CN109943621B - 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。本发明应用来自弧菌属的碱性几丁质酶对真菌进行染色，能够靶向地特异性与真菌细胞壁的几丁质结合，在荧光显微镜下观察，用340nm‑400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或黄绿色。
Description
技术领域
本发明属于病原菌生物学检验技术领域，具体涉及来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。
背景技术
真菌容易引起真菌性皮肤病。当真菌侵犯人体后，医生将按它们对人体的侵犯部位来划分，因此真菌可分为浅部真菌和深部真菌两大类。浅部真菌(癣菌)仅侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲，而深部真菌能侵犯人体皮肤、黏膜、深部组织和内脏，甚至导致严重败血症、心内膜炎、脑膜炎等致死性疾患。
现代医学临床检验中，对浅部真菌感染的诊断主要依赖于临床样本的真菌直接镜检和培养。在传统真菌感染的诊断中，KOH湿片镜检法是最简单、最经济的方法，但该法的准确检测需要有经验的检验工作者，易把细胞壁、纤维误认为菌丝，把气泡和油滴误认为孢子。且KOH湿片镜检法不具备特异性，容易受到杂质的影响。
随着真菌荧光染色法的推广，利用荧光染色液中荧光素与真菌细胞壁上多糖的非特异性结合发出荧光，从而观察判别真菌的存在。适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各种样本。但该方法仍不具备特异性，易受到染色底物杂质的干扰，且荧光衰退快。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种真菌的染色方法。
本发明的再一目的在于提供一种真菌染色液。
本发明的技术方案如下：
来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用，上述几丁质酶在pH＝10.0的Tris-HCl中的酶活力为0.2-0.8U/mL，在pH＝9.0的Tris-HCl中的酶活力为0.6-3.0U/mL，在pH＝8.0的Tris-HCl中的酶活力为0.4-1.2U/mL，在pH＝7.0的Tris-HCl中的酶活力为 0.1-0.6U/mL，以使每毫升碱性几丁质酶酶液每min产生1微摩尔的乙酰氨基葡萄糖的酶的量即为1个酶活单位U。
在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii、Vibrio cholerae或Vibrio parahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 01至03所示。
本发明的另一技术方案如下：
一种真菌的染色方法，包括如下步骤：
(1)将来自弧菌属的碱性几丁质酶与羧基荧光微球偶联，制得碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液；
(2)将碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液与其他组分混合，制成染色液，其中，其他组分包括伊文思兰、丙三醇和纯化水；
(3)将步骤(2)所制得的染色液对真菌进行染色，于荧光显微镜下用340nm-400nm的紫外光激活后观察。
在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii、Vibrio cholerae或Vibrioparahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 01至03所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述染色液中，所述羧基荧光微球、伊文思兰、丙三醇和纯化水的比例为0.8-1.2mg∶0.18-0.22g∶14-16mL∶80-90mL，所述碱性几丁质酶与羧基荧光微球的质量比为1∶8-11。
在本发明的一个优选实施方案中，所述其他组分还包括KOH。进一步优选的，KOH在所述染色液中的含量为5-20％(W/V)。
本发明的再一技术方案如下：
一种真菌染色液，包括碱性几丁质酶偶联的羧基荧光微球悬液、伊文思兰、丙三醇与纯化水，其中碱性几丁质酶来自弧菌属。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括KOH。进一步优选的，KOH在所述真菌染色液中的含量为5-20％(W/V)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii、Vibrio cholerae或Vibrio parahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 01至03所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述羧基荧光微球、伊文思兰、丙三醇和纯化水的比例为0.8-1.2mg∶0.18-0.22g∶14-16mL∶80-90mL，所述碱性几丁质酶与羧基荧光微球的质量比为1∶8-11。
本发明的有益效果是：本发明应用来自弧菌属的碱性几丁质酶对真菌进行染色，能够靶向地特异性与真菌细胞壁的几丁质结合，在荧光显微镜下观察，用340nm-400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或黄绿色。
附图说明
图1为本发明实施例1的染色结果图。
图2为本发明实施例2的染色结果图之一。
图3为本发明实施例2的染色结果图之二。
图4为本发明对比例1的染色结果图之一。
图5为本发明对比例1的染色结果图之二。
图6为本发明对比例2的染色结果图。
图7为本发明对比例2的另一染色结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例以来自坎氏弧菌(Vibrio campbellii)的碱性几丁质酶为例：
坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是海洋环境及水生生物体内的常见菌，是水产养殖动物的致病菌之一，可引起鱼、虾和贝类的大量死亡。坎氏弧菌能够表达并分泌淀粉酶、明胶酶、脂酶和碱性几丁质酶(氨基酸序列如SEQ ID NO 01所示)
菌株来源：ATCC
培养基：使用2116E发酵培养基为基础，加入0.5％(w/v)的胶体几丁质。
培养条件：选用灭菌后的，250ml锥形瓶中的100ml培养基，按照2％(v/v)比例接种，在180r/min，33℃的条件下培养48h。
几丁质酶的纯化分离：发酵液1000r/min离心20min后，上清即为粗酶液；粗酶液经硫酸铵沉淀过夜，1000r/min离心10min去上清，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液溶解沉淀；制备胶体几丁质亲和层析柱，用乙酸钠缓冲液平衡亲和柱，加样过柱，使用氯化钠梯度 (0～1.0mol/L)洗脱碱性几丁质酶。纯化获得的碱性几丁质酶酶液通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定纯化效果(约54ku)，将该碱性几丁质酶酶液经冻干后，获得碱性几丁质酶。
酶活测定：取上述碱性几丁质酶酶液1mL，2500g离心30min后，加入3ml 0.5％(w/v) 胶体几丁质溶液(pH 10.0Tris-HCl缓冲液)，37℃水浴30min后，换沸水浴5min以终止反应，反应液1000g离心后取上清液，用3，5-二硝基水杨酸比色法测定OD480，使每毫升碱性几丁质酶酶液每min产生1微摩尔的乙酰氨基葡萄糖的酶的量即为1个酶活单位 (U)。使用相同体积的，不加入几丁质的发酵离心液直接沸水浴5min作为阴性对照。发酵液在pH10.0Tris-HCl缓冲液中测得的酶活约0.8U/mL，亲和层析后获得的纯化液中测得的酶活约0.3U/mL。
用上述碱性几丁质酶制备染色液，具体如下：
1构建羧基荧光微球偶联碱性几丁质酶
1.1取10mg碱性几丁质酶，溶解于pH6.0磷酸盐缓冲液中，并在pH6.0磷酸盐缓冲液中透析2h；
1.2取100mg羧基荧光微球，pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，重新悬浮于10mL pH6.0磷酸盐缓冲中；
1.3将上述酶和羧基荧光微球混合，称取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和100mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于上述混合溶液中；
1.4室温避光搅拌反应1h；
1.5pH10.0Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最终悬浮于10mL pH10.0Tris-HCl缓冲液中。
2配制染色液
2.1取0.1mL偶联好的荧光微球-几丁质酶复合物、0.2g伊文思兰，15mL丙三醇和10g KOH，溶解于纯化水，定容至100mL，即得。
实施例1真菌培养物的荧光染色(一步法)
无菌手术刀片刮取培养的念珠菌，涂于防脱载玻片上，滴加一滴上述染色液，室温静置2～5min，而后在荧光显微镜下观察，结果显示蓝色荧光，如图1所示。
实施例2甲屑的荧光染色(二步法)
无菌手术刀片刮取真菌性皮炎患处甲屑标本1和标本2，每个标本涂于3个防脱载玻片上，分为3组，即组1至组3，每一组包括一标本1和一标本2。对第一组标本滴加一滴10％氢氧化钾，室温静置2～5min以溶解角质，用纯化水冲洗载玻片，滴加一滴染色液 (除不含有KOH以外，其余配方同实施例1的染色液)，室温静置2～5min，而后在荧光显微镜下观察，结果显示蓝色荧光，如图2和图3所示，其中图2为标本1的组1，图3 为标本2的组1。
对比例1KOH湿片法
选取实施例2中的组2，滴加一滴10％氢氧化钾，微微加热后轻压盖玻片使标本溶解后，置于普通光学显微镜下观察，结果如图4和图5所示，其中图4为标本1的组2，图 5为标本2的组2。
对比例2荧光素染色法
根据CN 105950700 A公开的技术方案配制将荧光素染色液(增白剂28溶于浓度为10％(W/V)氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂28的浓度为0.1％(W/V)，加入伊文思蓝染料和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为1％(W/V)，甘油浓度为30％ (V/V))。选取实施例2中组3，涂于防脱载玻片上，滴加一滴荧光素染色液，5min后在荧光显微镜下观察，结果如图6和图7所示，其中图6为标本1的组3，图7为标本2 的组3。
实施例2、对比例1和对比例2的对比结果如下表所示：
| 本发明的染色液 | KOH湿片法 | 荧光素染色法 | |
| 是否需要加热 | 否 | 是 | 否 |
| 视野效果 | 荧光清晰，背景对比强烈 | 昏暗 | 荧光清晰，背景有底色 |
| 荧光强度 | 强 | 无荧光 | 强 |
| 阳性率 | 90％～100％ | 50％～70％ | 80％～100％ |
本领域普通技术人员可知，上述实施例中的碱性几丁质酶还可以来自Vibriocholerae 或Vibrio parahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 02和03所示，仍然能够得到与上述实施例相同的技术效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 美林美邦（厦门）生物科技有限公司
<120> 来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 427
<212> PRT
<213> Vibrio campbellii
<400> 1
Met Lys Leu Thr Lys Leu Ala Met Val Thr Leu Leu Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ser Gln Phe Ser Tyr Ala Gln Glu Ala Pro Lys Gly Thr Ile Tyr Leu
