CN103262838A

CN103262838A - 一种宫颈异常细胞筛查试剂盒和酶标液基细胞保存液

Info

Publication number: CN103262838A
Application number: CN2013102198614A
Authority: CN
Inventors: 沈玉先; 王阳; 方圣文
Original assignee: HEFEI ANYON BIOPHARMACEUTICALS CO Ltd
Current assignee: Hefei Jiusheng Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103262838B

Abstract

本发明涉及药物制剂技术领域，具体体涉及一种宫颈异常细胞筛查试剂盒和酶标液基细胞保存液。本发明的宫颈异常细胞筛选试剂盒具有优异的敏感性和良好的特异性，而本发明的酶标液基细胞保存液能较好的保持宫颈脱落细胞的酸性磷酸酶活性以及细胞形态，有防腐、除去杂质、溶解红细胞的功能，使用期对保存后的细胞进行制片、染色的效果要优于传统保存液。

Description

一种宫颈异常细胞筛查试剂盒和酶标液基细胞保存液

技术领域

本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种宫颈异常细胞筛查试剂盒和酶标液基细胞保存液。

背景技术

宫颈癌在女性恶性肿瘤占第二位，仅次于乳腺癌，全球大约每两分钟就有一位女性死于宫颈癌，全球每年估计有27万女性死于宫颈癌，每年新发病例有50万，其中大约有一半来自亚洲。

宫颈癌是早期发现可以成功治愈的癌症之一。有大量证据表明早期发现宫颈癌并进行治疗，女性完全可以获得康复。因此，疾病的早期发现至关重要，同时也是一项极具意义的公共政策。世界卫生组织和所有发达国家及一些发展中国家的政府部门都在极力推进和鼓励21-64岁的女性每年进行一次宫颈癌筛查，尤其对于性生活正常的女性，不管年龄大小，每年都需要进行此项检查。

目前宫颈癌筛查方法的原理是基于对细胞形态学异常改变的观察。遗憾的是，这项技术包括对这一技术的最新改进，步骤过于复杂、耗时长，都难以迎合进行大规模宫颈异常细胞的筛查的要求。为了满足这一需要，我们开发了这种宫颈异常细胞的快速筛查方法。这项发明通过增强在传统涂片上异常宫颈细胞的可视性，同时提高了传统涂片法的敏感性和特异性。

同时，我们发明一种酶标液基细胞保存液，保存液用于临床宫颈脱落细胞的保存。保存液包括醇类、稳定pH的缓冲液、维持离子强度和渗透压的盐类组成，在此保存液中，宫颈脱落细胞的酸性磷酸酶活性以及细胞形态得以保持，同时能够除去样本中的粘液、红细胞和其他杂质，使液基制片更容易观察。保存液有防腐、除去杂质、溶解红细胞的功能。

说明书附图

图1临床确诊宫颈癌患者宫颈涂片染色示意图，灰色箭头所示为正常的宫颈鳞状上皮细胞；黑色箭头所示为典型的酸性磷酸酶阳性的宫颈鳞状上皮细胞。

图2A为健康对照宫颈涂片染色示意图，酸性磷酸酶阴性。B为宫颈癌细胞系Hela细胞染色示意图，箭头所示红色为酸性磷酸酶着色部位，C为细胞放大2倍后效果。

图3A为FSC保存液中常温保存4日的HeLa细胞染色结果；B为保存液A中常温保存4日的HeLa细胞染色结果；C为Thinprep保存液中常温保存4日的HeLa细胞染色结果。

发明内容

酸性磷酸酶是在男性前列腺高表达的一种酶，酸性磷酸酶检测已被当作一个生物标志物，来诊断前列腺癌及检测肿瘤有否向身体其他组织扩散，同时也被用来检测治疗效果。为了检测女性宫颈组织是否也有酸性磷酸酶表达，我们发现在宫颈异常细胞中酸性磷酸酶高表达，而在正常宫颈细胞中则没有表达。这项发现提示酸性磷酸酶是宫颈异常细胞筛查的一个非常实用的生物标志物。利用酸性磷酸酶这个生物标志物，开发出新的检测试剂盒用于宫颈异常细胞的筛查。这种新方法应用细胞染色技术，利用传统宫颈涂片来检测酸性磷酸酶的表达来甄别宫颈异常细胞，其原理是利用萘酚AS-BI盐或萘酚AS-MX盐作为酸性磷酸酶底物，利用快红紫、固酱紫或品红等重氮盐作为偶联物在异常细胞内形成红色沉淀。这种方法选择性标记宫颈异常细胞，而正常细胞则不会着色。因此，标记上红色的异常宫颈细胞与传统染色相比结果更鲜明突出，显著增加了异常细胞的可视性。

