CN109897911A

CN109897911A - 疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109897911A
Application number: CN201910236404.3A
Authority: CN
Inventors: 张晨; 熊琴; 钱雨琳; 郑新月; 李雪
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109897911B

Abstract

本发明公开了一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。该LAMP检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；检测试剂盒包括LAMP检测引物、LAMP反应液。本发明根据疫霉菌P.hydropathica的翻译延伸因子EF‑TU序列设计引物，采用LAMP技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、现场应用方便等优点，解决了现有疫霉菌P.hydropathica检测技术中存在的周期长、灵敏度低、成本高、现场应用困难等缺陷，对疫霉菌P.hydropathica检疫鉴定、监测和减少对农药盲目使用方面具有重要意义。

Description

疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种疫霉菌Phytophthora hydropathica的环介导等温扩增(LAMP)检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于疫霉菌 P.hydropathica的快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于疫霉菌P.hydropathica的早期诊断和病菌的检测和鉴定。

背景技术

疫霉菌Phytophthora hydropathica属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目 (Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。疫霉属中许多种都是植物病原菌，引起的病害对许多乔灌木、农作物和花卉植物造成了毁灭性危害，在中国由于疫霉菌引起的疫病损失以及疫霉种群的复杂性逐年都在增加，严重威胁人类正常生产生活。疫霉菌P. hydropathica作为病原菌寄主范围广，危害性强，可以侵染杜鹃花、山月桂、黄瓜、赤杨木、绣球等植物。2017年本课题组首次在胭脂树上分离出这种病原菌，随后该种病原菌在广东、云南省多个城市被陆续发现。为了阻止P.hydropathica传播范围的不断扩大，防止该疫病的大面积爆发，使其引起的疫病得到控制，开发快速灵敏的检疫鉴定疫霉菌P.hydropathica的技术迫在眉睫。

目前疫霉菌P.hydropathica的特定的检测鉴定方法少见于文献或其它资料。一般而言，疫霉菌Phytophthora spp.的分类鉴定和检测方法主要有传统方法和分子生物学方法两大类，传统方法主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等性状。传统方法在疫霉菌的检测鉴定中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制；特别是诊断一些致病症状及形态特征极其相似而难以区分的病原菌，给传统的鉴定方法更带来了巨大的挑战。随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为基础的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，如常规PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，现已被广泛使用于鉴定和定量分析各类病毒、细菌、真菌和卵菌病原微生物。然而，该方法检测时间仍然比较长，之后的电泳跑胶费时费力，且需要依赖精密且价值较高的PCR仪，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种高效的核酸扩增方法。它是一种新型的分子生物学检测技术，该方法是根据靶基因的6个区域设计4 种特异引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换反应，在60-65℃恒温条件下短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，可将目的基因扩增到10⁹倍，由此来断定扩增产物是否存在目标基因，并可用琼脂糖凝胶电泳及SYBR Green I荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时，国内外科学家进行了大量的研究，先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法，目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBR Green I指示剂法。该技术不需要严格的实验环境和精密昂贵的仪器设备，操作步骤简单易学，具有高特异性、高灵敏性等特点。该技术从2003年开始首先被用于医学的临床检测，取得了引人注目的效果。许多学者已经将其广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测，目前尚未见环介导等温扩增方法检测P.hydropathica的方法及试剂盒的相关开发。

发明内容

发明目的：针对现有技术中对疫霉菌P.hydropathica检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，本申请的目的是提供一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物以期实现特异性检测鉴定出疫霉菌P.hydropathica。本申请的另一目的是提供上述疫霉菌P.hydropathica的检测试剂盒，使得疫霉菌P.hydropathica的检测灵敏、方便和快捷。本申请的另一目的是提供上述疫霉菌P.hydropathica的检测方法，以解决现有方法耗时长、程序繁琐、准确度低等问题。

技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：

一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：

FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；

BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；

F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；

B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；

LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。

所述的LAMP检测引物在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。

一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒：至少包括1次用量以上的引物溶液和 LAMP反应液；其中，引物溶液中的引物为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB，各引物序列具体如下：

FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；

BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；

F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；

B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；

LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。

作为优选，所述的LAMP反应液含有10×ThermoPol Buffer、MgSO₄、甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶和显色剂HNB(羟基萘酚蓝)。

