CN107435034A - 一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用 - Google Patents

一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用，属于生物医学技术领域。该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为耐万古霉素金黄色葡萄球菌0630（VRSA）；该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC NO.60082。本发明对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌可用于筛选药物，具有良好的应用前景。

Description

一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是抵抗力较强的无芽胞细菌，且适应能力强，易产生耐药性变异，在1961年分离出第1例MRSA距离合成甲氧西林不到1年。近年来MRSA感染率在世界范围内逐年升高，且常有爆发流行，因其耐药率高和耐药谱广，引起感染的治疗己经成为当前临床最为棘手的问题之一。
目前，病原菌耐药己成为一个全球性的问题，越来越多的病原菌对常用抗菌药物产生耐药性，且耐药水平不断上升，引起了世界卫生组织以及各国卫生行政部门和广大学者的广泛关注。金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的重要病原菌，耐药机制复杂，耐药性发展迅速，是近年来研究的热点问题，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的出现及流行，引起了人们对金黄色葡萄球菌耐药性的空前关注和重视。有学者将MRSA引起的感染与艾滋病、乙型肝炎一起并列为世界三大感染性疾病，并将其称为“超级细菌”。
细菌耐药性情况的不断加剧，为抗感染的治疗加深了难度，为了寻求解决办法，致力于研究新型抗耐药菌药物刻不容缓。从医院临床分离感染相关疾病治疗无效的患者身上获得的耐药菌株成为了寻求新的抗菌药物研究实验的必要材料，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产 ESBLs 或 AmpC 酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；多重耐药的铜绿假单胞菌、热带念珠菌等。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的主要耐药机制是：MecA基因编码低亲和力的青霉素结合蛋白PBP2a所致。在高浓度抗生素存在时，正常青霉素结合蛋白PBPs因与抗生素结合而失去催化细菌细胞壁粘肽交联的功能。耐甲氧西林金黄色葡萄球产生的特殊的PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力很低或消失，可替代正常青霉素结合蛋白PBPs的生物合成功能，继而催化细菌细胞壁粘肽交联。PBP2a 的存在能维持细菌的生长和繁殖，表现出对所有β-内酰胺类抗生素耐药。同时，由于MecA基因所在的染色体盒SCCmec具有吸纳其他耐药基因的功能，使得MRSA一般对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类等抗生素都产生耐药。糖肽类抗生素如万古霉素是治疗MRSA感染疗效最为确切的药物，也是严重MRSA感染治疗的最后一道防线。但是本发明申请人在研究中发现一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，该细菌在国内外目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用，该细菌是寻求细菌耐药机制的重要材料，可用于筛选药物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其特征在于，该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为耐万古霉素金黄色葡萄球菌0630（VRSA）；该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC NO.60082。
本发明还提供上述对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在药物筛选中的应用。
本发明对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物学特征为：该菌鉴定为金黄色葡萄球菌，参照美国临床实验室标准委员会（CLSI）2012版规定的头孢西丁纸片法进行耐药鉴定，如图1所示：头孢西丁对该菌的抑菌圈≤19mm，对万古霉素（VA）的抑菌圈≤10mm。故判定该菌为对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄菌。
美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards institute,CLSI)2011年出版的操作手册中的定义，根据金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感性的不同将金黄色葡萄球菌分为四类：金黄色葡萄球菌对万古霉素的MIC≤2μg/ml时，为万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(VSSA)；MIC为2~4μg/ml时是指万古霉素异质性中介耐药金黄色葡萄球菌(h VISA)；MIC为4~8μg/ml，为万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(VISA)；MIC为≥16μg/ml，为万古霉素完全耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)。本发明金黄色葡萄球菌MIC为31.25μg/ml，（参考美国临床和实验室标准协会所公布的标准，采用微量液基稀释法以万古霉素初始浓度为125ug/ml在96孔板上对半稀释万古霉素进行）。
