TW211039B - - Google Patents

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五、發明説明（I ) 技術領域 〔產業上之刺甩領域〕 本發明係有藤一種感染症之檢測系統，以及一種可用 於該系統中之徽生物之檢出及截生物之鑑疋方法。 背甭技術 〔發明之背景〕 感染係指—種在病理學上，病原性之截生物（以下稱 之爲菌）侵入生體內而展開增殖之現象。®惑染所發生之 症狀，係依宿主生體之抵沉力與菌之毒性力間之相互赖係 而定。 感染症中，有菌血症之治療方法之改良’係如下所 述般之彘一種重要的問題。 菌血症並不是一種因特足之細菌ππ形成之病症，其係 因各種菌在血液中出現並開始痿息而始’在臨床上’當有 接近40。之發燒現象持續商曰以上時，被認爲有發病之疑° 菌血症之症狀是高熱；又，當不注意此病症，在數日，或 是特別在患者爲小孩或憑末期兰體抵抗力像弱之患者的場 合，更甚至在一、二日1¾，患者盒S之处亡。因此菌血症 係騸一種重症，而旦是一槿轂重之病症。 经濟部中央標準局印焚· (請先閱讀背面之注意事項存琪窵本頁) 感染症發生時，生韹袒辕內之最主要的防御系統是， 嗜中性白血球、單球狀白血寒以及小呑嗤飽胞系之呑嗤細 胞。 _於菌血症，據®菌之所以在血液中出現，係因菌與 甲4(210X29了公沒） 〜I〜 ύ A6 B6 五、發明説明（么） 呑噬細胞之交戰後成爲優勢，而自組截慶入血液內所造成。 由於菌血症係因此過程所造成之現象，因此在治療時 係對患者投與大童之對於病因菌有感受性之抗生物質。 然而，抗生物質在一般上會造成肝臟等生體（臟器） 擦能之低落，因此，必須極力避免势處於危險狀態之患者 投與並不有效之抗生物質。 —般而言，細胞之噬菌力並不及於菌之毒力’考將菌 之擴散至全身血流中之狀沅稱爲菌血症，因菌所產生之毒 素之作用而顗示厳重症狀的菌血症則被稱爲敗血症。又， 菌血症之證明（亦卽診^之確定）中，⑴臨床症狀’⑵培 養，⑶格蘭氏染色，⑷休克狀態之始認等，係屬重要項目 ，在此等項目之黃施完成後，再決定治療方針° 因此，在治療時不可或缺的是’迅速且確實之困的鑑 定。 (習用技術） 依據菌之鑑定的現行方法，被疑患有®血症之檢Ε， 在檢查室中被檢出及鑑定其菌時，—般麈限於培養瓶（以 下稱之爲0·3 )陽性之檢揸，霣施時，係便用選擇性培養 基而進行鑑定。然而，在實際上，自此等血液檢體培養函 之成功率非常之低；而且，在被頌疑患有菌皿症|7Π投與大 量抗生物質之場合，卽便血液中含困，也吊不會增函及發 育，因此，成爲c · Β _性之比率少之又少。 此外，黠於次一紱化之方法，尙有菌盩成分涿跑 ¾..............................ίτ…：..........................^ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部中央櫺準局印裝 £110： Α6 Β6 五、發明説明（s) 產物之橡器分析法（辨野義己，由氣體色管分雞法所達成 之細菌鑑定之迅速化及臨床檢査，詒見醫學書院1985年u 月第29集第12號），利用特異抗體之方法（請参見曰本特 公昭60-224068號），以及，利用DNA特異性之雜交物（日 本特公昭61-50 237 6"號）以其特異性而達高正確性之方法 等等，曾爲相關人士所提出；但不論何植方法’都須要菌 之分雞及增菌培養。 另一方面，着眼於惑染症時呑噬細胞作用之方法，曾 有一種險覷集中血液試料中白血球成分之取瑰黃層（buf玫 coat )的塗抹染色標本±方法。 一般而言，以血瑪黃層漂本，菌被檢出之頻度，貧有 報告指出在成人菌血症之葛合，與耳朵皿同傣地係及於30 %，在新生嬰兒之揚合，1〇例中有7例C 70%)可檢出菌 體；依據塗抹標本之檢視’有關末梢血中圈之有無之情報 ，係可爲治療之一大方針。 上述方法雖然在診澍技術中被要求具有迅速性及確霣 性，但擊治療幾乎無所幫助。 〔發明所欲蘚決之問頦〕 習用技術之前段中的訪處理，至少要在自檢齷之選擇 性分避上耗時1〜2 E，在增菌上耗時1日，在固足換作 上耗時1日以上，合計必須耗時3〜4日，而在S際上， 此一培養必須持繪至菌發胃舄止，123此，違成爲C.B陽性 之#合，也芾須耗時一星枭以上。是以，此已成爲依習用 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •发. ‘打. 缘· 甲 4 (210X29 了公沒） 女- 姐㈣ ^ 經濟部中央標準局印¾ 五、發明説明（斗） 方法在OB陽性下死亡率過高之要因。例如，L日本惑染 症學誌1 1984年第58集第2號第12 2頁之#告中，曾指出 卽使血液培養餳性率爲28.6% ( 163/5 69件），其中死 亡率仍及於84.6 %( 138 / 163件）之程度。 