CN116064317B - 一种貉源肠外致病性大肠杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种貉源肠外致病性大肠杆菌及其应用。该大肠杆菌为名称为大肠杆菌LW1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No:M20221478。该菌株是引起貉肺炎的致病菌株，通过小鼠接种实验证明，其可对肺脏侵染致小鼠肺炎症状，具有强致病性，致死率100％。同时，该菌株对多种抗生素产生抗药性，为兽医临床指导用药，以及大肠杆菌的药敏特征为临床作为模式菌种的研究具有重要价值。

Description

一种貉源肠外致病性大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种貉源肠外致病性大肠杆菌及其应用。
背景技术
貉是1957年由中国农业科学院特产研究所对产于黑龙江的野生乌苏里貉进行人工驯化、家养和繁殖，至今已有60多年的历史。貉皮是世界裘皮中的重要的大毛细皮原料，以其轻便柔软，美观保暖著称，尤其是以貉皮作为内胆的派克服的流行，导致近年貉皮的市场需求量骤增。
近年来，由于饲养密度增大、饲养环境条件恶劣以及养殖户乱用抗生素，造成貉肺炎病频频发生，其主要危害呼吸系统，以咳嗽、打喷嚏为主要症状，给养殖户带来了巨大的经济损失。据不完全统计，每年由于肺炎可导致貉死亡率在5-50％，全国貉养殖总量约1000万只，以每张皮平均销售价格300元计算，每年因为肺炎造成的经济损失至少在1.5亿元以上。
造成貉肺炎的病原微生物种类繁多，主要有大肠杆菌、链球菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌及巴氏杆菌等。近些年来，大肠杆菌造成肺炎的病例越来越多，成为诱发肺炎的一大主因。目前针对大肠杆菌性肺炎的防治除加强管理外，主要采用抗生素防治，由于抗生素的滥用，细菌的耐药性日益严重，造成药物选用困难，进而又加剧了抗生素的滥用，形成恶性循环。为了促进养貉业的快速发展，尽快控制该菌的发生和流行，预防阻断大肠杆菌对貉的感染，必须分离当地的貉大肠杆菌流行株，加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用，实现对当地导致貉大肠杆菌肺炎的有效防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种貉源肠外致病性大肠杆菌及其应用。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一株貉源肠外致病性大肠杆菌及其16S rRNA序列。
本发明的貉源肠外致病性大肠杆菌分离自肺炎死亡貉的肺脏和肝脏，所采用的分离方法，包括以下步骤：
1)细菌分离培养：将采集的样品接种于TSA培养基中，长出圆形、隆起、光滑、湿润、半透明的小菌落，取单克隆菌划线接种于麦康凯培养基、SS培养基和伊红美蓝培养基，麦康凯培养基上长出粉红色菌落，SS培养基上长出红色菌落，伊红美兰培养基上长出金属光泽、深紫黑色的圆形菌落，挑取单个菌落备用；
2)革兰氏染色、镜检；
3)生化鉴定试验；
4)16S rRNA扩增与序列分析
步骤1)中TSA培养基的组成为：胰蛋白胨15g，大豆胨5.0g，氯化钠30.0g，琼脂15.0g，pH值7.1-7.5；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨20.0 g，乳糖10.0g，牛胆盐5.0g，氯化钠5.0 g，中性红0.075 g，琼脂12.0，pH值7.4±0.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，磷酸氢二钾2.0g，琼脂15.0g，伊红0.4g，美蓝0.065g，PH值7.1±0.2；SS琼脂培养基的组成为：牛肉粉5.0 g，示月胨5.0 g，乳糖10.0 g，3号胆盐8.5 g，枸橼酸钠8.5 g，硫代硫酸钠8.5 g，枸橼酸铁1.0 g，中性红0.025 g，煌绿0.00033 g，琼脂17.0g，PH值6.9-7.1。
步骤1)中培养的温度为37℃，培养时间12～20h。
步骤2)中革兰氏染色主要包括涂片、初染、媒染、脱色、复染五步操作。具体操作为：将培养的菌作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜；初染：加结晶紫液盖满标本处，染一分钟后水洗，并将玻片上积水轻轻甩净。媒染：加碘液盖满标本处，1分钟后水洗，甩净玻片上积水；脱色：加95％酒精盖满标本，轻轻摇动玻片，约20秒钟后水洗、甩干；复染：加稀释石炭酸复红液或沙黄溶液1-2滴盖满标本，染30秒钟后水洗，待标本自干或用吸水纸印干。
步骤2)中镜检为：用香柏油覆盖涂菌部位，置油镜观察，革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
