CN110144421B - 一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的rpa引物、探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，属于生物安全技术领域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Vd‑RPA‑F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Vd‑RPA‑R如SEQ ID No.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Sp acer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端33bp处进行THF修饰。本发明还提供基于所述RPA引物和探针形成的试剂盒和检测方法。本发明首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为棉花黄萎病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法。
背景技术
由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病属于土传性真菌病害，在世界各棉区普遍发生，是制约棉花生产最主要的病害之一。大丽轮枝菌主要以微菌核的形式在土壤中长期存活，可以在棉花的各生育时期入侵并发病。我国是棉花黄萎病发生危害最严重的地区，且发病程度呈明显上升趋势。因此，快速准确地检测出大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的早期诊断、监测和预警以及综合防治具有及其重要的意义。
近年来，分子生物学技术的不断发展，为大丽轮枝菌的快速检测提供了良好的技术平台。目前，常规分子检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR技术、微流控芯片PC R、限制性片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温技术(LAMP)等。上述检测方法具有特异性强、灵敏度高及准确性高等优点，同时可以实现对发病组织和大批量土壤样品的定量检测，但是该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高。因此，继续开发对大丽轮枝菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是新兴的恒温扩增技术，其在重组酶的介导下模拟DNA复制过程。重组酶与RPA引物结合形成蛋白-DNA 复合物后，与模板DNA进行同源比对，在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA结合。随后，在DNA聚合酶的作用下，进行扩增反应，整个过程在37℃-42℃恒温反应20min即可完成；同时结合侧向流动免疫层析技术，可在10min内完成RPA扩增产物的检测，即利用RPA技术可在30min内完成对大丽轮枝菌的可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测方面的报道。
发明内容
1、要解决的问题
针对棉花黄萎病病原大丽轮枝菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本发明提供一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，它可以提高棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测的特异性和灵敏度，为棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的现场检测和早期诊断提供新方法。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，
所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，
所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQ ID No.1所示，
所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQ ID No.2所示；
所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，
所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer 修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp-38bp处进行THF修饰。
优选地，所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No.2所示的序列，且其5’端用Biotin 修饰；
所述的RPA探针Vd-LF-Probe如SEQ ID No.3所示的序列，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行 THF修饰。
一种含有上述所述的RPA引物和RPA探针的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的试剂盒。
优选地，所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。
一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物和RPA 探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。
优选地，步骤(1)中所述的样品为棉田发病土壤。
优选地，所述的RPA引物和RPA探针的检出下限为10pg DNA。
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃)下反应20分钟，随后冰上终止反应。
优选地，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带(即为检测带)，而且质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌，若试纸条仅质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中RPA引物和探针基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌ITS区差异序列设计，可稳定扩增且特异性较高，对大丽轮枝菌的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38℃下和30min内完成对大丽轮枝菌DNA的恒温扩增和可视化检测，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，本发明建立的棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法操作简单且结果易判定，为棉花黄萎病的早期诊断和指导科学施药提供有力技术支持。
附图说明
图1为实施例2棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法建立(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的检测结果图；
图2为实施例2棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法建立(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的检测结果图
图3为实施例3棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的特异性检测结果图；
图4为实施例3棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的特异性检测结果图；
图5为实施例4棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的灵敏度检测结果图；
图6为实施例4棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的灵敏度检测结果图；