所述的耐万古霉素金黄色葡萄球菌0630（VRSA）的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供了一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其应用。该菌株对万古霉素耐药，可做为筛选新型抗生素的模型材料，具有良好的应用前景。
本发明对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为耐万古霉素金黄色葡萄球菌0630（VRSA）；该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC NO.60082；保藏日期为2016年9月23日，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
图1为采用琼脂纸片扩散法测定耐万古霉素金黄色葡萄球菌药敏纸片抑菌圈图；其中，1（VA）为万古霉素(抑菌圈的大小为9mm)，2（CFX）为头孢西丁(抑菌圈的大小为0mm)，3（LVF）为左氧氟沙星(抑菌圈的大小为26mm) ，4（CAZ）为头孢他啶(抑菌圈的大小为20mm)，5（AM）为氨苄西林(抑菌圈的大小为0mm)，6（FEP）为头孢吡肟(抑菌圈的大小为0mm)，7（CAC）为头孢他啶/棒酸(抑菌圈的大小为20mm)
图2为本发明对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物外形形态图；
图3为本发明对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的革兰氏染色图。
图4为本发明菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳图；其中，泳道M：DL2000 DNAMarker；1：PCR产物；+：正对照；-：负对照；正对照、负对照是试剂盒中本身就有的。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
MH琼脂培养基：称取MH干粉7.6g置于锥形瓶中，加入200ml蒸馏水，摇匀。滴加质量浓度为10%的氢氧化钠水溶液调节pH至7.2-7.4之间。将配好的培养基高温灭菌（121℃，15min）后倾注灭菌平皿，置于4℃冰箱冷藏备用。
MH肉汤培养基：称取MH肉汤干粉5.4g，加入200ml蒸馏水溶解。滴加质量浓度为10%的氢氧化钠水溶液调节pH至7.2-7.4之间。将配好的培养基高温灭菌（121℃，15min），待其自然冷却后于4℃冰箱冷藏备用。
中国蓝玫瑰酸琼脂平板培养基：称取中国蓝玫瑰酸琼脂粉20.5g，加入蒸馏水500ml，经高温灭菌（121℃，15min）后倾注灭菌平皿，置于4℃冰箱冷藏备用。
本发明中指出的合适溶媒是能溶解待筛化合物的溶媒。
本发明菌株来源：本发明菌种分离自昆明总医院地干病房患者口痰中，按临床微生物学操作规程对标本进行接种培养、分离鉴定。
患者情况：患者为离退休干部，85岁，因肺部感染多次住院，2007年10月30日主因腹泻入住我院地干病房（住院号：489245），最后诊断为：1.急性肠炎；2.肺部感染；3.泌尿系感染；4.2型糖尿病；
住院期间，患者病情反复，肺部感染加重加强了抗感染治疗。11月21日取患者深部口痰标本做药敏培养。口痰外观颜色为淡棕色，粘稀，涂湿片镜下观察：WBC 15-25，RBC 200↑，上皮细胞8-10。
菌株的分离、鉴定：
接种环挑取患者口痰，接种在MH琼脂培养基和中国蓝玫瑰酸琼脂平板培养基边缘三分之一处，火焰上烧过接种环后，采取曲线划线分离法。每次分区划线均须烧接种环。接种了口痰的MH琼脂培养基和中国蓝玫瑰酸琼脂平板培养基于35℃恒温培养24小时。24小时后取出MH琼脂培养基和中国蓝玫瑰酸琼脂平板培养基观察。根据菌落外观、颜色、气味及产生溶血圈的不同对细菌进行初步鉴定。培养平板上单菌落数目较多的为培养物中的优势菌群，排除外来菌污染及非致病菌情况下。挑取该单菌落进一步做细菌菌种鉴定。该菌落在中国蓝玫瑰酸琼脂平板培养基上不生长。在MH琼脂培养基上形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、直径为1-2mm菌落。可产生金黄色色素，其产生色素不能扩散到培养基中。(该菌分离后外形形态见图2，革兰氏染色见图3)
革兰氏染色：于洁净载玻片上滴加1小滴生理盐水，再用接种环挑取菌落少许，均匀涂布于生理盐水中。涂片膜向上通过火焰数次固定菌落。已固定的细菌涂片，滴加结晶紫乙醇饱和溶液一滴染1分钟，水洗。滴加碘液1滴媒染1分钟，水洗。将片上残水甩掉，用体积浓度为95%酒精根据涂片厚度，脱色20-60秒，至无明显紫色继续脱落为止，水洗，加上番红一滴复染10-30秒，水洗。35℃恒温培养箱烘干后镜检。菌落革兰氏染色为紫色，细菌外观形态为葡萄串状，无芽孢，无荚膜，如图3所示。
触酶实验：取24小时35℃恒温MH琼脂培养基培养菌落，置于清洁载玻片上，滴加1滴质量浓度为3%的过氧化氢水溶液，产生大量气泡者判断为阳性。本发明菌落反应为阳性。
血浆凝固酶实验：将1-2个菌落与载玻片上的一滴生理盐水乳化，10-20秒后接种环取兔血浆一环，与其混合。经20秒钟出现颗粒判断为阳性，另设生理盐水为阴性对照。本发明菌落血浆凝固酶实验为阳性。
甘露醇发酵实验：无菌操作取2-3个菌落接种于MH肉汤培养基，取接种后的培养基于甘露醇发酵管，其上覆盖无菌石蜡油，37℃培养24小时。培养基变浑浊，颜色由紫色变黄色判断为阳性。本发明菌落甘露醇发酵实验为阳性
综合考虑患者口痰培养物菌落的外观、形态、革兰氏染色及生化反应可鉴定该菌为金黄色葡萄球菌。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的鉴定：
取24小时35℃恒温MH琼脂培养基培养已分离、鉴定的菌落进行的鉴定，依据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准头孢西丁使用纸片扩散法和苯唑西林法进行。方法为：准备厚度为4mm的MH琼脂培养基，将菌液调至0.5麦氏浓度（菌悬液浓度为1.0×108CFU/ml），涂抹于上述MH琼脂培养基，以金黄色葡萄球菌ATCC25923为质控菌株，将药敏纸片贴于其上，35℃培养箱孵育24h，苯唑西林抑菌圈≤10mm为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。经实验，本发明菌落苯唑西林抑菌圈≤10mm，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
