SU1751199A1 - Питательна среда дл выделени патогенных стафилококков - Google Patents

Abstract

Использование медицинска  микробиологи . Сущность изобретени : питательна  среда используетс  с целью повышени  селективных свойств среды, упрощени  и ускорени  выделени  патогенных стафилококков Среда дополнительно содержит желток, при этом нативный  ичный белок и желток она содержит в виде  ичной взвеси. 0,1 %-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов агар-агар 20,0 25,0 г, хлористый натрий 100,0-102,0 г,  ична  взвесь 100,0-150,0 г; 0.1 %-ный водный раствор кристалвиолета 3,0-3,5 мл, дефиб- ринированна  100,0-150,0 мл, бульон Хоттингера до 1 л. 2 табл. о w Ё

Description

Изобретение относитс  к медицинской микробиологии.

Известна питательна  среда дл  выделени  стафилококков, содержаща  агар- агар, приготовленный на м сном бульоне, и 10% дефибринированной крови.

Недостатком данной среды  вл ютс  слабые селективные свойства

Известна питательна  среда дл  выделени  стафилококков, содержаща  физиологический раствор, м со-пептонный агар (рН 7,2) 10% хлористого натри  и 10-20% желточной взвеси.

Недостатком данной среды  вл ютс  также слабые селективные свойства

Известна также питательна  среда дл  выделени  стафилококков, содержаща  агар-агар, нативный  ичный белок хлори стый натрий, бульон Хоттингера

Недостатком данной питательной среды  вл ютс  ее слабые селективные свойства , сложность и длительность выделени 

патогенных стафилококков, так как в св зи с широким применением антибиотиков и хи- миотерапевтических препаратов, оказывающих вли ние на изменчивость микробов кокковой группы, в этиологии многих гнойно-воспалительных процессов больша  роль стала придаватьс , нар ду с золотистым стафилококком, и другим видам стафилококков , относ щимс  к группе потенциально-патогенных В соответствии с этим недостатком известной питательной среды  вл етс  определение только одного вида стафилококков что снижает диагностическую ценность питательной среды

Целью изобретени   вл етс  повышение селективных свойств среды, упрощение и ускорение выделени  патогенных стафилококков .

Эта цель достигаетс  тем что среда дополнительно содержит желток,при этом на тивный белок и желток она содержит в виде  ичной взвеси. 0.1 %-ный водный раствор

VI

сл

ю о

кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар20,0-25,0 г

Натрий хлористый100,0-102,0 г

Яична  взвесь100,0-150,0 г

0,1%-ный водный раствор кристалвиолета3 ,0-3,5 мл Дефибринированна  кровь100,0-150,0 мл Бульон Хоттингера До 1 л Питательную среду готов т, например, следующим образом.

1000 мл агаровой питательной основы, приготовленной из сухого питательного агара по обычной прописи с добавлением 10%- ного хлористого натри  и 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристалвиолета, стерилизуют , охлаждают до 60-70°С, добавл ют в асептических услови х стерильно приготовленную  ичную взвесь (куриное  йцо - белок и желток, смешанное с 200 мл стерильного физиологического раствора) в количестве 100 мл и 110 мл дефибриниро- ванной крови. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывани  и подсушивани  среду используют дл  проведени  необходимых исследований . Срок хранени  среды после приготовлени  7-10 дней при температуре +4° С.

