷贝数复制有关的蛋白质。
或者，选择几丁质酶编码区内的其他融合点。编码区的平截物可用于提高产物的同质性，提高比活性或者改变底物特异性。
用已知方法，例如乙酸锂处理[Stearns等，Meth.Enz.，同上文，pp.280-297]或者等同的方法，将前段中所述的DNA构建体转化到酵母细胞中。在耗尽生长培养基中的葡萄糖后，诱导ADH2启动子[Price等基因(Gene)55：287(1987)]。前原α序列或者其他前导序列影响融合蛋白的分泌，从细胞中释放成熟的人几丁质酶肽。将所述信号肽前导序列通过信号肽酶加工，或者在前原α的情况下，用KEX2蛋白酶除去原区[Bitter等美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：5330-5334(1984)]。
几丁质酶在其成熟氨基酸序列中在位置107-108(Lys-Arg)和209-210(Arg-Lys)含有两个可以在分泌过程中通过KEX2蛋白酶剪切的二碱基序列。为了稳定和/或提高从细胞中分泌的产物的水平，可将这些序列进行突变以消除Gillis等所示的潜在蛋白水解位点[Behring Inst.Mitt.，83：1-7(1988)]或者通过在KEX2缺陷的宿主中表达不含二碱基修饰的几丁质酶来使这些序列发生突变。通过筛选不含KEX2蛋白酶的突变体或者通过基因取代/基因破坏技术操作基因组KEX2座位[Orr-Weaver等美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：6354-6378(1981)]可以得到所述宿主。
可以用类似的含启动子PRB1、GAL4、TPI或者其他适宜的携带各种强启动子的片段的载体或者通过与各种前导序列融合从啤酒酵母中分泌重组几丁质酶[Sleep等，生物/技术(Bio/Tech)8：42-46(1990)]。
其他非啤酒酵母类适宜的表达宿主包括乳克鲁维氏酵母、粟酒裂殖糖酵母、巴斯德毕赤氏酵母以及汉逊氏酵母或曲霉属的成员。用于这些真菌的类似的重组表达系统包括这些生物体本身和其适宜的自主复制型载体[例如，Falcone等质粒(Plasmid)15：248-252(1988)]或者多整合表达盒。这些系统也依赖上述的信号序列或前导序列以便介导向培养基中的分泌。
通过例如用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化几丁质酶的方法(参见实施例3和实施例5)，从酵母生长培养基中纯化分泌的人几丁质酶。
或者，在啤酒酵母细胞或类似宿主的胞质中表达重组几丁质酶产物的成熟形式，然后从溶解的宿主细胞中纯化。在纯化过程中可将所述蛋白质再折叠以便得到适宜的比活性。
                  实施例5
      在哺乳动物细胞中生产重组人几丁质酶
A在COS细胞中表达
分离MO-218克隆和MO-13B克隆，这两个克隆均含有在pRc/CMV的CMV启动子3’的全长人几丁质酶cDNA。按如下方法制备第三个质粒，该质粒对应于在上述实施例3中在细菌细胞中表达的相同C末端片段。用寡核苷酸引物218-1(CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCGG，SBQ ID NO：12)通过PCR扩增MO-218质粒，该引物含有HindIII位点和在SEQ ID NO：1之MO-218几丁质酶cDNA的核苷酸2-23，在PCR反应中还使用互补下游引物T-END(GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG，SEQ ID NO：13)，该引物含MO-218的核苷酸1164-1183，终止密码子和XbaI位点。将扩增的DNA通过电泳纯化，用XbaI和HindIII消化，然后克隆到预先用相同的限制酶消化的pRc/CMV载体(Invitrogen，San Diego，CA)中。将所得克隆的连接物在Model 373(Applide Biosystems，FosterCity，CA)上测序，证实该克隆编码SEQ ID NO：14所列的预测的遗传工程蛋白序列。
通过DEAE转染方法[参见例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室(1989)]将所有三个质粒瞬时转染到COS细胞中。在37℃3天后，按下文实施例9所述体外检测细胞培养基的几丁质酶活性。每种培养物均有显著的几丁质酶活性(600-800mU/ml/分)，同样观察到类似数量的各构建体。
按如下方法纯化重组人几丁质酶。用pRc/CMV-MO-13B质粒转染COS细胞5天后，收集来自培养物的条件培养基，用等体积水稀释。将稀释的条件培养基加到Q-Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)上，该柱用25mM Tris，10mM氯化钠，1mM EDTA，pH8.0预平衡。约95％的几丁质酶活性直流，并不与柱结合。将所述Q-Sepharose直流物用1.2M硫酸铵调整，然后加到Butyl-Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia)上，该柱用25mMTris，1.2M硫酸铵，1mM EDTA，pH8.0预平衡。用在25mM Tris pH8.0中的1.2M-0M硫酸铵反向梯度洗脱蛋白质。在低盐洗脱了对应于几丁质酶活性峰在280nm的单吸收峰。按照用SDS-PAGE确定的，该物质的纯度大于85％并含有约60％的几丁质酶活性。然后将该蛋白质浓缩，用10000 MWCO(UltrafreeTM 10K，Millipore Corp.，Bedford，.MA)缓冲交换到20mM Tris，150mM氯化钠pH8.0中。然后按实施例9和10所述，体外检测该制品的酶促和抗真菌活性。该重组制品的壳三糖酶活性为90nmol/分钟/mg蛋白质。
B在CHO细胞中表达
通过切割来自pRc/CMV/MO-13B的含全长几丁质酶基因的1.77kbHindIII/XbaI片段，然后与用HindIII/XbaI-消化的pDEF1的片段相连，而将几丁质酶基因插入pDEF11(按1997年5月1日申请的美国系列申请08/847218中实施例4的描述构建，该文献引入本文作为参考)，得到质粒pDEF1/CTN.1。再将含1.7kb HindIII/XbaI片段的几丁质酶基因连接到HindIII/XbaI消化的pHDEF1中，得到质粒pHDEF1/CTN.1。质粒pHDEF1与pDEF1相同，不同之处有两点：(1)在pHDEF1中，含潮霉素抗性基因的衍生于pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的2kb EheI/SalI片段代替了19bp的pDEF1的PmeI/SalI片段；(2)在pHDEF1中，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的表达受在120bp NheI/Asp718片段上的短SV40启动子的控制，该片段代替了相应的pDEF1的212bp NheI/Asp718片段。该120bpNheI/Asp718片段用下列方法制备：首先，用寡核苷酸引物94-26(5’-TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA-3’，SEQ ID NO：16)和引物94-27(5’-GCAAGTTTGGCGCGAAATCG-3’，SEQ ID NO：17)，用来自携带SV40-DHFR盒的pDC1(在1997年5月1日申请的美国系列申请08/847218的实施例4中描述的)的DNA作为模板，扩增171bp PCR片段，然后用NheI和Asp718消化该171bp PCR片段。
按1997年5月1日申请的美国系列申请08/847218的实施例5中所述，用质粒pDEF1/CTN.1转染DHFR阴性中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系DG44。另外用质粒pHDEF1/CTN.1转染CHO细胞系DG44，然后用下列改变的方法进行筛选。首先在含800mg/升潮霉素(Calbiochem，San Diego，CA)和次黄嘌呤和胸苷(因此制备DHFR基因非选择性培养基)的培养基(用2-10％透析的FBS补充的DMEM/F-12)中仅筛选潮霉素抗性的细胞。筛选出潮霉素抗性的转染体后，再通过使其在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长来筛选表达DHFR基因的细胞。接着，在先含10nM，然后20nM，最后50nM氨甲喋呤的培养基中筛选DHFR阳性和潮霉素抗性CHO细胞，这样筛选出高水平表达几丁质酶的细胞。
按如下方法纯化pHDEF1/CTN.1转染的含过表达重组人几丁质酶的CHO细胞上清液(rH-几丁质酶)。在阴离子交换色谱的制备过程中，用20mM Tris，pH7.0(缓冲液A)以1∶3稀释所述上清液。将用Q-Sepharose Fast Flow树脂(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)装的阴离子交换柱用缓冲液A平衡，然后每1升树脂负载15升稀释的上清液。从Q-Sepharose收集直流的rH-几丁质酶，然后在阳离子交换色谱的制备中，用5％聚乙二醇(PEG)400(Mallinckrodt Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ)，30mM醋酸钠，pH4.3调整。将用CM-Sepharose Fast Flow树脂(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)装的阳离子交换柱用30mM醋酸钠，5％PEG 400，pH4.3(缓冲液B)平衡。将rH-几丁质酶样品以1mg/mL树脂负载到CM-Sepharose柱上，用40mM Tris，5％PEG，pH7.5(缓冲液C)从柱上洗脱rH-几丁质酶。然后通过加入硫酸铵达到1.5M来制备rH-几丁质酶样品用于疏水相互作用色谱。将用Macro-Prep Methyl H1C Support(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)装的柱用含1.5M硫酸铵的20mMTris，5％PEG，pH7.5(缓冲液D)平衡。将rH-几丁质酶样品以1mg/mL树脂负载到Macro-Prep Methyl柱上。用含1.1M硫酸铵的缓冲液D洗涤该柱，然后用含0.2M硫酸铵的缓冲液D洗脱rH-几丁质酶。通过膜过滤，将纯化的洗脱液交换到150mM氯化钠，20mM Tris，pH7.0(缓冲液B)中。
                 实施例6
      人几丁质酶类似物和片段的生产
用前文实施例中所述的重组技术制备人几丁质酶多肽类似物或片段。更具体地讲，用熟知的技术，例如定点诱变和聚合酶链反应对编码人几丁质酶的多核苷酸进行修饰以使其编码所需的多肽类似物。通过例如缺失所述多寡核苷酸编码序列的适当部分可制备C末端和N末端缺失。主要参见Sambrook等，同上文，第15章。重组表达修饰的多核苷酸，然后按前文实施例所述纯化重组多肽类似物或片段。
通过与其他几丁质酶的同源性和取代天然人几丁质酶氨基酸残基的丙氨酸可鉴定对人几丁质酶活性重要的残基。半胱氨酸通常对蛋白质的功能完整性是很重要的，因为它们可以形成二硫键，从而限制二级结构。为了确定是否人几丁质酶中的任何半胱氨酸对于酶活性均很重要，逐个将每个半胱氨酸突变成丝氨酸。
按上文实施例3和5所述，通过在氨基酸373的密码子后导入终止密码子来制备成熟人几丁质酶蛋白质的39kDa C末端平截片段。该39kDa片段没有成熟蛋白质的72个C末端氨基酸残基，包括6个半胱氨酸，但是与全长重组人几丁质酶相比，保留了相似的特异性酶活性。该结果表明，酶活性不需要失去的72个C末端残基，包括6个半胱氨酸。
另外，通过用核酸外切酶III将实施例3所述的平截人几丁质酶编码序列的3’末端消化不同的时间，然后将变短的编码序列在所有3个阅读框架中与质粒DNA编码终止密码子相连，可制备C末端缺失产物。用类似的方法，通过消化编码序列的5’末端，然后将消化的片段连接到含启动子序列和启动子位点上游紧接着的起始甲硫氨酸的质粒制备N末端缺失产物。还可将这些N-末端缺失类似物或片段表达为融合蛋白。
或者，用本领域已知的技术，通过全部或部分化学肽合成方法来制备人几丁质酶多肽类似物。[参见，例如在Clark-Lewis等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，266：23128-34(1991)中的IL-8的合成；在Clark-Lewis等科学(Science)231：134-139(1986)中的IL-3的合成；以及Dawson等科学(Science)266：776-779(1994)中的连接合成]。所述合成方法还可以选择性地导入新的、非天然氨基酸和其他化学修饰。
通过本领域已知的技术，例如在下文实施例9和15中描述的技术可检测人几丁质酶多肽类似物的生物活性，包括酶、抗真菌和细胞外基质再成型活性。
                  实施例7
     人几丁质酶几丁质-结合片段和其类似物的生产
A  SEAP融合蛋白的产生
通过产生含人几丁质酶N末端平截部分的融合蛋白，然后检测这些产物的几丁质-结合活性来确定人几丁质酶几丁质-结合结构域的位置。首先，按如下方法产生与人几丁质酶的C末端99个氨基酸融合(在嵌合蛋白的C末端)的含全长分泌的碱性磷酸酶(SEAP)蛋白(在嵌合蛋白的N末端)[Berger等基因(Gene)66：1-10(1988)]的嵌合蛋白。以SEAP组分作为所述嵌合蛋白的可示踪标记物。
用在5’末端导入一HindIII位点并在3’末端导入一多克隆区的引物SEAP Start(SEQ ID NO：18)和SEAP Stop(SEQ ID NO：19)，经聚合酶链反应(PCR)从pSEAP2-对照质粒(Clontech，Palo Alto，CA)扩增SEAP DNA。用100ng模板DNA，1μg各引物，0.125mM各dNTP，10mM Tris-HCl，pH8.4，50mM MgCl2和2.5单位Taq聚合酶，完成PCR，在94℃的开始变性步骤反应4分钟，然后30个循环的扩增：在94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟。将该PCR-产生的cDNA克隆到pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)的HindIII和ApaI位点以产生称为pcDNA-SEAP的载体。在相同的条件下，用下列表1中所列的引物通过PCR产生编码人几丁质酶的C末端99个氨基酸的DNA(参见347-445)，在5’和3’末端导入EcoRI和XbaI位点。将该PCR-产生的几丁质酶DNA序列克隆到pcDNA-SEAP之多克隆区的EcoRI和XbaI位点。
通过在含0.5mg/ml DEAE葡聚糖，0.1mM氯喹和10μg质粒DNA的Dulbecco’s改性Eagle培养基(DMEM)中培养1.5小时而将编码所述嵌合体的构建体瞬时转染到COS7细胞中。然后用在磷酸缓冲盐的10％DMSO将细胞处理45秒，用无血清培养基洗涤，然后在用1mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10％胎牛血清补充的DMEM中培养。4天后，按Flanagan和Leder细胞(Cell)63：185-194(1990)所述检测培养基的SEAP活性。SEAP活性是容易检测的。在4℃，将含所述融合蛋白的培养基与不溶性几丁质(Sigma，St.Louis，MO)一起保温1小时，80％以上的SEAP活性与几丁质一起沉淀。该结果表明，在人几丁质酶C末端的99个氨基酸内包含了完整的几丁质-结合结构域。
通过PCR产生编码其他几丁质-结合结构域平截产物的DNA，并将所述DNA按上述表达为与SEAP蛋白质的融合产物。检测这些融合蛋白的几丁质结合活性，在下列表1中给出了结果。
                       表1
   检测的平截物     用于产生平截物的引物 几丁质结合活性
    氨基酸347-445   SEAP CBD 1149(SEQ ID NO：20)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸374-445   SEAP CBD 1231(SEQ ID NO：21)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)     
    氨基酸392-445   SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸400-445   SEAP CBD 1309B(SEQ ID NO：23)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸409-445   SEAP CBD 1338(SEQ ID NO：24)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸347-431   SEAP CBD 1149(SEQ ID NO：20)和SEAP CBD 1357(SEQ ID NO：25)
    氨基酸374-431   SEAP CBD 1231(SEQ ID NO：21)和SEAP CBD 1357(SEQ ID NO：25)
    氨基酸392-431   SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和SEAP CBD 1357(SEQ ID NO：25)