耐万古霉素MRSA的鉴定：
接种环挑取经18h-24h培养的新鲜菌落于3-10ml无菌生理盐水，调制成相当于0.5号麦氏比浊管的菌液浓度（务必于15min内使用）。无菌棉拭子沾取菌液，并经管壁旋转挤压去除过多的菌液后，均匀涂抹接种于MH琼脂培养基表面，以不同角度涂抹3次，然后沿平皿内缘涂抹一周，盖上皿盖，置室温干燥3-5min后，用镊子将万古霉素药敏试纸贴于琼脂面上。将平皿倒扣置培养箱内孵育24h后，游标卡尺量取抑菌环直径。抑菌环≤10mm为万古霉素耐药，抑菌环11-13为万古霉素中介；抑菌环≥15mm为万古霉素敏感。经实验，本发明菌落抑菌环≤10mm，为万古霉素耐药。
利用下述方法进行菌种基因组DNA提取，在-20℃下保存。
挑取菌体于50 ul TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板。反应条件：80℃，15 min。
使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No.RR176），进行PCR扩增目的片段。
反应体系:
模版 1 ul，
PCR Premix 25 ul，
Forward primer(20pmol/ul) 0.5ul，
Reverse primer2(20pmol/ul) 0.5ul，
16S-free H2O 23ul，
Total 50ul。
上游引物：5’-cagagtttgatcctggct-3’；（SEQ ID NO.2）
下游引物：5’-aggaggtgatccagccgca-3’。（SEQ ID NO.3）
扩增程序：94℃ 5 min 1 cycle；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30 cycles；72℃ 5 min 1 cycle
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4。
电泳检测扩增产物后，送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。将测序得到的序列（SEQ ID NO.1）与GenBank 数据库中的序列进行比对分析，结果如下：
与Staphylococcus aureus strain FORC_039全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌M92全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌GD1667全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌GD1539全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌GD705全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌GD5全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌293G全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌C2406全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌JE2全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌亚种菌株ATCC6538全基因序列的相似度为99%；与金黄色葡萄球菌08S00974全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌USA300-SUR24全基因序列的相似度为99%；
与金黄色葡萄球菌USA300-SUR23全基因序列的相似度为99%。
该菌种的具体应用方法主要两个方面：（1）万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌(VRSA)在我国的出现，使感染患者出现较高的治疗失败率和死亡率，MRSA 感染的临床治疗面临严峻考验，探讨VRSA的耐药发生机制，对治疗MRSA 感染的新策略的研究具有重要指导意义。该种可作为寻求细菌耐药机制的重要材料。（2）另一个用途为筛选药物，该筛选药物模型已建立。
具体应用方法：
1.受试样品的制备
精密称取一定量的待测药物，用合适溶媒（如质量浓度为5%的DMSO或质量浓度为5%的DMF）溶解，配制成30mg/ml的溶液，待用。再用合适溶媒（如质量浓度为5%的DMSO或质量浓度为5%的DMF）配制成浓度为2000ug/ml的溶液，用来测定MIC和MBC，置于冰箱中-4℃保存备用。
菌悬液的配制
实验前一天，取出于冰箱-4℃保存的本发明耐药菌株，待放至室温，用接种环分别挑取少量菌落，分别接种于MH琼脂培养基上，在35℃恒温箱中培养18-24h。于新长出菌落的MH琼脂培养基上，用接种环挑取少量活化菌落于已灭菌的干燥试管中，用无菌生理盐水稀释配制成1.5*10ˆ8CFU/ml的菌悬液（标准比浊管对照），备用。测定MIC值和棋盘法时，用无菌生理盐水再次稀释，使之浓度为5.0*10ˆ5CFU/ml。供K-B纸片扩散法用时，配制成浓度为1.5*10ˆ8CFU/ml的菌悬液。
样品的初筛
按照美国临床实验试标准委员会（CLSI）上的方法和标准进行测定，实验前一天，待测标准细菌接种于MH琼脂培养基，在35℃恒温箱中培养18-24h，使活化。以合适溶媒为溶剂（如质量浓度为5%的DMSO或质量浓度为5%的DMF），使待测药物溶解，放置待用。再以无菌棉签蘸取已制备好的标准细菌浓度为1.5*10ˆ8CFU/ml的菌悬液，均匀涂抹至相应的MH琼脂培养基，用孔径为6mm的无菌圆形玻璃管在培养基上打孔，用微量移液器将50ul配好的药液（30mg/ml）加入孔中，置35℃恒温箱中培养18-24h，测量抑菌圈大小。用溶媒作空白对照。
药物最低抑菌浓度MIC值的测定
选取对耐药菌株敏感（抑菌圈直径不小于10mm）的待测药物，根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的微量液基稀释法来测定菌株对不同药物的MIC值，每组平行操作3次，得出浓度平均值。选择无菌96孔平底微量培养板，在每排第一孔中加入200ul MH肉汤培养基作为阴性对照；在每排第二孔中加入100ul本发明耐药菌菌液和100ul MH肉汤培养基作为阳性对照；在每排第3-12各孔中加入MH肉汤培养基100ul，然后于每排第3孔加入待测药物100ul，混合均匀，并取出100ul移至第4孔中，以此类推直至第12孔混匀后吸取100ul弃去，最后于各孔中加入混匀后的本发明耐药菌（5*10ˆ5CFU/ml）的菌悬液100ul。将培养板置于35℃恒温箱中培养18h观察结果，测定其MIC值。选择黑色背景观察，以溶液清晰透亮的最低浓度孔中的药物浓度为MIC。