此外，在培養中若有一般細菌混入時，也有無法區別 之狀況發生。 例如，作爲菌血症之主要起因菌中的一徨之葡萄球菌 中的表皮葡萄琮菌，由於其係—複在正常人反賓中亦存有 之园，因此在蔣注射用針刺入皮廣.內時’咳囷货混入所採 取檢鎧內之眞。 另外，重要的是因上述情事，待培養之檢饞中有許多 菌被上述呑噬細胞所呑筮或因抗生物隻之投與而死亡成靜 止狀態，故而卽便在培養條#下，能壻殖之菌的數目亦不 多。因此，在霣：察上使街產床檢體進打培養舞’菌之.險出 率僅達10 %左石，非常之低。 具體·. S之，將在Ss床上·»i fe疑患有S血症之S者的血 液再培養一晝夜以上並予演查後’其血中有园存正之我象 有和^含法判明。因此，目前在臨床上均是如前所述般之 在磨疑有敗皿症之喑段卽不待檢出結杲掲曉卽開始治療。 亦I!」，對葸者设與笋於最：.費範圍之菌有效的抗生物質並觀 {請先閲讀背*之注意窜項再填3?本頁) -¾. •訂· 叙. 甲 4(210X297 公沒) A6 B6 五、發明説明（5") 察1、2日，當沒有效果時，再採用其他之抗生物質，具 體言之，對患者係以試行方法予以治療之。 又，在習用技術之後段中所述及之染色法，因生體組 織與菌同樣地被染色，因此虫#中僅藉形態卽迅速地判別 菌體，必須仰賴熟練之技術，有時會有剡定困難之情形c (相關問題之探討） 一般而言，％於細胞可予染色覲祭。細胞會企圖將進 入之菌饈外側所復之蛋白貧予以消化。籐推足，進入之_ 係以便外側蛋白質殘留之方式趦染色，而後，外惻蛋白質 逐漸被分解，其後，DNA或RNA則被坂壞；然而，此等蛋 白質或DNA或RNA係以何種程度分解則屬未知。 無論如何，依此種方式，DNA或RNA因可維持較長之 時間，因此若以其而鑑定細胞內之菌，並注目變性程度極 低且保存程度高之DNA或RNA而不注目在細胞內消化程度 較大之蛋白質的話，似可獲致有效及正確之結果。又，進 入細胞內之菌本身具有抵抗倥，無疑將會殘存c例如，非 爲敗血症之主要起因菌佢可在呑噬細胞內生存的有例如分 枝捍菌麁、結核菌鏖、列士透菌鏖、沙門捍®屬、布氏捍 菌屬、Lationei la pnenmothila等等，其可適用於本發明之檢 測方法中。 甲4(21〇父297公沒) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •訂· •線.

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ABI 五、發明説明（^) 依據實驗，可證明在钿胞吞噬菌體之後，菌之DNA或 ，RNA之特異性可獲維持。 發明之開示 〔發明之目的〕 用以治療感染症之檢測中，確定檢體中之菌係檢査之 最終目的。 於本發明中，爲有效进提高作業效率，其目的係在提 供下述⑴之方法以及⑴內之⑵、⑶步驟Z方法。 ⑴就被確認吞噬細胞中E呑噬有菌體之檢體，鑑定其菌。 ⑵藉著檢出處於被吞噬於吞噬細胞內狀態Z菌，而高比率 地予以檢S。 (3)藉著直接檢出被吞噬於#喔細胞內之菌而不予增殖，而 迅速且正確地鑑定函tt。 〔發明之要旨〕 〔q包含下述土 · ϋ_.苹騄z感-染铳一 爲生體皖份之含有多量血液、腹水或其他吞噬 細S^·^·或成份等的檢體予以固定； ii藉著包含.¾ S3方法將檢體中之菌予以篕定： ①利街放射性或之探針在檢體中進行雜交。 〔2〕包含下述i〜iii步孬之的檢測系統 經濟部中央揉準局印¾ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i將作爲生體成份之含有多量血水或其他吞噬 細胞之部份或成份等的檢體予以固定1\^ ___藉著包含下述①、②步駿-之方法將檢 、 m 定|：· 甲 4(210X 297公沒） A6 B6 五、發明説明ί 7 ) (請先聞讀卄面之注意事項再瑱寫本頁) 本發明偽提供感染症病原阖，待別是被呑噬入呑噬細 胞中之細菌的新穎性檢潮法，以及鑑定之方法。 具髏言之，本發明之感染症病原菌的檢測法，其待擞 (a) 將從血液、腹水、透析液及膜等活體成份所諏製成 的含有呑噬細胞之活髏外檢體，予以固定； (b) 使卵白素狀蛋白質與上述檢體接觸； (c) 使结合有酵素、抗體、色素及金等標識分子之維他 命H,與上述己與卵白素狀蛋白質接觸之檢體接觸 ;及 (d) 檢出上逑標識分子。 本發明之感染症病原菌的鑑定法，其持擻偽在：此鑑 定法包含以下之步驟： (a) 將從血液、腹水、透析液及膜等活體成份所調製成 的含有呑噬細胞之活體外檢髏.予以固定； (b) 將上述檢體與細菌DNA探針雜交；及 (c) 檢出雜交物形成之信號。 此外，本發明復提供上逑檢測法及鑑定法之組合成的 威染症病原菌之撿測法。 〔作 困〕 發明人等發現，若便臣結合有標識分子之键球菌卵白 素或卵白累，不管又含有酵母之菌體成份之種類，可定量 甲 4(210X 2972 发） 五、發明説明（豸） 地予以檢出。