CN108168983A - 一种真菌特殊染色的荧光试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够标记真菌的免疫显色试剂，包括水、盐、结合蛋白、特异性抗体，荧光素、促溶剂以及背景复染剂。本发明产品通过优化配方，能够实现一步法快速染色，并且缩短了染色时间，临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。

Description

一种真菌特殊染色的荧光试剂

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种真菌特殊染色的荧光试剂。

背景技术

真菌广泛分布于自然界，绝大多数对人类无害甚至有益，但其中400余种可引起人类疾病，亦即为我们所称致病性真菌。致病真菌可分为皮肤癣菌、酵母菌和霉菌。真菌引起的疾病称为真菌病，临床上真菌病可分为浅部真菌病和深部真菌病或系统性真菌病。浅部真菌病由只侵犯人体皮肤、毛发和甲等浅表组织的真菌引起。在我国90%以上的真菌病属于浅部真菌病。引起系统性真菌病的病原真菌包括组织胞浆菌、芽生菌、球孢子菌和副球孢子菌，这些都是双相真菌，在自然界中以霉菌形态菌如隐球菌属、念珠菌属、曲霉属等均可致严重的系统感染。

随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物的广泛使用，糖皮质类固醇激素的长期使用，体腔内有创检查的大量开展，人口老龄化和糖尿病等慢性疾病患者的增多，真菌病的发病率和死亡率在逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。然而，作为条件致病真菌及大自然中原本认为不致病的真菌种类，近年发现在逐年上升，由于对很多真菌感染的微生物学特性了解甚少，因而出现临床诊治的困难，加之真菌感染的临床表现多种多样，故通常会出现临床的误诊漏诊，导致患者病情迁延甚至危及生命。面对这种现状，如何真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题，解决这一问题的关键在于提高实验室的真菌鉴定水平。尽管分子生物学等非培养技术的迅猛发展，目前仍缺乏早期快速的诊断方法，这些都给真菌病的预防和诊治带来挑战。因此，逐步开展临床致病真菌检测的研究对于临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。

临床常见的用于真菌检测的方法包括镜检法、培养法和组织病理学方法等。

1.直接镜检法：直接涂片镜检是一种常用、简便而迅速的真菌检测方法,对真菌感染的诊断具有重要意义。直接涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上,用染色或加10％KOH溶液,在光镜下检查。但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，还需要进一步培养鉴定。另外,直接镜检阴性也不能排除真菌感染的可能性。

2.分离培养方法：从临床标本中对致病菌进行培养，目的在于从临床标本中分离真菌,以确定是否有真菌感染,特别是在直接镜检为阴性时。从疑似患者身上采集的标本可以直接接种在培养基上。一般培养超过2周仍无真菌生长,可报告阴性。培养法虽然检测结果准确性高，但由于真菌生长缓慢,培养常需要数天甚至数周才有结果，常会延误患者病情。

荧光染色法通过使用特殊的荧光素，与组织样品的β-多糖物质相结合，如纤维素、几丁质等。在荧光显微镜的紫外激发光下呈现荧光。使用荧光染色液进行真菌检测，是介于传统检验方法中直接镜检法和生化检测法两者之间的一种检测方法。利用直接镜检的基本操作方法，通过荧光染料与真菌细胞壁及寄生虫的多糖成分非特异性结合，能够对真菌和寄生虫感染导致的各种疾病，做出快速、准确的实验室检测。国内外已经有很多实验证实了荧光染色法具有阳性率高、适用范围广等优点。

荧光染色法一般需要三种主要成分，包括荧光素、氢氧化钾和背景压制剂。荧光素与真菌细胞壁及寄生虫多糖成分相结合，产生荧光；氢氧化钾能溶解样品组织中的角质、消除杂质，并使组织透明；而背景压制剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。然而，由于荧光增白剂在强碱环境中稳定性差，荧光素会发生析出沉淀现象；而且背景压制剂也会影响荧光素的稳定性，会引起检测灵敏度的降低，甚至无法对真菌染色。因此，在现有技术下，荧光染色法所需的这三种染色液成分无法稳定长期共存，需分别配制储存，染色时需要两个甚至三个步骤才能完成，操作上相对繁琐，染色时间相对较长。