步骤3)中生化鉴定采用细菌微量生化反应管(如肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司)。具体操作见试剂盒说明书。
步骤3)中生化鉴定为大肠杆菌的菌株进行菌种保存，采用磁珠保存管，购自青岛海博生物。具体操作具体操作见试剂盒说明书。
步骤4)将分离得到的菌种接种于1 mL的TSA培养基中，37℃、220 r/min培养8 h。所用引物为16S rRNA通用引物，引物序列为:P1:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，P2:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的分离株DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体为20μL):2×Taq PCRMasterMix II 10μL，上下游引物各1μL,DNA模板1μL,ddH2O 7μL。PCR扩增程序:94℃5 min；94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min，共30个循环；72℃10 min。预期扩增的目的片段长度约为1500 bp。将回收纯化后的PCR扩增产物送生物科技有限公司测序，根据测序比对结果(同源性比对结果>96％)对分离株进行鉴定和相应编号。
结果获得一株大肠杆菌菌株，其16S rRNA的序列如序列表中序列1所示，该大肠杆菌为貉源肺炎大肠杆菌，分类命名为Escherichia coli，菌株名称为大肠杆菌LW1，已于2022年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC No:M20221478。
含有上述貉源肠外致病性大肠杆菌的生物制剂也属于本发明的保护范围，所述生物制剂可以为预防和/或治疗动物肺炎疾病的疫苗或者检测疗动物肺炎疾病的检测试剂。
第二方面，本发明提供了一种貉源肠外致病性大肠杆菌的应用。
貉源肠外致病性大肠杆菌具有如下耐药特征：
分离菌对头孢唑林、头孢曲松最敏感，对头孢氨苄、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢他啶中度敏感，对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、米诺环素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星具有不同程度的耐药性。
基于此，本发明所述的貉源肠外致病性大肠杆菌可作为模式菌株用于动物肺炎疾病的防治研究中。
本发明的貉源肠外致病性大肠杆菌可以用于筛选预防和/或治疗动物肺炎疾病的药物。该应用中，所述的貉源肠外致病性大肠杆菌作为筛选预防和/或治疗动物肺炎疾病的药物的靶标。
本发明所述的貉源肠外致病性大肠杆菌可用于制备用于预防动物肺炎疾病的生物制品中。
本发明所述的貉源肠外致病性大肠杆菌可用于制备用于治疗动物肺炎疾病的生物制品中。
所述的貉源肠外致病性大肠杆菌在制备用于检测动物肺炎疾病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述貉源肠外致病性大肠杆菌的用途中，所述动物，可以为貉或者鼠。
本发明的有益效果：
本发明的大肠杆菌LW1易于培养，利用本发明所得菌株在TSA培养基上增殖快，增殖滴度高，可达7.2×109cfu/mL；本发明菌株致病力较高、能引起小鼠和仔貉肺炎。用不同类型抗生素对本发明得到的大肠杆菌菌株进行耐药试验，得到了意想不到的结果，为貉肺炎疾病的有效防控提供了重要生物材料。
该菌株是引起貉肺炎的致病菌株，通过小鼠攻毒实验证明，其可对肺脏侵染致病，致小鼠肺脏淤血充血、病理切片炎性细胞浸润等肺炎症状，具有强致病性，致死率100％。
目前肠外致病性大肠杆菌菌株引起的貉肺炎疾病，没有可用疫苗，只能依靠抗生素治疗。通常使用沙星类药物能得到比较好的抑菌效果，但本发明得到的菌株对通常敏感的氨基糖苷类、四环素类和沙星类药物耐药，这对于防治肠外致病性大肠杆菌病有重要指导意义，对于大肠杆菌病的研究模式菌提供了较好的素材和思路。本发明发明为兽医临床指导用药，以及大肠杆菌的药敏特征为临床作为模式菌种的研究具有重要价值。
附图说明
图1为病死貉解剖肺部照片。
图2为实施例1中菌落形态图；
图3为镜检细菌的形态图。
图4为16S rRNA扩增电泳图。
图5为本发明大肠杆菌毒力基因扩增电泳图，泳道M为marker，泳道1-13分别为hlyF、colv、fimc、sfa、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、irp2、fyuA、ECs3703和ECs3737基因扩增片段。