又，此等分子與呑噬細胞竑無親和性。 據信，此係因上述卵白素與維他命Η之袞和性較其與 其他物質之結合力鬲過數百倍，因此菌篚成份之外膜可均 勻一致地包在維他命Η之外，因此，經由卵白素，可使細 胞內之菌的存在可超過感度地由標識分子視覺化。 此外，卵白素及維Ί&命Η與生體之結合速度較習用之 作爲檢出試藥困的抗髖快上許多，具有在2〜3小時內卽 可檢出之優點。 例如，經由與菌結合之鐽卵白素，可使其與酵素結合 而行顯色反應，以將檢釋中之菌以特定之色檢出。 此外，如前所述，發明人等匿又著眼於吞噬細胞之將 吞嗤菌體予以聚集之事實，發現藉著使該細胞作爲樣品施 予適當處理而在不增殖菌之狀態下實施現場增殖，可充份 地檢出存於袪吞噬且持續被破壞；2菌中仍被維持z DNA。 從而，因無須增殖菌體，故而檢出迅速確實。 又’此現場雜交法，在組織病理學之層面，雖被闬於 惑染之病毒的檢出，但因以下之事實，而未能被應用於菌 感染症中。 具磨言之，病袤系在細胞內增殖，藉雜交而可檢出之 DNA或RNA係以目田之狀態充份地存在；但在菌體2場合 ’並非沐吊牝等宿主依存式增殖法，經保存之DNA ( RNA )係因菌體而被保護，或與遭破壞之蛋白質密接，亦卽， 被吞嗤入細胞內ζ狀態據信有許多種，非常複雜，尙未有 任何嘗試之5¾例。 A6 B6 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. •訂· 叙· 甲4(210X 297公沒） 組濟部中央揉準局印¾. A6 _:_56 一 — 五、發明説明（气） 將以上事實再歸納可得： ⑴菌之DMA或RNA之存在狀態，在本質上係與病毒之DNA或 RNA之存在狀態不同，在吞噬細胞內，尤被濃縮成聚集 狀。 ⑵菌之DNA或RNA，其破壞係較菌蛋白質之破壞爲少，因 此其因應場合而被妥善保存之可能性高。 著眼於上述兩點，發明人等終而確立在菌之範疇內首 先藉雜交ΓΓΠ運成之檢出方法。 若以非放射性之探針爲用於雜交中之探針，例如使甬 經維他命Η化;Z探針時.，卽使在未設置放射性同位素使闬 設施之一般檢査室，也仍能使g光學顯微鏡進行檢出，非 常迅速、簡便。 依據本發明之感染症之檢測方法7與習闬之例如依據培 養法所逵成之檢出中卽使達陽性：ζ場合也須以24小時以上 來確認菌之有無，以24〜48小時以上來鑑定該菌（屬、種 之決定）之總f+須3〜4日的事實相較，具有上述作用之 兩個本發明方法的單獨或組合使用，在確認菌之有無時僅 須2〜3小時，充其量最多僅藉著1〜2日卽可迅速且明 瞭地檢出；再者，就泛柽亡3 Z檢體，具有上鹆作闬之 場雜交法可迅速及正確地鑑定菌，可在整體上最多麈耗1 〜2日卽得以實現極爲確實Z檢出，誠具有劃時代之效果 。卽使菌體成份幾乎完全被消化未檢出之場合，亦可將其 未變性之DNA ( RNa )雜交而予撿出。 圖面之簡單說明 {請先聞枝背面之注意事項再填寫本頁) .装· .打. •線. 甲 4(210X 29了公;？I) 9 ro ο 2

A B 五、發明説明（10) 第1圚〜第20圖中所示的是顯示本發明實施例結果之 表示生物形態的照片，各照片中之示有指示線的部份係如 下所定義： 第1圖玻片1上Z人類細胞中之淋菌（粒子狀之信號）。 第2圖 玻片2上之被吞噬入人類白血球中之菌（未鑑定 〕C臨檢）。 第3圖 玻片3上之被吞噬入人類白血琮中之葡萄球菌C 玻璃器皿中）。 第4圖 玻片4上之被吞噬入鼠類白血球中之葡萄球菌（ 活體中）。 第5圖 玻片5上之由透析患者之透析液所採取；z酵母。 第6圖 玻片6上之由進入鼠類腹水中之葡萄球菌所得之 DNA的雜交物〔與由葡萄球菌所得之探針之雜交 ' 信號〕。 第7圖 玻片7上之玻片6方法中使用其他探針的例。雜 交信號不可見。 第8圖玻片8上之η人類橫膈膜下濃瘍中之葡萄琮菌所 得的DNA之雜交物（與囪葡g球菌所得之探針之 ........................................^ .............¾.. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂· .線· 經裔邡中兴揉準局印义· 例 的 針 探 他 其 用 使 中 法 方 8 α 片 見 。 玻可 } 之不 號上號 信 9 信 交片交 雜玻雜 圖 9 第 甲 4 (210X297 公沒） A6 B6 經濟部中央揉準局印乂· 2110-trt^ ---- 五、發明説明（丨丨） 第10圖 玻片10上之利用探針24之點雜交。 第11圖玻片1〗上之利用探針77之點雜交° 第12圖玻片12上之利甩探針7之點雜交。 第13圖 玻片13上之利用探針36之點雜交。 第Μ圖本發明實施例中所用之由葡萄球菌所得之探針的 限劁酵素圖譜。 