这种结果可读性的增强减少了传统涂片染色或新发展的液基细胞学检查中结果读取过程中的模糊性。我们的临床实验结果显示新的方法可以提高20％以上的灵敏度，降低假阴性率达60％以上。而且，新方法在可读性方面的提高适用于自动化，因而显著增加宫颈异常细胞筛查中的高敏感性和特异性的输出。新的检测方法更快捷、花费更小，同时采用了常规可靠的染色方法，这种检测方法在可以进行传统涂片检查的任何实验室都可以进行。新方法结果可读性的增加同时也显著减少了样本检测所需要的时间，传统涂片染色的操作可以由实验室技术员或医务人员进行，但结果则需要专业的病理学家来解读。

具体实施例

实施例1：

一、FSC-811染色试剂盒成分：

(1)试剂A：固定液：10％福尔马林

(2)试剂B：染色液：萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺配制成的溶液，其中萘酚AS-BI磷酸盐终浓度为12.5g/l

(3)试剂C：盐酸品红：盐酸品红溶于2N HCl配制成的溶液，其中盐酸品红的终浓度为4％(w/v)

(4)试剂D：亚硝酸钠：0.5M NaNO2

(5)试剂E：醋酸钠溶液：2.5M，pH5.2

(6)试剂F：苏木素复染液

(7)滤纸

二、染色步骤：

1.涂片在试剂A中固定1分钟

2.用水充分洗净

3.将试剂B，C，D，和E混匀后，用滤纸过滤到染色缸中

4.将涂片放入染色液中置于25-37℃染色20-30分钟

5.用水充分洗净

6.用试剂F染色1分钟

7.封片或晾干，镜检

三、染色结果：

异常宫颈细胞胞质中有红色沉淀，核呈蓝色；正常细胞胞质无着色，核呈蓝色。

四、临床试验结果：

安徽医科大学第一附属医院和安徽省立医院的临床研究结果有力的证明了产品敏感性高、特异性强、假阴性率低的特点。我们在2010年1月至5月期间从安徽医科大学第一附属医院常规就诊的门诊病人和安徽省立医院常规就诊的门诊病人中共收集有效病例208例，同时采用PAP染色和TCT/LCT的方法进行制片染色。在30例确证为宫颈癌的病例中，FSC染色全部阳性，FSC试剂的诊断宫颈癌的敏感性100％，特异性高于93％(结果见表1)。

结果与巴氏染色相比，FSC染色较易寻找阳性细胞，阅片时间短，检测诊断结果的可重复性高。对不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)诊断率减少，低度鳞状上皮内病变(LSIL)阳性率明显升高，高度鳞状上皮内病变(HSIL)及鳞状细胞癌(SCC)阳性率持平。FSC与TCT检查对于宫颈病变中HSIL及SCC的筛查的稳定性相同，前者对LSIL诊断的阳性率高，而对ASCUS的诊断率较后者略低。FSC较TCT-巴氏诊断所用的时间短，诊断的可重复性高，体现了在疾病筛查中的优势。

敏感性及特异性计算方式：

灵敏度＝TP/(TP+FN)如果大于1，记为100％；

特异性＝TN/(TN+FP)。TP：真阳性病人数；TN：(某检测方法测得)阴性病人数；FP：假阳性病人数

表1：临床试验数据

五、FSC-811酶标液基细胞保存液

FSC-811酶标液基细胞保存液(以下称FSC保存液)是配合FSC-811染色试剂盒使用的专用保存液，应用于临床宫颈脱落细胞的保存。保存液包括醇类、稳定pH的缓冲液、维持离子强度和渗透压的盐类组成，在此保存液中，宫颈脱落细胞的酸性磷酸酶活性以及细胞形态得以保持，同时能够除去样本中的粘液、红细胞和其他杂质，使液基制片更容易观察。鉴定保存液效果的标准为：保存HeLa细胞，常温4天或4摄氏度保存14天后，使用FSC-811试剂盒染色，观察到细胞质中红染颗粒颜色鲜艳，细胞核染蓝，并且细胞形态保持较好。FSC保存液有防腐、除去杂质、溶解红细胞的功能，进行所述制片、染色的效果要优于传统保存液。

