CN108707688A - 检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其应用 - Google Patents

检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其应用 Download PDF

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段维军
郭立新
段丽君
陈先锋
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Abstract

本发明公开了一种检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其应用。本发明首先提供了一种特异引物对，由序列表的序列1所表示的引物VF和序列表的序列2所表示的引物VR组成。本发明还提供一种引物探针组，包括所述特异引物对和探针，所述探针由序列表的序列3所表示。本发明还提供所述特异引物对或所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；(b2)制备用于鉴定植物病原性轮枝菌的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌；(b4)制备用于检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的试剂盒。

Description

检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒，及利用其进行实时荧光PCR的检测方法和相关应用。
背景技术
轮枝菌属(Verticillium)由Nees在1817年建立，其中危害植物的种类主要包括以下10个种，即黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum、苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、Verticillium isaacii、Verticillium klebahnii、长孢轮枝菌Verticillium longisporum、非苜蓿轮枝菌Verticillium nonalfalfae、云状轮枝菌Verticillium nubilum、三体轮枝菌Verticillium tricorpus、Verticilliumzaregamsianum。在这10种轮枝菌中，以同为土壤习居菌的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌危害最为严重，可引起植物维管束病害，造成作物减产，甚至绝产，属于我国重要植物检疫对象。
有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分析和科学控制是防范外来物种的核心内容，其中，有害生物鉴定是其中的首要环节。对大丽轮枝菌和黑白轮枝菌及其近似种进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，我国进出境口岸对检疫性轮枝菌种类鉴定的主要依据标准是根据其形态学特征进行，由于轮枝状分生孢子梗形成需要较长时间，且观察不易，故单纯依据形态特征进行该属病菌区分具有一定难度。
为了解决上述问题，现有技术中虽然公开了有关大丽轮枝菌(一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒，CN103333969A)和黑白轮枝菌(一种检测黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，CN104263824A)的实时荧光PCR检测方法及试剂盒，但都具有一定的检测局限性，只能较为准确地检测出一种轮枝菌，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸日常检测筛查的需要。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其应用，能够针对多种植物病原性轮枝菌进行快速、准确地检测。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种特异引物对，由引物VF和引物VR组成；
所述引物VF为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物VR为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b2)制备用于鉴定植物病原性轮枝菌的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的试剂盒。
一种引物探针组，包括上述特异引物对和探针VP：
所述探针VP为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3；
(c2)与序列3相比进行了一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
所述探针VP的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。所述探针VP的5'末端具有荧光报告基团，3'末端具有荧光淬灭基团。所述荧光报告基团具体可为FAM，所述荧光淬灭基团具体可为MGB。
所述探针VP完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
所述引物探针组的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b2)制备用于鉴定植物病原性轮枝菌的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的试剂盒。
本发明还保护所述特异引物对或所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b2)制备用于鉴定植物病原性轮枝菌的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的试剂盒。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(b1)、(b3)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌。
所述试剂盒还包括2×PCR预混液和/或2×PCR缓冲液和/或酶混液和/或无菌水。为了更好地说明本发明，例如，当试剂盒还包括2×PCR预混液时，所采用预混液具体为ABI公司的Universal PCR Master Mix。
本发明还提供一种鉴定待测菌是否为植物病原性轮枝菌的方法，包括如下步骤：
以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测菌为或候选为植物病原性轮枝菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测菌为或候选为非植物病原性轮枝菌；