20 25 30
Thr Phe Asp Asp Gly Pro Ile Asn Ala Ser Ile Asp Val Ile Asn Val
35 40 45
Leu Asn Gln Gln Gly Val Lys Gly Thr Phe Tyr Phe Asn Ala Trp His
50 55 60
Leu Asp Gly Ile Gly Asp Glu Asn Glu Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ala Leu Asp Thr Gly His Ile Val Ala Asn His Ser Tyr Ala
85 90 95
His Met Ile His Asn Cys Val Glu Glu Phe Gly Pro Asn Ser Gly Ala
100 105 110
Glu Cys Asn Ala Thr Gly Asp His Gln Ile Asn Ser Tyr Gln Asp Pro
115 120 125
Val Tyr Asp Ala Gly Thr Phe Ala Glu Asn Leu Ala Val Leu Glu Arg
130 135 140
Tyr Leu Pro Asn Ile Asn Ser Tyr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Glu Phe
145 150 155 160
Ala Arg Leu Pro Tyr Thr Asn Gly Trp Arg Val Thr Lys Asn Phe Lys
165 170 175
Ala Asp Gly Leu Cys Ala Thr Ser Asp Asp Leu Lys Pro Trp Glu Pro
180 185 190
Gly Tyr Val Cys Asp Thr Asp Asn Pro Ser Asn Ser Val Lys Ala Ser
195 200 205
Ile Glu Val Gln Asn Ile Leu Ala Asn Lys Gly Tyr Gln Thr His Gly
210 215 220
Trp Asp Leu Asp Trp Ala Pro Glu Asn Trp Gly Ile Ala Met Pro Ala
225 230 235 240
Asn Ser Leu Thr Glu Ala Glu Pro Phe Leu Gly Tyr Val Asp Ala Ala
245 250 255
Leu Asn Ser Cys Ala Pro Thr Thr Ile Asn Pro Ile Asn Ser Lys Ala
260 265 270
Gln Glu Phe Pro Cys Gly Thr Pro Leu His Ala Asp Lys Val Ile Val
275 280 285
Leu Thr His Glu Phe Leu Phe Glu Asp Gly Lys Arg Gly Met Gly Ala
290 295 300
Thr Lys Asn Leu Pro Arg Leu Ala Lys Phe Ile Gln Ile Ala Lys Glu
305 310 315 320
Ala Gly Tyr Ile Phe Asp Thr Met Asp Asn Tyr Thr Pro Val Trp Gln
325 330 335
Val Gly Gln Ala Tyr Val Ala Ser Asp Tyr Val Thr His Ser Gly Thr
340 345 350
Val Tyr Lys Ala Val Thr Thr His Val Ala Gln Gln Asp Trp Ala Pro
355 360 365
Ser Ser Thr Ser Ser Leu Trp Thr Asn Ala Asp Pro Ala Thr Asn Trp
370 375 380
Thr Leu Asn Val Ala Tyr Glu Ala Gly Asp Val Val Thr Tyr Gln Gly
385 390 395 400
Leu Arg Tyr Leu Val Asn Val Pro His Val Ser Gln Ala Asp Trp Thr
405 410 415
Pro Ser Thr Gln Asn Thr Leu Phe Thr Thr Leu
420 425
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
<400> 2
Met Asp Thr Lys Met Lys Leu Lys Lys Leu Ala Leu Phe Thr Ala Ile
1 5 10 15
Ser Leu Ala Ile Ser Gly His Ser Phe Ala Asn Ser Thr Pro Lys Gly
20 25 30
Thr Ile Tyr Leu Thr Phe Asp Asp Gly Pro Ile Asn Ala Ser Val Glu
35 40 45
Val Ile Lys Val Leu Asn Gln Gly Gly Val Lys Ala Thr Phe Tyr Phe
50 55 60
Asn Ala Trp His Leu Asp Gly Ile Gly Asp Glu Asn Glu Asp Arg Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Asp Ser Gly His Ile Val Gly Asn
85 90 95
His Ser Tyr Asp His Met Ile His Asn Cys Val Glu Asp Phe Gly Pro
100 105 110
Thr Ser Gly Ala Asp Cys Asn Ala Thr Gly Asn His Gln Ile His Ser
115 120 125
Tyr Gln Asp Pro Val Arg Asp Ala Ala Ser Phe Glu Gln Asn Leu Ile
130 135 140