1.试剂及实验材料

FSC-811染色试剂盒，FSC-811酶标液基细胞保存液，HeLa细胞，24孔细胞培养板及培养基。

2.仪器设备

CO₂培养箱，水浴锅，冰箱，显微镜，移液枪。

3.方法

3.1保存液配制

(1)15％甲醇

(2)0.2-0.5mM EDTA

(3)0.1mM NaCl

(4)0.1M醋酸缓冲液，pH4-6

(5)dd H₂O

3.2HeLa细胞培养

将对数生长期的HeLa细胞接种在24孔培养板中，CO₂培养箱中培养过夜，细胞贴壁后待用。

3.3保存液使用

HeLa细胞倾去培养基后，加入1-2毫升保存液，室温放置3天或4摄氏度冰箱中放置14天后用于染色。

3.4FSC-811染色

保存液中的的HeLa细胞经过制片后用前述的酸性磷酸酶染色。显微镜观察。

4.结果

新鲜配制的保存液室温保存3天或4摄氏度冰箱中保存14天后，HeLa细胞的细胞核被染成蓝色，胞浆中出现红色颗粒物质，颜色鲜艳，细胞形态保持较好，与培养板中生长的细胞形态一致，说明保存液作用正常。

5.与Thinprep保存液比较

将宫颈癌细胞株HeLa分别在本申请所述的FSC保存液、本公司另一专利(CN201110178041.6)中描述的保存液(保存液A)和Thinprep保存液(医院中TCT项目使用的保存液)中常温保存4日后，进行制片和酸性磷酸酶染色，得到的结果如附图3所示，在本发明的FSC保存液中的细胞进行的制片和染色效果(图3A)效果明显好于对照组保存液A(图3B)和Thinprep保存液(图3C，所有细胞酸性磷酸酶染色阴性)；由附图结果可知，保存液A染色效果明显不如本发明FSC保存液，而Thinprep保存液更是酸性磷酸酶染色完全阴性。其具体比较结果如下表所示(“+”多表示效果更优)：

	FSC保存液	保存液A	Thinprep保存液
				颜色鲜艳程度	+++++	+++	-
细胞形态保持	++++	++++	++++
				核仁清晰程度	+++++	++++	++++
阳性细胞染色比例	+++++(＞96％)	++(约40％)	-无(0％)
				综合染色效果	+++++	+++	++

结果显示，FSC保存液不但能保存细胞形态，也能保持酸性磷酸酶活力；而Thinprep保存液仅能保存细胞形态，不能保持酸性磷酸酶活力。

Claims

1.一种酶标液基细胞保存液，其特征在于，所述酶标液基细胞保存液的具体组成如下所示：

(1)15％甲醇

(2)0.1mM EDTA

(3)0.1mMNaCl

(4)0.01M醋酸钠缓冲液，pH5.2

(5)5％Proclin300

(6)dd H₂O。

2.权利要求5所述的酶标液基细胞保存液在制备用于筛查宫颈异常细胞的试剂盒中的用途。

3.一种用于筛查宫颈异常细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由细胞染色试剂和酶标液基细胞保存液组成。

4.权利要求3所述的筛查宫颈异常细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞染色试剂由固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、苏木素复染液及滤纸组成。

5.权利要求4所述的筛查宫颈异常细胞的试剂盒，其特征在于，所述的细胞染色试剂的具体组成如下所示：

试剂A：固定液：10％福尔马林

试剂B：染色液：12.5g/l的萘酚AS-BI磷酸盐溶液，由萘酚AS-BI磷酸盐溶于二甲基甲酰胺配制而成

试剂C：盐酸品红：4％(w/v)盐酸品红溶液，由盐酸品红溶于2N HCl配制而成

试剂D：亚硝酸钠：0.5M NaNO₂

试剂E：醋酸钠溶液：2.5M，pH5.2

试剂F：苏木素复染液

滤纸。

6.权利要求3所述的筛查宫颈异常细胞的试剂盒，其特征在于，所述酶标液基细胞保存液的具体组成如下所示：

(1)15％甲醇

(2)0.1mM EDTA

(3)0.1mMNaCl

(4)0.01M醋酸钠缓冲液，pH5.2

(5)5％Proclin300

(6)dd H2O。