第15圖玻片15上之人類血液樣品與由綠膿菌而得之DNA 探針的雜交物。 第16〜20圖 分別爲玻片Ιό〜19上之人/類血液樣品與由葡 萄球菌而得之DNA探針的雜交物。 又，第〖5圖、第16圖、第Π圖、第19圖爲倍率1〇〇〇倍 之光學顙微鏡照片，第化圖爲倍率4〇()倍之光學顯隙照片 ，第20圖爲第Π圖之倍率400倍的光學顯激照片。 實施發明之最佳形態 Α撿體之調製法 首先，將依以下⑴之調製法所得之檢體，以下列⑵之 方法予以固定在玻片上，作爲本發明各實施例中所用之樣 品0 ⑴依塗掠法之各種臨床樣證的關製法 ①自血液（人類及動物之附加肝燐脂2原血）之樣品調製 自血液_製樣品，係可该以下兩種方法中之任一種達成 ①一1 Mono - poly 溶媒（X卜 PEM : Flow Laboratories 公司 )法 首先，將31111之：^-?1?\!詹;入13父1〇〇111111之試管內 (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. -打. 線· 甲 4 (210X297公沒） 經裔部中央橾準扃印¾ A6 B6 五、發明説明（11) ，然後小心地將作爲檢體之附加肝燐脂的原血（採取後2 小時以內）3.5 ml重疊於該Μ — ；PEM之上，並接著於室溫 下利用懸吊式旋轉器以300 g之力將其離心之，離心後， 僅採取多核白血球之帶；其後，以PBS (等張化磷酸緩衝 液）將其洗淨並予離心之。而後，再以適量（約Irol)之 PBS將所得之細胞沉澱物予以懸浮以作爲檢體。 ① 一2 6%葡聚糖法 在作爲檢體之附加肝燐脂之原血1容（lml )中，添 加Η〜％容之6 %葡聚糖予以混合，然後再於37 “C下將其 靜置1小時，其次，採取其上層並以PBS將其稀釋，稀釋 後再將其離心，接著，再以適量之細胞沉澱物將所得之細 胞沉涵物懸浮，以之作爲檢體。 ② 自尿之樣品的調製 將自尿而得之檢體直接塗抹。 Φ 自腹水之樣品的調製 將腹水採取於試管內，以800 r.p.m.或3〇00 r . p . m， 之轉速將其離心之，然後再以適量之PBS將所得之細胞沉 澱物懸浮之.，以之而作爲檢體。 ④ 自膿之辕品的誘袈 將自膿而得之檢附直接塗抹。 ⑵玻片固定樣品塗抹法 {請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. .訂. 將依⑴之操所得之各種檢體以適當量載於以2 %明膠 塗覆之玻片（最好使用由Boxy Brown公司所製之「E.T. Coating Slide」）上，並以滴管等之腹部等將其延展，然

乎 4(21〇X 297公沒) | (^r A6 B6 經濟部中央標準局印

2li〇^^ 五、發明説明（丨,3) 後再予風乾至完全乾燥爲止。然後，將該玻片浸漬於卡諾 固定液（乙醇：氣仿：薛鼓=6:3 .1)中’進行細胞 之固定。其後，再將坂片®輕地於7〇 %乙醇中予以洗淨， 洗浄後再予風乾。 實施例1 嵌卵白素狀蛋白貧之菌檢出法（以下稱之爲鏈 卵白素法） 於本實施例中，係便用麵卵白素作爲卵白素狀蛋白質。 首先，將依上述A方法所製作之玻片固定樣品置於 PBS溶液中在室溫下予以再水合10分鐘以上，然後再將含 有5 Pg / ml鐘卵白素( Amersham ) 、1%牛血淸蛋白（ Sigma Fraction V )及 〇. 1 % Tween 20 ( Tween 20，商品名） (Sigma )之PBS載於上述固定樣品上，而後再於潤濕箱 中以37 X：使其反腫60分鐘，之後，在室溫下將其在含有〇. 1 % Tween 20之適量PBS中錾藝地予以振盪洗淨三次，一次洗 麁10分鐘。 其次’將含书5 /ig / ml維他命Η _性；酸酷（E LABS公司），1%牛血清蛋白及〇·!% Tween 20之PBS ，載於莰片固定樣品上，然後再於潤濕箱中以37 X：使其反 騰CG分Μ，之後，在罜溫下將其在含有1无v:veen 20之 適量PBS中輕輕地予以振逯洗淨一次（】〇分選），而後， 再在室溫下於含有 0. 〇5 % Tri ton ( Triton X _ 1 00，Sigma )(以下稱爲 TX )之 AP 7· 5 ( 100 mM Tris · HC1 pH 7.5 ，1 〇〇 mM NaCl )中藝藝地予以振盪，予以洗淨二次，一 次洗淨10分鐘；繼之，再於g溫下在aP 9. 5 ( 10〇 TriS (請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁) •装· •味. 甲 4 (210X29:么'沒) 經 部 中 央 準 局 印 Ββ 五、發明説明（I午） HCl pH 9.5，100 πιλί NaCl ，10 miM 崩gCl2)中輕輕地予 以振逯洗淨三次，一次洗淨10分鐘。 