WO1989010411A1

WO1989010411A1 - Method for diagnosis of infectious diseases and method of detecting and identifying microorganisms

Info

Publication number: WO1989010411A1
Application number: PCT/JP1989/000424
Authority: WO
Inventors: Tsuneya Ohno; Akio Matsuhisa
Original assignee: Fuso Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1988-04-20
Filing date: 1989-04-19
Publication date: 1989-11-02
Also published as: KR900700623A; US5358846A; TW211039B; EP0366813A4; AU623889B2; KR930000277B1; ATE133205T1; AU3535389A; EP0366813B1; DE68925457D1; EP0366813A1; DE68925457T2

Description

明細書『感染症の診断方法及び微生物の検出と微生物の同定の方法』技術分野

(産業上の利用分野）

本発明は、感染症の診断システム及びそれに用いることができる、微生物の検出と微生物の同定の方法に関する。背景技術

(発明の背景）

感染とは、病理学的に、病原性の微生物（以下菌という）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立することをいう。それによる発症は宿主生体の抵抗力と菌の毒力との相互閲係に依存する。

感染症のなかでも、菌血症の治療方法の改善は以下のとおり重要課題である。

菌血症は、特定の細菌による病気ではなく色々な菌が血液中に出現して棲息し始めることにより始まり、臨床的には 40度近い熱が 2 日以上続くとその発病を疑う。症状が高熱であり、また、放置すれば、数日あるいは特に小児、癌の末期で生体の抵抗力が弱まつた状態の患者の場合 1 、 2 日で亡くなってしまう、という重症かつ緊急な病気である。

感染症において、生体組織内では第一義的には好中球、単球及びマク口ファージ系の食細胞がその防御に働いている。

菌血症での血液中への菌の出現とは、食細胞との戦いて、優勢になった菌が組織から血液中に侵出してきたことと考えられる _n 一一菌血症はこうなってからの状態であるから、治療において、起因菌に感受性のある抗生物質を大量に投与する。

ところが抗生物質は一般に、肝臓など生体（臓器）の機能を低下させるものであるから、危険な状態にある患者に有効でない抗生物質を与えることは極力避けなければならない。

一般に、細胞の食菌力が菌の毒力に及ばず、菌が全身の血流中に拡がる場合を菌血症（ba c terem i a) と定義すれば、菌の産生する毒素の働きで、重い症状を示す菌血症を敗血症（s eps i s) と言う。そして、 s eps i sの証明（すなわち診断の確立）には、 1)臨床症状、 2)培養、 3)グラム染色、及び 4)ショック状態の確認が重要項目であり、これらの項目が満たされて治療方針を決定する。

したがって、治療には、迅速かつ確実な菌の同定が不可欠である。

(従来技術）

この菌の同定の現行方法でば、菌血症を疑われた検体の検查室での菌の検出 ' 同定において、ルーチンとして、カルチャー • ボトル（以下、「C · B 」と言う）陽性のものに限って、選択培地を用いて同定が行われるのが一般的な手順である。しかしながら、実際にはこれらの血液検体からの菌の培養の成功率は極めて低い。しかも、菌血症を疑われた時点で、大量に抗生物質を投与されている場合には、たとえ血液中に菌が舍まれていたとしても、増菌 · 発育できない場合が多く、それ故、 C · B 陽性になる割合は極めて少ない。

また、サブルーチンとしての方法として、菌体成分や菌の代謝産物の機器分折法（辨野義己、ガスクロマトグラフィ一による細菌同定の迅速化、臨床検查、 voし 29 No . 12 1985 年 11月、医学書院参照）、特異抗体を利用した方法（日本特許出願公開昭 60-224068 号参照）、さらには、 D A の特異性を利用したハイブリダィゼーシヨンによるもの（日本特許出願公表昭 6レ 502376 号参照）でその特異性に基づいた正確性の高い方法等があるが、いずれも、菌の分離及び増菌培養が不可欠である。一方、感染症における食細胞の働きに着目したものに、血液試料中の白血球成分が集中しているバフィーコ一ト（Buffy coat) の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。

一般にバフィ一コート標本で菌が検出される頻度は、成人菌血症では耳朶血のそれと同様に 30%にとどまる力、新生児では、 10例中 7例（70% ) で菌を検出している報告もあり、塗抹標本の検鏡により末梢血中蘭の有無に関する情報は治療に大きな指針となつている。

このように、本来、迅速性 · 確実性が要求される診断分野にもかかわらず、従来法はほとんど治療に寄与しているとは言えない。

(発明が解決すべき問題点）

従来技術の前段における前処理では、少なくとも検体からの選択的分離に 1 〜 2 日、増菌に 1 日、固定操作で 1 日以上、合計で 3〜 4 日は十分かかり、現実にはこの培養を菌が発育するまで続けるわけであるので、 C - B 陽性になった場合ですら一週間以上かかる場合が多い。従って、これが従来法での C - B 陽性での死亡率を高くしている要因となっている。例えば、「日本感染症学誌」， vol. 58, No.2, PP. 122, 1984年の報告によれば、血液培養陽性率が 28, 6% (163/569件）でも、その内死亡率が 84.6% (138/163件〉にまで到っていることが報告されている。