或为，
以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述特异引物对进行PCR扩增，如果产生特异扩增产物，则待测菌为或候选为植物病原性轮枝菌；如果不产生特异扩增产物，则待测菌为或候选为非植物病原性轮枝菌。
所述待测菌可为待测真菌培养物。
本发明还提供一种检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的方法，包括如下步骤：
以待测样本的总DNA为模板，采用上述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测样本不含有或疑似不含植物病原性轮枝菌；
或为，
以待测样本的总DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，如果产生特异扩增产物，则待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌；如果不产生特异扩增产物，则待测菌不含有或疑似不含有植物病原性轮枝菌。
为了更好的说明本发明，上述方法中，在进行实时荧光PCR的反应体系中，优选引物VF浓度为0.3-1.0μmol/L，引物VR浓度为0.3-1.0μmol/L，探针VP浓度为0.3-1.0μmol/L。进一步优选地，引物VF浓度为0.7-1.0μmol/L，引物VR浓度为0.7-1.0μmol/L，探针VP浓度为0.7-0.8或1.0μmol/L。
优选实时荧光PCR的反应条件为：依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
以上任一所述特异扩增产物可为88bp的扩增产物。
以上任一所述待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品、土壤样品等。所述植物样本具体可为叶片、茎秆、根等。
本发明还提供一种检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否具有所述特异引物对的靶序列，如果具有所述靶序列、待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌，如果不具有所述靶序列、待测菌不含有或疑似不含有植物病原性轮枝菌。
所述靶序列为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(c2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
本发明针对现有植物病原性轮枝菌检测方法主要依赖形态学检测方法，费时、繁琐、专业人员形态学观察要求高的缺点，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测植物病原性轮枝菌的方法。本发明进一步优化了实时荧光PCR的反应体系，获得了最优的引物浓度和探针浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)高普适性：对比现有技术适于单一进行检测一种病源性轮枝菌，本发明针对多种病源性轮枝菌具有高度的普适性，包括且不仅限于检测Verticillium albo-atrum、Verticillium alfalfae、Verticillium dahliae、Verticillium isaacii、Verticilliumklebahnii、Verticillium longisporum、Verticillium nonalfalfae、Verticilliumnubilum、Verticillium tricorpus、Verticillium zaregamsianum。
(2)快速简单：只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR步骤，得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的电泳等处理过程；
(3)特异性强：采用针对植物病原性轮枝菌的特异引物对进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；
(4)灵敏度高：由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度；
(5)交叉污染低：整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染；
(6)可以实现定量检测。
本发明对于植物病原性轮枝菌的检测以及防控具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例1引物探针组检测轮枝菌属的扩增曲线图。
图2为实施例2中不同DNA含量的扩增曲线对比图。
图3为实施例3中不同引物浓度的扩增曲线对比图。
图4为实施例4中不同探针浓度的扩增曲线对比图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：实时荧光PCR检测植物病原性轮枝菌的特异性
1)待测菌DNA准备：
将苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii MYA 3697、苹果溃疡病菌Cytospora cincta ATCC 28972、大豆南方溃疡病菌Diaporthe phaseolorumvar.meridionalis ATCC 24634、香蕉枯萎病菌古巴专化型Fusarium oxysporumf.sp.cubense ATCC 44684、葡萄茎枯病菌Phoma glomerata ATCC96757、豌豆脚腐病菌Phoma pinodella ATCC38814、栎树猝死病菌Phytophthora ramorumMYA 3238、大豆疫霉病菌Phytophthora sojae ATCC 200094、华丽腐霉Pythium splendens ATCC36444、苹果黑星病菌Venturia inaequalis ATCC 11096、Verticillium albo-atrum CBS 102464、Verticillium alfalfae VAA2、Verticillium dahliae VD1、Verticillium isaaciiCBS130343、Verticillium klebahnii CBS130344、Verticillium longisporum CBS110226、Verticillium nonalfalfae CBS 394.91、Verticillium nubilum CBS 456.51、Verticillium tricorpus CBS 447.54和Verticillium zaregamsianum CBS137621的基因组DNA分别稀释后作为待测菌DNA模板。上述待测菌除VAA2与VD1为发明人分离鉴定外(文献参见段维军,郭立新,张祥林,等.检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定[J].植物病理学报,2013,43(3):274-285.)，其他轮枝菌属菌株均为从荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)购买获得，轮枝菌属以外菌株均为从美国菌种保藏中心(ATCC)购买获得。
