CN112544609A - 宫颈细胞样本保存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医用试剂领域,具体而言,涉及一种宫颈细胞样本保存液及其应用。该宫颈细胞样本保存液以工作浓度计,包括如下成分:醇醛组分:异丙醇15v/v%~25v/v%、甲醇5v/v%~10v/v%、乙二醇4v/v%~8v/v%、甲醛0.5v/v%~2.5v/v%,且所述醇醛组分的总含量≤40v/v%;醋酸盐13mM~17mM;阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为33mM~43mM;所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。本发明所提供的宫颈细胞样本保存液能有效的去除血液、粘液等影响诊断的因素,同时细胞保存能力强,保存后放置6个月以上细胞形态不改变。
Description
技术领域
本发明涉及医用试剂领域,具体而言,涉及一种宫颈细胞样本保存液及其应用。
背景技术
液基细胞保存液是液基细胞学检测技术(Thin-Cytologic Test,TCT)主要耗材。液基细胞学保存液的功能是保存从活体取样后的得到的细胞。液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年美国等国家,率先应用于妇科细胞学检查,国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究,使该项技术得到迅速发展,被称之为一场细胞学制片技术的革命。
中国专利申请号200910034575.4于2010年3月10日公开了一种液基细胞保存液,它由醇类、双蒸水、磷酸盐、灭菌剂苯酚、粘液分解剂N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二澳苯甲胺盐酸盐组成。该发明的目的是提供一种液基细胞保存液,该保存液无法将标本中的黏液、血液和炎性细胞彻底分离所以制得高质量的涂片;而且这种液基细胞保存液保存的标本放置4周后,细胞形态就开始发生变化,这对于一些疑难杂症,需要重复制得涂片的标本显得勉为其难,不能符合病案研究的需要,不利于患者治疗。
中国专利申请号CN105409925A公开了一种液基细胞保存液,该液基细胞保存液是由醇类、磷酸钠缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠0.08%-0.12%、氯化钾、甲醛、二硫苏糖醇、醋酸钙、醋酸镁等配制而成。但是该液基细胞保存液存在以下缺点:磷酸钠缓冲液与醋酸钙、醋酸镁发生化学反应后生成磷酸镁磷酸钙沉淀会对后续的诊断结果造成影响。
发明内容
针对于以上问题,本发明提供一种宫颈细胞样本保存液,能有效去除粘液、血液,且保存液标本后放置时间很久,细胞形态也不会发生改变,从而提高诊断质量,增加阳性率。
本发明涉及一种宫颈细胞样本保存液,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇15v/v%~25v/v%、甲醇5v/v%~10v/v%、乙二醇4v/v%~8v/v%、甲醛0.5v/v%~2.5v/v%,且所述醇醛组分的总含量≤40v/v%;
·醋酸盐13mM~17mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为33mM~43mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种宫颈细胞样本保存方法,包括:
将采集得到的宫颈分泌物标本用如上所述的宫颈细胞样本保存液孵育保存。
本发明还涉及制备宫颈细胞制品的方法,包括:用如上所述方法保存宫颈细胞,以及;
将所述宫颈细胞与基底结合。
本发明还涉及含有如上所述的宫颈细胞样本保存液的试剂盒。
宫颈细胞样本成分复杂,通常包含鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞、表层不全角化细胞、完全角化细胞、细菌、滴虫、黏液、中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞、红细胞、高分化鳞癌细胞、腺癌细胞等成分中的一种或多种,因此对保存液的要求很高。
本发明以异丙醇、甲醇、乙二醇为固定剂,甲醛作为防腐剂和固定剂,多种固定剂成分可以应对宫颈细胞样本中的复杂成分,较强的固定能力能使细胞保存后6个月不发生形态改变;醋酸盐起到缓冲作用,并能有效去除红细胞;适宜浓度的阳离子也能够有效保持所保存细胞的形态。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的宫颈细胞样本保存液能有效的去除血液、粘液等影响诊断的因素,同时细胞保存能力强,保存后放置6个月以上细胞形态不改变。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中固定保存4h镜下细胞保存效果;A、B、C、D依次对应实施例1、比较例1、比较例2、比较例3;
图2为本发明一个实施例中固定保存6个月后镜下细胞保存效果;A、B、C、D、E依次对应实施例1、比较例1、比较例2、比较例3、比较例4。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种宫颈细胞样本保存液,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇15v/v%~25v/v%、甲醇5v/v%~10v/v%、乙二醇4v/v%~8v/v%、甲醛0.5v/v%~2.5v/v%,且所述醇醛组分的总含量≤40v/v%;
·醋酸盐13mM~17mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为33mM~43mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
本发明所提供的宫颈细胞样本保存液能有效的去除血液、粘液等影响诊断的因素,同时细胞保存能力强,保存后放置6个月以上细胞形态不改变。