その上、培養では常在する菌が混入しても区別できない場合もある。例えば、菌血症の起因菌として有力であるとされている 1つである、ブドゥ球菌のなかの表皮ブドウ球菌（ェピデルミーデ 7A E i de丫 ides ) ) とよばれるものは、正常人の皮膚にもある菌なので、注射針を皮膚に剌す時にこれを取り込み検体中に混ざってしまう虞がある。

そして重要なことは、前逮した事情から培養すべき検体 Φでは多くの菌は前記食細胞に取り込まれ、抗生物質投与のため死んでいるか静止状態にあるため、培養条件下であるとしても増殖できる菌の数は少ない。このため、実際に臨床検体を用いての培養による菌の検出率は 10 %前後と、非常に低い。

つまり、臨床的に菌血症を疑うべき患者の血液をさらにー昼夜以上培養して検査しても結局、その 90 %は菌の存在すら判明しないのが現状である。そこで現在は臨床的に敗血症を疑った段階で、検岀結果が出るのを待たずに治療を開始していることば前述の通りである。即ち、最も広範通な種類の菌に効く、抗生物質を投与し、 1、 2日様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行方法である。

また、（従来技術）の後段で述べた染色法では、生体成分も菌と同様に染色されるから、その像の中から彤態によってのみ、迅速に菌を判別するのは熟線が必要であり、判定が困難な場合もある。

(問題点に閬する検討）

一般に細胞は染色して見ることができる。そして、細胞は、入ってきた菌の外側を被う蛋白質を消化しょうとする。入りたての菌ば外側蛋白質がそのまま残って染色されるが、次第に外側の蛋白質は分解され、次いで DN A 又は RNA が壌れると推定されるが、これらの蛋白質や D NA 又はがどの程度まで分解されているか明らかではない。いずれにせよ、このように DNA 又は RNA の方がより長く維持されているだろうから、細胞内の菌を同定するのであれば、細胞内消化程度の大きい蛋白質にではなく、より変性程度の低く保存程度の高い DNA 又は RNA に注目すれば効率がよく正確であろう。また、とりこまれて、菌自体が抵抗性を持ち、残っている場合は言うまでもない。例えば、敗血症の主要起因菌ではないが食細胞内で生存することができる、例えば、マイコバクテリウム（ Myco&aci er ium)、ッべノレクローシス (Tuberculosis) ^ リステリア（Listevia)、サノレモネラ（S^ mone U a 、ブルセラ（ Br cel la) 、レシオ不ラ ' ニューモフイラ (Laiioneliな

neumothi la)等があり、本発明の診断方法に適用可能である。実験によっても、細胞が菌を取り込んだのち、菌の DNA 又は RNA の特異性は保持されていることが裏付けられている。発明の開示

(発明の目的）

さて、感染症の治療のための診断において、検体中の菌を確定することが検査の最終の目的である。

本発明においては、その作業を効率的に進めるため、全体として、下記の（1)の方法及び（1)内のステップとしての（2)、（3)の方法を提供することを目的とする。

(1) 食細胞に菌が取り込まれていることを確認した検体について、その菌を同定する。

(2) 食細胞に取り込まれた状態の菌を検出することにより、高率に検出する。

(3) 食細胞に取り込まれた菌を増菌せずに直接検出することにより、菌を迅速にかつ正確に同定する。

(発明の要旨）一一

C 1 〕下記 ί 〜 ii のステツプを舍む感染症の診断システム。

i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に舍む分画又は成分である検体を固定する。

ϋ . 下記①のステップを舍む方法により検体中の菌を同定する。

①. 放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にハイブリダィゼーションを行う。

〔 2 〕下記 i 〜 iiiのステツプを舍む感染症の診断システム。

ϋ . 下記①、 ②のステップを舍む方法により、検体中の菌を検出する。

① . 検体にストレプトアビジン（S trep tav i d i n) を舍むァビジン（Av i d i n)様蛋白質を接触させる。

② . 前記処理を施した検体に、酵素、抗体、色素、金（ Go l d) 等の標識分子を結合させたピオチンを接触させる。 iii . 前記 ii において菌が検出された検体について、下記①のステップを舍む方法により検体中の菌を同定する。

①. 放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にハィブリダィゼーションを行う。

〔 3 } 下記 i 〜 ii のステップを舍む、検体中の菌を検出する方法。

ii . 下記①のステップを舍む方法により検体中の菌を同定する。

①. 放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にノヽィブリダイゼーションを行う。〔 4 〕下記 i 〜 iiiのステップを舍む、検体中の菌を検出する方法。

