JP3294299B2 - 細胞保存溶液 - Google Patents

細胞保存溶液

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、室温で細胞を保存する
ための溶液並びに方法に関し、更に詳しくは、分析を効
果的に行うために生細胞を迅速に固定するための溶液並
びに方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床並びに研究の分野で効果的な分析を
行うためには、細胞検体を保存することが、必要不可欠
である。診断面からいっても、検体が新しければそれだ
け価値が高いことになる。検体採取と検体のスライド等
のマトリックスへの固定との間に時間が経過すればする
ほど、分析が不正確になる。供与体のおかれている生理
学的条件から引き離された場合、細胞は、数分後には自
己分解を始める。臨床の現場では、患者から鞘細胞、筋
細胞等の検体を取り出し、これを組織学的に分析するた
めに染色する、という操作が日常的に行われる。このよ
うな組織化学的染色は、細胞生理学並びに病理学の解釈
・研究上、非常に有益であるが、多くの場合、検体採取
と染色を同時に行うことはできない。通常、患者の生検
を行った後、時間をおいてから、採取された細胞、組織
等の細胞学的あるいは組織学的分析が行われる。が、こ
の間に、細胞は次第に弱っていき、分析結果は信頼性の
おけないものとなる。細胞の採取から固定及び／あるい
は分析にいたるまでの間、細胞検体を保存する、ための
溶液として、数種類の塩溶液、塩類溶液が市販されてい
る。これには、ハンクス細胞培養用塩類溶液、最小必須
組織培養媒体(MEM)、 Polysal、 標準塩溶液等が含まれる
が、ハンクス溶液、MEM 等の媒体は高価であり、ルーチ
ンには用いられていない。カリフォルニア州エメリヴィ
ルのCutter Biologicalsが販売しているPolysalは、正
常なヒト血漿と生理学的に等濃度の塩化ナトリウム、カ
ルシウム、マグネシウムを含む、ポリイオン性電解溶液
である。この塩溶液は、比較的短時間の細胞保存には適
しているが、バクテリアの成長を阻止することができ
ず、室温での長期間に渡る保存には使用できない。ハン
クスBSS 溶液は、リンガー溶液を改良したものであり、
浸透圧を生理学的限界内に維持し、緩衝系を含むことに
より最適のpH範囲を保持し、且つ、正常な細胞代謝に適
した無機イオン濃度を与えるように、調製されている。
この溶液には、グルコースエネルギー源が含まれてい
る。しかし、この溶液で２０分以上細胞を生存させてお
くことは難しく、長時間細胞を保存した場合には、細胞
病理学的分析結果に悪影響を与える。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】臨床組織並びに細胞検
体の多くは、染色並びに分析を妨害する、生体外タンパ
ク質を含んでいる。が、検体細胞を塩類溶液の中に保存
する場合、このような副次的問題には、ほとんど考慮が
払われていない。検体を長時間保存した場合、バクテリ
アが成長する可能性が高いが、従来の標準あるいは添加
塩類溶液は、このバクテリアの成長を促進させてしま
う。本発明は、上記問題点を解決するためになされたも
のであり、細胞学的並びに組織学的分析のために細胞及
び組織を保存する、細胞定着溶液並びに方法を提供する
ことを目的とする。具体的には、本発明は、細胞を、長
期間、室温、インビトロ（生体外）で保存する、保存媒
体を提供することを目的とする。更に、本発明は、検体
溶液から不用のタンパク質を移動させ、これを除去す
る、保存媒体を提供することを目的とする。
【０００４】本発明の細胞保存溶液は、生検後、染色等
の分析までの間、室温、インビトロ（生体外）で、哺乳
類細胞及び組織を保存するための、アルコール緩衝溶液