其次，在含有 0.3 mg / ml NBT ( Nitrobluetetrazorium ，Bethesda Eesearch Laboratories )及 〇. 17 mg / ml BCIT (隣 酸 5 ~~ 溴一4 一氯—3 — Π引噪醇，Bethesda Research Labora-tories )之AP 9.5中，於37 ·(：在暗處使其行若干畤間之發 色。反應之停止係藉浸漬於10 niM EDTA中數分鐘達成，反 應後再予風乾。 最後，再以適當濃度之萘敔藍黑（Sigma )進行對此染 色，述接著於流水中予以洗浄，之後_·>再予風乾至完全乾燥 ，並接著利用油浸在顙滎鏡下觀察上述乾燥後樣品中菌之有 無（信號）。 又，菌係可在紫色之信號中觀察得，而嗜中性白血球等 之細胞係以水色〜藍色夜觀察得。 " 以下，兹就各玻片實施之實ir例，以各玻片之顯微照片 中所付之掊示縲，將所得之.結杲說明之。 光學顯微鏡岛採用倍率爲1000倍者。 玻片1 ......尿（臨床檢證）甲之菌（琳菌）； 人體紙泡中之洧S，厗以夜柒成藍色之粒子狀的 信號被觀察得。（第1圖） 自人體血液（臨床檢體）所檢出之菌（未経鑑定 );血液調製法洚泫葡聚糖法。 衩呑噬入人類白血球中之細菌的®號可見。（第 2圖） (請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· ♦訂· 玻片2 甲 4(210Χ 297公; ;11〇 Α6 Β6 經濟部中央標準局印¾ 五、發明説明（丨5Ί 玻片3......自人類血液（玻璃器皿中）所檢出之葡萄球菌 ，•血液調製法係软Μ〇η〇 _ p〇ly 媒法，將血液 及葡萄球菌培養20分鐘而實施。 被呑噬入人類白血球中之葡萄球菌的信號m見 。（第3圖） 坂片4 ......自人類血液（活體中）所檢出之葡萄球菌；將 葡萄球菌靜脈注氛’於鼠類中，4小時後，资常 法製作血液樣品。 钣吞噬入鼠類白血球中之葡萄球菌的信號可見 。（第4圖〕 玻片5 ......自腹膜灌流後之透析液所檢出之酵母； 自透析患者而獲得。 自透析患者之透析液所得之酵母的®號可見。 (第5圖） 又，玻片2 , 3 , 4之P製法，均可由葡聚糖法或·νιοπο -poly溶媒法實施β 實施例2 资據武用維他命Η化之現場雜交所實施之細胞 內外的菌（感染菌）之檢出及鑑定（以下稱之 爲深針法）-* 首先’將泫上述万法所作成之各玻片固定樣品，在室 溫下浸漬於PBS溶液中Κ)分鐘以上而進行再水合，然後再 將該樣品置於含有植物g質及TX - loo各0.25 % ( W/ V ) 之PBS溶液中輕輕地將其振逢1〇分鐘，在室溫下完成10分 鐘之處理。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •訂. •線. 甲 4(210X 297公沒） 17 110., A6 B6 五、發明説明（丨) 其次*再將含有5 mg./ml溶菌酵素（S i gma )及

Lys ostafin C 商品名，Si gma )、5 mg/ml N —乙醒基 Muramid SG (商品名，生化學工業公司製）Z PBS -植 物皀質C 0。05 %)溶液*就每一穴滴入約100 Μ，然後再將 其懂：於室溫或37 X；下Ζ潤濕箱中120分鐘。而後*再以含 有〇·2 N HC1 Ζ生理食塩水將其洗滌20分鐘。其次，再路 上述葆品莰片浸漬於由包含0。5 %無水醋裒之〇·Ι Μ三乙 醇胺一 HC1緩衝液（pH 8.0 )所得之溶液中20分潼。 繼Z ^再以70 %，並接著以90 %之乙醇將备坂片洗之 *洗滌後1再予充分風.乾。其次，再緒各玻片浸漬於含有 70 nM NaOH Z生涅食塩水，容液中3分鐘，韮接著：i刻先以 70 %後以95 %乙醇將其洗之，洗滌後，予以充份.風乾*並 將風乾所得物作S現場雜交之樣品。 Z後1再將逢量Z具有以下組成Z雜交用溶I;夜載於固 -定在S片上Z樣品上，然後再賂其置於潤彘箱中於37 (下 便其反應一晝夜。 C組 成）

45 %甲韹 2 X SSC 婭濟部中央標準局印- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 X Denhar t液C 0。〇2 :¾聚乙燒吡咯規調（S i gma ) 、0。02 3h p h y c ο 1 ( Pharmacia Fine Chemicals )、 0 · 02 .¾牛血：靑蛋臼） 25 0 /』g./mU疰魚靖子DNA (預先以！(XTC將其加熱5分鐘 ，然後再於泳卞中將其急冷3並預先變性C Pharmac ia 甲 4(21〇X 297公沒） A6 B6

Slio^__ 五、發明説明（it )