ϋ . 検体にストレプトァビジンを舍むァビジン様蛋白質を接触させる。

iii . 前記処理を施した検体に、酵素、抗体、色素、金（ Go l d) 等の標識分子を結合させたピオチンに接触させる。〔 5 〕下記 i 、 ii のステップを舍む、検体中の菌を同定する方法。

i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に含む分画又は成分である検体を固定する。

ii . 放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にノヽィブリダィゼーションを行う。

(作用）

本発明者は、ストレプトアビジン又はァビジンに標識分子を結合したものを用いれば、酵母をも舍む菌体成分の種類にかかわらず、定量的に検出できることを見出した。そして、これらの分子は食細胞とは親和性がない。

これはアビジンが、ピオチンに対して、他の物質との結合力の数百倍も高い親和性があり、菌体成分の外膜が一様にビォチンを取り込んでいる可能性が考えられ、アビジンを介して、細胞内の菌の存在を非常に高感度に標識分子により視覚化できるわけである。

しかも、アビジン · ビォチンの生体との結合速度が従来用いていた検出試薬としての抗体より格段に早く 2 〜 3時間以内に検出できるという利点をも持っている。

例えば、菌に結合するストレブトァビジンにビォチンを介して酵素を結合させて呈色反応を行い、検体中の菌を特定な色として検出することができる。

また、前述したように食細胞が菌を取り込み集菌していることに着目し、そのままサンプルとして適当な処理を施して増菌をしないでィンサイテュ（i n s i tu) ハイブリダィゼーションを実施することにより、取り込まれて破壊されつつある菌においてなお維持されている DNA を十分検出できる。従って、増菌の必要なしに行えるから、検岀が迅速かつ確実である。

なお、このインサイテュ（i n s i tu) ノヽイブリダィゼ一シヨン法は、組織病理学の分野で、感染したウィルスの検出に用いられているが、以下の事情により菌感染症への応用は確立されていなかった。

即ち、ウィルスは細胞内で増殖し、ハイブリダィゼーシヨンにより検出できる DNA 又ば RNA がフリーな状態で十分存在しているが、菌の場合、そのような宿主依存的な増殖方法ばとらず、保存されている DNA (RNA)ば菌体によつて保護されているか、破壌された蛋白質と密着しているか等、細胞内に取り込まれた状態はいろいろに考えられ複雑であり、未だ試みた例はない。

以上をさらにまとめると、

1) 菌の DNA 又ば βΝΑ の存在状態は、ウィルスの又は RNA の存在状態とは本質的に異なるが、食細胞の中で最も濃縮されている。

2) その DNA (RNA)ば、菌蛋白質よりはダメージが小さく、場合によってはかなりよく保存されている可能性が高い。

結局上記 2点に着百した結果、本発明によって、菌においても初めてハイプリダイゼーションによる検出方法が確立されることになつた。

ハィブリダィゼーシヨンに用いるプローブを非放射性のもの、例えば、ピオチン化したものにすれば、放射性同位元素使用施設のない一般検査室でも光学顕微鏡を用いて検出できるから、迅速、簡便になる。

本発明による感染症の診断方法は、従来の例えば、培養法による検出では、陽性の場合ですら菌の有無を確認するだけで、 24時間以上さらにその菌を同定（属、種の決定）するために 24 〜 48時間以上かかり全体として 3 〜 4 日かかったことに比し、上記の作用を有する両方法を単独で又は組み合わせて用いることにより、菌の有無を僅か 2 〜 3時間、精々 1 〜 2 日で迅速かつ明瞭に検出でき、さらにこの検出された検体についても、上記作用を有するインサイテュ（ i n s i t u) ハイブリダィゼーション法により迅速かつ正確に菌を同定するから、全体として精々 1 〜 2 日でずっと的確な検出を実現するという作用を有し、画期的である。また、菌体成分がほとんど消化されて検出されない場合でも、その未変性 DNA ( R N A)をハィブリダイスし検出できる。

11面の簡単な説明

第 1 図〜第 20図は、本発明の実施例の結果を示す生物の形態を表す写真であって、各写真における引き出し線が示すものは下記の通りである：

第 1図プレート 1 における、ヒト細胞中の漱菌（粒子状のシグナル）。

第 2 図プレート 2 における、ヒト白血球中に取り込まれている菌（同定されていないもの）（臨検）。

第 3 図プレート 3 における、ヒト白血球中に取り込まれているブドウ球菌（ i n v i t r o )。

第 4 図フ。レート 4 における、マウス白血球中に取り込まれているブドウ球菌（i n vi vo) 。

第 5 図プレート 5 における、透折患者の透折液からの酵母。第 6 図プレート 6 における、マウス腹水に取り込まれたブドゥ球菌由来 D A とのハイブリッド（ブドウ球菌由来のプローブとのハイブリッドシグナル）。

