CN104388566A - 一种铜绿假单孢菌的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒及其应用。所述试剂盒，由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括BstDNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水。所述试剂盒的应用，是使用本试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的铜绿假单孢菌。本发明具有操作简便、快速、结果判定方便、特异性强、灵敏性高而且成本低等优点。

Description

一种铜绿假单孢菌的快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于微生物分子检测技术应用领域，具体涉及一种灵敏度高，特异性强的可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒及其应用。 

背景技术

铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）也称绿脓杆菌，属假单胞菌属，在自然界分布广泛，各种水、空气、土壤、正常人的皮肤、呼吸道和肠道都有该菌存在。铜绿假单孢菌为条件致病菌，是医院内感染的重要条件病原菌之一，患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌，且死亡率较高。目前铜绿假单孢菌的检测大都沿用传统的细菌培养和免疫学检测，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法。 

环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO 00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，在1h内能达到10⁹靶序列拷贝，通过荧光染料显色，在自然光下肉眼观察判断结果，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。 

发明内容

本发明的一个目的是在于提供一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒。根据铜绿假单孢菌的oprl基因保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现铜绿假单孢菌的快速检测，为铜绿假单孢菌检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法，可替代传统的铜绿假单孢菌的检测方法，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。 

本发明的另一个目的是在于提供一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内，通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的铜绿假单孢菌。 

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒

该试剂盒由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水。

所述特异性引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。 

一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用

使用方法包括细菌DNA的提取、环介导等温扩增和显色结果判定：

1、细菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即将样品稀释液煮沸，上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板。

2、LAMP扩增： 

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1mM，甜菜碱0.5M，硫酸镁6mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择64℃避光反应60分钟。

3、检测结果判定： 

将检测管倒置甩动，使反应液与内盖上的滤纸片充分混匀，室温放置2分钟；正置后用力甩动检测管，使管内混有荧光显色剂的反应液聚于检测管底部，在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色则说明样品中含有铜绿假单孢菌，棕色则说明样品中没有铜绿假单孢菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测样本中是否存在铜绿假单孢菌特定基因片段，进而确定样本中是否存在铜绿假单孢菌；

2、快速高效，能在不到2小时完成检测（不包括样品培养时间）；

3、不需要使用昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低；

4、鉴定方便简单，自然光下通过肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断；

5、整个过程不涉及有毒试剂，保证了操作人员及环境的安全。

附图说明

图1 为本发明试剂盒检测管的俯视图，显示内盖附着的灭菌滤纸片添加了荧光显色剂。 

图2 为本发明试剂盒检测管的侧视图，显示分装的无色反应预混液。 

图3 为本发明试剂盒应用检测结果的示意图。 

在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色（左）则说明样品中含有铜绿假单孢菌，棕色（右）则说明样品中没有铜绿假单孢菌。 

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。 

实施例1：

一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒

该试剂盒由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水。

所述特异性引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。 

实施例2：

一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的优化

本发明的试剂盒的优化程序为：筛选最适的特异性引物组，内外引物的最适浓度比，最适反应温度，硫酸镁浓度，甜菜碱浓度，dNTP浓度，反应时间，均通过取反应扩增产物，用2%（w/v,以下相同）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图片显示LAMP特征性梯状条带的强弱来确定最佳条件。最后优化荧光显色剂的用量。以下以最适反应温度的优化为例具体说明。

一、细菌DNA模板的制备： 

无菌操作，按1:1000（v/v）接种铜绿假单孢菌纯培养物至灭菌LB液体培养基中，置36±1℃培养16±1小时；无菌操作，从上述培养液中取0.1ml至0.9ml灭菌生理盐水中；置于100℃沸水中保温5分钟，室温冷却后置4℃备用，当天使用。

二、LAMP扩增的反应体系： 

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1mM，甜菜碱0.5M，硫酸镁6mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，无菌双蒸水补足余量。

三、LAMP扩增的反应条件： 

反应管分别置于60、61、62、63、64、65、66℃温育60分钟。

四、结果判定： 

取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示64℃时结果最好。

实施例3：

一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用

结合本发明试剂盒检测的灵敏度和相关检测标准的要求，对待检样品的处理做了优化。

一、待检样品中细菌DNA的提取： 

无菌操作，称取待检样品25g或25ml至225ml灭菌LB液体培养基中，置36±1℃培养16±1小时；无菌操作，从上述培养液中取0.1ml至0.9ml灭菌生理盐水中；置于100℃沸水中保温5分钟，室温冷却后置4℃备用，当天使用。

二、LAMP扩增： 

无菌操作，取5μl上述制备的煮沸后稀释液上清至分装有反应预混液、荧光显色剂的检测管中。64℃避光反应60分钟。

三、检测结果判定： 

将检测管倒置甩动，使反应液与内盖上的滤纸片充分混匀，室温放置2分钟；正置后用力甩动检测管，使管内混有荧光显色剂的反应液聚于检测管底部，在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色则说明样品中含有铜绿假单孢菌，棕色则说明样品中没有铜绿假单孢菌。

另外建立使用外引物F3和B3的常规PCR检测技术，40个循环扩增，对待检样品的检测结果与本发明试剂盒的检测结果一致。 

  

SEQUENCE LISTING

<110>  武汉明曼基因工程有限公司

<120>  一种铜绿假单孢菌的快速检测试剂盒及其应用

<130>  一种铜绿假单孢菌的快速检测试剂盒及其应用

<160>  4

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  17

<212>  DNA

<213>  铜绿假单孢菌

<400>  1

TCTGCGTGCG ATCACCA                             17

<210>  2

<211>  16

<212>  DNA

<213>  铜绿假单孢菌

<400>  2

ACGACGCTCG CCCAGA                              16

<210>  3

<211>  43

<212>  DNA

<213>  铜绿假单孢菌

<400>  3

CGTGTACGTC CAGAGCGCGT TTTCTTCGAG TACGACAGCT CCG        43

<210>  4

<211>  46

<212>  DNA

<213>  铜绿假单孢菌

<400>  4

CGAAAGACCT GAAAGGCAGC GGTTTTCCAT ATTGTACTCG CGGGTG            46。

Claims (2)

1.一种可视化铜绿假单孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒，其特征在于，由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水；

所述特异性引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下：

F3：5’-TCTGCGTGCGATCACCA-3’

B3：5’-ACGACGCTCGCCCAGA-3’

FIP：5’-CGTGTACGTCCAGAGCGCGTTTTCTTCGAGTACGACAGCTCCG-3’

BIP：5’-CGAAAGACCTGAAAGGCAGCGGTTTTCCATATTGTACTCGCGGGTG-3’。

2.所述试剂盒的应用，其特征在于，通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的铜绿假单孢菌；使用方法包括细菌DNA的提取、环介导等温扩增和显色结果判定：

1）、细菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即将样品稀释液煮沸，上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板；

2）、LAMP扩增：

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1mM，甜菜碱0.5M，硫酸镁6mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择64℃避光反应60分钟；

3）、检测结果判定：

将检测管倒置甩动，使反应液与内盖上的滤纸片充分混匀，室温放置2分钟；正置后用力甩动检测管，使管内混有荧光显色剂的反应液聚于检测管底部，在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色则说明样品中含有铜绿假单孢菌，棕色则说明样品中没有铜绿假单孢菌。