图6为本发明大肠杆菌耐药基因扩增结果，泳道M为marker，泳道1-5为blaTEM、strA-strB、tetA、tetC和aadB基因片段。
图7为实施例6对照组小鼠肺脏照片。
图8为实施例6中对照组小鼠肺泡组织。
图9为实施例6中攻毒小鼠肺脏照片。
图10为实施例6中攻毒小鼠肺泡组织。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1、貉源大肠杆菌LW1的获得及鉴定
貉源大肠杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1)采集样品：石家庄某貉养殖场分窝的仔貉发生鼻镜干燥、腹式呼吸、咳嗽等特征的疾病。无菌采集2只病死貉的肺脏和肝脏，进行病原菌的分离培养和检测。临床发现貉子有咳嗽症状，剖检发现2只貉肺脏出血(见图1中A)、化脓(见图1中B)，脾脏肿大(见图1中C)肺炎症状。
从某貉养殖场无菌采集2只发生肺炎死亡貉的肺脏和肝脏，进行病原菌的分离培养和检测；
2)细菌分离培养：将采集的样品分别接种于TSA培养基中，放置于摇床上于37℃、200rpm下培养15h，取单克隆菌划线接种于麦康凯培养基、SS培养基和伊红美蓝培养基，麦康凯培养基上长出粉红色菌落，SS培养基上长出红色菌落，伊红美兰培养基上长出金属光泽、深紫黑色的圆形菌落，挑取单个菌落备用；
TSA培养基的组成为：胰蛋白胨15g，大豆胨5.0g，氯化钠30.0g，琼脂15.0g，pH值7.1-7.5；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨20.0 g，乳糖10.0 g，牛胆盐5.0 g，氯化钠5.0 g，中性红0.075 g，琼脂12.0，pH值7.4±0.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，磷酸氢二钾2.0g，琼脂15.0g，伊红0.4g，美蓝0.065g，PH值7.1±0.2；SS琼脂培养基的组成为：牛肉粉5.0 g，示月胨5.0 g，乳糖10.0 g，3号胆盐8.5 g，枸橼酸钠8.5 g，硫代硫酸钠8.5 g，枸橼酸铁1.0 g，中性红0.025 g，煌绿0.00033 g，琼脂17.0 g，PH值6.9-7.1。
结果表明：分离培养的菌落均符合大肠杆菌的菌落形态(见图2，图2中A为麦康凯培养基上的菌落形态，B为SS培养基上得菌落形态，C为伊红美蓝培养基上得菌落形态)；
3)革兰氏染色：培养的菌作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜；初染：加结晶紫液盖满标本处，染一分钟后水洗，并将玻片上积水轻轻甩净。媒染：加碘液盖满标本处，1分钟后水洗，甩净玻片上积水；脱色：加95％酒精盖满标本，轻轻摇动玻片，约20秒钟后水洗、甩干；复染：加稀释石炭酸复红液或沙黄溶液1-2滴盖满标本，染30秒钟后水洗，待标本自干或用吸水纸印干；
镜检：染色后，用香柏油覆盖涂菌部位，并将玻片置于显微镜下观察，先用低倍镜找到菌，再换用高倍物镜观察染色情况和细菌形态；
染色和镜检结果表明：菌均为革兰氏阴性菌，并且符合大肠杆菌的细菌形态(见图3)，两端钝圆、单个或成对，微小短杆状；
4)生化鉴定试验：采用肠杆菌科细菌生化鉴定管(购自杭州微生物试剂有限公司)对上述分离菌进行鉴定，具体操作为：分别取细菌生化鉴定管用砂轮划痕从鉴定管中间折断，用接种针从平板上挑取已纯化分离的同一菌落接种于鉴定管试验组的一端，与检测液充分混合均匀封口膜密封；将密封好的鉴定管置于37℃培养箱中，培养15h后，观察生化管两端颜色变化，根据编码值检索肠杆菌科细菌生化编码册(包括硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、枸橼酸盐等测试项目)，判定菌株的种属特性；
生化鉴定结果表明：分离菌符合大肠杆菌的基本生化特性，能发酵葡萄糖、棉籽糖、山梨醇、木糖，鸟氨酸、赖氨酸、半固体琼脂和氨基酸脱羧酶对照试验结果均为阳性，硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水、枸橼酸盐、侧金盏花醇和尿素试验结果均为阴性，判定分离菌为大肠杆菌；
5)菌种保存：用无菌棒挑取单个或成对的大肠杆菌菌落接种于TSA培养基中，放置于摇床上于37℃、200 rpm下培养15h；挑取单克隆菌落于菌种保存管中，配成3-4麦氏比浊度的菌悬液，拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，拧紧保存管，迅速置于-20℃或-70℃冰箱中。
6)大肠杆菌分型及基因序列测定
(1)菌株基因DNA提取
对分离到的进行扩繁培养传代，取200μl细菌液，用索莱宝细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，具体操作如下：
