CN103911459A - 铜绿假单胞菌ⅲ型分泌系统毒素基因的lamp快速检测试剂盒及其应用和方法 - Google Patents

铜绿假单胞菌ⅲ型分泌系统毒素基因的lamp快速检测试剂盒及其应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒及其应用和方法，其LAMP快速检测试剂盒含有铜绿假单胞菌ExoU和ExoS基因进行LAMP扩增的引物组，其中LAMP扩增ExoU基因的引物组如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，LAMP扩增ExoS基因的引物组如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，可以快速检测铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统中编码强毒性效应蛋白的ExoU和ExoS基因，进而判断铜绿假单胞菌菌株毒素基因型及毒性，为突发情况或例行监测中快速判断铜绿假单胞菌菌株的毒力具有重要意义。

Description

铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒及其应用和方法
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒，还涉及该试剂盒的应用和方法。 
背景技术
铜绿假单胞菌是一种重要的机会致病菌，广泛的分布于土壤、水体、动植物表面上。铜绿假单胞菌可感染烧伤或免疫力低下的患者，在囊性纤维化患者中能够造成更严重的伤害甚至死亡。原因是铜绿假单胞菌分泌一些致病因子，这些致病因子会与宿主体内的特定位点相结合作用，从而使之具备强致病性。其中，毒性最强的致病因子是由Ⅲ型分泌系统(Type III Secretion System，T3SS)传递的，铜绿假单胞菌可以通过其T3SS系统将毒力蛋白直接注入到宿主细胞中，干扰宿主细胞的信号传导，改变宿主细胞的功能，创造有利于细菌生存和散布的环境。 
因此，T3SS系统是铜绿假单胞菌中最重要的毒性物质，铜绿假单胞菌的毒性可以主要由编码T3SS毒性效应蛋白的基因的存在性来判断。铜绿假单胞菌的T3SS系统主要分泌四种毒素ExoU，ExoS，ExoT和ExoY，其中ExoT和ExoY对菌毒性的作用很小，而ExoU、ExoS最具破坏性并引起广泛关注，ExoU一种拥有磷脂酶活性的坏死性毒素，ExoS是一类拥有鸟苷三磷酸酶激活蛋白活性和二磷酸腺苷核糖转移酶活性的双功能毒素。ExoU作为T3SS系统中最强的毒性效应蛋白，比ExoS的毒性更强。所以铜绿假单胞菌菌株呈现出不同的T3SS毒素基因型，由ExoU或ExoS基因(分别编码ExoU、ExoS毒性效应蛋白)的存在来定义。无论是在环境或是临床样本中，一般每株铜绿假单胞菌只携带ExoU、ExoS基因中的一种。并且，携带ExoU基因的铜绿假单胞菌比携带ExoS基因的毒性更强。只有从临床急性感染样本或严重污染环境样本中分离的铜绿假单胞菌株，才会携带ExoU基因。因此非常有必要检测ExoU或ExoS基因的存在性，用以在突发情况或例行监测中判断铜绿假单胞菌菌株的毒力。 
现已有研究用PCR技术来检测铜绿假单胞菌的ExoU和ExoS基因。但是，PCR方法对仪器设备(如PCR仪)要求高、投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。环介导等温扩增技 术(LAMP)是新的核酸扩增技术，其使用4-6条引物，针对目标DNA序列的6-8个区域，在等温条件下进行反应，在一个小时内即可完成扩增。简单快速，具有高度的特异性和灵敏度。并且，因为LAMP可在等温条件下反应，所以无需昂贵的热循环设备。因此，建立铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统重要毒素基因(ExoU、ExoS)的LAMP快速检测技术具有重要的意义，但是目前还没有相关研究。 
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒，本发明的目的之二在于提供上述LAMP快速检测试剂盒的应用，本发明的目的之三在于提供应用上述LAMP快速检测试剂盒的方法。 
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： 
1、铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒，含有铜绿假单胞菌ExoU和ExoS基因进行LAMP扩增的引物组， 
其中LAMP扩增ExoU基因的引物组如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，LAMP扩增ExoS基因的引物组如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示。 
优选的，所述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、甜菜碱和MgSO4。 
优选的，所述试剂盒中dNTPs的浓度为0.3mM、Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL、PCR反应缓冲液为10×PCR反应缓冲液，甜菜碱的浓度为0.8M、MgSO4的浓度为4.0mM。 
更优选的，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品分为ExoU基因阳性质控品和ExoS基因阳性质控品，所述ExoU基因阳性质控品为铜绿假单胞菌PA14基因组DNA，所述ExoS基因阳性质控品为铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA，所述阴性质控品为水。 