在一些实施方式中,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇18v/v%~22v/v%、甲醇6v/v%~8v/v%、乙二醇5v/v%~7v/v%、甲醛0.5v/v%~1.5v/v%;
·醋酸盐14mM~16mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为36mM~40mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
在一些实施方式中,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇19v/v%~21v/v%、甲醇6.5v/v%~7.5v/v%、乙二醇5.5v/v%~6.5v/v%、甲醛0.7v/v%~1.2v/v%;
·醋酸盐14mM~16mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为36mM~40mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
在一些实施方式中,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇20v/v%、甲醇7v/v%、乙二醇6v/v%、甲醛7v/v%;
·醋酸盐15mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为38mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
在本发明中,“工作浓度”用于限定所述宫颈细胞样本保存液在处理宫颈细胞样本时主要活性组分的比例,所述宫颈细胞样本保存液中主要活性组分的浓度可以为工作浓度,也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液)。
在本发明中,异丙醇、甲醇、乙二醇、甲醛的纯度优选≥99.5%,例如99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%或者100%。
在一些实施方式中,所述宫颈细胞样本保存液还含有除醋酸盐以外的其他缓冲物质。
如本文使用的术语“缓冲物质”指当酸或碱加入该溶液或组合物中时,所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类物质的缓冲性质。因此,显示出缓冲活性的物质被称为缓冲物质。缓冲物质一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反,它们一般能够维持在特定范围内的pH,例如pH 7~pH 9。一般地,缓冲物质能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如,Mohan,Buffers,A guide for thepreparation and use of buffers in biological systems,CALBIOCHEM,1999)。缓冲物质一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。优选的缓冲物质包括磷酸盐。
在一些实施方式中,所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或多种。它们可以带有一个或多个结晶水。
在一些实施方式中,所述其他缓冲物质包括3.0mM~3.6mM的磷酸二氢钠,还可以选择3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM。
在一些实施方式中,所述宫颈细胞样本保存液不含有苯酚。
在一些实施方式中,所述宫颈细胞样本保存液的pH用NaOH和/或KOH调节至7.0~7.2。
NaOH和/或KOH能够有效去除宫颈细胞样本中粘液。
在一些实施方式中,所述宫颈细胞样本保存液含有15mM~19mM的Cl-,还可以选择16mM、17mM、18mM。
Cl-能够平衡阳离子,并且同样可帮助提供细胞保存的渗透压微环境。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种宫颈细胞样本保存方法,包括:
将采集得到的宫颈分泌物标本用如上所述的宫颈细胞样本保存液孵育保存。
在一些实施方式中,保存的时间≥6个月,例如7个月、8个月或更久。
在一些实施方式中,用符合人体解剖学结构的小刷子采集宫颈样本。
在一些实施方式中,所述宫颈分泌物标本为宫颈脱落细胞。
在一些实施方式中,所述宫颈细胞样本包括宫颈细胞、异常的细胞、组织吸引术中获得的细胞、灌洗收集中获得的细胞或活组织检查中获得的细胞。
在一些实施方式中,所述异常的细胞包括癌细胞;进一步地,所述癌细胞为宫颈癌细胞。
本发明还涉及制备宫颈细胞制品的方法,包括:用如上所述方法保存宫颈细胞,以及;
将所述宫颈细胞与基底结合。
在一些实施方式中,所述基底选自显微镜载玻片、杯、微量滴定盘、细胞培养盘和盖玻片。
本发明还涉及含有如上所述的宫颈细胞样本保存液的试剂盒。
在一些实施方式中,所述的试剂盒为液基细胞学检测技术试剂盒。
在一些实施方式中,所述试剂盒中还含有细胞染料、细胞清洗液、基底、宫颈样本采集装置(例如木质刮板或小刷子)中的一种或多种。
在一些实施方式中,所述细胞染料为巴氏染色法所用染料。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇20%(体积百分数,下同),甲醇7%,乙二醇6%,甲醛1%,氢氧化钠0.03g(3mM),磷酸二氢钠0.1g(3.3mM),氯化钠0.25g(17.1mM),醋酸钠0.3g(14.6mM)。
实施例2
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇25%(体积百分数,下同),甲醇5%,乙二醇4%,甲醛2.5%,氢氧化钠3.2mM,磷酸氢二钠3mM,氯化钠19mM,醋酸钠13mM。
实施例3
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇15%(体积百分数,下同),甲醇10%,乙二醇8%,甲醛0.5%,氢氧化钾2.8mM,磷酸氢二钾3.6mM,氯化钠10mM,氯化钾5mM,醋酸钾17mM。