2)用于检测植物病原性轮枝菌的引物探针组：
正向引物VF：5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3'(序列表的序列1)；
反向引物VR：5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3'(序列表的序列2)；
探针VP：5’-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3’(序列表的序列3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
3)用于检测植物病原性轮枝菌的PCR反应体系：
反应体系(10μL)：5μLUniversal PCR Master Mix，0.5μL引物VF(10μmol/L)，0.5μL引物VR(10μmol/L)，0.5μL探针VP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物VF终浓度为0.5μmol/L，引物VR终浓度为0.5μmol/L，探针VP终浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替模板，作为空白对照。
4)用于检测植物病原性轮枝菌的实时荧光PCR反应条件：
依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
实施结果见附图1，10种轮枝菌属待测菌的荧光信号均显示符合阳性扩增曲线，轮枝菌属以外待测菌均无扩增，说明所设计引物和探针具有良好的特异性，仅能检出植物病原性轮枝菌。
实施例2：实时荧光PCR检测植物病原性轮枝菌的灵敏度
1)待测菌DNA制备：
提取大丽轮枝菌VD1菌株的基因组DNA，将基因组DNA进行梯度稀释后作为模板。
2)用于检测植物病原性轮枝菌的引物探针组：
正向引物VF：5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3'(序列表的序列1)；
反向引物VR：5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3'(序列表的序列2)；
探针VP：5’-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3’(序列表的序列3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
3)用于检测植物病原性轮枝菌的PCR反应体系：
反应体系(10μL)：5μLUniversal PCR Master Mix，0.5μL引物VF(10μmol/L)，0.5μL引物VR(10μmol/L)，0.5μL探针VP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物VF终浓度为0.5μmol/L，引物VR终浓度为0.5μmol/L，探针VP终浓度为0.5μmol/L；
建立对照实验，以模板中的DNA含量作为变量，其余条件不变：
反应体系1中，模板的DNA含量为10ng；
反应体系2中，模板的DNA含量为1ng；
反应体系3中，模板的DNA含量为100pg；
反应体系4中，模板的DNA含量为10pg；
反应体系5中，模板的DNA含量为1pg；
反应体系6中，模板的DNA含量为100fg；
反应体系7中，模板的DNA含量为10fg；
反应体系8中，模板的DNA含量为1fg；
用等体积水代替模板，作为空白对照。
4)用于检测植物病原性轮枝菌的实时荧光PCR反应条件：
依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
实施结果如图2，图中为3次重复实验的扩增曲线对比图，反应体系1至反应体系5均显示阳性扩增曲线，即最低检测限为1pg模板DNA/体系。
实施例3：实时荧光PCR检测植物病原性轮枝菌的引物浓度
1)待测菌DNA制备：
提取大丽轮枝菌VD1菌株的基因组DNA，将基因组DNA进行稀释后作为模板。
2)用于检测植物病原性轮枝菌的引物探针组：
正向引物VF：5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3'(序列表的序列1)；
反向引物VR：5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3'(序列表的序列2)；
探针VP：5’-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3’(序列表的序列3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
3)用于检测植物病原性轮枝菌的PCR反应体系：
反应体系(10μL)：5μLUniversal PCR Master Mix，XμL引物VF(10μmol/L)，XμL引物VR(10μmol/L)，0.5μL探针VP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，探针VP终浓度为0.5μmol/L；
建立对照实验，以反应体系中引物浓度作为变量，其余条件不变：
反应体系1中，X为0.1，引物VF终浓度为0.1μmol/L，引物VR终浓度为0.1μmol/L；
反应体系2中，X为0.2，引物VF终浓度为0.2μmol/L，引物VR终浓度为0.2μmol/L；
反应体系3中，X为0.3，引物VF终浓度为0.3μmol/L，引物VR终浓度为0.3μmol/L；
反应体系4中，X为0.4，引物VF终浓度为0.4μmol/L，引物VR终浓度为0.4μmol/L；
反应体系5中，X为0.5，引物VF终浓度为0.5μmol/L，引物VR终浓度为0.5μmol/L；
反应体系6中，X为0.6，引物VF终浓度为0.6μmol/L，引物VR终浓度为0.6μmol/L；
反应体系7中，X为0.7，引物VF终浓度为0.7μmol/L，引物VR终浓度为0.7μmol/L；
反应体系8中，X为0.8，引物VF终浓度为0.8μmol/L，引物VR终浓度为0.8μmol/L；
反应体系9中，X为0.9，引物VF终浓度为0.9μmol/L，引物VR终浓度为0.9μmol/L；
反应体系10中，X为1.0，引物VF终浓度为1.0μmol/L，引物VR终浓度为1.0μmol/L；
用等体积水代替模板，作为空白对照。
4)用于检测植物病原性轮枝菌的实时荧光PCR反应条件：
依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
实施结果如图3，反应体系1至反应体系10均能显示出阳性扩增曲线；其中反应体系7至反应体系10均显示形状较好的阳性扩增曲线。