所述的疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。

一种检测疫霉菌P.hydropathica的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP检测引物或所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在疫霉菌P.hydropathica；紫色表示检测结果为阴性，不存在疫霉菌P.hydropathica。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点和积极效果为：

1)特异性强，所用的特异引物根据疫霉菌P.hydropathica的翻译延伸因子EF-TU不同区域设计出5条引物，特异性比常规PCR要强。

2)灵敏度高，对不同浓度的基因组DNA进行LAMP扩增，确定该LAMP体系最低检测限度为100pg/μL，灵敏度是普通PCR的1000倍左右。

3)检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。

4)仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测。

5)操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成。结果清晰明显，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

6)对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明是国内外首次对疫霉菌P.hydropathica建立特定的分子检测手段，且发现本发明所采用的LAMP检测方法比常用PCR技术检测方法具有更强的特异性、灵敏度和便携性。该技术可从发病组织中直接检测出疫霉菌P.hydropathica，对该菌引起的病害进行快速诊断，具有实际的应用价值。

附图说明

图1是LAMP方法和PCR方法对疫霉菌P.hydropathica的特异性检测比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP分析；B.PCR方法；1-12：不同地区采集分离的疫霉菌P. hydropathica(依次是YZ-1，YZ-2，DJ-3，DJ-5，SYG-6，SYG-8，HG-11，HG-14，CYM-6， CYM-8，XQ-9和XQ-15)；13-18：疫霉属中其他六个菌株(大豆疫霉，辣椒疫霉，致病疫霉，棕榈疫霉，桂氏疫霉和掘氏疫霉)；19-20：其他真菌类群的两个菌株，分别为腐皮镰孢菌FS-1和终极腐霉菌ZJ-3；NC：空白对照(无DNA模板)；M：Marker III(天根，MD103，中国)；

图2是LAMP方法和PCR方法对疫霉菌P.hydropathica的灵敏度检测比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP分析；B.PCR方法；M：Marker II(天根，MD102，中国)；1-9：不同DNA模板浓度(依次为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL， 100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL)；NC：空白对照(无DNA模板)；

图3是人工接种感病叶片中疫霉菌P.hydropathica的LAMP和PCR检测法比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP检测分析；B.PCR检测；PC：阳性对照(疫霉菌P.hydropathica YZ-1菌株基因组DNA为模板)；NC：阴性对照(从用水代替孢子液喷雾接种健康的胭脂叶片中所提取的基因组DNA为模板)；1-16：从疫霉菌P.hydropathica YZ-1菌株人工接种后发病的胭脂叶片中所提取的基因组DNA为模板；M：Marker II(天根，MD102，中国)。

图4是自然感病胭脂叶片中疫霉菌P.hydropathica的LAMP和PCR检测法比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP检测分析；B.PCR检测。PC：阳性对照(疫霉菌P.hydropathica YZ-1菌株基因组DNA为模板)；NC：阴性对照(从健康的胭脂叶片中所提取的基因组DNA 为模板)；NT：空白对照，无DNA模板；1-16：依次从16张有典型水渍状病斑症状的胭脂叶片中提取基因组DNA为模板；M：Marker II(天根，MD102，中国)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

将供试菌株(表1)转至V8培养基上培养，在25℃黑暗条件下培养4d后切取菌丝块于液体V8培养基中培养，三层滤纸过滤培养液，收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，用NaOH裂解法提取基因组DNA后作为DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

表1在LAMP分析中所用到的全部菌株

a所有的P.hydropathica疫霉菌株，其他疫霉物种和其他真菌菌株都由南京农业大学保存。 NJAU，南京农业大学。*菌株数目。

2.疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物的设计

通过测定疫霉菌P.hydropathica和其他疫霉菌Phytophthora spp.的翻译延伸因子EF-TU 基因，对疫霉菌属不同种间翻译延伸因子EF-TU基因序列进行比对分析，利用专门的LAMP 引物设计软件Primer Explore V4设计一套疫霉菌P.hydropathica的特异性的LAMP检测引物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB 组成，各引物序列如下：

FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；

BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；

F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；

B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；

LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。

3.疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测方法的建立及LAMP检测引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25.5μL，包括2.5μL10×ThermoPol Buffer，1.5μμL MgSO₄(100mM)，4μL甜菜碱(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μL，F3和B3(10μM)各0.5μL，LB(10μM) 1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL^-1)，1μL模板DNA；65℃保温 60min，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性，存在疫霉菌P.hydropathica；反应液为紫色判断为阴性，不存在疫霉菌P.hydropathica。