2、所述LAMP快速检测试剂盒在非疾病诊断中用于判断铜绿假单胞菌毒素基因型。 
3、利用所述LAMP快速检测试剂盒在非疾病诊断中判断铜绿假单胞菌毒素基因型的方法，包括如下步骤：从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为引物进行LAMP扩增反应，将扩增获得的LAMP产物进行电泳即可。 
更优选的，所述LAMP扩增的条件为先63℃扩增反应30分钟，再在80℃终止反应2分钟。 
本发明的有益效果在于：本发明公开了铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒可以检测铜绿假单胞菌编码强毒性效应蛋白的ExoU和ExoS基因，进而判断铜绿假单胞菌菌株的T3SS毒素基因型及毒性，该试剂盒具有特异性和灵敏度高的优点，远远优于常规PCR方法，并且检测周期短可用于在突发情况或例行监测中快速判断铜绿假单胞菌菌株的毒力，具有重要意义；同时该试剂盒不需要高昂的仪器投入，便于基层推广使用。 
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图： 
图1为本发明试剂盒检测结果图(M：DL2000DNA Marker；1-4：LAMP检测铜绿假单胞菌ExoS基因(1-3：模板为铜绿假单胞菌PA14的基因组DNA；4：非模板水对照)；5-8：LAMP检测铜绿假单胞菌ExoU基因(5-7:模板为铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA；8：非模板水对照))。 
图2为ExoS和ExoU基因灵敏度试验结果(1-5分别表示模板DNA浓度为10pg、1pg、100fg、10fg和0)。 
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1、铜绿假单胞菌模板DNA的制备 
铜绿假单胞菌模板DNA的制备，包括如下步骤： 
1)分别选取携带ExoU或ExoS基因的铜绿假单胞菌PA14和PAO1接种于LB肉汤中，然后在37℃、220rpm条件下培养12h； 
2)取步骤1)的细菌培养液500μL，然后在10000rpm条件下离心1min，弃上清，收集沉淀； 
3)将步骤2)收集的菌体沉淀悬浮在0.2mL裂解液中(Tris-HCl10mM pH8，EDTA1mM，NaCl100mM，SDS1％(w/v)，Triton X-1002％(w/v))，之后加入0.2mL Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和0.3g半径为106μm的玻璃珠(Sigma，USA)。使用研磨器(BioSpec，Bartlesville,USA)研磨细胞，持续2个循环(每个循环20s)，进行机械破壁； 
4)12000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。加入等体积的Tris饱和酚/氯仿 /异戊醇(25:24:1)抽提两次，12000g分别离心10min。小心吸取上清液，用乙醇清洗得到的DNA沉淀，-20℃沉淀30min； 
5)12000g离心10min，弃掉上清液，将液体吸净；吹干沉淀，加入50μL蒸馏水溶解，分别得铜绿假单胞菌PA14和PAO1基因组DNA，保存于-20℃备用。 
实施例2、设计LAMP引物组 
以铜绿假单胞菌ExoU基因(GeneBank：CP000438)和ExoS基因(GeneBank：AE004091)基因为目标基因，利用在线设计软件Primer Explorer V4software(Fujitsu Limited，Japan[http://primerexplorer.jp/e/])设计LAMP引物，具体引物如下： 
扩增ExoU基因所需要的引物组： 
ExoU-FIP:5’-agtacgggactccccttgccgaagttgccggaaagcgtta-3’(SEQ ID NO.1)； 
ExoU-BIP:5’-gcagatcactctgcgccagtcaatggtggccgactgag-3’(SEQ ID NO.2)； 
ExoU-F3:5’-ggttgccctaaagagcacg-3’(SEQ ID NO.3)； 
ExoU-B3:5’-gccgcttaggaccagact-3’(SEQ ID NO.4)； 
对ExoS基因扩增时所需要的引物组： 
ExoS-FIP:5’-gtcggccgatactctgctgac-taatgagcgaggtcgcact-3’(SEQ ID NO.5)； 
ExoS-BIP:5’-atggcctggtgaagcggttc-ttcggcgtcactgtggat-3’(SEQ ID NO.6)； 
ExoS-F3:5’-caccgaccagttgcatcag-3’(SEQ ID NO.7)； 
ExoS-B3:5’-gagaccaagcgccatcac-3’(SEQ ID NO.8)。 
实施例3、LAMP扩增反应 
分别以实施例1提取的铜绿假单胞菌PA14和铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，分别以实施例2设计扩增ExoU基因和扩增ExoS基因的引物组进行LAMP反应，LAMP反应体系为：10μM引物FIP4.8μL，10μM引物BIP4.8μL，10μM引物F30.6μL，10μM引物B30.6μL，2.5mM dNTPs4μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、10×PCR反应缓冲液3μL、5M甜菜碱5μL、150mM MgSO40.8μL，模板DNA1μL，用无菌水补足体积至30μL，然后在63℃扩增反应30分钟，再在80℃条件下2分钟终止反应。 
按照上述方法重复3次试验，以验证其重复性。 
实施例4、LAMP结果分析 