第 7 図プレート 7 における、プレート 6 の方法において他のプローブを用いた例。ノヽイブリッドシグナルは見えない。

第 8 図プレート 8 における、ヒト横隔膜下膿瘍中のブドウ球菌由来 DNA とのハイブリッド（ブドウ球菌由来のプローブとのハイブリッドシグナル）。

第 9 図プレート 9 における、プレート 8 の方法において他のプローブを用いた例。ハイブリッドシグナルは見えない。

第 10図プレート 10における、プローブ 24を用いたドットハイブリダイゼーション。

第 11図プレート 11における、プローブ 77を用いたドットハイブリダイゼーション。

第 12図プレート 12における、プローブ 7を用いたドットハイブリダイゼ一ション。

第 13図プレート 13における、プロ一ブ 36を用いたドットハイブリダイゼ一ション。

第 14図本発明の実施例に用いたブドウ球菌由来のプロ一ブの制限酵素地図。

第 15図プレート 15における、ヒト血液サンプルと緑膿菌由来由来 DN'A プ口ーブとのハイブリッド。

第 16図〜第 20図それぞれプレート 1 6〜19における、ヒト血液サンプルとブドウ球菌由来の D N A プロ一ブとのハイブリッド。

尚、第 15図，第 16図、第 17図、第 19図は倍率 1000倍の光学顕微鏡写真、第 18図は倍率 400倍の光学顕微鏡写真、第 20図は第第 17図の倍率 400倍の光学顕微鏡写真である。発明を実施するための最良の形態

A . 検体の調製法

以下の（1)の調製法による検体を、（2)の方法によりスライドグラスに固定し、本発明の各実施例に用いるサンプルとした。

(1) 塗抹法における各種臨庆検体の調製法

① 血液（ヒト及び動物のへバリン加全血）からのサンプル調製

血液からのサンプル調製は、以下の 2 通りのいずれかにより行った。

①一 1 モノ一ポリ溶媒（M-PRM:Flow Laboratories, Inc.

) 法

3 ; ^の M- PRM を 13 X 100 卿の試験管に入れ、その上に検体であるへパリン加全血（採取後 2時間以内） 3.5 mi を注意深く重層し、室温で 30分間、スィング α—タを用いて 300gで遠心し、多核白血球のバンドのみを採り、これを PBS (等張化リン酸バッファー）で洗浄遠心する。得られた細胞沈澱物を適量（約 1 ) の PBS で懸濁し、検体とする。

①一 2 6 %デキストラン法

検体であるへパリン加全血 1 容（1 ) に 6 %デキストラン 1/3 〜1/4 容を加えて混和し、 37て 1 時間静置し、上層を採り、これを PBS で希釈したのち遠心し、得られた細胞沈澱物を適量の PBS で懸濁し、検体とする。 - -

② 尿からのサンプル調製

尿からの検体をそのまま塗抹する。

③ 腹水からのサンプル爾製

腹水を試験管に採り、 800r.p.tn. 又は 3,000r.p._m. で 15〜30分間室温で遠心し、得られた細胞沈殺物を適量の PBS で懸濁し、検体とする。

④ 膿からのサンプル調製

膿からの検体をそのまま塗抹する。

(2) スライドグラス固定サンプル塗抹法

(1)の操作によりそれぞれ得られた検体を適当量、 2 %ゼラチンによりコートしたスライドグラス（望ましくは、「 H.T. Coating Slide j , Boxy Brown社製を使用）に載せ、ピぺットの腹等で延ばし、完全に乾くまで風乾させる。次に力ルノァ固定液（ェタノ一ル：クロロホルム：酢酸 =6: 3:1)中にスライドグラスを 10分間浸し、細胞の固定を行う。その後スライドグラスを 70%エタノール中で軽く洗浄し、風乾する。

荬施例 1 ァビジン檨躉白暫による菌検出法（以下ストレブトァビジン法という）

本実施例では、ァビジン様蛋白質としてストレプトアビジンを用いた。

上記 Aの方法により作製した各スライドグラス固定サンプルを PBS 溶液中に室温で 10分間以上再水和し、その固定サンプル上に適当量の、 5 / スレプトアビジン（Amersham) 、 1 % ゥシ血清アルブミン（Sigma フラクション Fraction V) 及び 0.1% トウウィーン 20 (T een 20, 商品名）（Sigma)を舍む PBS を載せ、湿潤箱中 37てで 60分間反応させたのち、適当量の 0.1 % トウウイ一ン 20を舍む PBS 中で軽く振盪させながら室温で 10 分間の洗浄を 3 回行う。