取细菌培养液1ml，12000 rpm离心1min，尽量吸除上清；向菌体中加入200ul溶液A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮向悬浮液中加入20μl的RNase A(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置15-30min；向管中加入20μl的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混匀，55℃消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状；向管中加入200ul溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀即会消失；向管中加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min；12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min；离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2 min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。
(2)菌株基因序列
引物为16S rRNA通用引物，引物序列为:P1:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，P2:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，由生工生物合成。以提取的分离株DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体为20μL):2×Taq PCR MasterMix II 10μL，上下游引物各1μL,DNA模板1μL,ddH2O7μL。PCR扩增程序:94℃5 min；94℃30 s,55℃1 min,72℃100 s，共30个循环；72℃10min。预期扩增的目的片段长度约为1500 bp(图4)。
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化1500bp的目的条带，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。拼接得到16S rRNA基因序列，如序列表中序列1所示。
序列表中序列1的序列如下：
将拼接获得的基因序列在线NCBI Blast比对，发现与Escherichia colistrainNBRC 102203序列比对同源性较高，达99.51％。
由此，确定此毒株为一株新的貉肠外致病大肠杆菌，命名为大肠杆菌LW1。
大肠杆菌LW1，分类命名为Escherichia coli，已于2022年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC M20221478。
实施例2、貉肠外致病大肠杆菌的耐药性实验。
药敏纸片、TSA培养基、SS培养基、伊红美兰培养基、麦康凯培养基、Mueller-Hinton琼脂(MHA)购自青岛海博生物技术有限责任公司，药敏纸片青霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、米诺环素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。
耐药性实验步骤如下：
1、菌悬液的准备：取培养大肠杆菌LW1的斜面，加无菌生理盐水调制成相当于0.5麦氏标准的细菌悬液。
2、涂布：按100μL/皿用移液器加于灭菌MHA蛋白胨培养基平板上，用无菌的涂布棒充分涂布。
3、加药敏试纸片：用冷却的无菌镊子将上述的药敏纸片放置于涂布好培养基平板上，轻轻按压，每个平板放置5种药物，正置5分钟后，于37℃培养箱中倒置培养12-24h。
判定依据：37℃培养18～24h，测量抑菌圈的直径。抑菌圈15.1mm≤直径≤20.1mm为高敏、10.1mm≤直径＜15.1mm为中敏、直径＜10.1mm为耐药。
药敏试验结果如表1所示，该菌株分离菌对头孢唑林、头孢曲松最敏感，对头孢氨苄、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢他啶中度敏感，对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、米诺环素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星具有不同程度的耐药性。
表1菌株耐药试验结果
实施例3、貉肠外致病大肠杆菌的毒力基因测定
设计20对常见的大肠杆菌毒力基因引物(见表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2. 20对常见的大肠杆菌毒力基因引物