实施例4：实时荧光PCR检测植物病原性轮枝菌的探针浓度
1)待测菌DNA制备：
提取大丽轮枝菌VD1菌株的基因组DNA，将基因组DNA进行稀释后作为模板。
2)用于检测植物病原性轮枝菌的引物探针组：
正向引物VF：5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3'(序列表的序列1)；
反向引物VR：5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3'(序列表的序列2)；
探针VP：5’-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3’(序列表的序列3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
3)用于检测植物病原性轮枝菌的PCR反应体系：
反应体系(10μL)：5μLUniversal PCR Master Mix，0.5μL引物VF(10μmol/L)，0.5μL引物VR(10μmol/L)，YμL探针VP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物VF终浓度为0.5μmol/L，引物VR终浓度为0.5μmol/L；
建立对照实验，以反应体系中探针浓度作为变量，其余条件不变：
反应体系1中，Y为0.1，探针VP终浓度为0.1μmol/L；
反应体系2中，Y为0.2，探针VP终浓度为0.2μmol/L；
反应体系3中，Y为0.3，探针VP终浓度为0.3μmol/L；
反应体系4中，Y为0.4，探针VP终浓度为0.4μmol/L；
反应体系5中，Y为0.5，探针VP终浓度为0.5μmol/L；
反应体系6中，Y为0.6，探针VP终浓度为0.6μmol/L；
反应体系7中，Y为0.7，探针VP浓度为0.7μmol/L；
反应体系8中，Y为0.8，探针VP终浓度为0.8μmol/L；
反应体系9中，Y为0.9，探针VP终浓度为0.9μmol/L；
反应体系10中，Y为1.0，探针VP终浓度为1.0μmol/L；
用等体积水代替模板，作为空白对照。
4)用于检测植物病原性轮枝菌的实时荧光PCR反应条件：
依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
实施结果如图4，反应体系1至反应体系10均能显示出阳性扩增曲线；其中反应体系7、反应体系8和反应体系10均显示形状较好的阳性扩增曲线。
实施例5：实时荧光PCR检测接种土壤中是否含有植物病原性轮枝菌
1)待测菌DNA制备：
选择苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii MYA3697、苹果溃疡病菌Cytospora cincta ATCC 28972、大豆南方溃疡病菌Diaporthe phaseolorumvar.meridionalis ATCC 24634、香蕉枯萎病菌古巴专化型Fusarium oxysporumf.sp.cubense ATCC 44684、葡萄茎枯病菌Phoma glomerata ATCC96757、豌豆脚腐病菌Phoma pinodella ATCC38814、栎树猝死病菌Phytophthora ramorumMYA 3238、大豆疫霉病菌Phytophthora sojae ATCC 200094、华丽腐霉Pythium splendens ATCC36444、苹果黑星病菌Venturia inaequalis ATCC 11096、Verticillium albo-atrum CBS 102464、Verticillium alfalfae VAA2、Verticillium dahliae VD1、Verticillium isaaciiCBS130343、Verticillium klebahnii CBS130344、Verticillium longisporum CBS110226、Verticillium nonalfalfae CBS 394.91、Verticillium nubilum CBS 456.51、Verticillium tricorpus CBS 447.54、Verticillium zaregamsianum CBS137621基因组DNA分别稀释后作为待测菌DNA模板。上述待测菌除VAA2与VD1为发明人分离鉴定外(文献参见段维军,郭立新,张祥林,等.检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定[J].植物病理学报,2013,43(3):274-285.)，其他轮枝菌属菌株均为从荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)购买获得，轮枝菌属以外菌株均为从美国菌种保藏中心(ATCC)购买获得。
选取其中一种作为待测菌，并在灭菌的土壤上接种该待测菌。
将菌株接种至PDA平板上，25℃培养箱静置培养15天左右。将菌落打成7㎜的菌饼，接到查彼得培养液中,每瓶接3个菌饼，黑暗振荡培养15天，用2层纱布过滤，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板将浓度调到1×107个孢子/ml；
取灭菌土100克，将菌悬液5毫升接入灭菌土中，搅拌充分混匀，置于25℃培养箱中黑暗密封培养3天后，取土样0.25克使用土壤DNA提取试剂盒(Mobio)对土壤提取DNA，所获得的总DNA作为模板；
2)用于检测植物病原性轮枝菌的引物探针组：
正向引物VF：5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3'(序列表的序列1)；
反向引物VR：5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3'(序列表的序列2)；
探针VP：5’-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3’(序列表的序列3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
3)用于检测植物病原性轮枝菌的PCR反应体系：
反应体系(10μL)：5μLUniversal PCR Master Mix，0.5μL引物VF(10μmol/L)，0.5μL引物VR(10μmol/L)，0.5μL探针VP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物VF终浓度为0.5μmol/L，引物VR终浓度为0.5μmol/L，探针VP终浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替模板，作为空白对照。
4)用于检测植物病原性轮枝菌的实时荧光PCR反应条件：
依次50℃反应2min，95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。