图7为实施例5棉田土壤中棉花黄萎病病原大丽轮枝菌(正向引物Vd-RPA-F、反向引物 Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购白英国TwistDX公司，商品编号T ANFO02KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA 反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。
实施例1
棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针的筛选。以大丽轮枝菌ITS序列为靶标，根据RPA引物和探针设计原则，设计用于RPA试剂盒(TwistAmp nfo)的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物(即为RPA引物的正向引物和反向引物)序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。随后，对上述引物进行修饰，在RPA引物的反向引物5’端加入一个生物素(Biotin)标记位点，另外，根据RPA引物扩增片段设计一条大小为49bp的探针，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3-Spacer 修饰，且在探针中间距5’端33bp处进行THF修饰。最后根据要求筛选得到用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的灵敏度高、特异性强的RPA引物和探针，它们的序列如下：
正向引物Vd-RPA-F(SEQ ID No.1)：5’-GTTCTGCGAGCCCGCCGGTCCATCAGTCT CTCTG-3’，
反向引物Vd-RPA-R(SEQ ID No.2)：5’-Biotin-AAGCGCCTGCGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’；
探针Vd-LF-Probe(SEQ ID No.3)：5’-CAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTG GG-(THF)-ATCTACGTCTGTAGGCC-(C3-Spacer)-3’。
此外，发明人在筛选RPA引物和探针的过程中还设计了另外一组引物和探针，它们的序列如下：
正向引物Vd-RPA-F2(SEQ ID No.4)：5’-CGGTCCATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACGATAC-3’，
反向引物Vd-RPA-R2(SEQ ID No.5)：5’-Biotin-GCTGTAACTACTACGCAAGGAAGGGCCACGC-3’；
探针Vd-LF-Probe2(SEQ ID No.6)：5’-TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG-(THF)-ACGCACATGGCGCC-(C3-Spacer)-3’。
实施例2
棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法的建立
本实施例的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用实施例1中所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：38℃下反应20分钟，随后冰上终止反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
(3)分析RPA扩增产物；取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液(取上述1μL RP A扩增产物加入49μL PBST缓冲液中混匀，其中所述的PBST缓冲液中含0.1％吐温-20的 PBS缓冲液)，将试纸条(Milenia Genline Hybridetect-1，德国Milenia Biotec公司)上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌，若试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。
如图1所示，选择正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe，分别进行阴性对照模板与阳性对照模板的试验；其中阳性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的DNA，其他内容同上述用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，图1中的标号“1”指的是阳性对照模板的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌；其中阴性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为ddH2O，其他内容同上述用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，图1中的标号“2”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。
如图2所示，选择正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2，分别进行阴性对照模板与阳性对照模板的试验；其中阳性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的DNA，其他内容同上述用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，图2中的标号“1”指的是阳性对照模板的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌；其中阴性对照模板的试验中的待检测DNA模板替换为ddH2O，其他内容同上述用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，图2中的标号“2”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。
综上所述，。
实施例3
棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针的特异性检测
本实施例的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法同实施例2，不同在于：
所述的样品分别为大丽轮枝菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌、棉花红腐病菌、油菜根腐病、油菜菌核病、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌。
图3为选择正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe，图4为选择正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2；如图3和图4所示，图3 和图4中的标号“1”、“2”、“3”、“4”指的是大丽轮枝菌4个不同群体的检测结果，图3和图4中的标号“5”指的是棉花枯萎病菌的检测结果，图3和图4中的标号“6”指的是棉花立枯病菌的检测结果，图3和图4中的标号“7”指的是棉花红腐病菌的检测结果，图3和图 4中的标号“8”指的是油菜根腐病的检测结果，图3和图4中的标号“9”指的是油菜菌核病的检测结果，图3和图4中的标号“10”指的是小麦纹枯病菌的检测结果，图3和图4中的标号“11”指的是小麦全蚀病菌的检测结果；图3和图4中的标号“12”指的是模板替换为ddH2O的检测结果(阴性对照)。
上述图3与图4的检测结果图表明，仅大丽轮枝菌的检测结果的检测线位置和质控线位置同时出现条带，而其他病菌的检测结果仅质控线位置出现条带，这表明本发明RPA引物和探针特异性较高。
实施例4
棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针的灵敏度检测
本实施例的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法同实施例2，不同在于：
提取大丽轮枝菌菌丝的基因组DNA，按10倍梯度依次稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/ μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0fg/μL。