次に、 5 g/ ビォチン化アル力リフォスファターゼ（E . y LABS. Inc.) _N 1 %ゥシ血清アルブミン及び 0.1% トウウイ一ン 20を含む PBS をスライドグラス固定サンプル上に載せ、湿潤箱中 37てで 60分間反応させたのち 0.1% トウウィーン 20を舍む PBS 中で軽く振盪させながら室温で 10分間の洗浄を 1 回行い、 0.05% トリトン（Triton X- 100， Sigma) (以下 TXという）を舍む AP7.5(100mM Tris · HC1 pH7.5, lOOmM NaCl )中で軽く振盪させながら、室温で 10分間の洗浄を 2 回行い、さらに AP9.5(100mM Tris . HC1 pH9.5, lOOmM NaCl, lOmM MgCl ；)中で軽く振盪させながら室温で 10分間の洗浄を 3回行う。

次に、 0.3mg/ NBT (ニトロブルーテトラゾリゥム，

Bethesda Research Laboratories) ¾ 0.17mg/ BCIP (5- ブロモ -4- クロ口- 3- インドリノレフォスフェート， Bethesda Research Laboratories) を舍む AP9.5中で 37て暗所で適当な時間究色を行う。反応の停止は 10 mM EDTAに数分間浸けることにより行い風乾させる。

最後に適当な濃度のナフトールブル一ブラック（S i gma) を用い対比染色を行い、流水中で洗浄し、完全に乾くまで風乾したものに油浸を用い顕微鏡下で菌の有無（シグナル）を観察する。なお、菌は紫色のシグナルに、好中球などの細胞は水色〜青色として観察できる。

以下に、各プレートについて実施した実験例についてその結果を各プレートの顕微鏡写真に付した引き出し線に従い説明する。

光学顕微鏡は倍率 1000倍のものを用いた。

プレート 1…尿（臨床検体）中の菌（菌）；

ヒト細胞中の淋菌がフルーに染まつた粒子状のシグナルとなって見える。（第 1図）

プレート 2 ヒト血液（臨床検体）から検出された菌（同定されていないもの）；血液調製法はデキストラン法によった。

ヒト白血球中に取り込まれている細菌を示すシグナルが見える。（第 2図）

プレート 3 ヒト血液（i n v i tro)から検出されたブドウ球菌;

血液調製法はモノーポリ溶媒法により、血液とブドウ球菌とを 20分間ィンキュベ一トして実施した。

ヒト白血球中に取り込まれたブドウ球菌を示すシグナルが見える。（第 3図）プレート 4 ヒト血液（i n v i vo) から検出されたブドウ球菌;

マウスにブドウ球菌を静脈注射し、 4時間後、常法に従い血液をサンプリングした。

マウス白血球中に取り込まれたブドウ球菌を示すシグナルが見える。（第 4図）

プレト 5…腹膜灌流後の透折液から検岀された酵母；

透折患者から得た。

透圻患者の透圻液からの酵母を示すシグナルが見える。（第 5図） '

尚、プレート 2 , 3， 4· の調製法ば、いずれも、デキストラン法、モノーポリ溶媒法どちらでも実施できる。荬施例 2 ピオチン化プローブを用いたィンサイテュハイブリダイゼーションによる細胞肉外における菌（感染茼）の検出 > 同定（以下プローブ法という）

上記 Aの方法に従って作成した各スライドグラス固定サンプルを、 PBS 溶液中に室温で 10分間以上浸して再水和を行い、サポニン及び TX-100を各々0.25% (w/v)舍む PBS 溶液に 10分間軽く振盪させながら室温で 10分間処理する。

次にリゾチーム（Sigma) とリゾスタフイン（商品名， Sigma) 5mg/ と、 N-ァセチルムラミディス SG (商品名，生化学工業社製） 0.5mg/ を舍む PBS-サポニン（0.05 % ) 溶液を 1 ゥヱルにつき約 100 滴下し、 120 分間室温又は 37'Cで湿潤箱中に放置する。その後、 0.2N HC1を舍む生理食塩液で 20分間洗う。次に、 0.1M トリエタノールァミン- HC1緩衝液（pH 8.0)に 0.5 %無水酢酸を舍む溶液中に 20分間浸す。

その後、各スライドグラスを、 70%、次に 95%のエタノールで洗い、十分風乾する。次に、 70mM NaOHを含む生理食塩水溶液に 3分間浸し、ただちに、 70%次に 95%エタノールで洗い、その後、十分風乾したものをィンサイテュハイブリダィゼーションのサンプルとする。

続いて、スライドグラス上に固定したサンプル上に以下の組成のハイブリダィゼ一ション用溶液を適量載せ、湿潤箱中 37 t で一昼夜反応させる。

(組成）

• 45%ホルムアミド、

- 2 X SSC 、

• 1 Xデンハート液（0.02 %ポリビュルピロリドン（S i gma)

、 0.02%ファイコ一ノレ（Pharmacia Fine Chemicals) 、 0.