以表1供试菌株的DNA为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为对照， PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTPMixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min， 98℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。

4.LAMP检测引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试菌株中只有疫霉菌P.hydropathica显示结果可观察到天蓝色，其余真菌显示结果为紫色(图1)，这与常规PCR结果相同，说明所设计的引物FIP/BIP、外引物F3/B3和环引物LB可以将疫霉菌P.hydropathica和其他病原菌区分开来，具有种的特异性，用于疫霉菌P.hydropathica快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

应用Nanodrop 2000分光光度计测定疫霉菌P.hydropathica基因组DNA浓度，将确定浓度的DNA依次进行10倍梯度稀释，使其浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100 pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL。

2.LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

各取1μL DNA作为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25.5μL，包括2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5μL MgSO₄(100mM)，4μL甜菜碱(5M)，3.5μL dNTPs (10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μL，F3和B3(10μM)各0.5μL，LB(10μM)1μL， 2μLHNB(2.4mM)，1μLBstDNA聚合酶(8U·μL^-1)，1μL模板DNA；65℃保温60min，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用显色剂目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性；反应液为紫色判断为阴性。

取1μL DNA作为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为对照，PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTP Mixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min，98℃ 10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。

3.LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明(图2)，100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL 浓度的疫霉菌P.hydropathica基因组DNA显色结果可观察到天蓝色；其余浓度及阴性对照显色结果为紫色。说明所设计的疫霉菌P.hydropathica正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB通过LAMP扩增，对疫霉菌P.hydropathica 的灵敏度可达100pg/μL，而常规PCR检测的灵敏度只能达到1ng/μL，LAMP检测具有更高的灵敏度。

实施例3：发病组织中疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测

样品采集：采集疫霉菌P.hydropathica侵染发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10μL 0.5mol/L NaOH，在研钵中将组织充分研磨成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5μL加入495μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25.5μL，包括2.5μL 10×ThermoPol Buffer，1.5μL MgSO₄(100mM)，4μL甜菜碱(5M)，3.5μLdNTPs(10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μL，F3和B3(10μM) 各0.5μL，LB(10μM)1μL，2μLHNB(2.4mM)，1μLBst DNA聚合酶(8U·μL^-1)，1 μL模板DNA；65℃保温60min，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性；反应液为紫色判断为阴性。

以上述提取的DNA为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为检测对照， PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTPMixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min， 98℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。

检测结果：检测结果(图3、图4)表明，疫霉菌P.hydropathica发病的叶片通过LAMP扩增，显示结果为天蓝色，说明存在疫霉菌P.hydropathica；而健康叶片及阴性对照显示结果为紫色，说明不存在疫霉菌P.hydropathica，该套技术能用于植物组织中疫霉菌P.hydropathica的快速分子检测。

LAMP检测与常规PCR检测对比(图3、图4)，LAMP检测对DNA模板质量的要求低，方法更简便，从发病组织DNA提取到获得检测结果更为迅速，大大提高检测效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 疫霉菌Phytophthora hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用

<130> 100

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> FIP引物序列(Artificial)

<400> 1

tgcttcacgc cgagcgtgaa ctccaaggag ggccagac 38

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> BIP引物序列(Artificial)

<400> 2

tggacgactc ctcggtcatg tccttcttca ggtacgtggt c 41

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> F3引物序列(Artificial)

<400> 3

gggcgagttc gaggct 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> B3引物序列(Artificial)

<400> 4

cttggccggc ttgtagc 17

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> LB引物序列(Artificial)

<400> 5

tcgttacgac gagatcaaga acgag 25

Claims

1.一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：

FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；

BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；

F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；

B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；

LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。

2.权利要求1所述的LAMP检测引物在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。

3.一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒，其特征在于：至少包括1次用量以上的引物溶液和LAMP反应液；其中，引物溶液中的引物为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB，各引物序列具体如下：

FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；

BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；

F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；

B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；

LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。

4.权利要求3所述的疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的LAMP反应液含有10×ThermoPol Buffer、MgSO₄、甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶和显色剂HNB。

5.权利要求3所述的疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。

6.一种检测疫霉菌P.hydropathica的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP检测引物或权利要求3所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在疫霉菌P.hydropathica；紫色表示检测结果为阴性，不存在疫霉菌P.hydropathica。