实验结果显示以下待测菌或接种了待测菌的土壤未扩增出阳性扩增曲线：苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii MYA 3697、苹果溃疡病菌Cytosporacincta ATCC 28972、大豆南方溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis ATCC24634、香蕉枯萎病菌古巴专化型Fusarium oxysporum f.sp.cubense ATCC 44684、葡萄茎枯病菌Phoma glomerata ATCC96757、豌豆脚腐病菌Phoma pinodella ATCC38814、栎树猝死病菌Phytophthora ramorumMYA 3238、大豆疫霉病菌Phytophthora sojae ATCC200094、华丽腐霉Pythium splendens ATCC36444、苹果黑星病菌Venturia inaequalisATCC 11096。
以下待测菌或接种了待测菌的土壤扩增出阳性扩增曲线：Verticillium albo-atrum CBS 102464、Verticillium alfalfae VAA2、Verticillium dahliae VD1、Verticillium isaacii CBS130343、Verticillium klebahnii CBS130344、Verticilliumlongisporum CBS 110226、Verticillium nonalfalfae CBS 394.91、Verticilliumnubilum CBS 456.51、Verticillium tricorpus CBS 447.54、Verticilliumzaregamsianum CBS137621。阳性和阴性对照均正常。
序列表
<110> 宁波检验检疫科学技术研究院
<120> 检测植物病原性轮枝菌的特异引物对、探针和试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtccgagc gtcgtttca 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccactgcttt taagggccta ca 22
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcccggtg ttgg 14
<210> 4
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgtccgag cgtcgtttca accctcgagc cccagtggcc cggtgttggg gatctacgtc 60
tgtaggccct taaaagcagt gg 82

Claims (10)

1.一种特异引物对，其特征在于由引物VF和引物VR组成；
所述引物VF为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物VR为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
2.一种引物探针组，其特征在于包括权利要求1所述特异引物对和探针VP：
所述探针VP为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3；
(c2)与序列3相比进行了一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于所述探针VP的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。
4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2或3所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b2)制备用于鉴定植物病原性轮枝菌的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的试剂盒。
5.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2或3所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(b1)、(b3)：
(b1)鉴定植物病原性轮枝菌；
(b3)检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌。
6.一种鉴定待测菌是否为植物病原性轮枝菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
以待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求2或3所述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测菌为或候选为植物病原性轮枝菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测菌为或候选为非植物病原性轮枝菌。
7.一种鉴定待测菌是否为植物病原性轮枝菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
以待测菌的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果产生特异扩增产物，则待测菌为或候选为植物病原性轮枝菌；如果不产生特异扩增产物，则待测菌为或候选为非植物病原性轮枝菌。
8.一种检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
以待测样本的总DNA为模板，采用权利要求2或3所述引物探针组进行实时荧光PCR并检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测样本不含有或疑似不含植物病原性轮枝菌。
9.一种检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
以待测样本的总DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果产生特异扩增产物，则待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌；如果不产生特异扩增产物，则待测菌不含有或疑似不含有植物病原性轮枝菌。
10.一种检测待测样本是否含有植物病原性轮枝菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
检测待测样本的总DNA中是否具有权利要求1所述特异引物对的靶序列，如果具有所述靶序列，待测样本含有或疑似含有植物病原性轮枝菌；如果不具有所述靶序列，待测菌不含有或疑似不含有植物病原性轮枝菌。
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