发明内容

本发明针对现有技术不足，研发出一种单剂型的真菌特殊染色的荧光试剂。本发明产品稳定性好，只需一步操作即可完成染色，临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。

本发明具体技术方案如下：

一种真菌特殊染色的荧光试剂，包括荧光素、水、盐、促溶剂以及背景压制剂。

本发明所述荧光素选自选二苯乙烯类型荧光增白剂，优选双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂。优选荧光素的浓度为0.01%-0.1%（W/V）。

荧光素结构如下所示：

。

本发明所述盐为碱性无机盐，优选氢氧化钾或氢氧化钠。优选碱的浓度为5%-10%（W/V）。

本发明所述背景压制剂为实验室常规使用的染料，优选酚蓝类染料或蓝色偶氮类染料，更优选溴酚蓝、溴甲酚蓝、台酚蓝、伊文思蓝中的一种或几种，优选背景染料的浓度为0.1%-1%（W/V）。

本发明所述促溶剂选自水溶性有机溶剂，优选二甲基亚砜和甘油，更优选二甲基亚砜。促溶剂的作用是染料的溶解度和稳定性。优选促溶剂的浓度为10-15%（V/V）。

本发明将荧光素、碱和背景压制剂混合配制，通过添加促溶剂，使得试剂能够长期稳定放置，使原本需要多步操作的检测方法能够实现快速一步染色，并且缩短了染色时间。临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。

附图说明

图1为本发明试剂1的培养真菌的染色结果。

图2为本发明试剂2的培养真菌染色结果。

具体实施方案

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1 真菌荧光试剂的配制

试剂1：将荧光素溶于浓度为8％（W/V）氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光素的浓度为0.02%（W/V），加入伊文思蓝染料，使伊文思蓝染料的浓度为0.2%（W/V）。

试剂2：将荧光素溶于浓度为8％（W/V）氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光素的浓度为0.02%（W/V），加入伊文思蓝染料和二甲基亚砜，伊文思蓝染料的浓度为0.2%（W/V），二甲基亚砜浓度为12%（V/V）。

实施例2 试剂1的染色效果

挑取培养基的真菌标本，放置于载玻片上，用试剂1进行染色染色1分钟，加上盖玻片，将多余的染料用纸吸掉，而后在荧光显微镜下观察。用340 nm–380nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或蓝绿色。结果显示试剂1能对真菌进行染色。

试剂2的染色效果

挑取培养基的真菌标本，放置于载玻片上，用试剂2进行染色染色1分钟，加上盖玻片，将多余的染料用纸吸掉，而后在荧光显微镜下观察。用340 nm–380nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或蓝绿色。结果显示试剂2能对真菌进行染色。

实施例2 溶液稳定性考察

将试剂1和试剂2放置于室温6个月，然后对培养真菌进行染色。从染色效果判断试剂的稳定性。结果如表1所示。

表1

	试剂1	试剂2
			染色效果	差	好
沉淀	有	无
			外观颜色	不变	不变

结果表明，室温放置放置6个月后，试剂1、试剂2外观颜色均不变，但试剂1有沉淀结晶现象，试剂不稳定，染色效果差。试剂2无结晶且染色效果好，试剂稳定性高。

Claims (7)

1.一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于包括荧光素、水、盐、促溶剂以及背景压制剂。

2.所述荧光素为二苯乙烯类型荧光增白剂，所述水为纯化水，所述盐为碱性无机盐，所述促溶剂为水溶性有机溶剂，所述背景压制剂为蓝色复染剂。

3.如权利要求1所述的一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于所述荧光素为双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂。

4.如权利要求1所述的一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于所述盐为氢氧化钾或氢氧化钠。

5.如权利要求1所述的一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于所述促溶剂为二甲基亚砜或甘油。

6.如权利要求1所述的一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于所述背景压制剂选自溴酚蓝、溴甲酚蓝、台酚蓝、伊文思蓝中的一种或几种。

7.如权利要求1所述的一种真菌特殊染色的荧光试剂，其特征在于包括荧光素、水、盐、促溶剂以及背景压制剂。