用1×TAE缓冲液配置质量分数为2％的琼脂糖凝胶，微波炉加热使琼脂糖完全溶解后加入溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)至终浓度为0.2μg/mL，倒胶后待胶凝固后取实施例3中3次扩增的LAMP产物进行检测，检测时扩增产物中加入相当于LAMP产物体积1/6的上样缓冲 液(0.25％溴酚蓝；0.25％二甲基苯腈蓝；0.25％蔗糖)混匀，然后分别将混合样添加到上样槽中，并在120V/cm电压下进行恒压电泳。然后用凝胶成像仪(BioRad，Hercules，USA)扫描并产生图像并进行图像分析，结果如图1所示。结果显示，检测组出现梯状条带，检测结果为阳性，对照组无条带，其检测结果为阴性。 
因此，本发明设计的LAMP引物能够分别特异扩增ExoU基因或ExoS基因，并且重复性好，能够用于检测铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统重要毒素基因(ExoU和ExoS)。 
实施例5、样本检测试验 
对铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌的ExoU及ExoS基因进行LAMP检测。使用5株铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌PA14、PAO1、PA103、PAK、PKE117)，以及14株非铜绿假单胞菌株(荧光假单胞菌、斯氏假单胞菌、恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌、洋葱假单胞菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短乳杆菌、长双歧杆菌、醋酸杆菌、丁酸梭菌、脆弱拟杆菌)，结果如表1所示。 
表1铜绿假单胞菌及非铜绿假单胞菌ExoU和ExoS基因的LAMP检测 
结果显示，铜绿假单胞菌PA14、PA103中存在ExoU基因，但缺失ExoS基因；铜绿假单胞菌PAO1、PAK、PKE117中存在ExoS基因，但缺失ExoU基因；而非铜绿假单胞菌均缺失ExoS及ExoU基因。由此可见，本发明设计的LAMP方法可以成功应用于检测ExoU和ExoS基因的存在。 
实施例6、灵敏度试验 
LAMP扩增结束后，将稀释了10倍的10,000×SYBR Green染料(Invitrogen,USA)加入到反应管中，如有阳性扩增，反应管中的颜色会由橙色变成绿色，而阴性仍保持SYBR Green染料的橙色不变。使用铜绿假单胞菌PAO1(缺失ExoU基因)的基因组DNA作为模板，分别在DNA模板浓度分别为10pg、1pg、100fg、10fg条件下检测LAMP方法检测ExoS基因的灵敏度，同时以水为模板作为对照；使用铜绿假单胞菌PA14(缺失ExoS基因)的基因组DNA作为模板，分别在DNA模板浓度分别为10pg、1pg、100fg、10fg条件下检测LAMP方法检测ExoS基因的灵敏度，同时以水为模板作为对照，结果如图2所示。结果显示，测试的DNA模板浓度分别为10pg、1pg、100fg、10fg，在模板浓度为10fg时，两个实验均已经检测不到目的条带。因此，由图中的检测结果可知此检测ExoU和ExoS基因的LAMP扩增的最低检出限均为 100fg。而传统的铜绿假单胞菌的PCR检测方法的灵敏度一般在10pg，因此采用本发明的实际和检测ExoU和ExoS基因的灵敏度较高。 
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 

Claims (7)

1.铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒素基因的LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：含有铜绿假单胞菌ExoU和ExoS基因进行LAMP扩增的引物组，
其中LAMP扩增ExoU基因的引物组如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，LAMP扩增ExoS基因的引物组如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、甜菜碱和MgSO4。
3.根据权利要求2所述的LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中dNTPs的浓度为0.3mM、Bst DNA聚合酶浓度为8U/μL、PCR反应缓冲液为10×PCR反应缓冲液，甜菜碱的浓度为0.8M、MgSO4的浓度为4.0mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品分为ExoU基因阳性质控品和ExoS基因阳性质控品，所述ExoU基因阳性质控品为铜绿假单胞菌PA14基因组DNA，所述ExoS基因阳性质控品为铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA，所述阴性质控品为水。
5.权利要求1-4任一项所述LAMP快速检测试剂盒在非疾病诊断中用于判断铜绿假单胞菌毒素基因型。
6.利用权利要求1-4任一项所述LAMP快速检测试剂盒在非疾病诊断中判断铜绿假单胞菌毒素基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，然后以提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为引物进行LAMP扩增反应，将扩增获得的LAMP产物进行电泳即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述LAMP扩增的条件为先63℃扩增反应30分钟，再在80℃终止反应2分钟。
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