    氨基酸395-445   SEAP CBD 1296(SEQ ID NO：35)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸397-445   SEAP CBD 1300(SEQ ID NO：36)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    氨基酸392-443   SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和Hu Chit Stop 7(SEQ ID NO：37)
B半胱氨酸突变类似物的产生
为了确定人几丁质酶99个C末端氨基酸内的6个半胱氨酸中的任何一个或几个是否对于结合几丁质是重要的，制备几丁质酶片段类似物，其中将每个半胱氨酸逐个突变为丝氨酸。用下列表2中所列的引物产生将6个半胱氨酸中的每一个逐个突变为丝氨酸的6个PCR产物，然后将其按上述与SEAP cDNA融合。按上述检测通过瞬时转染的COS细胞产生的嵌合蛋白的几丁质-结合活性。这些试验的结果说明，6个半胱氨酸中的每一个对于几丁质-结合活性都是必需的。
                        表2
检测的几丁质酶结合结构域   用于产生类似物的引物 几丁质结合活性
    C399S SEAP CBD dC1(SEQ ID NO：27)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    C419S SEAP CBD dC2(SEQ ID NO：28)和Hu Chit Stop(SEQ ID NO：26)
    C429S SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和SEAP CBD dC3(SEQ ID NO：29)
    C439S SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和SEAP CBD dC4(SEQ ID NO：30)
    C441S SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和SEAP CBD dC5(SEQ ID NO：31)
    C442S SEAP CBD 1285(SEQ ID NO：22)和SEAP CBD dC6(SEQ ID NO：32)
通过实施例6中所述的重组技术或者完全或部分化学合成方法可制备其他几丁质-结合片段和其片段类似物。
C  几丁质-结合片段在酵母中的表达
在啤酒酵母中以高水平表达由SEQ ID NO：2的残基392-445组成的几丁质-结合结构域片段。设计表达构建体α-FLAG-CBD，其中将对应于SEQ ID NO：2的残基392-445的核苷酸与编码啤酒酵母α因子前原序列[Brake等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)81：4642-4646(1984)]之序列的3’末端和FLAG表位标记(Eastman Kodak)融合。为了达到该目的，用全长人几丁质酶DNA为模板使用引物CBDαFLAG(有义；SEQ ID NO：33)和Hu Chit Stop 5(反义；SEQ ID NO：34)进行PCR。CBDαFLAG引物序列在FLAG标记编码区的上游含有Asp718限制内切酶位点，所述编码区与编码几丁质-结合结构域片段392-445的前8个氨基酸的序列在框架中。Hu ChitStop 5引物序列编码几丁质-结合结构域片段的7个C末端氨基酸，该结构域片段接有与6个组氨酸残基相连的Gly-Ala-Gly，所述6个组氨酸残基在位于翻译终止密码子前的3个氨基酸片段之前。包括所述His6序列以便有利于通过金属亲和色谱[按Nilsson等，Prot.Expr.Purification 11：1-16(1997)所述]纯化被表达的产物。在终止密码子的紧邻3’包含有NotI限制核酸内切酶位点。
用Asp718和NotI消化用这些引物产生的PCR产物，然后克隆到质粒pAYE/VEC之表达盒内的相应位点，所述质粒通过修饰pAYE674[Delta Biotechnology Limited；Sleep等，生物/技术(Bio/Technology)9：183-187(1991)]，增加限制位点以便有利于将表达盒掺入pSAC/VEC(下文描述的)中而产生的。在所得的称为pAYE/AF/CBD的构建体内的表达盒由编码啤酒酵母α因子前-原序列的核苷酸与几丁质-结合结构域片段框内融合组成。合成后，将所述融合蛋白靶向膜，在膜中，通过KEX2蛋白酶的作用从α因子前原序列中释放成熟的FLAG-几丁质-结合结构域片段-His6肽。α因子前原CBD融合产物的转录是在强启动子PRB1和ADH1的转录终止序列的控制下。
通过用SfiI和PacI消化从pAYE/AF/CBD中切割所述表达盒，然后克隆到pSAC/VEC的相应位点，pSAC/VEC是通过修饰分解载体pSAC35(Delta Biotechnology Limited；Sleep等，同上文)以掺入一多克隆位点而产生的。该穿梭载体pSAC35含有带有LEU2d可选择标记的完整2微米质粒和位于pUC-衍生的大肠杆菌复制原点侧的两个重复序列和β内酰胺酶抗性标记。主要按照Ito等细菌学杂志()153：163-168(1983)所述，将所得的pSAC2/AF/CBD质粒转化到啤酒酵母宿主菌株IE41(cir°leu2 pep4：：URA3 L261；Sleep等，同上文)中，然后通过在亮氨酸缺陷型培养基上生长进行筛选。将pSAC2/AF/CBD导入宿主菌株后，所述重复序列进行单交换重组，消除pUC序列。该载体是自主复制的，高度稳定的，而且已表明，当其宿主在选择性或者非选择性培养基中生长时，该载体可分泌高水平产物(Sleep等，同上文)。
克隆筛选后，在30℃，2毫升选择性培养基中，使4个酵母克隆生长16小时。将培养物随后转移到18毫升YEPD培养基中，在30℃再生长48小时。收集培养基并通过SDS-PAGE评估是否存在表达的重组蛋白。凝胶表明从所有4个克隆中都分泌重组几丁质-结合结构域片段392-445，但从空载体对照中不分泌。通过在Western印迹上其与按实施例8所述产生的几丁质-结合结构域-特异性单克隆抗体的反应性，将分泌的蛋白质阳性鉴定为几丁质-结合结构域片段。
分泌的几丁质-结合结构域片段在酵母培养基中是高度富集的，但不纯。完成初步的小规模金属亲和纯化以得到纯物质。将2毫升Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)加到12毫升滴注柱(BioRad)中。将10毫升50mM NiSO4加到Chelating Sepharose上以便用镍使其带电。用10毫升蒸馏水洗涤后，用10毫升缓冲液A(20mM Tris，pH8，0.5M NaCl)平衡带电的柱。负载前，通过加入TrispH8达到20mM的终浓度而将来自克隆34A之培养基的pH调整到8。使14毫升培养基通过该柱，然后用10毫升缓冲液A洗涤。随后通过含10(2毫升)，50(2毫升)或者100mM(3毫升)咪唑的缓冲液A的连续应用洗脱重组蛋白。用SDS-PAGE分析纯化过程中各10微升的馏份。凝胶分析表明100mM咪唑可洗脱基本上纯的重组几丁质-结合结构域片段392-445。将100mM咪唑洗脱的馏份2和3合并；发现所述合并物含有约0.4mg/ml纯化蛋白质。
为了评估重组蛋白的功能，在4℃将1mg粉末几丁质与25微升纯化的几丁质-结合结构域片段392-445一起保温1小时。保温后，离心除去不溶的几丁质，通过SDS-PAGE将上清液中剩余的蛋白质的量与无几丁质对照培养基的量进行比较。在用几丁质处理的培养基中，观察到重组蛋白减少约50％。这表明至少一种重组蛋白的显著馏份保留了结合几丁质的能力。
设计第二个酵母表达构建体以表达不含FLAG表位和His6标记的由SEQ ID NO：2的残基392-445组成的几丁质-结合结构域片段。按上述组装所述构建体，不同之处在于，用于扩增几丁质-结合结构域-编码区的PCR引物是CBDα(有义；SEQ ID NO：38)和Hu Chit Stop 4(反义；SEQ ID NO：39)。按上述转化并筛选细胞。
在30℃10毫升含2％葡萄糖的SC-leu-ura培养基(Bio101，Vista，CA)中使表达重组几丁质-结合结构域的转化的酵母克隆生长过夜。将1毫升该培养物接种到100毫升相同的培养基中，然后在30℃振荡培养。19小时后，将65毫升培养物接种到在3升发酵罐中的1.2升YB2V培养基[0.2％葡萄糖，0.008％FeCl3，1g/L柠檬酸钠，25g/L酪蛋白氨基酸，13.5g/L KH2PO4，3.8g/L(NH4)2SO4，4mM MgSO4，0.0004％硫胺素，痕量金属和维生素]内。在30℃，pH5.5完成发酵，以1200rpm搅动，空气流速为3L/分钟。用磷酸和氢氧化铵控制pH。在前13个小时批量条件下操作发酵罐，此后，开始按时补加(time feedaddition)。将补料培养基YF6V.1[50％葡萄糖，0.02％ FeCl3，1g/L柠檬酸钠，50g/L酪蛋白氨基酸，2.9g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，15.2mM MgSO4，0.001％硫胺素，痕量金属和维生素]以3.6ml/小时的恒定速率加到发酵罐中，经4小时，然后以5小时加倍时间将补料速率指数增加到9.38ml/小时。共发酵93小时后，离心收集细胞。在4℃，5000xg将1.6升培养液离心40分钟。弃去细胞沉淀，然后通过预过滤器和0.2μM滤器过滤上清液。
使来自发酵的培养基通过几丁质珠柱来纯化重组几丁质-结合结构域。用50毫升柱(Amicon)，用250毫升1％SDS预洗涤，然后用250毫升缓冲液A(20mM Tris，pH8，500mM氯化钠)以2ml/分钟的流速平衡来制备25毫升床体积的几丁质珠(New England Biolabs)。使澄清的培养基以1ml/分钟的流速通过几丁质珠柱。用250毫升缓冲液A洗涤后，用50％乙腈，0.1％三氟乙酸从珠上洗脱蛋白质，并收集4毫升馏份。通过真空离心从洗脱液中蒸发乙腈。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质定量分析洗脱馏份表明，在3个连续馏份中回收了94％的纯化几丁质-结合结构域。从130毫升发酵培养基中共得到109mg几丁质-结合结构域。用MALDI质谱(Perseptive Biosystems)分析纯化的蛋白质表明，有一分子量为5911.9的峰，对应于5909.8的预测质谱的值。在其功能完整性的检测中，与250微升几丁质珠混合的20微克纯化的几丁质-结合结构域产生＞95％与所述珠结合的肽。
                     实施例8
           人几丁质酶的单克隆抗体的制备
用下列两种方法(多攻击或单次注射免疫)产生人几丁质酶的单克隆抗体。在第一种方法中，通过定期注射按实施例3-6任一方法得到的重组人几丁质酶(例如用弗氏完全佐剂乳化的10-20微克)来免疫小鼠。给予小鼠最后预融合的在PBS中的人几丁质酶加强注射液，4天后，杀死小鼠，取出其脾。将脾放在10毫升无血清RPMI 1640，通过研磨浸在无血清RPMI 1640中的两个玻璃显微镜玻片的霜冻末端的脾来形成单细胞上清液，用2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。通过无菌70目Nitex细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，NewJersey)过滤细胞悬浮液，然后以200xg离心5分钟洗涤两次，然后将沉淀重悬于20毫升无血清RPMI。用类似的方法，制备来自3个首次用于实验的Balb/c小鼠取的脾细胞，并用作对照。将融合前3天保持在含11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中的于对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞以200xg离心5分钟，按前段所述将沉淀洗涤两次。
将1×108脾细胞与2.0×107NS-1细胞合并，离心，然后抽吸上清液。通过轻拍试管，使细胞沉淀离开原位，在1分钟的过程中加入1毫升37℃ PEG 1500(在75mM Hepes，pH8.0中50％)(BoehringerMannheim)，同时搅拌，然后在7分钟内加入7毫升无血清RPMI。再加入8毫升RPMI，将细胞以200xg离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬在含15％FBS，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸苷(HAT)(Gibco)，25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106脾细胞/ml的200毫升RPMI，然后铺在10康宁平底96孔组织培养皿(Corning，Corning New York)中。
在融合后2，4和6天，从融合平板的孔中取出100微升培养基，用新鲜培养基代替。在第8天，按下列方法通过ELISA筛选融合，检测其中是否存在与人几丁质酶结合的小鼠IgG。用25mM Tris，pH7.5稀释的100ng/孔人几丁质酶在37℃将Immulon 4平板(Dynatech，Cambridge)涂覆2小时。抽吸涂覆溶液，加入200μl/孔封闭液[用CMF-PBS稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma)]，然后在37℃保温30分钟。用含0.05％Tween 20(PBST)的PBS将平板洗涤3次，然后加入50微升培养上清液。在37℃保温30分钟后，按上述洗涤，加入用PBST以1∶3500稀释的50微升辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。按上述将平板保温，用PBST洗涤4次，加入100微升底物，底物由在100mM柠檬酸，pH4.5中的1mg/ml邻-苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml30％H2O2组成。5分钟后，加入50微升15％硫酸终止颜色反应。在平板读数仪(Dynatech)上读取A490。通过稀释到96孔平板中将所选的融合孔克隆两次，5天后，肉眼记录每孔菌落数。用Isostrip系统(Boehringer Mannheim，IN)将杂交瘤生产的单克隆抗体同型化。
或者，主要按照Spitz酶学方法(Methods Enzymol.)121：33-41(1986)完成利用单次注射的脾内免疫。将动物的脾暴露，然后注射按照实施例3-6任一所述方法得到的重组人几丁质酶(例如以约0.02％-0.04％的浓度在PBS中10-20微克，含有或不含铝佐剂)，此后将脾放回腹腔，用缝线缝合动物。3天后，杀死小鼠，然后取出脾。制备脾细胞悬浮液，用3％胎牛血清(FCS)补充的RPMI1640洗涤两次，然后重悬在25毫升相同的培养基中。收集指数生长期的骨髓瘤细胞(NS-O)，洗涤一次，以3∶1或2∶1(脾细胞∶骨髓瘤细胞)加到在50毫升试管中的脾细胞悬浮液中。将混合物以约450xg(1500rpm)沉淀，抽吸上清液，轻拍试管弄松沉淀。通过在1分钟内加入1毫升聚乙二醇(PEG)1500，同时恒定搅拌，在室温完成融合。将混合物再保温1分钟，然后在1分钟内加入1毫升热RPMI(30-37℃)，然后在3分钟内加入5毫升RPMI，再在另一3分钟内加入10毫升RPMI。将细胞悬浮液离心，然后重悬在约200毫升HAT选择培养基中，所述培养基由用100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，20％FCS，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基喋呤和16μM胸苷补充的RPMI 1640组成。将1毫升细胞悬浮液分散在组织培养皿中，然后在37℃在含5％二氧化碳-95％空气的湿润环境中保温8-10天。将上清液抽吸，按照细胞生长情况，每隔2-3天用1毫升HAT培养基/孔给细胞补充营养。筛选汇合孔上清液的特异性抗体，然后克隆阳性孔。
用上述方法，产生与人几丁质酶有反应性的数种单克隆抗体。为了融合243，在0天，将5只6-12周龄的Balb/c小鼠预先取血，然后通过皮下注射10-20微克按实施例5所述制备的重组人几丁质酶进行免疫，几丁质酶在弗氏完全佐剂中乳化。在第21、42和60天，用在不完全弗氏佐剂中的50微克同样的重组人几丁质酶给每只小鼠加强注射。在第216天至219天，每天给小鼠#2483再注射20微克重组人几丁质酶。在第220天，无菌去除小鼠#2483的脾，然后按上述处理。简而言之，通过研磨浸在无血清RPMI 1640中的两个玻璃显微镜玻片的霜冻末端的脾来形成单细胞上清液，培养基中的补加有2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。通过无菌细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤细胞悬浮液，然后以200xg离心5分钟洗涤两次，然后将沉淀重悬于20毫升无血清RPMI。用类似的方法制备从首次用于实验的Balb/c小鼠中取的胸腺细胞。
将融合前3天保持在含10％胎牛血清(FCS)(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中的于对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞以200xg离心5分钟，按前段所述将沉淀洗涤两次，然后重悬在10毫升无血清RPMI中。