02%ゥシ血清ァルブミン）、

• 250 g/ サケ精子 DNA (予め 100 て 5分間熱し、氷中で急冷し、変性させておく、（Pharmacia Fine Chemicals) ) 、 • 10%デキストランスルフヱート（Pharmacia Fine

Chen? i ca 1 、 - -

- 適当量のピオチン化プローブ DNiU予め変性させておく）。プローブ DNA のビォチン化はニックトランスレーション法により行う。例えば、ニックトランスレーションキット (Be thesda Resesrch Laboratories) ¾:用い。

次に、 50%ホルムァミドを舍む 2 XSSC 中で 37'C、 30分間洗浄し、 50%ホルムアミドを舍む 1 XSSC 中で 37'C以上の温度、 30分間洗浄する。さらに、 1 XSSC 中で軽く振盪しながら室温で 20分簡 3回洗浄した後 PBS 中に室温 10分間浸ける。

続いて、ブロッキングを行うためにスライドグラス固定サンプル上に 10%正常ゥサギ血清 (Vector Laboratories Inc.) を舍む PBS を載せ、湿潤箱中 37°Cで 60分間保温処理し、 PBS 中で室温数分間浸す。

次に、 g Mのストレプトアビジン、 1 %ゥシ血清アルブミン、 0.1 % トウウィーン 20を舍む PBS をスライドグラス固定 'サンプル上に載せ、湿潤箱中 37'Cで 60分間保温し、 0.1 % トウゥィ一ン 20を含む PBS 中で軽く振盪しながら室温 10分間で 3回洗浄する。

次に、 2 g/ のビォチン化アルカリフォスファターゼ、 1 % BSA、 0.1 % トウウイ一ン 20を舍む PBS をスライドグラス固定サンプル上に載せ、湿潤箱中 37°Cで 60分間保温し、 0.1 %トゥウイ一ン 20を含む PBS 中で軽く振盪しながら室温 10分間で洗浄し、 0.05% トリトン X- 100 を舍む AP7.5 中で軽く振盪しながら室温 10分間で 2回洗浄し、さらに AP9.5 中で軽く振盪しながら室温 10分間で 3酉洗浄する。

つぎに、 330 μ g T、 170 g BCIP を舍む AP9.5 中で 37'C暗所で適当な時間発色を行う。反応の停止は 10 m EDTA に数分間浸けることにより行い'、風乾させる。

最後に適当な濃度のナフトールブルーブラックを用い対比染色を行い、流水中で洗浄し、完全に乾くまで風乾したものに油浸を用い、顕微鏡下で発色と特異形態から菌の有無を判定する以下に、各実験例についてその結果を各プレートの顕微鏡写真に付した引き出し線に従い説明する。尚、光学顕微鏡は倍率 1000倍のものを用いた。

実験例 1 ブドウ球菌由来の DN A プロ一ブの調製

下記実験例 2及び 3 に用いたブドゥ球菌由来の DN A プロ一ブの性質は、以下のとおりである。

その調製方法は、テキスト、例えば分子クローニング技術ガィド（Guide to Molecular Cloning Techn i q ues ) (酵素学の手法 ((Method in Enzymology)) Φ 0 vol .152) Academic Press 1987 年において確立されたクロ一ニング技術を用い、ブドウ球菌を染色体 DNA をベクター（例えば、 PBR)に挿入する。

得られた各クローンからブドウ球菌特有の DN A 断片を保有するものを選びそれらをプローブとした。

これらのプローブは、他の細菌（例えば、大腸菌、クレブシエラ、シユードモナス（ Pse^do onas ) _N ェンテロノ 'クタ（£ nterobacter ) 等又は同属の表皮ブドウ球菌）とはク π スしない。

これらの、プローブの制限酵素地図は、第 14図のとおりである。

また、各プローブと臨床株（黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌。この 2種は、感染症の原因菌のトップであり、類緣菌であるところから、優先的に実験した）との反応性を以下のとおり調べた。

〔調製法〕

調製法は、前記のテキストにしたがい臨床菌株を培養しその DNA を抽出する。 ' これを一定量（例えば 5 n i ) ナイロンフィルタにスポットし、アルカリ変性後ハイブリダィゼ一ションのサンプルとする。

〔ドットブロットノヽイブリダイゼ一シヨン〕

同テキストにしたがい、 50 %ホルムアミド 5 X SSC 、 42 'C で上記 32 Pラベルしたプローブで終夜ハイブリダィゼーションを実施する。

その後洗いとして、 0 . 1 X SSC 、 0 . 1 SDS 、 55 'C . 20分を 2 回処理し、一 70 °Cで終夜放射線照射した後、現像した。

これらの各プローブと臨床株（黄色ブドウ球菌と表皮ブドゥ球菌) との反応性を、プレート 10 , 11 , 12 , 13に示す。

いずれも、黄色ブドウ球菌をスポットした箇所（第 10， 11 , 12 , 13 図の上 2段のスポット）にシグナルが見え、表皮ブドゥ球菌をスポットした箇所にぱ見えない（同各 IIの下 2段のスポット）。即ち、これらのプローブは、黄色ブドウ球菌を明確に検岀するが、黄色ブドウ球菌の類緣菌である表皮ブドゥ球菌とクロスしない。