Fine Chemi cals)) 10 % 葡聚楗硫酸酯（Pharmac ia Fine Chemica Is) 適量之維他命H化探針DNA (預先變性）（探針DNA之 維他命Η化係藉切割轉譯法進行，例如*可採用切_轉 譯道具 C Be thesda Research Laboratories)) 而後*冉將上述坜片丨置於含有50 %甲醛之2 X SS C中 ，在37 X；下予以洗淨30分鐘。繼；Z *再將其於室溫下置於 SSC中輕輕地予以振逯洗淨三次（一次20分鐘），洗淨後 *將其浸漬於在室溫下之pBS中10分鐘。 爲進行阻碍*然後再將含有丨〇 %正常兔.子血淸（Vector Laboratories 公司）之PBS载於坂片固定樣品上*然後 再於潤濕箱中於37 ·(：下將其保溫00分鐘*然後於室溫下將 其浸於PBS中歡分鐘。 繼之，再骆含有2 pg/ml Z鏈卵白素* I %牛血淸蛋 白，0。1 .% Twe sn 20之PBS載於玻片固定樣品上，並接著 在潤濕箱中將其保溫60分鐘*然後再於含有〇.1 % Tween 20 2： PBS中在室溫下輕鎏地予以振邀洗淨三次*每次i〇分 鐘0 而後’將含有2 pg/ml Z·適他命Η化驗性攝_酿、1 % BSA、0. 1 % Twe en 20 % Z PBS * 載於茇片 Ssi 矩樣品上 ，恣後再於潤濕箱中於37X：下將其保溫分道，並接蓍於 室溫下在含有0· 1 :¾ Twe en 20之PBS中經羥地予以轉盪洗 淨丨〇分鐘，而後再於室溫下在含有0 · 〇5 % t r i t ο η X— W0 Ζ ΑΡ 7.5 中輕輕地予以振盪洗淨兩次，每次1〇分鐘；羝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裴· •訂· 45f. 經濟部中央標準局印裝 甲 4 (210X297 公; Λ» I ? 絰濟部中央揉準局印装 A6 B6 五、發明説明（（8：) 之*再於室溫下在AP9.5 中輕輕地予以振盪洗淨三次， 每次10分鐘0 其後，將上述樣品置於含有330 pg/ml NBT、17〇 戶g/m 1BCIP 21AP9.5 中，在37·(：下於暗處行適當z時 間發色反應。反應之停止係藉浸漬於10 mM EDTA中數分鐘 而達成*反應予以風乾。 最後，再便用適當濃度Z萘酚藍黑行對比染色1然後 再於流水中予以洗淨*洗淨再予風乾至全乾爲止a全乾後 ，再利用油浸而在顯激鏡下由發色及特異形態而判定菌之 有無。 以下，茲就各實驗例;2結果*依各玻片Z顯激照片中 所附Z指示線進行說明。又，所用Z光學顯澂鏡係倍率爲 100 0 倍者β 貢驗例1 由葡萄球菌所潯之DNA探針Ζ調製 - 下述貫驗例2及3中所钼之由葡萄球菌所得Z DNA探 針Ζ性質*係如下所述。 關於其調製方法*係採角敎科書中，例如採用分子選 殖指南（Guide to Molecular Cloning Techniqnes )( 酵* 學；Z 方法 C Method in Enzymology))巾；1 笫 152 集 )Aca demi c Pr e ss 1 98 7年淠確立2選殖技術，將葡萄球 以染色體DNA挿入載撞（例如PBR ) Z內。 然後*自所獲得之:各竦系選取保有葡萄球菌特有之 DNA斷片者*將其作爲探針。 此等探針與其他;Z細M C例如大腸菌、克雷白稈菌屬 甲 4(210X297 公芨） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. ，訂. A6 _ B6 五、發明説明（丨1 ) 、假單胞菌 C Psendornonas )、大腸桿菌（

Enterobac te r)等或同屬之表皮葡萄球菌）不會交叉雜交。 此等探針z限制酵素圖譜，係示於第w圖中。 又*各探針與臨床珠（黃色葡萄球菌興表皮葡萄球B 。此二種係惑染症原因Μ Z苜131，由於爲類似菌，故痠先 實驗）間；Ζ反應性*係以如下之方式_査。 〔調製法〕 調製法區依上述敎科書中所述方式達成’培養臨床菌 株，萃取其DNA。 然後*將上述DNa·以一定量（例如5 pi)斑點化於耐 隆逋紙上，予以鹼性麁性後*將其作爲雜交Z樣品。 〔點 吸漬 雜交〕 依據相同Z敎科書，在42 ·(：下*以50 %甲醛5 X SSC ，利用上述32 P標記；Z探針貫整夜之雜交。 — 其後，以0。1 X SSC、0. 1 % SDS在55 X；下將所得物 洗滌運涅二次，一次20分鐘，然後再於一 70"C下整夜以放 射蒜將其照射；Z，照射後蔣其顯像° 此等各探針與臨床珠（黃色匍萄球囷與表皮葡萄球S )間；Z反®注，除示於莰、：i - 12、13中。 經濟部中央標準局印焚 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 各莰片上均是如下Z結果，點上黃&葡萄球菌Z叵置 (第10、11、12、13圆之上二段的斑點）中可見到信號； 而在點上表皮葡萄球菌2应置則未見到：言號C问各圖之下 二段的斑點）。