将脾细胞与NS-1细胞以5∶1的比例合并，以200xg离心，然后抽吸上清液。通过轻拍试管，使细胞沉淀离开原位，在1分钟的过程中加入1毫升37℃PEG 1500(在75mM Hepes，pH8.0中50％)(Boehringer Mannheim)，同时搅拌，然后在7分钟内加入14毫升无血清RPMI。再加入16毫升RPMI，将细胞以200xg离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬在含15％ FBS，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸苷(HAT)(Gibco)，25单位/ml IL-6(BoehringerMannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的200毫升RPMI，然后以200微升/孔铺在10个康宁平底96孔组织培养皿(Corning，Corning NewYork)中。在用20号针(Becton Dickinson)从每个孔中抽吸约100微升进行筛选前，给平板中的细胞补充营养3-5次，加入100微升/孔上述平板培养基，该平板培养基含10单位/ml IL-6，但没有胸腺细胞。
用ELISA，在免疫原(全长人几丁质酶)上对来自融合产物243的上清液进行初步筛选，然后用山羊抗小鼠IgG(fc)辣根过氧化物酶结合物进行检测。为了确保纯系性(clonality)，通过用不含氨基喋呤的培养基有限稀释，将从各融合产物筛选的阳性孔亚克隆4次。完成细胞系243K、243M和243Q的克隆。
用Isostrip试剂盒(Boehringer Mannheim)或者利用同种型特异性试剂(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)的ELISA，确定来自两个细胞系之单克隆抗体的同种型。所有抗体均是IgG1同种型。
为了检测这些抗体是否都具有针对几丁质-结合结构域的特异性，用每个抗体检测含全长几丁质酶、C末端平截的几丁质酶(氨基酸1-373)以及酵母中产生的重组几丁质-结合结构域的Western印迹。3个抗体243K、243M和243Q与全长几丁质酶和几丁质-结合结构域结合，但不与C末端平截物结合。
检测所有3种抗体的所有组合用于夹心ELISA的应用性。用125微升2μg/ml的第一抗体包被Nunc-Immuno Module平板，然后在4℃保温过夜。然后用300微升/孔封闭液(5％Teleostean明胶，在CMF-PBS中的0.05％Proclin 300)代替抗体溶液。在室温保温30分钟后，用在0mno稀释剂((1％Teleostean明胶，0.05％Tween20在CMF-PBS中的0.05％Proclin 300)中的20ng/ml重组几丁质-结合结构域代替封闭液，然后在37℃保温30分钟。用洗涤缓冲液(145mM氯化钠，1.5％Tween 20)将孔洗涤5次，然后加入0.25μg/ml生物素化第二抗体。在37℃保温30分钟后，将孔再洗涤5次，用100微升链霉抗生物素-结合的辣根过氧化物酶(Pierce)处理，然后在37℃保温30分钟。再洗涤5次后，向孔中加入100微升底物(用二甲亚砜以1∶100稀释到100mM醋酸钠三羟化物中的0.01g/ml四甲基联苯胺，pH5.5，0.015％H2O2)，然后在黑暗中在室温保温。30分钟后，加入100微升1N硫酸终止反应，确定在450和630nm波长的吸收值。该方法鉴定出243Q(第一抗体)和243M(第二抗体)为相对于所有其他组合可传递最大信号的组合。生产抗体243Q的杂交瘤243Q被保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，保藏号为＿＿＿＿。生产抗体243M的杂交瘤243M被保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，保藏号为＿＿＿＿。
                     实施例9
             重组几丁质酶的催化活性
用在McUlvain缓冲液(Hollak等同上文)中的产荧光底物4-甲基umbell iferyl-β-D-N，N’，N”-三乙酰基壳三糖(4-MU-壳三糖，SigmaChemical，St.Louis，MO)测量壳三糖酶(几丁质酶)活性。将10微升实施例5A中所述的重组产物样品与10微升牛血清白蛋白(10mg/ml)，15微升产荧光底物(2.71mM)和65微升缓冲液(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸钠，pH5.2)以100微升的总体积混合。在37℃，将反应进行15分钟，然后加入2毫升0.3M甘氨酸/NaOH缓冲液(pH10.6)终止反应。用荧光测量仪(SLM-AMINCO Instruments，Inc.，Rochester，NY)在450nm监测荧光裂解产物，4-甲基伞形酮。为了得到标准曲线，将数个底物浓度与过量细菌几丁质酶混合以确保底物被完全裂解。然后已知量的4-MU与荧光测量仪的荧光信号相关联，然后用线性回归确定标准曲线。用实验中稀释的纯化重组几丁质酶产生的信号代表反应过程中由所述酶裂解的底物的nmol量。然后该数除以蛋白质的浓度以得到nmol/分钟/mg蛋白质(用A280和计算的摩尔消光系数确定的)。
确定出在实施例5A COS细胞中产生的重组人几丁质酶的壳三糖酶活性是90nmol/分钟/mg蛋白质。还可以用该方法检测本发明任何人几丁质酶片段产物的几丁质酶酶活性。
                      实施例10
          几丁质酶片段产物的体外抗真菌活性
可以检测已与本发明的人几丁质酶产物结合的常规抗真菌剂在体外已知真菌生长的作用。两种真菌白色假丝酵母和烟曲霉对于无免疫应答的患者来说是炎症的病原体。在37℃，使念珠菌和曲霉在RPMI生长培养基中生长到约10000-50000菌落形成单位(CFU)/ml。将系列稀释的试验药物加到培养物中，在24小时，通过培养物的浊度评估真菌的生长。
还可用琼脂扩散实验，按照国家委员会关于临床实验室标准的肉汤检测，以及按照Selitrennikoff，Antimicrob.AgentsChemother.，23：757-765(1983)的细胞壁抑制实验评估试验药物的抗真菌活性。
在琼脂扩散实验中，将约1×106细胞/ml白色假丝酵母(ATCCno.90028)接种到1.5％琼脂(用2-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)，pH7.0缓冲的RPMI 1640培养基)中。将含一定量例如50微克试验药物或对照的平皿放在琼脂上，然后测量生长抑制区。
在肉汤实验中，将一定量例如50微克/ml试验药物或者对照与一定浓度的试验真菌一起加到用MOPS，pH7.0缓冲的RPMI 1640培养基中。将样品在35℃培养48小时，同时以120rpm振荡，然后通过测量悬浮液的浊度评估生长情况。适宜浓度的试验真菌包括：2.5×104细胞/ml白色假丝酵母(ATCC no.90028)；5×104细胞/ml白色假丝酵母聚烯抗性(ATCC no.38247)；1×104细胞/ml烟曲霉(ATCC no.16424)；1×104细胞/ml粗糙链孢霉(ATCC no.18889)和1×104细胞/ml啤酒酵母(ATCC no.26108)。
基本按照Selitrennikoff，同上文所述，将1.5×105原生质体/ml接种到琼脂(Vogel’s Medium N，7.5％山梨醇，1.5％蔗糖，10微克ml烟酰胺和1％琼脂)中，然后在25℃培养72小时，完成os-1全细胞检测，该检测可鉴定真菌细胞壁生物合成抑制剂。在将含一定量例如50微克试验药物或对照的平皿放在琼脂培养基上后，监测培养物的生长和形态改变。os-1细胞是当在37℃的特定条件下培养时，生长为没有细胞壁的原生质体，但在温度变为约22℃的适宜条件下再生出细胞壁的粗糙链孢霉的突变株。抑制生长的样品被认为是真菌生长抑制剂，抑制细胞壁再生，但不杀死细胞的样品被认为是细胞壁特异性抑制剂。
                    实施例11
        重组几丁质酶在小鼠体内的抗真菌活性
按下列方法确定重组人几丁质酶在小鼠中的药物动力学。给6-8周龄的雌性Balb/c小鼠通过在尾静脉中进行静脉内注射施用0.5mg/kg，5.0mg/kg和50mg/kg的重组人几丁质酶。对于每个剂量，在注射后0.01，0.25，1，8和24小时后定时取血(每个剂量，每个时间点使用2只动物)。然后监测血清样品的几丁质酶活性和浓度。在下表3中列出了结果。
                      表3
剂量(mg/kg) AUC(μg/ml/h) Vss(ml/kg) cL(ml/h/kg) MRT(h) 半衰期(h) Cmax(μg)
 0.5  31.24  12.03  16.01  0.75  0.74  22.30
 5.0  278.50  13.61  17.95  0.76  1.38  162.84
 50.0  2505.83  52.92  19.95  2.65  2.33  1179.19
AUC：在曲线下到无穷时间的面积
Vss：分布的稳定状态体积
cL：清除率
MTR：总身体平均滞留时间
Cmax：峰值血清浓度
可用同样的方法评估本发明的几丁质酶片段产物或者含所述几丁质酶片段产物的药物的药物动力学。
已开发了数个动物模型用于检测抗真菌化合物的效力[参见Louie等，感染与免疫(Infect.Immun.)62：2761-2772，1994；Kinsman等抗微生物剂和化疗(Antimicrobial Agents andChemotherapy)37：1243-1246，1993；Nakajima等抗微生物剂和化疗(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)39：1517-1521，1995；Tonetti等欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)25：1559-1565(1995)；Denning和Stevens，抗微生物剂和化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)35：1329-1333(1991)；另参见Stevens，J.Mycol.，Med.，6(suppl.I)：7-10(1996)]。简而言之，用真菌感染动物宿主，给所述动物施用不同剂量的试验药物，过一段时间测量其存活。用常规抗真菌剂或者与几丁质酶片段产物结合的同样的试剂完成比较实验以确定所述试剂与几丁质-结合片段产物的结合是否提高其抗真菌效力。具体地讲，通过10×106CFU白色假丝酵母的腹膜内或者静脉内攻击使小鼠患急性全身性念珠菌病。在攻击前或者在攻击后1-5小时施用治疗剂，5天后确定存活小鼠的数量。另外，可将小鼠杀死，确定具体器官例如脑、肾、肺、肝和脾中的真菌数。或者，用较低剂量的真菌例如曲霉(8-10×106CFU)或者念珠菌(1×106CFU)攻击小鼠，其中在更久的时间点，例如45天测量存活的小鼠数。通过连续治疗一周或更长的时间，例如11天，然后跟踪动物达数周，例如18天至一个月可评估试验药物的长期杀真菌/抑制真菌活性。有效的抗真菌剂可提高动物的长期存活并减少血液和器官中的真菌数。
                    实施例12
      在侵染性曲霉病兔模型中几丁质酶的体内活性
用侵染性曲霉病的免疫抑制兔模型评估含几丁质酶片段产物的治疗剂的效力，该模型用于评估各种抗真菌治疗已达十多年。参见例如，Andriole等，临床传染病(Clin.Infect.Dis.)。14(Suppl.1)：S134-S138(1992)。主要按照Patterson等，抗微生物剂化疗(Antimicrob. Agents Chemother.)37：2307-2310(1993)或者George等，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，168：692-698(1993)所述完成该研究。简而言之，在第1天，给兔静脉内施用环磷酰胺(200mg)以减少其血小板，然后在实验过程中每天皮下施用曲安奈德(10mg)。在第2天，在免疫抑制24小时后，将动物用约105(致死攻击)或约105(亚致死攻击)烟曲霉分生孢子进行静脉内攻击。在攻击24小时后或攻击48小时前(预防性的)，开始用试验药物进行抗真菌治疗并持续5至6天或直至动物死亡。常规抗真菌剂的示范剂量为1.5或0.5mg/kg/天静脉内给药两性霉素B，60或120mg/kg/天口服给药氟康唑和100mg/kg/天口服给药5-氟胞嘧啶。对照兔不用抗真菌剂治疗。
在尸检或死亡时，对肝、脾、肾、肺和脑进行半定量真菌培养和组织病理学检查。还对心脏、尿和血进行培养。间隔取血并检测白细胞计数并用ELISA检测分析循环中的曲霉碳水化合物抗原。按三种效应评估用试验药物治疗的效果：死亡率的降低、来自靶器官的曲霉微生物数量(真菌负荷)的减少以及循环曲霉抗原水平的降低。有效的抗真菌剂可以降低死亡率和/或真菌负荷。
或者，可以按照Cbilvers等，Mycopathologia，108：163-71(1989)的描述，用该模型评估肺曲霉病，其中，将免疫抑制的兔用烟曲霉分生狍子通过气管内滴注进行攻击，然后在攻击后的第1、2、4、7和10天进行支气管肺泡灌洗；对灌洗液进行真菌培养、几丁质检测、白细胞计数以及组织病理学分析以确定肺内的感染负荷。有效的抗真菌剂可以减少肺内的感染负荷或炎症。
                       实施例13
     在弥散性念珠菌病兔模型中几丁质酶的体内活性
按照Rouse等，抗微生物剂化疗(Antimicrob.AgentsChemother.)，36：56-58(1992)的描述在弥散性念珠菌病兔模型中评估含几丁质酶片段产物的治疗剂的效力。将新西兰白兔用约3×106白色假丝酵母芽生孢子进行全身性感染。在用念珠菌攻击后48小时(或在攻击前预防)开始用试验药物进行抗真菌治疗并持续例如4天。处死存活的动物，对带有附着了赘生物的主动脉瓣、肺、肾和脾进行真菌培养。对这些以及其他的器官如肝、脑和心脏同样进行真菌培养和组织病理学检查。还进行了尿和血的培养。确定抗真菌治疗对死亡率和循环或组织真菌负荷的效力。
Bayer等，抗微生物剂化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)，19：179-184(1981)描述了用约5×108CFU白色假丝酵母腹膜内接种的兔模型。在腹膜内接种后4天，从各动物获取盐水腹膜吸出物并培养，将真菌培养吸出物呈阳性的动物随机分成对照或治疗组。攻击7天后开始用试验药物进行抗真菌治疗。用检眼镜间接检查法对所有兔子的眼睛进行评估，因为弥散性念珠菌病可以引起念珠菌眼内炎。在开始治疗7、11和14天后处死动物并检查其腹部是否有腹膜炎和腹内脓肿形成的迹象。用肉眼观察眼睛的损伤。将来自腹膜脓肿、其他所有可见脓肿、肾、肝、脾和眼结构的组织样品称重，在脑心灌注肉汤中匀浆化、系列稀释然后培养以确定每克组织的CFU。还将肾和腹膜脓肿在10％中性甲醛中固定并进行组织病理学检查。将切片用高碘酸-Schiff试剂染色以确定真菌负荷和真菌形态。评估药物改善存活率和减少真菌负荷的效力。
                    实施例14
        在真菌眼内炎兔模型中几丁质酶的体内活性
按照Park等，抗真菌剂化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)39：958-963(1995)的描述在念珠菌眼内炎兔模型中评估含几丁质酶片段产物的治疗剂的效力。简而言之，将2-2.5kg新西兰白化兔用约1000CFU的白色假丝酵母玻璃体内接种感染。接种5天后通过检眼镜间接检查确定所述兔感染了眼内炎，并根据视网膜和脉络膜脉管系统的部分或大于50％的完全变暗而将眼内炎定义为中度至严重玻璃体模糊。玻璃体的浊度按大小分级，可通过基底照相术将基底外观分级并记录。然后用试验药物给兔治疗2-4周。常规抗真菌剂的示范剂量为80mg/kg/天的口服氟康唑，每隔12小时100mg/kg口服5-氟胞嘧啶。
在治疗2和4周，通过间接检眼镜检查、定量真菌培养和组织病理学检查评估治疗效果。对于定量真菌培养，将眼割下并称重，将各样品称重的部分匀浆，然后在布鲁氏杆菌琼脂-5％马血平板上，在35℃5-10％CO2中培养48小时。还可将匀浆的样品在铺板前用无菌盐水稀释10-或100倍。以从测量的样品部分产生的生长为基础，用肉眼计数菌落和总CFU。根据总眼内真菌负荷的减少来评估治疗效果。对于组织病理学检查，取出代表性的眼，用福尔马林固定，包埋入塑料，然后切成5微米的切片。将所述切片用苏木精-曙红或者Gomori’s乌洛托品银染料染色，然后用光学显微镜进行炎症、纤维组织和真菌检查。评估抗真菌剂对降低死亡率、减少真菌负荷或者降低与真菌感染有关的炎症的作用。
或者，主要按照Jain等，Doc.OphthDlmol.，69：227-235(1988)所述使用曲霉眼炎兔模型。简而言之，给新西兰白兔的一只眼中接种约40个烟曲霉的孢子。其对侧眼(对照)接受同样量的无菌接种物。用试验药物治疗后，可评估兔眼的临床外观、视网膜电图波形、检眼镜间接检查、定量真菌培养和组织病理学检查。临床上明显的眼内炎主要是在接种后3-7天内发生。
                       实施例15
       几丁质酶在真菌心内膜炎兔模型中的体内活性