実験例 2 マウス腹水中のブドウ球菌の検出

マウス腹腔にブドウ球菌を注入後、 4〜 6時間経過後に開腹し、腹水をとり上記 A (l)③の調製法に従って得られた遠心沈殺物を、 100 £の PBS で懸濁し、その 20〜5 ^ £をスライドグラスのゥエルに載せで固定サンプルを作成し、前記実施例 1 に記載した方法に従って、下記のプローブを用いてハイブリダィズした。

この実験結果を、以下に各実験プレート毎に示す。

プレート 6…腹水中に取り込まれたブドゥ球菌とブドゥ球菌由来の D NA プローブとのハイブリダィゼーション；ハィブリッドを示すシグナルが見える。

白血球が拡散したシグナルである。（第 6 図

)

フ。レート 7 大腸菌由来とクレブシヱラ（ e i ) 由来の D N A プローブを用いたハィブリダィゼーション；

ハィブリッドのシグナルが検出されない。（マ図）

実験例 3 ヒ - ··■· ^■''· øブドウ菌检出

ヒト横隔膜下膿瘍を生理食塩水で懸濁し、その . . .

ヱルに塗抹して拡げた後風乾（40 分）し、その後、プレ - . 7と同様に前処理して、実施例 1 の方法に従って、インサイテュハイブリダィゼーションを実施した。

この実験結果を、以下に各実験プレート毎に示す。

プレート 8…プレート 6 , 7 で用いた DN A プローブとのハイブリダィゼーション；

ハイリッドのシグナルが見える。（第 8 図）プレート 9…プレート 6 ，7 と同様のプローブを用いたハイブリダィゼーシヨン；

大腸菌由来、クレブシヱラ由来の DN A プロ一ブを用いた場合では、ハィブリッドのシグナルは検出されない。

実施例 3 インサイテュハイブリダィゼーション法と血液培養法との ¾較荬験

前述した実施例 1 のストレプトアビジン法によって菌が検出されなかつた患者から、上記 A (l)①ー 2 の 6 %デキストラン法及び A (2)のスライドグラス固定サンプル塗抹法に従って、固定サンプルを作成してヒト血液サンプルを調製した。これを、前記実施例 1 に記載した方法に従って、実験例 1で調製したブドウ球菌由来の DNA プローブを用いてハイブリダィズした（下記の表 I のプレート 16〜19、及び第 16〜19図参照）。

また、緑腸菌 ( ？ seu.domonas aeruginosa ) 由来の DNA フ '口ーブを実験例 1 の DNA プローブ調製法と同様な方法で調製した ₀ 具体的は、緑騰菌 ( ？ sev.dora.onas aeruginosa ) の染色体 DMA を制限酵素 Hindiで断片化し、適当なベクター（例えば、 PBR322) に入れて増幅させ、他のバクテリア DNA (例えば、大腸菌、クレブシエラ、ェンテロノ、'クタ（ £ i;e o&acter) 、スタヒロコッカス (Staphylococcus ) 等) とクロスしないものを選択し、この中から適当な長さのもの（例えば、 10 kb 、 5kb 、 4. 5 kbなど）を用いてプローブとする。

これを前述したように調製したヒト血液サンプルと前記実施例 1 に記載した方法に従ってハイブリダイズした（下記の表 I のプレート 15、第 15図参照) 。

また、上記のヒト血液サンプルを調製した同じ患者の静脈から、ブラッドコレクティングユニット「ロシュ」を用いて、リコィド BCボトル「ロッシュ」（日本ロッシュ㈱社製）に血液を無菌的に各々 10 採取し、これを室温でィンキュペートし、経日的に観察した。その結果、下記の袠 I に示したように、ボトル 15〜19ではそれぞれ菌が検出されなかった（顕微鏡写真示さず）。

以上の結果を下記の表 I に示した。

¾ Ϊ プローブ法と血'液培春法との ft象荬験結 ¾ フレ一卜 or プローブ法による血液培養法

卜ノレ No. 検出菌名 1ヶ月以内

15 ？ sendomonas aeruginosa

16 Staphylococcus aureus

i ^ ！ ,.

17 ； 18 ― *

19

注記かつ痰力、りは？ seudomonas aeruginosa 力く検出された

1 力、らは Sia ¾ylococcus aureus 力く検出された上記の表 I の結果から明らかなように、従来の血液培養法、ならびに直接ストレブトアビジン法によって菌が検出されなかつたものでも、プローブ法を用いれば菌が検出できその検出能が優れていることが判明した。

(発明の効果）

先ず第一に、血液培養で陽性でなかった検体につき、食細胞に着目したィンサイテュハイブリダィゼーション法では、迅速 • 確実に菌の同定が可能であった。従って、この診断法の確立は、菌血症の治療に対して画期的な指針を与えることができ、これにより、死亡率の低減が期待される。

さらに、従来の血液培養法では、その検体の調製において、患者より血液サンプルを、菌が検出されるまで経日的に約 5 〜

10 採取しなければならず、患者に対して肉体的に或いは精神的に苦痛を強いるのに比較して、本発明の診断方法では、患者よりの血液サンプルの採取が一度で良く厳密な無菌操作も不要で、しかもその採取量も例えば、デキストラン法では約 1 idと極めて少量で良いので、患者に及ぼす肉体的に或いは精神的な苦痛が低減できる。

また、プローブ法のみを用いる本発明による感染症の診断方法では、上記の診断方法においてストレプトアビジン法によつて菌が検出されなかった検体でも菌が検出 · 同定可能であり、さらにその検出 · 同定能が格段に優れている。

さらにまた、ストレプトアビジン法のみを用いた本発明の検出方法は、非常に明確な検出結果を迅速に与えるものである。すなわち、この発明はそれ自体、従来の臨床的に菌血症らしいということで抗生物質治療を試み始めざるをえなかった扰況に対して、菌血症であることを確定できるという点で、大きな進歩である。

さらに、プローブ法のみを用いた本発明の検出及び同定方法は、菌血症の起因菌の同定に関連しても次の効果がある。すなわち、本ハイブリダィゼーション法によれば、 1回分の検体で菌の種類の同定まで実施でき、所要時間は従来法によれば 3〜 4 日は十分かかった（しかも検出される率は低い）ものが、本方法で精々 1 〜 2 日と飛躍的に短縮でき、しかもその検出率も格段と高い。

特に、非放射性標識のうち、特に、ピオチン化プローブを用いれば、簡便にかつ場所を選ばず実施できる。

しかしながら、この DN A のハイブリダィゼーション法では、なるべく特異的なプローブを探すことが研究課題である。

すると例えば、黄色ブドウ状球菌だけに特異的な D N A を開発して用い、検体に黄色ブドウ状球菌がない場合、検出結果は陰性になる。そしで次々に D NA の種類を替えて検出し、用意していた全ての D N A に検体が陰性であったとした場合でも、菌の有無自体は依然不明である。

そこで、本発明による感染症の診断方法で、ストレブトアビジン法とプローブ法とを併用した診断方法は、菌の有無を迅速に検出した検体について、迅速に正確に菌を同定するから、全体どして迅速的確であるという効果をもたらす。

すなわち、ストレプトァビジン法で菌の有無を確認することが、菌がない検体にハイブリダィゼーションを繰り返すという不経済を防ぐ上で非常に有用である。

さらに、従来の染色法のように生体成分には染色せず、塗抹染色標本中の菌等に特異的に染色するので、感染状況を熟練を要せずに迅速かつ的確に判断できる。

Claims

請求の範西

1 . 下記 i 〜 ii のステップを舍む感染症の診断システム。

i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に舍む分面又は成分である検体を固定する。

ϋ . 下記①のステップを含む方法により検体中の菌を同定する。

①。放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にハイブリダィゼーションを ί亍ぅ。

2 . 下記 i 〜 iiiのステツプを舍む感染症の診断システム。

π . 下記①、 ②のステップを含む方法により、検体中の菌を検出する。

① . 検体にストレプトアビジン（S trep tav i d i n) を舍むァビジン（A v i di n)様蛋白質を接触させる。

② . 前記処理を施した検体に、酵素、抗体、色素、金（ Go l d) 等の標識分子を結合させたビォチンを接触させる。 i . 前記 iiにおいて菌が検出された検体について、下記①のステップを舍む方法により検体中の菌を同定する。

3 . 下記 i 〜 iiのステップを舍む、検体中の菌を検出する方法 < i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に舍む分画又は成分である検体を固定する。

下記 i 〜iiiのステップを舍む、検体中の菌を検出する方法。 i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に舍む分画又は成分である検体を固定する。

ϋ . 検体にストレプトアビジンを含むアビジン様蛋白質を接触させる。

iii . 前記処理を施した検体に、酵素、抗体、色素、金（

Go l d) 等の標識分子を結合させたピオチンに接触させる。下記 i、 ii のステップを舍む、検体中の菌を同定する方法。 i . 生体成分であって、血液、腹水その他食細胞を多量に舍む分画又は成分である検体を固定する。

ϋ . 放射性、非放射性のどちらかのプローブを用いて検体にノヽィブリダィゼーションを行う。