亦卽，此等探針可明％地裱出黃色滷萄球 菌*沮不致與黄色葡萄球鹵2鉬似Μ妁表皮葡萄球鹵交叉 甲 4(210X 297公潑） B6 五、發明説明（_2〇 ) 雜交。 贾驗例2 鼠類腹水中之葡萄球菌之檢岀 在將葡萄球菌注入鼠類腹腔之內後4〜δ個小時，剖 開其腹腔採取其腹水，然後將依上述Α⑴③Ζ調製法所得 Z離心沈澱物以100⑷ Z PBS懸浮之，之：後再將其20〜5 户1載設於玻片之穴內製成固定樣品*然後再依上述貢施 例1中所記載;Z方法*刹用下述探針實施雜交。 所得之實驗結果*係示於下列各實驗玻片中β 玻片6 ......進入腹水中之葡萄球菌與由葡萄球菌獲得之 DNA探針間之雜交； 顯示雜交物Ζ信號可見β 白血球浯以擴散信號顯示（第6圖）。 玻片7 ......利用由大腸菌及克雷白桿菌麁（Klebsiella) 所得之DNA探針的雜交； 雜交物之信號未檢出（第7圖）。 實驗例3 人類橫膈漠下膿瘍中之:葡’萄球az檢出 經濟部中央操準局印¾ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本百) 首先，以生理食塩水懸浮人類橫臈膜下噥瘍*取其中 20 μΐ塗抹於各穴中予以莪開，展開後予以風乾C 40分鐘 )*風乾後*再與坂片6、7同樣般地進行前處埋，並依 實施例1之方法實施現場雜交a 所得Z貢驗結果*系示於下列各實驗照片中。 甲 4(210X297 公潑） 五、發明説明（Zl) 玻片8 ......與玻片6，7中所用之D NA探針雜交； 雜交物之信號可見C第8圖）· 玻片9……利用與玻片6，7中相同之探針的雜交； 利用由大腸菌及克雷白桿菌Μ所得之D N A探 針之揚合，未撿出雜交物之信號。 實旌例3 現易雜'交法與血液培養法之比較·實驗 自以上述實施例1之鏈卵白素法而未被檢出帶菌之患 .者，依上述A⑴①一2之6 %葡聚糖法及A⑵之玻片固定 様品塗抹法，作成固定槎品，卽調製成人皚血液槎品。然 後，依據上述賢施例1中所記戴之方法，利甩實驗例1中 所調製之由葡萄球菌两桿的D N A探針與上述樣品雜交〔 請參見下述表工之玻片16〜19，及第丨6〜19圖〕。 此外，又利用舆實驗例1之E N A探針調整法相同之 方法，詞製由綠遐捍菌C Pseudomonas aeruginosa)而得 之D N A探針》具疆言之，區以限劁薛素Hin d冚切1窗綠濃 捍菌之染色疆DN A，並將斷片納入適當之载镘（例如PBR 3 22 )中予以放大，然後再選取與其他之細菌D N A〔例 如大腸菌、克雷白捍菌遘、大腸捍菌C Enterobacter〕、 笋萄球菌,5 Γ Staphy lccoccus〕等〕不致交叉雜交夕部 份，和用其甲具有逵當長度之部份C例如1 Okb、5klD 、 4.5kb等作爲針。 經濟部中央標準局印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 而後，铱據上述黃旌阕1中之方法將上述探針與上述 詞製之人類血液場品雜交C下述表1中之玻片15，誚參見 第15圖）。 又甴血液笼油取兵π製上述人類血沒窀品之相同 甲 4(210X 297 公;!I) 〜〜 A6 B6 liOoi 五、發明説明（22·) 患者的靜脈，利用血液採集器Γ Rosii」，將其血液以無 菌之方式採集於利克益德B C瓶「Rosh」C日本Rosh公 司製〕中C每一瓶中爲10 ml〕然後在室溫下將其培育之 ，鉉日予以觀察，其結杲係如下表I中所示，瓶15〜19电 均未檢出菌C未示顯微照片）。 以上之結杲係示於下表1中。 表1 探針法與血液培養法之比較實驗結杲 玻片或瓶NO . 依探針法檢出之菌名 皿液培養法 1個月以內 15 綠’膿捍菌 _ * 16 金黃色葡萄琮菌 — 17 η —' 18 " _ 氺氺 19 " — 註：*……甶痠祓出綠彍桿菌 * *由糞便檢出金黃色葡萄球菌 甴上述表1之結杲可知，卽使是以習用之血液培養法 及iS蛋鏈卵白素法無法撿出菌之搓品，若以探訂£：-，可將 菌予以檢出，而且菡出能力®異。 〔發明之效果〕 首先，玄發明的第一效果是，就血液培養非爲陽性之 檢卷，依據著眼於呑噬細胞之現場雜交法，可迅速確足地 蔣菌予以鑑定。因此，玄發明檢測法之確立，對於菌血症 甲 4(210X297公发） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裏· •訂· 參 經濟部中央標準局印装 r ili〇- A6 B6 經濟部中央揉準局印¾ 五、發明説明U3) 之治療可斌與阈時代之指針，依此，死亡运之厥低乃可獲 期待。 