PCR扩增总体系为20μl，模板1μl，Primer 1(10μM)1μl，Primer 2(10μM)1μl，2×Taq PCRMasterMix II 10μl，ddH2O 7μl。PCR扩增条件94℃3min；94℃30 sec，52-66℃30sec，72℃1 min，循环30次；72℃5 min。
反应结束后取3μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
结果扩增出hlyF、colv、fimc、sfa、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、irp2、fyuA、ECs3703和ECs3737基因片段，图5所示。
实施例4貉肠外致病大肠杆菌的耐药基因测定
设计20对常见的耐药基因引物(见表3)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表3.20对常见的耐药基因引物
PCR扩增总体系为20μl，模板1μl，Primer 1(10μM)1μl，Primer 2(10μM)1μl，2×Taq PCRMasterMix II 10μl，ddH2O 7μl。PCR扩增条件94℃3min；94℃30 sec，48-60℃30sec，72℃1 min，循环30次；72℃5 min。
结果扩增出blaTEM、strA-strB、tetA、tetC和aadB基因片段，见图6。
实施例5、大肠杆菌LW1的培养
从培养皿中挑大肠杆菌LW1单克隆菌，接种于3-5mL灭菌TSA培养基中，200rpm/min，37℃培养12-16h。培养过程中检测大肠杆菌LW1的浓度，结果表明，培养12小时之内大肠杆菌浓度达到7.2×109cfu/mL。
结果表明，发明的大肠杆菌LW1易于培养，利用本发明所得菌株在TSA培养基上增殖快，增殖滴度高，可达7.2×109cfu/mL。
实施例6、貉肠外致病大肠杆菌的小鼠致病性试验
实验动物SPF昆明小鼠，10只，体重约20g，雌雄各半，腹腔注射大肠杆菌LW1菌液0.2 mL/只(108 CFU/mL)获得攻毒小鼠,对照组腹腔注射等量的PBS得到对照组小鼠。
记录每组攻毒小鼠和对照组小鼠的发病及死亡情况,对于死亡的昆明系小鼠肺脏进行细菌的分离鉴定。
结果大肠杆菌LW1攻毒小鼠在6h内死亡率100％,对照组健康存活。对死亡小鼠肺脏进行细菌的分离鉴定,结果显示,与大肠杆菌LW1一致,该大肠杆菌LW1对小鼠具有致病性。
实施例7、貉肠外致病大肠杆菌对小鼠肺脏病理切片分析
将实施例6的方法获取的对攻毒小鼠和对照组小鼠肺脏做病理切片分析。
结果如图7-10所示，对照组小鼠肺脏呈粉红色、有弹性(图7)，病理切片肺泡等组织正常(图8)，攻毒小鼠肺脏淤血充血(图9)，病理切片炎性细胞浸润(图10)，其他器官无明显病理变化。

Claims (4)

1.一种貉源肠外致病性大肠杆菌，其特征在于，名称为大肠杆菌LW1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No:M20221478。
2.权利要求1所述的貉源肠外致病性大肠杆菌在作为模式菌株用于动物肺炎疾病的防治研究中的应用；所述动物为貉或者鼠。
3.权利要求1所述的貉源肠外致病性大肠杆菌在筛选预防和/或治疗动物肺炎疾病的药物中的应用；其中，所述的貉源肠外致病性大肠杆菌作为筛选预防和/或治疗动物肺炎疾病的药物的靶标；所述动物为貉或者鼠。
4.权利要求1所述的貉源肠外致病性大肠杆菌的培养方法，其特征在于：在TSA培养基中，37℃培养；TSA培养基的组成为：胰蛋白胨15g，大豆胨5.0g，氯化钠30.0g，琼脂15.0g，pH值7.1-7.5。
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狐、貉源大肠杆菌分离鉴定及毒力基因检测;李倩倩 等;微生物学通报;第49卷(第3期);第1048-1056页 参见全文，尤其是摘要，第1节 *
狐、貉肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性、耐药性研究;马帅 等;黑龙江畜牧兽医(第01期);第90-95、164页 参见全文，尤其是摘要，第2-4节 *
秦皇岛地区貉肠外大肠杆菌的致病性与耐药性分析;刘勃兴 等;中国兽医学报;第40卷(第10期);第1947-1953页 参见全文，尤其是第1-3节 *
马帅 等.狐、貉肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性、耐药性研究.黑龙江畜牧兽医.2021,(第01期),第90-95、164页 参见全文，尤其是摘要，第2-4节. *

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