であり、検体細胞あるいは組織を定着するために充分な
量の、水と混和可能なアルコールと、溶液内での細胞の
凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存す
る間、溶液のpHを４から７の範囲に保つ緩衝剤とを含
む、ことを主な特徴とする。本発明の保存溶液中に懸濁
させた場合、室温（約３７度）で、約三週間、細胞を保
存することができる。この細胞保存期間は、保存溶液の
新しさ（調製後細胞懸濁液作成までの溶液貯蔵期間）、
細胞採取から細胞懸濁までに経過した時間、並びに、ア
ルコール含量により左右される。調製後冷蔵庫あるいは
室温でかなり長期間貯蔵されていた溶液を用いた場合、
細胞保存能力は低下する。アルコールとしては、エタノ
ール、メタノール、イソプロパノール等を用いることが
でき、特に、メタノールが望ましい。アルコール成分
は、細胞のDNA を維持し、細胞学的染色並びに分析に適
した状態に、細胞核の細部を保持する。溶液中のアルコ
ール成分の含量は、４５ないし５５％、更に望ましくは
５０％である。溶液が６０％以上のアルコール成分を含
む場合、細胞の凝集が起こり、検体細胞を効果的に染色
することが難しくなる。逆に、アルコール含量が４０％
以下の場合、細胞を長期保存することができず、時間と
共に細胞の質が低下する。但し、長期保存用（二日以
上）ではなく、染色、分析までの間、短期に細胞を定着
・保存する目的の場合には、アルコール含量を約２０％
としてもよい。細胞を最初２０％アルコール含量の溶液
で定着させた後、５０％含量の溶液に移して、長期保存
を図ることもできる。抗凝集剤としては、エチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）あるいはその二ナトリウム塩、三カ
リウム塩、四ナトリウム塩等の、キレ−ト剤が用いら
れ、特に、EDTAの二ナトリウム塩が好ましく用いられ
る。あるいは、クミジン、ヘパリン、ストレプトキナー
ゼ、及びその他溶解あるいは抗凝集性組成を有するキレ
−ト剤を用いてもよい。本発明の溶液に用いられる緩衝
剤は、大きな緩衝能力を有し、溶液中に懸濁されている
検体細胞から自己分解副産物が生じる結果起こるpHの変
化を収容、調整できるものであればよい。例えば、古く
なった頚部細胞は、自己分解副産物を放出し、懸濁溶液
のpHを変化させる。また、細胞種毎に、保存の際要求さ
れる酸性度並びにpH範囲が異なる。従って、溶液が広い
緩衝範囲を有していれば、様々な種類の細胞種の保存に
用いることができる。本発明の溶液が対象とする細胞に
は、例えば、頚部細胞、白血球、気管枝細胞、唾液等が
含まれる。従って、緩衝剤として好ましく用いられるも
のは、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシ
ウム、あるいはその複数が組合せられた酢酸緩衝液であ
る。他にも、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ク
エン酸、クエン酸塩等を用いることもできるが、有効な
緩衝範囲は、酢酸緩衝液ほど広くはない。また、EDTAあ
るいはその塩を緩衝剤として用いることもできる。本発
明の細胞保存溶液は、例えば、４５ないし５５％（特に
望ましくは５０％）のメタノールと、２ないし４％の酢
酸（特に望ましくは氷酢酸の形で３％）と、６ないし８
％（特に望ましくは７％）の酢酸ナトリウム緩衝液とを
含む（％はすべて容量％である）。また、メタノール、
抗凝集剤としてEDTAのナトリウム及びカリウムの混合
塩、更に、緩衝剤として酢酸緩衝液を含む、構成でもよ
い。あるいは、約２０％のメタノール、１mM酢酸マグネ
シウム、２mM酢酸カルシウム、１０mM塩化カリウム、及
び、０．１％塩化ナトリウムを含む溶液を保存溶液とし
て調製してもよい。本発明の溶液は、細胞保存に用いる