图5为选择正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe，图6为选择正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2；如图5和图6所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”、“10”分别指的是不同浓度(100ng/μ L、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、 0fg/μL)基因组DNA的检测结果。
上述图5的检测结果图表明，棉花黄萎病病原大丽轮枝菌DNA的检出下限为10pgDNA (由于50μL反应体系中待检测DNA模板的加入量为1μL，经过换算可得知标号“5”对应的10pg/μL浓度的基因组DNA加入50μL反应体系内，相当于加入的DNA模板总量为10 pg。)。
上述图6的检测结果图表明，棉花黄萎病病原大丽轮枝菌DNA的检出下限为1ngDNA模板。
由实施例4和图5及图6可知，本发明的(试剂盒和)方法具有较高的检测灵敏度。
实施例5
棉田土壤中棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA检测
为验证本发明所述RPA检测技术的实用性，采集安徽棉田9份疑似棉花黄萎病发病田块的土壤，提取土壤DNA并进行RPA检测，土壤中大丽轮枝菌的RPA检测方法同实施例2。
图7为发病土壤的检测结果图，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”分别指的是9份疑似棉花黄萎病发病田块土壤的RPA检测结果，标号“10”指的是阳性对照 (人工施放棉花黄萎病病原大丽轮枝菌)土壤的RPA检测结果，标号“11”指的是健康土壤的RPA检测结果。
上述图7的检测结果图表明，4份(“2”、“3”、“5”、“6”)发病田块和1份(“10”)阳性对照的土壤均检测到大丽轮枝菌，而其他6份发病田块(“1”、“4”、“7”、“8”、“9”、“11”) 的土壤中未能检测到大丽轮枝菌，这与11份棉田田块大丽轮枝菌的实际感染情况相一致：上述表明本发明大丽轮枝菌RPA引物和探针具有较强的实用性。
综上所述，由实施例1-5可见，本发明首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，具备特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为棉花黄萎病的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法；其中RPA引物和探针基于大丽轮枝菌 ITS区差异序列设计，特异性较高、检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在38℃下和30min内完成对大丽轮枝菌的恒温扩增和可视化检测，无需任何 PCR仪、凝胶电泳和成像系统，检测效率远高于常规分子检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象；本发明建立的大丽轮枝菌RPA检测方法操作简单且结果易判定，不需要繁琐的电泳和紫外观察，为大丽轮枝菌的现场检测或快速检测提供有力技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 安徽省农业科学院棉花研究所
<120> 一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法
<141> 2019-05-16
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 1
gttctgcgag cccgccggtc catcagtctc tctg 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 2
aagcgcctgc gggactccga tgcgagctgt aac 33
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 3
caaccctcga gccccagtgg cccggtgttg ggatctacgt ctgtaggcc 49
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 4
cggtccatca gtctctctgt ttataccaac gatac 35
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 5
gctgtaacta ctacgcaagg aagggccacg c 31
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)
<400> 6
tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgacgca catggcgcc 49
Claims (9)
1.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的组合物，所述组合物为RPA引物和RPA探针，其特征在于：
所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，
所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQ ID No.1所示，
所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQ ID No.2所示；
所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，
所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp-38bp处进行THF修饰；
所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No.2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；
所述的RPA探针Vd-LF-Probe如SEQ ID No.3所示的序列，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
2.一种含有权利要求1所述的组合物用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。
4.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）提取样品中的DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
（3）分析RPA扩增产物。
5.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述的样品为棉田发病土壤。
6.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出下限为10 pg DNA 。
7.根据权利要求6所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
待检测DNA模板 1.0μL
10μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的上游引物 2.1μL
10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA引物的下游引物 2.1μL
10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA探针 0.6μL
反应缓冲液 29.5μL
RPA冻干粉 5.0mg
280mmol/L醋酸镁 2.5μL
ddH2O 补足至50μL。
8.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃下反应20分钟，随后冰上终止反应。
9.根据权利要求4-8任意一项所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌，若试纸条的仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。
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| 重组酶聚合酶扩增技术研究进展;景志刚等;《生物技术通报》;20161231;第32卷(第6期);第47页左栏第1段-右栏第1段，第48页左栏第2段-右栏第1段 * |
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