Thr Leu Glu Lys Tyr Leu Pro Thr Ile Arg Ser Tyr Pro Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Gly Tyr Glu Leu Ala Arg Leu Pro Tyr Thr Asn Gly Trp Arg Val Thr
165 170 175
Lys His Phe Gln Ala Asp Gly Leu Cys Ala Thr Ser Asp Asn Leu Lys
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Pro Trp Glu Pro Gly Tyr Val Cys Asp Pro Ala Asn Pro Ser Asn Ser
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225 230 235 240
Pro Met Pro Ala Asn Ser Leu Thr Glu Ala Val Pro Phe Leu Ala Tyr
245 250 255
Val Asp Lys Ala Leu Asn Ser Cys Ser Pro Thr Thr Ile Glu Pro Ile
260 265 270
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Lys Val Ile Val Leu Thr His Asp Phe Leu Phe Glu Asp Gly Lys Arg
290 295 300
Gly Met Gly Ala Thr Gln Asn Leu Pro Lys Leu Ala Glu Phe Ile Arg
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<211> 427
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 3
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1 5 10 15
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Trp Asp Val Asp Trp Ala Pro Glu Asn Trp Gly Ile Ala Met Pro Ala
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245 250 255
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260 265 270
Gln Glu Phe Pro Cys Gly Thr Pro Leu His Ala Asp Lys Val Ile Val
275 280 285
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340 345 350
Val Tyr Gln Ala Val Thr Ser His Thr Ala Gln Gln Asp Trp Ala Pro
355 360 365
Ser Pro Thr Ser Ser Leu Trp Thr Asn Ala Asp Pro Ala Thr Asn Trp
370 375 380
Thr Gln Asn Val Ser Tyr Lys Gln Gly Asp Val Val Thr Tyr Gln Gly
385 390 395 400
Leu Arg Tyr Leu Val Asn Val Pro His Val Ser Gln Ala Asp Trp Ser
405 410 415
Pro Ser Ser Gln Asn Thr Leu Phe Thr Ala Leu
420 425
Claims (6)
1.来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用，其特征在于：所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii，其氨基酸序列如SEQ ID NO 01所示，
包括如下步骤：
（1）将来自弧菌属的碱性几丁质酶与羧基荧光微球偶联，制得碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液；
（2）将碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液与其他组分混合，制成染色液，其中，其他组分包括伊文思兰、丙三醇和纯化水；
（3）将步骤（2）所制得的染色液对真菌进行染色，于荧光显微镜下用340nm–400nm的紫外光激活后观察。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述染色液中，所述羧基荧光微球、伊文思兰、丙三醇和纯化水的比例为0.8-1.2mg：0.18-0.22g：14-16mL：80-90mL，所述碱性几丁质酶与羧基荧光微球的质量比为1:8-11。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述其他组分还包括KOH。
4.一种真菌染色液，其特征在于：包括碱性几丁质酶偶联的羧基荧光微球悬液、伊文思兰、丙三醇与纯化水，其中碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii，其氨基酸序列如SEQ IDNO 01所示。
5.如权利要求4所述的一种真菌染色液，其特征在于：还包括KOH。
6.如权利要求4或5所述的一种真菌染色液，其特征在于：所述羧基荧光微球、伊文思兰、丙三醇和纯化水的比例为0.8-1.2mg：0.18-0.22g：14-16mL：80-90mL，所述碱性几丁质酶与羧基荧光微球的质量比为1:8-11。
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Non-Patent Citations (1)
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