药物最低杀菌浓度MBC值的测定
当确定MIC值后，取MIC值前3-5个孔的细菌和MH肉汤培养基混合物，转种在MH琼脂培养基上，置35℃的培养箱中，培养22h后取出观察，平均数小于5个的最低药物浓度即确定为该化合物的MBC。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga caatacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc 1260
cataaagttg ttctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg tagatcagca tgctacggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agccggtgga gtaacctttt aggagctagc 1440
cgtcgaaggt gggacaaatg attggg 1466
SEQ ID NO.2
cagagtttga tcctggct 18
SEQ ID NO.3
aggaggtgat ccagccgca 19
SEQUENCE LISTING
<110> 巍, 余
<120> 一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcgaacg gacgagaagc ttgcttctct 60
gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tggataacct acctataaga ctgggataac 120
ttcgggaaac cggagctaat accggataat attttgaacc gcatggttca aaagtgaaag 180
acggtcttgc tgtcacttat agatggatcc gcgctgcatt agctagttgg taaggtaacg 240
gcttaccaag gcaacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctggaactga 300
gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat gggcgaaagc 360
ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggtcttcgga tcgtaaaact ctgttattag 420
ggaagaacat atgtgtaagt aactgtgcac atcttgacgg tacctaatca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt 540
gggcgtaaag cgcgcgtagg cggtttttta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg 600
tggagggtca ttggaaactg gaaaacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg 660
tagcggtgaa atgcgcagag atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct 720
gtaactgacg ctgatgtgcg aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 900
ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga araaccttac 960
caaatcttga catcctttga caactctaga gatagagcct tccccttcgg gggacaaagt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttaagctt agttgccatc attaagttgg gcactctaag ttgactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga caatacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc 1260
cataaagttg ttctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg tagatcagca tgctacggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agccggtgga gtaacctttt aggagctagc 1440
cgtcgaaggt gggacaaatg attggg 1466
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagagtttga tcctggct 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (2)

1.一种对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其特征在于，该菌株属于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，命名为耐万古霉素金黄色葡萄球菌0630（VRSA）；该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号GDMCC NO.60082。
2.权利要求1所述的对万古霉素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在药物筛选中的应用。
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