主要按照Witt和Bayer，抗微生物剂化疗(Antimicrob.AgentsChemother.)，35：2481-2485(1991)所述用念珠菌心内膜炎兔模型评估含几丁质酶片段产物的治疗剂的效力。另外可参见Longman等，传染病综述(Rev.Infect.Dis.)，12(Suppl.3)：S294-298(1990)。通过经主动脉瓣放置一无菌聚乙烯导管(内径，0.86mm)，使新西兰白兔产生无菌血栓形成心内膜炎，所述导管在研究期间保持在原处。然后在插管48小时后，通过静脉内注射约2×107白色假丝酵母芽生孢子建立传染性心内膜炎。或者，还使用近平滑假丝酵母。在真菌攻击前24小时或者之后24-60小时开始用试验药物进行抗真菌治疗。治疗持续9-12天。常规抗真菌剂的举证性剂量为1mg/kg/天静脉内两性霉素B，50mg/kg/天或者100mg/kg/天静脉内或者腹膜内氟康唑。不给对照兔施用抗真菌剂。在处死时，取出心，确定所述导管的位置。去除来自各动物的心赘生物，合并，称重，然后用1毫升无菌盐水匀浆。将所述匀浆物系列稀释，然后在35℃，酵母钾葡萄糖琼脂上定量培养48小时。以平均赘生物重量为基础，认为培养阴性赘生物含不到2log10 CFU/克。
                      实施例16
人几丁质酶片段的几丁质-结合活性和几丁质水解活性
A.几丁质-结合结构域对于几丁质酶与几丁质的结合是必需的
将全长几丁质酶(445个氨基酸)的几丁质-结合和壳三糖酶活性与上述实施例5中所述的C末端平截片段(氨基酸1-373)的活性进行比较。按下列方法制备全长几丁质酶和几丁质酶片段。将实施例5中所述全长几丁质酶(MO-13B)和373氨基酸C末端平截片段的表达构建体转染到COS细胞中。24小时后，用不含胎牛血清的培养基代替培养基[Dulbecco’s改性Eagle培养基(Gibco)+10％胎牛血清+1mM L-谷酰胺+100U/ml青霉素+100微克/ml链霉素]。将细胞再培养3天，此后，收集培养基，并检查水解和几丁质-结合活性。
按实施例9所述确定的壳三糖酶活性的水平与从表达全长几丁质酶(57.6nmol/ml/分钟)的培养基和表达C末端平截片段(57.8nmol/ml/分钟)的培养基中的活性几乎相同。这与实施例6中报道的结果一致。用于确定壳三糖酶活性(按实施例9)的底物是三乙酰基壳三糖，三个残基的可溶性寡糖。
为了比较几丁质-结合活性，用研钵和杵将蟹壳几丁质(Sigma)磨成细粉，用平衡缓冲液(20μM Tris.pH8，500μM NaCl)洗涤3次，然后重悬为100mg/ml。将100微升几丁质悬浮液加到1毫升转染的COS细胞培养基中，在4℃，将混合物培养4小时，同时用连续立式圆筒混合机混合。培养后，通过离心(5分钟，12000xg)沉淀几丁质。用Laemmli缓冲液和50mM二硫苏糖醇(DTT)补充等体积上清液，煮沸，通过12％聚丙烯酰胺凝胶(Novex)电泳。随后用几丁质酶-特异性单克隆抗体(260A)通过Western印迹分析凝胶表明在上清液中没有全长几丁质酶，即所有全长几丁质酶均已于几丁质结合并已与几丁质一起沉淀。相反，在上清液中C末端平截片段(氨基酸1-373)的量没有辨别得出的的减少，这表明所述平截物未与几丁质结合。
这些观察结果表明人几丁质酶的72个C末端氨基酸对于几丁质-结合活性是必需的，但对于三乙酰基壳三糖的水解不是必需的。
B.几丁质-结合结构域对于几丁质而不是三乙酰基壳三糖的水解是必需的
上述用于实施例16A中用于确定壳三糖酶活性的底物是可溶的，三残基寡糖。但是，天然几丁质是长链不溶性多糖。因此，有可能能够水解小类似物的酶不能水解几丁质。为了比较全长几丁质酶(445个氨基酸)与C末端平截片段(1-373个氨基酸)的几丁质分解活性，将蟹壳几丁质掺入到琼脂糖凝胶中。在固化凝胶中打孔，加入全长几丁质酶或平截物。保温后，孔周围的澄清区表明几丁质水解的程度。
按下列方法完成试验。将0.4％几丁质悬浮液和1.5％琼脂糖在20μM磷酸钠pH6中煮沸，倒入10厘米平皿中，达到2毫米的厚度，使其固化。琼脂糖/几丁质基质中的切出直径3毫米的孔。向孔中加样前，在30000分子量截断过滤装置(Millipore)上，将来自转染的COS细胞之培养基中的重组蛋白浓缩70倍。将等量全长和C末端平截重组蛋白加入到相邻孔中。第3个孔加入来自模拟转染的COS细胞的浓缩培养基。需要重复每个孔的等量负荷以便产生可用肉眼观察的澄清区。在负载有来自产生全长几丁质酶的COS细胞的浓缩培养基的孔周围，观察到距孔达3毫米的澄清区。在含平截物的培养基或模拟转染细胞培养基的孔周围没有观察到澄清区。
这些结果表明人几丁质酶的C末端72个氨基酸对于几丁质的水解是必需的。
                    实施例17
通过与其他试剂结合的重组几丁质-结合结构域的化学修饰
为了检测几丁质-结合结构域是否能够作为小分子药物的载体，将由人几丁质酶氨基酸392-445组成的几丁质-结合结构域与生物素或者罗丹明按下列方法化学结合。
按照制造商的方法用Pierce EZ-link Sulfo-NHS-BiotinyJation试剂盒(Pierce)完成生物素化。预期NHS键针对在几丁质-结合结构域上的游离氨，而游离氨被发现位于N末端的赖氨酸402和440。与预期一致，MALDI质谱表明有三种生物素化产物，其质量分别对应于每个肽一个、两个或三个生物素分子。大部分(＞60％)是三生物素化的。
用琥珀酰亚胺基(succinimidyl)键(Molecular Probes)，将罗丹明与几丁质-结合结构域的N末端相连。
生物素-或者罗丹明-标记的肽与几丁质的结合同非标记肽的结合特性是没有区别的。这表明几丁质-结合结构域能够耐受一些化学修饰而不会损害其几丁质-结合活性。
预期本领域技术人员可以对上述本发明进行许多修饰和改变。因此，仅有后附的权利要求书可构成所述限制。
                             序列表<110>(发明人)Gray，Patrick W.
 (发明人)Tjoelker，Larry W.
 ICOS CORPORATION<120>几丁质酶几丁质结合片段<130>27866/35407<140><141><150>09/039，198<151>1998-03-12<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1636<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(2)..(1399)<220><221>成熟肽<222>(65)..(1399)<400>1c atg gtg cgg tct gtg gcc tgg gca ggt ttc atg gtc ctg ctg atg atc 49Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile
  -20                 -15                 -10cca tgg ggc tct gct gca aaa ctg gtc tgc tac ttc acc aac tgg gcc   97Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala-5              -1   1               5                  10cag tac aga cag ggg gag gct cgc ttc ctg ccc aag gac ttg gac ccc   145Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro
         15                  20                  25agc ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc ttc gct ggc atg acc aac cac   193Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His
     30                  35                  40cag ctg agc acc act gag tgg aat gac gag act ctc tac cag gag ttc   241Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe
 45                  50                  55aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag ctg aag acc ctg tta gcc atc   289Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile60                  65                  70                  75gga ggc tgg aat ttc ggc act cag aag ttc aca gat atg gta gcc acg   337Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr
             80                  85                  90gcc aac aac cgt cag acc ttt gtc aac tcg gcc atc agg ttt ctg cgc   385Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg
         95                 100                 105aaa tac agc ttt gac ggc ctt gac ctt gac tgg gag tac cca gga agc   433Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser
    110                 115                 120cag ggg agc cct gcc gta gac aag gag cgc ttc aca acc ctg gta cag   481Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln
125                 130                 135gac ttg gcc aat gcc ttc cag cag gaa gcc cag acc tca ggg aag gaa   529Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu140                 145                 150                 155cgc ctt ctt ctg agt gca gcg gtt cca gct ggg cag acc tat gtg gat   577Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp
            160                 165                 170gct gga tac gag gtg gac aaa atc gcc cag aac ctg gat ttt gtc aac   625Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn
        175                 180                 185ctt atg gcc tac gac ttc cat ggc tct tgg gag aag gtc acg gga cat   673Lau Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His
    190                 195                 200aac agc ccc ctc tac aag agg caa gaa gag agt ggt gca gca gcc agc   721Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser
205                 210                 215ctc aac gtg gat gct gct gtg caa cag tgg ctg cag aag ggg acc cct   769Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro220                 225                 230                 235gcc agc aag ctg atc ctt ggc atg cct acc tac gga cgc tcc ttc aca   817Ala Ser Lye Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
            240                 245                 250ctg gcc tcc tca tca gac acc aga gtg ggg gcc cca gcc aca ggg tct   865Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser
        255                 260                 265ggc act cca ggc ccc ttc acc aag gaa gga ggg atg ctg ccc tac tat   913Gly Thr Pro Gly Pro Pha Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr
    270                 275                 280gaa gtc tgc tcc tgg aag ggg gcc acc aaa cag aga atc cag gat cag   961Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln
285                 290                 295aag gtg ccc tac atc ttc cgg gac aac cag tgg gtg ggc ttt gat gat   1009Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp300                 305                 310                 315gtg gag agc ttc aaa acc aag gtc agc tat ctg aag cag aag gga ctg   1057Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu
            320                 325                 330ggc ggg gcc atg gtc tgg gca ctg gac tta gat gac ttt gcc ggc ttc   1105Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
        335                 340                 345tcc tgc aac cag ggc cga tac ccc ctc atc cag acg cta cgg cag gaa   1153Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu
    350                 355                 360ctg agt ctt cca tac ttg cct tca ggc acc cca gag ctt gaa gtt cca   1201Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro
365                 370                 375aaa cca ggt cag ccc tct gaa cct gag cat ggc ccc agc cct gga caa   1249Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln380                 385                 390                 395gac acg ttc tgc cag ggc aaa gct gat ggg ctc tat ccc aat cct cgg   1297Asp Thr Phe Cys Gln Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg
            400                 405                 410gaa cgg tcc agc ttc tac agc tgt gca gcg ggg cgg ctg ttc cag caa   1345Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln
        415                 420                 425agc tgc ccg aca ggc ctg gtg ttc agc aac tcc tgc aaa tgc tgc acc   1393Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr
    430                 435                 440tgg aat tgagtcgcta aagcccctcc agtcccagct ttgaggctgg gcccaggatc    1449Trp Asn
445actctacagc ctgcctcctg ggttttccct gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt 1509tctgtggtct tcctttatcc aggctttctg ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt 1569ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaat aaatctttgg tttgtgcccc tcttcccaaa 1629aaaaaaa                                                           1636<210>2<211>466<212>PRT<213>人<400> 2Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile
-20                 -15                 -10Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala-5              -1   1               5                  10Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro
         15                  20                  25Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His
     30                  35                  40Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe
 45                  50                  55Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile60                  65                  70                  75Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr
             80                  85                  90Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg
         95                 100                 105Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser
    110                 115                 120Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln
125                 130                 135Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu140                 145                 150                 155Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp
            160                 165                 170Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn
        175                 180                 185Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His
    190                 195                 200Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser
205                 210                 215Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro220                 225                 230                 235Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
            240                 245                 250Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser
        255                 260                 265Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr
    270                 275                 280Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln
285                 290                 295Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp300                 305                 310                 315Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu
            320                 325                 330Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
        335                 340                 345Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu
    350                 355                 360Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro
365                 370                 375Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln380                 385                 390                 395Asp Thr Phe Cys Gln Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg
            400                 405                 410Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln
        415                 420                 425Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr
    430                 435                 440Trp Asn
445<210>3<211>1656<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(27)..(1424)<220><221>成熟肽<222>(90)..(1424)<400>3gctgcagcct gccgctgagc tgcatc atg gtg cgg tct gtg gcc tgg gca ggt  53
                        Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly
                            -20                 -15ttc atg gtc ctg ctg atg atc cca tgg ggc tct gct gca aaa ctg gtc    101Phe Met Val Leu Leu Met Ile Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val
    -10                 -5               -1   1tgc tac ttc acc aac tgg gcc cag tac aga cag ggg gag gct cgc ttc    149Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe5                  10                  15                  20ctg ccc aag gac ttg gac ccc agc ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc    197Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala
             25                  30                  35ttc gct ggc atg acc aac cac cag ctg agc acc act gag tgg aat gac    245Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp
         40                  45                  50gag act ctc tac cag gag ttc aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag    293Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys
     55                  60                  65ctg aag acc ctg tta gcc atc gga ggc tgg aat ttc agc act cag aag    341Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe Ser Thr Gln Lys
 70                  75                  80ttc aca gat atg gta gcc acg gcc aac aac cgt cag acc ttt gtc aac    389Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn85                  90                  95                 100tcg gcc atc agg ttt ctg cgc aaa tac agc ttt gac ggc ctt gac ctt    437Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu
            105                 110                 115gac tgg gag tac cca gga agc cag ggg agc cct gcc gta gac aag gag    485Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu
        120                 125                 130cgc ttc aca acc ctg gta cag gac ttg gcc aat gcc ttc cag cag gaa    533Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu
    135                 140                 145gcc cag acc tca ggg aag gaa cgc ctt ctt ctg agt gca gcg gtt cca    581Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro
150                 155                 160gct ggg cag acc tat gtg gat gct gga tac gag gtg gac aaa atc gcc    629Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala165                 170                 175                 180cag aac ctg gat ttt gtc aac ctt atg gcc tac gac ttc cat ggc tct    677Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser
            185                 190                 195tgg gag aag gtc acg gga cat aac agc ccc ctc tac aag agg caa gaa   725Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu
        200                 205                 210gag agt ggt gca gca gcc agc ctc aac gtg gat gct gct gtg caa cag    773Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln
    215                 220                 225tgg ctg cag aag ggg acc cct gcc agc aag ctg atc ctt ggc atg cct    821Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro
230                 235                 240acc tac gga cgc tcc ttc aca ctg gcc tcc tca tca gac acc aga gtg    869Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val245                 250                 255                 260ggg gcc cca gcc aca ggg tct ggc act cca ggc ccc ttc acc aag gaa    917Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu
            265                 270                 275gga ggg atg ctg gcc tac tat gaa gtc tgc tcc tgg aag ggg gcc acc    965Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr
        280                 285                 290aaa cag aga atc cag gat cag aag gtg ccc tac atc ttc cgg gac aac    1013Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn
    295                 300                 305cag tgg gtg ggc ttt gat gat gtg gag agc ttc aaa acc aag gtc agc    1061Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser
310                 315                 320tat ctg aag cag aag gga ctg ggc ggg gcc atg gtc tgg gca ctg gac    1109Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp325                 330                 335                 340tta gat gac ttt gcc ggc ttc tcc tgc aac cag ggc cga tac ccc ctc    1157Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu
            345                 350                 355atc cag acg cta cgg cag gaa ctg agt ctt cca tac ttg cct tca ggc    1205Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly
        360                 365                 370acc cca gag ctt gaa gtt cca aaa cca ggt cag ccc tct gaa cct gag    1253Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu
    375                 380                 385cat ggc ccc agc cct gga caa gac acg ttc tgc cag ggc aaa gct gat    1301His Gly Pro Ser Pro Gly Gln Asp Thr Phe Cys Gln Gly Lys Ala Asp
390                 395                 400ggg ctc tat ccc aat cct cgg gaa cgg tcc agc ttc tac agc tgt gca    1349Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala405                 410                 415                 420gcg ggg cgg ctg ttc cag caa agc tgc ccg aca ggc ctg gtg ttc agc   1397Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser
            425                 430                 435aac tcc tgc aaa tgc tgc acc tgg aat tgagtcgcta aagcccctcc         1444Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr Trp Asn
        440                 445agtcccagct ttgaggctgg gcccaggatc actctacagc ctgcctcctg ggttttccct 1504gggggccgca atctggctcc tgcaggcctt tctgtggtct tcctttatcc aggctttctg 1564ctctcagcct tgccttcctt ttttctgggt ctcctgggct gcccctttca cttgcaaaat 1624aaatctttgg tttgtgcccc tcaaaaaaaa aa                               1656<210>4<211>466<212>PRT<213>人<400>4Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile
-20                 -15                 -10Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala-5              -1   1               5                  10Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro
         15                  20                  25Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His
     30                  35                  40Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe
 45                  50                  55Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile60                  65                  70                  75Gly Gly Trp Asn Phe Ser Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr
             80                  85                  90Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg
         95                 100                 105Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser
    110                 115                 120Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln
125                 130                 135Asp Leu Ala ASn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu140                 145                 150                 155Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp
            160                 165                 170Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn
        175                 180                 185Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His
    190                 195                 200Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser
205                 210                 215Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro220                 225                 230                 235Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr
            240                 245                 250Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser
        255                 260                 265Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr
    270                 275                 280Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln
285                 290                 295Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp300                 305                 310                 315Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu
            320                 325                 330Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe
        335                 340                 345Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu lle Gln Thr Leu Arg Gln Glu
    350                 355                 360Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro
365                 370                 375Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln380                 385                 390                 395Asp Thr Phe Cys Gln Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg
            400                 405                 410Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln
        415                 420                 425Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr
    430                 435                 440Trp Asn
445<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>5gacactatag aatagggc                                      18<210>6<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>6tgggatcatc agcaggacca tgaaacctgc ccaggccaca gaccgcaccat  51<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>7tacatctaga attatggcaa aactggtctg ctacttcacc              40<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>8agatctaacc ttaggtgcct gaagacaagt atgg                    34<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>9tacagaattc ttattcacat  ccggccctg                      29<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>10tacatctaga ctccatccag aaaaacaggt atgg                 34<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>11tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt                       30<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>12cgcaagcttg agagctccgt tccgccacat ggtgcggtct gtggcctggg 50<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>13gactctagac taggtgcctg aaggcaagta tg                   32<210>14<211>373<212>PRT<213>人<400>14Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly1               5                  10                  15Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His
         20                  25                  30Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr
     35                  40                  45Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys
 50                  55                  60Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe65                  70                  75                  80Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln
             85                  90                  95Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp
        100                 105                 110Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Ala
    115                 120                 125Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln Asp Leu Ala Asn Ala
130                 135                 140Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser145                 150                 155                 160Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val
            165                 170                 175Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp
        180                 185                 190Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr
    195                 200                 205Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala
210                 215                 220Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile225                 230                 235                 240Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser
            245                 250                 255Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro
        260                 265                 270Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tlr Tyr Glu Val Cys Ser Trp
    275                 280                 285Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln Lys Val Pro Tyr Ile
290                 295                 300Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys305                 310                 315                 320Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val
            325                 330                 335Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gln Gly
        340                 345                 350Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu Leu Ser Leu Pro Tyr
    355                 360                 365Leu Pro Ser Gly Thr
370<210>15<211>373<212>PRT<213>人<400>15Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly1               5                  10                  15Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His
         20                  25                  30Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr
     35                  40                  45Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys
 50                  55                  60Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe65                  70                  75                  80Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln
             85                  90                  95Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp
        100                 105                 110Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Ala
    115                 120                 125Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln Asp Leu Ala Asn Ala
130                 135                 140Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser145                 150                 155                 160Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val
            165                 170                 175Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp
        180                 185                 190Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr
    195                 200                 205Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala
210                 215                 220Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile225                 230                 235                 240Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser
            245                 250                 255Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro
        260                 265                 270Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp
    275                 280                 285Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln Lys Val Pro Tyr Ile
290                 295                 300Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys305                 310                 315                 320Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val
            325                 330                 335Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gln Gly
        340                 345                 350Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu Leu Ser Leu Pro Tyr
    355                 360                 365Leu Ser Ser Gly Thr
370<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>16tgatacggta ccgccccatg gctgacta                                      28<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>17gcaagtttgg cgcgaaatcg                                               20<210>18<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><230>人工序列描述：引物<400>18gcttaagctt gctgcagcct gccgctgagc tgcatcatgc tactactact gctgctgctg   60ggcctg                                                              66<210>19<211>115<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>19aacagggccc ttaattaatt aggtacctgc gcggccgcag catcgattgc tctagaagcg   60atatcagcga attctgtctg ctcgaagcgg ccggccgccc cgactcgaga gtaac        115<210>20<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>20tatagaattc ttctcctgca accagggccg atac                               34<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>21tatagaattc ccagagcttg aagttccaaa accag                              35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>22tatagaattc agccctggac aagacacgtt ctgcc                              35<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>23agaggaattc cagggcaaag ctgatgggct ctatc                              35<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>24acaggaattc aatcctcggg aacggtccag cttctac                            37<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：引物<400>25cacatctaga ttatgtcggg cagctttgct ggaacag                            37<210>26<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>26agagtctaga tcaattccag gtgcagcatt tgcagg                             36<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>27agaggaattc agccctggac aagacacgtt cagcc                              35<210>28<211>97<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>28agaggaattc agccctggac aagacacgtt ctgccagggc aaagctgatg ggctctatcc 60caatcctcgg gaacggtcca gcttctacag cagtgca                          97<210>29<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>29tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgcaggagtt gctgaacacc aggcctgtcg 60ggctgct                                                             67<210>30<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>30tgcttctaga ttaattccag gtgcagcatt tgctgg                             36<210>31<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>31tgcttctaga ttaattccag gtgcagcttt tgcagg                             36<210>32<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>32tgcttctaga ttaattccag gtgctgcatt tgcagg                             36<210>33<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>33ctctggtacc tttggataaa agagactaca aggacgacga tgacaagagc cctggacaag   60acacgttctg cc                                                       72<210>34<211>77<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>34atatgcggcc gcgacttatc cactactatg atgatgatga tgatgtcctg ctccattcca   60ggtgcagcat ttgcagg                                                  77<210>35<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>35ctctgaattc caagacacgt tctgccaggg caaagct                            37<210>36<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>36atatgaattc acgttctgcc agggcaaagc tgatg                              35<210>37<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>37aacatctaga ttaggtgcag catttgcagg agttgctgaa c                       41<210>38<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>38aagaggtacc tttggataaa agaagccctg gacaagacac gttctgcc                48<210>39<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>39gagagcggcc gcgacttaat tccaggtgca gcatttgcag g                       41

Claims (24)

1、几丁质-结合的，几丁质酶失活的多肽，含有SEQ ID NO：2所列人几丁质酶的54个C末端氨基酸的几丁质-结合片段。
2、权利要求1的多肽，选自下列多肽：含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基347-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基374-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基392-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基395-445之序列的多肽以及含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基397-445之序列的多肽。
3、选自含有SEQ ID NO：2氨基酸残基X-Y的序列的多肽的多肽，其中X是从347-397的连续整数，Y是445。
4、含有权利要求3多肽的几丁质-结合的、几丁质酶失活多肽。
5、含有与异源多肽融合的权利要求1多肽的融合蛋白。
6、权利要求5的融合蛋白，其中所述异源多肽是酶。
7、含权利要求1多肽和生理学可接受稀释剂的组合物。
8、权利要求7的组合物，还含有非几丁质酶抗真菌剂。
9、含与抗真菌剂结合的权利要求1或4多肽的组合物。
10、治疗真菌感染的方法，包括给患有真菌感染的个体施用权利要求7-9的任一组合物。