Питательна  среда используетс  следующим образом

Дл  выделени  культур стафилококков исследуемый материал (мазки из зева носа, гной, раневое содержимое, вода, смывы с обьектов внешней среды) рассеивают по всей поверхности питательной среды тампоном (лли шпателем, а при дифференциации уже выделенных штаммов стафилококков - штрихами на сектора чашки Петри, Учет результатов провод т через 24-48 ч инкубации в термостате при 37°С

При посеве исследуемого материала на предлагаемую диагностическую среду на ней вырастают, нар ду с золотистым стафилококком , и другие виды стафилококков с признаками патогенности (вирулентности) П р и м е р 1. При пр мом посеве тампоном мазка из зева ребенка с подозрением на дифтерию были использованы одновременно простой м со-пептонный агар(МПА), кров ной и желточно-солевой агары, а также предлагаема  диагностическа  среда Указанный набор питательных сред примен лс  как при пр мом посеве патологиче- ского материала, так и при проведонии идентификации выдел емых из зева микроорганизмов Через 18-24 ч все культуры с

простого агара подозрительные как стафи лококки (наличие золотистого, желтого или белого пигмента колоний), пересевались вновь на кров ной агар, желточно-солевую

и предлагаемую среды Все колонии с предлагаемой питательной диагностической среды также засевались на кров ной и желточно-солевой агары. После 18 ч инкубации производилс  учет результатов. Из зева ре0 бенка было выделено 9 штаммов стафилококков (3-е золотистым пигментом, 6 - с белым) Дальнейша  идентификаци  позволила установить, что все три штамма золотистого стафилококка обладали

5 гемолитической и лецитиназной активностью . Из культур белого стафилококка два штамма дали на кров ном агаре четкую зону гемолиза и один штамм обладал лецитиназной активностью. При посеве этого же мате0 риала на предлагаемую диагностическую среду было выделено 11 штаммов стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета), из которых у 4 культур наблюдали одновременно зоны лизиса эритроцитов и

5 помутнени  с радужным венчиком у трех колоний отмечалась только зона гемолиза и у одного штамма - только зона помутнени  Следовательно, обычными методами выделено б штаммов стафилококков, обладав0 ших факторами агрессии (гемолизин лецитиназа), а при использовании предлагаемой диагностической среды изолировано 8 штаммов патогенных стафилококков Несмотр  на несущественное различие в ко5 личестве выделенных штаммов следует подчеркнуть, что исследование с применением предлагаемой диагностической среды продолжалось в течение 18-24 ч, в то врем  как использование обычной методики по0 требовало не менее 48 ч работы

П р и м е р 2. При параллельном контрольном посеве на МПА, кров ной агар и предлагаемую питательную среду шести смывов и двух проб воздуха в операционной

5 после ее профилактической обработки было обнаружено, что в одном смыве с загубника наркозного аппарата и в одной пробе воздуха присутствовали белые стафилококки обладавшие при последующем исследовании

0 гемолитической активностью, но не имевшие лецитиназы. Применение обычных сред позволило получить окончательный ответ через 48 ч, а при использовании предла5 гаемой диагностической среды ответ был получен через сутки

Пример 3. Готов т среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера г/л Агар-агар180

Натрий хлооистый99 О

Яична  взвесь 80.0мл

0,1 %-ный водный

раствор кристалвиолета2,75 мл

Дефибринированна 

кровь80,0 мл

Золотистый стафилококк дает хороший типичный рост колоний. Зоны гемолиза и помутнени  слабо различимы. Колонии белого стафилококка светло-фиолетового цвета , Наблюдаетс  единичный рост колоний кишечной палочки и вульгарного проте , что свидетельствует о недостаточном тормоз щем действии хлористого натри  и кристалвиолета в количествах, добавл емых в среду.

Пример 4, Готов т среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Агар-агар20

Натрий хлористый100

Яична  взвесь100 мл

0,1 %-ный водный

раствор кристалвиолетэ3 мл

Дефибринированна 

кровь100мл

При посеве золотистого стафилококка вырастают колонии оранжево-желтого цвета с  вно выраженной зоной гемолиза и зоной помутнени  с радужным венчиком, размером на 1 мм более размера зоны гемолиза . Белые стафилококки дают колонии светло-фиолетового цвета с зоной гемолиза и без нее или с зоной помутнени : радужный венчик больше размеров зоны гемолиза на 1 мм, Среда позвол ет дифференцировать стафилококки с признаками патогенности от непатогенных видов. Кишечна  палочка и протеи роста не дают.

П р и м е р 5. Готов т среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Агар-агар23,0

Натрий хлористый101,0

Яична  взвесь130 0 мл

0,1 %-ный водный

раствор кристалвиолета 3,25 мл

Дефибринированна 

кровь1300мл

Рост колоний патогенных стафилококков типичный, сопровождаетс  четкой зоной гемолиза вокруг колоний с зоной помутнени  и радужным венчиком, превосход щим по размеру зону гемолиза на 3 мм. Колонии стафилококков типичные, оранжевого или фиолетового цвета Некоторые колонии белого стафилококка дают слабый радужный венчик, что позвол ет отн ётТГй и х к группе стафилококков с при 5нлк ми пато- генносги. Кишечные палочки и протеи не дают роста.

П р и м е р Готов т среду, как указано при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л

Агар-агар25,0

5Натрий хлористый102,0

Яична  взвесь150,0мл

0,1 %-ный водный раствор кристалвиолета3 ,5 мл 0 Дефибринированна 

кровь.150,0мл

Колонии золотистого и белого стафилококков типичные, оранжевого цвета с зоной гемолиза и зоной помутнени  с радужным 5 венчиком по периферии. Зона помутнени  превосходит размеры зоны гемолиза на 3 мм; колонии белого стафилококка фиолетового цвета; некоторые колонии дают зону гемолиза и зону помутнени  с радужным 0 венчиком, свидетельствующие о наличии факторов агрессии - гемолизина и лецити- назы. Кишечные палочки и протеи не растут. П р и м е р 7, Готов т среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих 5 количествах в бульоне Хоттингера, г/л Агар-агар27,0

Натрий хлористый103,0

Яична  взвесь170,0 мл

0,1 %-ный водный 0 раствор кристалвиолета3 ,75 мл Дефибринированна  кровь170,0 мл Колонии золотистого стафилококка вы- 5 растают  рко-оранжевого цвета с нетипичной морфологией (колонии мелкие, слегка морщинистые) со значительным количественным уменьшением числа колоний по сравнению с контрольным высевом, что сви- 0 детельствует о тормоз щем действии из- бытка хлористого натри  и кристалвиолета. Зоны гемолиза и помутнени  нечеткие, едва различимые из-за сли ни  по цвету с интенсивно окрашенным фоном среды. Белые 5 стафилококки темно-фиолетового цвета с нетипичной морфологией колоний. Кишечные палочки и протеи роста не дают.

Указанное свидетельствует, что предлагаема  модификаци  питательной диагно- 0 стической среды позвол ет сократить объемы и срок исследований за счет преимущественного выделени  стафилококков, одновременной их идентификации и определени  признаков из вирулентности, так 5 как наличие в среде раствора кристалвиолета позвол ет расти только стафилококкам; присутствие желтка  ШТной взвеси в питательной среде дает возможность в этой же чашке визуально наблюдать лецитовителаз- ную реакцию, с помощью которой определ тс  наличие у исследуемого штамма микрорганизмов фермента лецитиназы; присуттвие в среде дефибринированной крови ает возможность визуально наблюдать гемолитическую активность штаммов. Все отмеченное расшир ет диагностические возможности среды.

Положительный эффект достигаетс  олько лишь при строго определенной взаимосв зи существенных признаков. Исклюение любого из них не позвол ет достичь положительный эффект.

Проведенные исследовани  предлагаемой диагностической среды с использованием выделенных и идентифицированных ранее 124 штаммов стафилококков показало , что предлагаема  диагностическа  среа четко дифференцирует патогенных микробов этой группы, как и с использованием набора других сред дл  выделени  и идентификации штаммов стафилококков, с той лишь разницей, что выделение и частична  идентификаци  этих бактерий проводитс  в одной чашке.

В результате изучени  выдел емости патогенных стафилококков с использованием различных питательных сред получены следующие результаты: всего исследовано 124 штамма стафилококков; выделено 97 штаммов стафилококков с признаками вирулентности; в том числе на обычных дифференциальных средах кров ной агар - 81, желточно-солевой агар 74: на предлагаемой диагностической среде 92.

При испытательных исследовани х на предлагаемой диагностической среде вырастали колонии только патогенных стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета). Кроме того, при наличии у микробов факторов агрессии (гемолизин и лецитиназа) вокруг колонии наблюдалась зона гемолиза эритроцитов и зона частичного помутнени  с радужным венчиком различной интенсивности по периферии зоны гемолиза или несколько ее превосход ща  по размерам (на 1-3 мм). В табл. 1 приведены данные, свидетельствующие о различных реакци х микроорганизмов в зависимости от дозы добавл емых в предлагаемую диагностическую среду ингредиентов .

Как свидетельствует табл 1. минимальные количества дефибринированной крови и  ичной взвеси, при которых получаетс  довольно четкий результат, определ ютс  на уровне 100-150 мл по показател м четкости зон гемолиза и помутнени  с радужным венчиком и величинам размеров зон гемолиза и помутнени .

Зависимость роста стафилококков на предлагаемой питательной среде от количества добавл емого в нее раствора кристалвио- лета представлена в табл. 2.

Как видно из табл. 2, доза добавл емого

в предлагаемую диагностическую среду кристалвиолета существенно не оказывает вли ни  на культуру стафилококка, в то врем  как культура кишечной палочки не растет

0 на среде уже в дозе кристалвиолета от 3,5 мл и выше,

Claims (1)

1. Таким образом, как свидетельствуют приведенные примеры, предлагаема  диагностическа  питательна  среда, приготов5 ленна  при строго определенных соотношени х вносимых ингредиентов, позвол ет четко дифференцировать патогенных представителей стафилококков от непатогенных с одновременным определе0 нием у них в одной чашке двух ферментов агрессии (гемолизин и лецитиназа). Это позвол ет в значительной мере сократить объ- емы и сроки исследовани  за счет преимущественного выделени  только ста5 филококков с одновременной их идентификацией и определением признаков вирулентности. Кроме того, использование предлагаемой диагностической среды позвол ет экономить питательные среды, не0 обходимые по обычной методике дл  аналогичной идентификации (кров ной агар, желточно-солевой агар), а также рабочего времени персонала, необходимого дл  посева на дополнительные среды (м со5 пептонный агар, кров ной агар, желточно- солева  среда) по обычной схеме исследовани , и времени, требуемого на их раздельное приготовление и подготовку посуды . Все указанное увеличивает произво0 дительность труда персонала бактериологических лабораторий Формула изобретени  Питательна  среда дл  выделени  патогенных стафилококков, содержаща  агар5 агар, нативный  ичный белок, хлористый натрий, бульон Хоттингера, отличающа с  тем, что, с целью повышени  селективных свойств среды, упрощени  и ускорени  выделени  патогенных стафилококков, она

   0 дополнительно содержит желток, при этом нативный  ичный белок и желток - в виде  ичной взвеси, 0,1%-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компо5 нентов:

   Агар-агар20,0 25.0 г

   Хлористый натрий100 0 102 0 (

   Яична  взвесь100.0 150 0 i

   0,1%-ный водный раствор кристалвиолета 3035 мл

   Дефибринированна  кровь

   100,0-150,0 мл

   Бульон Хоттин- гера

   До 1 л

   Таблица 1

   Зависимость размеров зон гемолиза и помутнени  о предлагаемой диагностической питательной среде от дозы добавл емых ингредиентов

   Т а б л и ц   2

   Количество колоний золотистого стафилококка нп предлагаемой ,агностической среде в зависимости от концентрации кристзлвиолета

   Чиста  культура золотистого стафило