再者，依據習甩之血液培養法，茌調裝撿罨時，自患 者探取血液援品’妾1囷怒檢出薦止，必須鎭日地進行，且 血液樣品量約逵5〜10 ml 之程度，對於悬者而言，必須 使其忍受肉體或辖神上之强烈痛苦，與此柜較，依據宏發 0弓之檢測方法，自恩者採取血液樣品之作業僅須乙次，而 且不需赣密之無菌操作，而旦其採取量亦極少C例如以葡 聚糖法僅須約1 m 1〕，可使息奢肉辑或耪祥之痛苦蒎匠。 此外，依據宏發眄之1採甩探針法的惑染症之檢測方 法；卽使是依上述檢測方法而未能以鏈卵白雰法被撿出菌 之檢费，菌仍然可被檢出及鑑定，而且檢出及鑑足能力弈 常優異。 再者，依據玄發明之麈採用鏈卵白焉法之檢出方法， -可迅速地提洪非售明確之撿出結果。具體言之，太發明係 可針對習用茌睽荥上因疑是Μ血症而不得不開始嘗試抗生 物質治療之狀況，確認Μ皿症，以此點，可稱爲具有進步 丨比外，1使审探針法之芏畀明之檢出及鑑足方£，庄 有闆菌血症之起因菌之鋈足的方面，亦有以下之袞杲，具 靖而言，诙據芷發明锥交法，以一次份量之檢證，卽可貢 施逵於菌種之鏗定；所需之時間方面，依習用之方法需3 〜4日之較長時間C而且钙出Μ低〕，及之，弦據：發明 方法則最長及1〜2日之程度，亦卽，可大幅縮短時間 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 .蛑. •訂· •線· 甲 4(210X297 公沒） 〜Ζ女〜 A6 B6 五、發明説明（2屮） ，而且檢出率也非常之低。 特別是在非放射性荽識中，若特別選周維他命Η化探 針，可在不須選擇場所下簡單地實施。 然而，在此D Ν Α之雜交法中，盡_可能地尋求特異之 探針此點乃爲硏究Η題。 如此，例如1就黃色葡萄球菌之場合，開發特異之 DhT Α使用，而當檢轘中不含黃色葡萄球菌之場合，檢出 結杲會成爲陰性。此外，依序替換D N A之種類而針對準 備之所有D NA卽使檢體爲陰性之場台，菌之有無本身依 然不明。 . 因此，依據宏發明之惑染症之檢測方法，若採用湃用 鏈卵白素法及探針法之診新方法，針葑菌之有無已被迅速 檢出之檢體，因可迅速正確地鑑足菌，故而在整疆上可帶 來迅速確實之效果。 I 亦卽，以鏈卵白絜法薙認菌有無此擧，在防止針對無 菌檢體重複雜交之不經濟方面，非営有用。 另外，如習用之染色法，由於對身體成份不會染色， 而且對於塗抹染色標五中之菌等會特足地予以染色，因此 可IT不需莬a fe術之下卽能迅速確實地判新惑染；汉ΪΓϋ。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •訂· .線. 經濟部中央揉準局印¾. 甲 4(210X297 公发) 2 liOhb 〇, ! 人 jT f 五、發明: 既明（） 申請第78109185號申請專利範圍修正本 1 . 一種感染症的檢測法，像屬一種由菌髅成份之外膜具 有雒他命Η的細菌或酵母菌所構成之威染症病原菌的 檢測法，其特歡係在： 此檢測法包含以下之步驟： (a) 將從血液、腹水、透析液及膜等活體成份所諝 製成的含有呑噬細胞之活體外檢體，予以固定 > (b) 就上述檢體，進行：含有與卵白素狀蛋白質結 合之維他命Η的上述感染症病原菌，所保持的 蛋白質之暴露處理； (c) 使卵白素狀蛋白質與上述經暴露處理之檢匾接 脚， (d) 使結合有選自酵素、抗體、色素及金.之標識分 子的維他命H,與上述已與卵白素狀蛋白霣接 觸之撿體接觸；及 (e) 檢出上逑標識分子。 2 ·依申諳專利範圍第1項所述之檢測法，其中該卵白素 狀蛋白質係鏈卵白素者。 3.—種威染症的鑑定法，偽靨一種包含於吞噬細胞中之 感染症病原菌的菌種之鑑定法，其持徵係在： 本紙張又度適用中困國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） {請先Η讀背面之注再本頁) —裝- 訂- 經濟部中央標準渴Λ工消費合作社印» ilObci A6 ______B6 五、發明説明（） 此鑑定法包含以下之步驟： (a) 將從血液、腹水、透析液及腱等活體成份所調 製成的含有呑噬細胞之活塍外檢塍，予以固定 (b) 就上述檢睡，進行由上述感染症病原菌所保持 之DNA/RNA的暴露處理； (c) 使用由1T染症病原菌所調製之結合有維他命Η 的細菌DNA探針，對於經上述暴露處理之檢 體，進行現場雜交； (d )令卵白素狀蛋白質與上述經現場雜交之檢體接 觸； (e) 使結合有選自酵素、抗體、色素及金之標識分 子的維他命H,與上述已與卵白素狀蛋白質接 觸之檢體接觸；； (f) 檢出上述標識分子。 4.依申誚專利範圍第3項所述之鑑定法，其中該細菌 DNA探針係放射性DNA探針者。 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 丨裝· 訂_ 經濟部中央櫺準局8工消费合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）