11、权利要求10的方法还包括给所述个体施用非几丁质酶抗真菌剂。
12、含有与可检测标记结合的权利要求1或4多肽的组合物。
13、权利要求12的组合物，其中所述可检测标记选自放射性同位素、荧光团、染料、电子致密化合物和酶。
14、检测样品中几丁质存在的方法，包括：
(a)将所述样品与权利要求12的组合物接触和
(b)确定与几丁质结合的标记的多肽的量。
15、诊断样品中几丁质存在的试剂盒，含有权利要求12的组合物。
16、编码权利要求1多肽的纯化的分离的多核苷酸。
17、权利要求16的多核苷酸，其为DNA。
18、含权利要求17的DNA的载体。
19、用权利要求17的DNA以使其在宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽的方式稳定转化或转染的宿主细胞。
20、生产含人几丁质酶片段的多肽的方法，包括在营养培养基中培养权利要求19的宿主细胞，然后从所述宿主细胞或所述营养培养基中分离所述多肽。
21、用权利要求20的方法生产的纯化的分离的多肽。
22、与SEQ ID NO：2所列人几丁质酶的54个C末端氨基酸内表位特异性结合的单克隆抗体。
23、权利要求22的单克隆抗体，其与由保藏的杂交瘤ATCC No.＿＿，产生的单克隆抗体243Q竞争结合人几丁质酶的几丁质-结合、几丁质酶失活片段。
24、权利要求22的单克隆抗体，其与由保藏的杂交瘤ATCC No.＿＿，产生的单克隆抗体243M竞争结合人几丁质酶的几丁质-结合、几丁质酶失活片段。
CN99805990A 1998-03-12 1999-03-12 几丁质酶几丁质－结合片段 Pending CN1357046A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/039,198 1998-03-12
US09/039,198 US6200951B1 (en) 1998-03-12 1998-03-12 Chitinase chitin-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1357046A true CN1357046A (zh) 2002-07-03

Family

ID=21904197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99805990A Pending CN1357046A (zh) 1998-03-12 1999-03-12 几丁质酶几丁质－结合片段

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6200951B1 (zh)
EP (1) EP1078073A1 (zh)
JP (1) JP2002505882A (zh)
CN (1) CN1357046A (zh)
AU (1) AU763582B2 (zh)
BR (1) BR9908724A (zh)
CA (1) CA2323070A1 (zh)
HU (1) HUP0101078A3 (zh)
IL (1) IL138375A0 (zh)
NO (1) NO20004522L (zh)
PL (1) PL343197A1 (zh)
RU (1) RU2000123559A (zh)
SK (1) SK13542000A3 (zh)
WO (1) WO1999046390A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943621A (zh) * 2019-01-22 2019-06-28 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7741000A (en) * 1999-09-30 2001-04-30 Icos Corporation Chitinase immunoglobulin fusion products
US7754676B2 (en) 2000-09-15 2010-07-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Defensin-antigen fusion proteins
US7244703B2 (en) * 2001-06-22 2007-07-17 Bentley Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for peptide treatment
HUP0400659A3 (en) 2001-07-24 2005-06-28 Zhu Zhou Woodbridge Methods, compositions and kits relating to chitinases and chitinase-like molecules and inflammatory disease
US7632654B2 (en) * 2002-04-29 2009-12-15 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for detecting endoglycosidase activity
MXPA04011390A (es) * 2002-05-16 2005-02-17 Sepracor Inc Aminas que inhiben un transportador de anandamida de mamifero, y metodos de uso de las mismas.
JP2006519771A (ja) * 2003-01-07 2006-08-31 ジェノバ・リミテッド 心臓血管障害で減少する分泌ポリペプチド種（チトトリオシダーゼ由来のフラグメント）
US20070099234A1 (en) * 2003-06-27 2007-05-03 New England Biolabs, Inc. Specific detection of chitin using chitin-binding domain
ES2348303T3 (es) * 2003-12-08 2010-12-02 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Composiciones farmacauticas y procedimientos de tratamiento con insulina.
US8377650B2 (en) * 2006-03-17 2013-02-19 The Norwegian University Of Life Sciences (Umb) Method of enhancing degradation of chitin
FR2908654B1 (fr) * 2006-11-20 2014-04-04 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type chitinase
AU2009207923A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-30 Rigshospitalet Classification of individuals suffering from cardiovascular diseases according to survival prognoses as found by measuring the levels of biomarker YKL-40
US8697384B2 (en) 2008-01-23 2014-04-15 Herlev Hospital YKL-40 as a general marker for non-specific disease
AU2009291312A1 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Herlev Hospital YKL-40 as a marker for gastrointestinal cancers
JP5036741B2 (ja) * 2009-02-18 2012-09-26 中原大學 翻訳段階で自己切断活性を有するポリヌクレオチド配列を同定するための方法およびシステム
WO2011135578A1 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Chetan Balar Composition comprising chitin and tinosporin for use in the treatment of viral diseases
US9933425B2 (en) 2014-04-10 2018-04-03 MEP Equine Solutions LLC Method for the quantification of parasite eggs in feces
EP3908263A4 (en) * 2019-01-08 2023-04-19 University of Georgia Research Foundation, Inc. TARGETED NANOPARTICLES AND THEIR USE IN RELATION TO FUNGAL INFECTIONS
BR102020002165A2 (pt) * 2020-01-31 2021-11-30 Fundação Oswaldo Cruz Anticorpo, seu uso, composição farmacêutica o compreendendo, método de diagnóstico de infecções fúngicas, kit de diagnóstico de infecções fúngicas e método para tratamento de infecções fúngicas.
WO2023074415A1 (ja) * 2021-10-25 2023-05-04 学校法人東京薬科大学 キチン結合ポリペプチドならびにキチンの検出方法および検出キット

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587292A (en) * 1987-05-22 1996-12-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Diagnosis of fungal infections with a chitinase
US5258502A (en) * 1989-01-30 1993-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Immobilization and purification of fusion proteins using chitin-binding ability
EP0505500B1 (en) 1989-12-22 1997-07-30 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Endogenous gene expression modification with regulatory element by way of homologous recombination
EP0539573A4 (en) 1991-05-15 1993-12-29 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous dna targeting
US5326561A (en) 1992-12-15 1994-07-05 Cornell Research Foundation, Inc. Antifungal synergistic combination of enzyme fungicide and non-enzymatic fungicide and use thereof
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5496934A (en) * 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
US5561051A (en) 1994-06-14 1996-10-01 American Cyanamid Company Screen for inhibitors of chitinase
US5928928A (en) 1995-06-07 1999-07-27 Universiteit Van Amsterdam Human chitinase, its recombinant production, its use for decomposing chitin, its use in therapy or prophylaxis against infection diseases
AU2593797A (en) 1996-03-29 1997-10-22 Human Genome Sciences, Inc. Chitotriosidase
US20030017570A1 (en) 1996-06-14 2003-01-23 Patrick W. Gray Chitinase materials and methods

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943621A (zh) * 2019-01-22 2019-06-28 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用
CN109943621B (zh) * 2019-01-22 2022-07-01 美林美邦（厦门）生物科技有限公司 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999046390A1 (en) 1999-09-16
BR9908724A (pt) 2000-11-21
RU2000123559A (ru) 2002-12-27
JP2002505882A (ja) 2002-02-26
US20030143216A1 (en) 2003-07-31
PL343197A1 (en) 2001-07-30
HUP0101078A3 (en) 2002-09-30
EP1078073A1 (en) 2001-02-28
US6399571B1 (en) 2002-06-04
SK13542000A3 (sk) 2001-07-10
IL138375A0 (en) 2001-10-31
NO20004522D0 (no) 2000-09-11
AU763582B2 (en) 2003-07-24
HUP0101078A2 (hu) 2001-07-30
AU2998999A (en) 1999-09-27
NO20004522L (no) 2000-11-01
CA2323070A1 (en) 1999-09-16
US6200951B1 (en) 2001-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1357046A (zh) 几丁质酶几丁质－结合片段
CN1053924C (zh) 制备含cr1和溶血栓剂的组合物的方法
CN1426423A (zh) 螯合淀粉样蛋白β肽的人源化抗体
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
CN1354796A (zh) α－半乳糖苷酶缺陷的治疗
CN1193352A (zh) 人几丁质酶,其重组生产,其分解几丁质的用途及其在治疗和预防感染性疾病中的应用
CN1196733A (zh) 抗Fas配体抗体和利用抗Fas配体抗体的测定方法
CN1452636A (zh) 抗树突细胞的人单克隆抗体
CN1589902A (zh) 抗－LT－β－R抗体在制备药用组合物中的应用
CN1511041A (zh) 利用抑制cd21的药剂治疗抗体介导的病变的方法
CN1335887A (zh) 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体
JPH08510133A (ja) 組み替えｄｎａ技術によるｃｈｏ細胞シアリダーゼ
CN1236393A (zh) 几丁质酶材料和方法
CN1192751A (zh) 单核细胞趋化蛋白－4
CN1737011A (zh) 抗hla－dr10的淋巴瘤特异性嵌合单抗
AU771747B2 (en) CHO cell sialidase by recombinant DNA technology
CN1634991A (zh) 人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其制备方法和用途
CN1082609A (zh) 受体衍生物
CN1399680A (zh) 上皮细胞生长抑制剂
CN1670197A (zh) 日本血吸虫精氨酸酶，其编码核酸及其应用
CN1931878A (zh) 抗血小板聚集的嵌合型单克隆抗体或/及其片段
CN1377409A (zh) Meg－1蛋白
CZ20003308A3 (cs) Chitin-vazebné fragmenty chitinázy
CN1626550A (zh) 作为肿瘤标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途
MXPA98010619A (en) Materials and methods for the production of quitin

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication