CN101392289B - 环介导等温扩增方法检测绿脓杆菌的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运用环介导恒温PCR技术检测化妆品中绿脓杆菌的方法，属于化妆品卫生领域，具体涉及一种运用环介导恒温PCR技术检测化妆品中绿脓杆菌的方法。其技术方案是以绿脓杆菌的16S-23S间区为目的检测序列，设计涵盖整个间区序列的四条特异性引物。本发明包括四条绿脓杆菌16S-23S间区特异性引物、化妆品中绿脓杆菌的提取以及环介导恒温PCR扩增的检测方法以及结果的判断。本发明填补了化妆品中绿脓杆菌环介导恒温PCR扩增技术检测方法的空白，用于检验进出口化妆品中绿脓杆菌。该方法具有低成本、高效率、操作简单、快速便捷的特点。

Description

环介导等温扩增方法检测绿脓杆菌的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用环介导恒温扩增反应来检测绿脓杆菌，特别是化妆品中绿脓杆菌的检测方法。

背景技术

绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(学名Pseudomonas aeruginos′)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。它是一种机会性感染细菌，且对植物亦是机会性感染的。

与其他假单胞菌属的细菌一样，绿脓杆菌分泌多种的色素，包括绿脓菌素(呈青色)、萤光素(呈荧光黄色)及绿脓菌红素(呈绯红色)。假单胞菌属培养基P就是用作增加绿脓菌素及绿脓菌红素的生产，而假单胞菌属培养基F就是加强萤光素的生成。

绿脓杆菌的特征是它那如珠母般的外形及在试管内的葡萄气味。临床确认绿脓杆菌的方法是在于绿脓菌素及萤光素的生成，且在42℃的环境下生长的能力。绿脓杆菌在柴油及航空燃料中仍能生长，更被称为「氢碳分解菌」，能引发微生物腐蚀作用。它会产生一种暗色的凝胶垫，一般被误解为藻类。

绿脓杆菌是一种令免疫受损的机会性感染病原，一般影响肺部及泌尿道，或造成烧伤、伤口及其他血液感染，如败血病。虽然很不常有，但绿脓杆菌亦会造成肺炎。在很多与通风机有关的肺炎研究中指出，绿脓杆菌是其中一种需要隔绝的细菌。绿脓菌素就是这种细菌的致病因子，且在氧化应激下能使秀丽隐杆线虫死亡，但是有研究指水杨酸能抑制绿脓菌素的生成。10％在医院感染的病症都是由绿脓杆菌所引致的。囊肿性纤维化病人的肺部是最先感染绿脓杆菌的一群。在缺乏适当处理食水质素下，它亦是引致皮肤炎的其中一种细菌。它也是造成烧伤感染最普遍的细菌。

基于以上致病性，绿脓杆菌是各国海关必检微生物之一。传统的检测方法按照《中华人民共和国国家标准——化妆品微生物标准检验方法——绿脓杆菌》检验程序为：

1、增菌培养：取1∶10样品稀释液10ml加到90ml SCDLP液体培养基中，置37℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

2、分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18-24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。

3、染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶实验。

4、氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，在15-30秒之内，出现分红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。

5、绿脓菌素试验：取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置

培养24h，加入氯仿3-5ml，充分振荡使培养物中的绿脓杆菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

6、硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。

7、明胶液化试验：取绿脓杆菌可疑菌落的培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10-30分钟，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。

8、42℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41-42℃培养箱中，培养24-48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。

目前细菌鉴定通常还是利用传统生理生化方法进行检测，利用传统的方法检测化妆品中的绿脓杆菌，不仅需要至少3天的时间进行菌落培养，更要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足进出口货物日益增长的现状。

从以上说明可以看出，检测妆品中的绿脓杆菌的各种现存方法，存在着过程复杂、时间长、准确性低的不足，就是存在试剂昂贵，不利于快速检验的缺点。

因此，随着分子生物学的发展，化妆品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术的发展。最新开发出来的环介导恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。它不仅需要的时间短，只要经过简单的增菌，而且，由于其要求的设备简单，一个热块或水浴锅即可完成检验，更加突出的是环介导等温扩增技术对最初模版量的要求为100个细菌，是普通PCR技术灵敏度的10倍。因此如何运用环介导恒温扩增技术检测妆品中的绿脓杆菌已成为食品检验检疫工作中进行攻关的重要课题。

发明内容

为了提高化妆品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过无数次的实验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测绿脓杆菌的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于环介导恒温扩增技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增完毕后可通过短暂离心直接目测白色沉淀检测结果，或通过电泳带形分析检测结果。

本发明用特异性的引物组扩增绿脓杆菌，反应后目测结果和电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。

该方法包括：应用该方法检测化妆品中绿脓杆菌所使用的引物组和与之配套的扩增反应条件或使用该引物制备的用于检验化妆品中绿脓杆菌的试剂盒，其中包括用于处理样品的细菌裂解液和显示结果的显色剂。其中所使用的引物组序列如下：

引物序列一：TCCACTCAGACCCACCAA

引物序列二：ACCGTATCGGCATAACTCATCCTGATACTGCGTGACT

引物序列三：TCTTACGACCGCAGCACAT

引物序列四：TTGCTTTTTATGTGGGGCTATGGAACTAAGCGGGATGGAA

环介导恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                  浓度            加样量

扩增体系预混合物      2×             12.5μL

引物序列一            10μmol/L       0.2μL

引物序列二            10μmol/L       1.6μL

引物序列三            10μmol/L       0.2μL

引物序列四            10μmol/L       1.6μL

DNA样品                               2μL

双蒸水                                6.9μL

总体积                                25μL

用于检验化妆品中绿脓杆菌的试剂盒，包括：

(1)环介导恒温PCR扩增反应试剂，包括2×扩增体系预混合物、双蒸水；

(2)按照1∶8∶1∶8比例混合的引物序列一、引物序列二、引物序列三和引物序列四；

(3)阳性标本对照、阴性标本对照。

(4)使用说明书。

环介导恒温扩增程序为：

(1)调整扩增温度，恒温水浴或热块扩增1小时，温度范围在60-65℃，最优温度为61℃。

(2)80℃10分钟停止反应。

环介导恒温扩增产物检测方法包括：

(1).10,000×g，5分钟，室温，可在试管底部见到白色沉淀；

(2).加入显色剂SYBR Green染料，反应液呈现绿色；

(3).1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有为阶梯状电泳条带；

选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

环介导恒温扩增产物检测理论依据

1、阳性结果会产生白色沉淀：在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增实验都是在61℃进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也不断积累。从而，在反应结束后，可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。

2、阳性结果在加入显色剂SYBR Green染料后，溶液变成绿色：阳性的环介导恒温扩增会合成大量核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。而阴性结果，由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBR Green也便无法同核苷酸链结合，结果只能是棕黄色。

3、阳性结果在电泳中表现为阶梯状电泳条带：环介导恒温扩增的引物设计有一至关重要的环节，即在正常扩增引物的5’末端结合了一段链内配对区域。其目的在于，在扩增进行的同时，链内配对区可以同新扩增的核苷酸链中的某部区域配对，从而在新扩增链的一端形成环状结构。同理，在新扩增链的另一端，也可以形成相同的环状结构。而在以后的扩增过程中，引物会不断地扩增这一段两端成环的模板，从而不断积累这一环状单位的个数，使新合成核苷酸链分子以一个环状结构为基数，不断合成、不断积累。而这一分子量的积累，反映在电泳中，则表现为形成阶梯状电泳条带。

如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定是否存在绿脓杆菌，需重新检验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，基于环介导恒温扩增的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、化妆品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次环介导恒温扩增反应就能够检测绿脓杆菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法仅需要简单的设备——一个恒温水域箱、一个离心机或普通电泳设备(电泳仪)即可，大大提高了性价比节约了成本。环介导恒温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的细菌。环介导恒温扩增鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。

附图说明

图1某待测护手霜样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，离心后目测沉淀结果：待测样品试管(右侧)底部可见明显白色沉淀；阴性对照(左侧)没有沉淀。

图2某待测护手霜样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，SYBR Green染色结果：待测样品溶液(右侧)呈现绿色；阴性对照(左侧)为棕黄色。

图3某待测护手霜样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果：待测样品(第3道)出现阶梯状条带；阴性对照(第2道)没有条带；第1道为Marker。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

样本：某处出口护手霜。

用常规生理、生化方法检测出绿脓杆菌落，然后进行如下环介导恒温扩增技术检测：

1.样品处理

(1)取10克待检样品，粉碎。

(2)将样品放于装有1升营养肉汤的锥形瓶中，培养箱中37℃培养8小时。

2.DNA抽提

用滴管取培养后的营养肉汤1mL，在冰浴中静置5分钟，然后在室温下3000转/分钟，离心10分钟，取上清液，室温下10000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，向沉淀中加入50μl细菌裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20℃保存。

3.环介导恒温扩增

扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                    浓度         加样量

扩增体系预混合物        2×          12.5μL

引物序列一              10μmol/L    0.2μL

引物序列二        10μmol/L    1.6μL

引物序列三        10μmol/L    0.2μL

引物序列四        10μmol/L    1.6μL

DNA样品                        2μL

双蒸水                         6.9μL

总体积                         25μL

环介导等温扩增程序为：

(1)61℃1小时；

(2)80℃10分钟。

反应在恒温水浴箱中进行。

环介导恒温扩增共进行2管反应，其中一管中加入样品DNA；另一管为无样品DNA的反应体系，作为阴性对照。

4.对被检测样品结果进行观察

(1)环介导恒温扩增产物离心后，待测样品试管底部有明显白色沉淀，阴性对照则没有沉淀，结果如图1。

(2)环介导恒温扩增产物加入显色剂SYBR Green染色后，待测样品溶液呈现绿色，阴性对照为棕黄色，结果如图2。

(3)环介导恒温扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，待测样品有阶梯状电泳条带，阴性对照没有电泳条带，结果如图3。

可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

实验表明样品中含有绿脓杆菌。

3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为绿脓杆菌。环介导恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。

Claims (6)

1.一种检验化妆品中绿脓杆菌的引物，其特征在于：其为通过环介导恒温PCR扩增检测绿脓杆菌的引物组，序列为：

(1)引物序列一：TCCACTCAGACCCACCAA

(2)引物序列二：ACCGTATCGGCATAACTCATCCTGATACTGCGTGACT

(3)引物序列三：TCTTACGACCGCAGCACAT

(4)引物序列四：TTGCTTTTTATGTGGGGCTATGGAACTAAGCGGGATGGAA。

2.权利要求1所述的引物在制备用于检验化妆品中绿脓杆菌的试剂盒中的应用。

3.一种用于检验化妆品中绿脓杆菌的试剂盒，包括：

(1)环介导恒温PCR扩增反应试剂，包括2×扩增体系预混合物、双蒸水；

(2)按照1∶8∶1∶8比例混合的权利要求1所述的引物序列一、引物序列二、引物序列三和引物序列四；

(3)阳性标本对照、阴性标本对照；如果需要，还包括

(4)使用说明书。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中还包括用于处理样品的细菌裂解液和显示结果的显色剂。

5.利用权利要求1的引物或权利要求3的试剂盒进行环介导恒温PCR检测化妆品中绿脓杆菌方法，包括：

(1)待测样品加入营养肉汤液体培养基中，培养箱中37℃培养8小时，待分析样品营养液混浊液，室温下3000转/分钟，离心10分钟，取上清液，室温下10000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，向沉淀中加入50μl细菌裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液；

(2)按照扩增反应液中各组分比例配制反应液，如下：

成分                浓度            加样量

扩增体系预混合物    2×             12.5μL

引物序列一          10μmol/L       0.2μL

引物序列二          10μmol/L       1.6μL

引物序列三          10μmol/L       0.2μL

引物序列四          10μmol/L       1.6μL

DNA样品                             2μL

双蒸水                    6.9μL

总体积                    25L

(3)调整扩增温度，恒温水浴或热块扩增1小时；

(480℃，十分钟停止反应；

(5)选择以下三种方式中任意一种对环介导恒温PCR扩增产物进行检测：

①10,000×g，5分钟，室温，在试管底部见到白色沉淀；

②加入SYBR Green，反应液呈现绿色；

③1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果为有阶梯状电泳条带。

6.权利要求5所述方法，其中(3)中环介导恒温扩增的温度为60-65℃。

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