实施例4
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇18%(体积百分数,下同),甲醇8%,乙二醇5%,甲醛0.5%,氢氧化钠2.9mM,磷酸二氢钠3.3mM,氯化钠17.5mM,醋酸钠14.9mM。
实施例5
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇22%(体积百分数,下同),甲醇6%,乙二醇7%,甲醛1.5%,氢氧化钠3mM,磷酸二氢钠3.3mM,氯化钠18mM,醋酸钠15mM。
比较例1
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇20%,甲醇7%,乙二醇6%,氢氧化钠0.03g,磷酸二氢钠0.1g,氯化钠0.25g,醋酸钠0.3g。
比较例2
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇25%,甲醇10%,乙二醇8%,甲醛2%,氢氧化钠0.03g,磷酸二氢钠0.1g,氯化钠0.25g,醋酸钠0.3g。
比较例3
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇25%,乙二醇8%,甲醛2%,氢氧化钠0.03g,磷酸二氢钠0.1g,氯化钠0.25g,醋酸钠0.3g。
比较例4
一种液基细胞保存液,以250ml计,其由如下成分制得:异丙醇25%,乙二醇8%,戊二醛2%,氢氧化钠0.03g,磷酸二氢钠0.1g,氯化钠0.25g,醋酸钠0.3g。
上述实施例和比较例的制备方法为:先将固体试剂加入到纯化水中,充分搅拌溶解后,按比例将醇醛类加入溶液中。取10ml配制好的相应溶液,装入20ml保存液瓶中,备用。
用宫颈刷采集一份宫颈分泌物标本,均等分为5份,分别浸入实施例1、比较例1-4的10mL的液基细胞保存液内进行处理,固定保存4h。在制片夹中先加入3ml清洗液,再分别加入实施例1、比较例1-4方案固定4小时的标本,离心甩片,巴氏染色,镜下观察细胞保存完好,无粘液杂质。
将剩余的标本放置在室温保存6个月后,按同样的方法再进行一次制片,镜下观察细胞保存完好无杂质。
固定保存4h镜下细胞保存效果如图1所示,固定保存6个月后镜下细胞保存效果如图2所示。从结果可以看出,无论是短期固定的样本还是长期保存后固定的样本,均不具有血液、粘液等干扰成分,视野内染色清晰,染色界限清楚。
比较例1在去除甲醛后,炎症细胞的数量显著减少(即图中的小圆点),说明固定液中的甲醛会显著影响炎症细胞的保存效果;比较例2在提高醇醛类物质含量至总含量为45%后,炎症细胞的数量也发生显著减少,且表层不全角化细胞(即图中粉红色细胞)的数量也发生显著减少,可见固定液中醇醛类物质的含量过高也不利于炎症细胞及表层不全角化细胞的保存;比较例3在将甲醇替换为异丙醇和乙二醇后,表层不全角化细胞也发生明显减少,这说明针对不同细胞组分需要采用不同的固定剂的合理配合才能达到理想的固定效果;比较例4在将甲醛替换为戊二醛后,表层不全角化细胞和炎症细胞均发生明显减少,这说明针对不同细胞组分需要采用不同的固定剂的合理配合才能达到理想的固定效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.宫颈细胞样本保存液,其特征在于,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇15v/v%~25v/v%、甲醇5v/v%~10v/v%、乙二醇4v/v%~8v/v%、甲醛0.5v/v%~2.5v/v%,且所述醇醛组分的总含量≤40v/v%;
·醋酸盐13mM~17mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为33mM~43mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
2.根据权利要求1所述的宫颈细胞样本保存液,其特征在于,以工作浓度计,包括如下成分:
·醇醛组分:异丙醇18v/v%~22v/v%、甲醇6v/v%~8v/v%、乙二醇5v/v%~7v/v%、甲醛0.5v/v%~1.5v/v%;
·醋酸盐14mM~16mM;
·阳离子:主要为Na+和/或K+,且所述阳离子的总浓度为36mM~40mM;
所述宫颈细胞样本保存液的pH=7.0~7.2。
3.根据权利要求1或2所述的宫颈细胞样本保存液,其特征在于,所述宫颈细胞样本保存液还含有除醋酸盐以外的其他缓冲物质。
4.根据权利要求1或2所述的宫颈细胞样本保存液,其特征在于,所述宫颈细胞样本保存液的pH用NaOH和/或KOH调节至7.0~7.2。
5.根据权利要求1或2所述的宫颈细胞样本保存液,其特征在于,所述宫颈细胞样本保存液含有15mM~19mM的Cl-。
6.宫颈细胞样本保存方法,其特征在于,包括:
将采集得到的宫颈分泌物标本用权利要求1~5任一项所述的宫颈细胞样本保存液孵育保存。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,保存的时间≥6个月。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,用符合人体解剖学结构的小刷子采集宫颈样本。
9.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述宫颈细胞样本包括宫颈细胞、异常的细胞、组织吸引术中获得的细胞、灌洗收集中获得的细胞或活组织检查中获得的细胞。
10.制备宫颈细胞制品的方法,其特征在于,用权利要求6~9任一项所述方法保存宫颈细胞,以及;
将所述宫颈细胞与基底结合。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述基底选自显微镜载玻片、杯、微量滴定盘、细胞培养盘和盖玻片。
12.含有权利要求1~5任一项所述的宫颈细胞样本保存液的试剂盒。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,其为液基细胞学检测技术试剂盒。
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