ことができるばかりでなく、ある種の病原体を殺す役割
も果たす。即ち、生検後、所定期間、哺乳類細胞検体を
本発明の保存溶液中に懸濁させることにより、細胞検体
から不用のタンパク質、微生物を除去することができ
る。例えば、カンジダ・アルビカンス、クロカビ、大腸
菌、緑膿菌、あるいは、黄色ブドウ球菌等の微生物を殺
すことができる。この作用に関しては、参考例１に詳述
する。また、タンパク質除去後の検体を新しい保存溶液
中に移し、保存することもできる。本発明の細胞保存方
法は、生検後、所定期間、哺乳類細胞検体を上述の保存
溶液に懸濁させる、ことを主な特徴とする。本発明の方
法は、懸濁された細胞を、少なくとも３週間、４度から
３８度の範囲の室温で、保存することを可能にする。こ
の期間中、細胞構造は保持されており、望ましい状態で
染色される。上述の細胞保存溶液を、孔のあいたスライ
ド、あるいは、適当な膜を備えたバイアル中にいれ、そ
こに、患者等から採取した細胞検体を入れる。この場
合、細胞採取から保存溶液への収容までの時間は短けれ
ば短いほどよい（１分以内が望ましい）。この間隔が短
ければ、細胞の損傷が少なくなり、室温での長時間保存
が可能になる。上述の保存及び／あるいはタンパク質除
去後、細胞を染色し、あるいは、分析する場合には、周
知の器具を用いて、保存溶液と共に懸濁細胞を取り出
し、スライド等に移せばよい。
【０００５】
【作用】本発明の細胞保存溶液は、アルコール、抗凝固
剤、並びに、細胞の保存中溶液のpHを４から７の範囲に
保つ緩衝液を含む、アルコール緩衝溶液である。採取さ
れた哺乳類細胞を本発明のアルコール緩衝溶液に懸濁さ
せることにより、細胞の核構造を維持し、且つ、細胞膜
をそのままに保った状態で、染色等の分析が行われるま
での所定期間、細胞を室温で保存することができる。ま
た、本発明の溶液は、検体中の微生物病原体を破壊し、
レトロウィルス活性を阻害し、検体から不用のタンパク
質を除去する役割も果たす。
【０００６】
【実施例】以下、本発明の実施例を実験結果と共に説明
するが、本発明は、下記実施例に限定されるものではな
く、その精神または主要な特徴から逸脱することなく、
他のいろいろな形態で実施することができる。 （参考例１） 以下の組成を有する細胞保存溶液約２０mlと、試験対象
となる微生物の一部を、殺菌した遠心分離チューブに移
した。検体は、すべて、レシン寒天培地で培養されたも
のを用いた。 保存溶液の組成： 180mM 酢酸ナトリウム： 24g 100mM 氷酢酸 ： 6ml メタノール ：500ml 脱イオン水 ：500ml 溶液のpHを約５．８に調節した後、次のATCC微生物の生
存率を調べた。 微生物 ATCC No. カンジダ・アルビカンス 10231 クロカビ 16404 大腸菌 8739 緑膿菌 9027 黄色ブドウ球菌 6538 下記に試験結果を示す。 微生物 元々のストック数 微生物／ml ０時間 ３０分 ３時間 カンジダ・アルビカンス 2.9×107 <1000 <10 <10 クロカビ 5.6×107 3.6×105 <10 <10 大腸菌 2.35×107 2.3×105 <10 <10 緑膿菌 2.0×107 <1000 <10 <10 黄色ブドウ球菌 3.0×107 1.5×105 <10 <10 従来の細胞保存溶液の多くは、検体中に存在する微生物
を殺すどころか、むしろ増殖させ、目的細胞の分析、研
究を阻害する結果となっていた。これに対して、以上の
実験から明かなように、本発明の細胞保存溶液には、上
記のような微生物を効果的に殺す働きがある。即ち、上
述の組成を持つ本参考例の溶液は、細胞保存効果に加え
て、抗菌効果も有する。
【０００７】（参考例２） 下記の組成を有する、５０％メタノール酢酸緩衝液を、
溶液Ａとして調製した。 氷酢酸(CH3COOH) ： 3.2ml 5N 水酸化ナトリウム(NaOH) ： 7.2ml 蒸留水(H2O) ：89.6ml メタノール(MeOH) ：100 ml 更に、リン酸緩衝塩（PBS)の２０％エタノール溶液を、
対照溶液Ｂとして、また、塩（NaCl）を抜いた５０％メ
タノールリン酸緩衝液を溶液Ｃとして、調製した。リン
酸緩衝液のpHは最初7.85であり、メタノール50mlを加え
たことにより、9.02に上昇した。そこにリン酸二水素ナ
トリウム（NaH2PO4）を2.8g加え、pHを6.52 とした後、
残りのメタノール50mlを加え、pHを7.5 に調節した。頚
部細胞検体を採取し、４℃の温度条件下、ＰＢＣ内で一
晩保存した。細胞検体１３ｍｌずつを、二本の５０ｍｌ
遠心分離チューブに計り取り（検体Ａ及び検体Ｂ）、検
体１５ｍｌを５０ｍｌ遠心分離チューブに計り取った
（検体Ｃ）。３本の検体を最高速度で１０分間遠心分離
した後、上澄みを取り除く。検体Ａの残渣に溶液Ａを４
０ｍｌ、検体Ｂの残渣に溶液Ｂを４０ｍｌ、溶液Ｃの残
渣に溶液Ｃを５０ｍｌ、各々加えた。各検体について、
以下の操作を０日目に行い、その後、１週間に一度ず
つ、３週間、同様の操作を行った。検体を軽く撹拌し、
残渣を分散させた。各検体チューブから１０ｍｌずつ取
り出し、ローター・シリンダーに移した。検体を８Ｖ
（４８２ｒｐｍ／Ｖ）で１５秒間回転させた後、二枚の
スライドにそれぞれ５ｍｌずつ検体を載せ、９５％エタ
ノールで３０分間定着させた。二枚のスライドの内一枚
を、直ちに、ルーチンに用いられるパパニコロー染色法
で染色した。二枚目のスライドは、蓋をした容器内で、
定着後、乾燥させ、染色生存度の偏りを少なくするた
め、試験の最後にまとめて染色した。以上の操作によ
り、以下の定性的な観察結果が得られた。 溶液Ａ 週 状態 ４℃ ０ 特に炎症細胞において、わずかな乾燥状態がみられた。 １ 特に炎症細胞、上皮細胞において第０日より進んだ乾燥状態がみ られた。 ２ 第１週と同様。 ３ 第１週と同様。壊死組織片が観察された。 室温 ０ 乾燥状態がみられた。 １ 異常細胞が観察された。診断特性は保持されていた。 ２ 子宮頚内細胞の保存確認。第１週と同様。 ３ 第１週と同様。 ３７℃ ０ ４℃並びに室温の場合と同様、乾燥状態がみられた。 １ 異常細胞のわずかな変性が観察された。 ２ 異常構造が観察された。形態変化なし。わずかな変性。 ３ 第２週と同様。子宮頚内細胞が観察された。壊死組織 片が観察 された。 溶液Ｂ 週 状態 ４℃ ０ 多少の乾燥状態がみられた。 １ 炎症細胞において変性（けば状態）が観察された。 ２ 保存状態良好。子宮頚内細胞の保持確認。 ３ 炎症細胞の活性低下。 室温 ０ 乾燥状態がみられた。 １ ローリングが観察された。 ２ 子宮頚内細胞の保存状態良好。ＨＫ増加（大きな孔）。異常細胞が 観察された。細胞学的特性低下。 ３ 子宮頚内細胞の保存確認。上皮核の変性増加。 ３７℃ ０ 乾燥状態がみられた。 １ ローリング。炎症細胞の変性。 ２ 炎症細胞の変性。 ３ 炎症細胞の変性。異常細胞において、多少の変性。異常細胞の数減 少。 溶液Ｃ 週 状態 ４℃ ０ 炎症細胞の顕著な変性。 １ 炎症細胞の保存確認されず。異常細胞の数減少。正常 細胞、異常細 胞共、核、細胞質の保存状態低下。 ２ 第１週と同様。 ３ 顕著な変性。 以上の比較より、溶液Ａの結果が最も良好であることが
わかる。溶液Ａ中では、細胞は３週間という長期にわた
り、非常によく保存されている。異常細胞中にいくらか
の変性が見られるが、これは生物学上存在するものであ
ると、考えられる。
【０００８】（参考例３） 上記と同様の実験（参考例２）を、異型鱗状細胞（ＡＳ
Ｍ）、弱異形細胞（ＬＧ）、異型匙状細胞（ＨＰＶ）、
子宮頚内細胞（ＥＣ）等の異常細胞を含む頚部細胞検体
を対象として行った。結果を以下に示す。 溶液Ａ 週 状態 ４℃ ０ ＬＧ；ＨＰＶ；ＡＳＭ；活性ＥＣ １ ＬＧ；ＨＰＶ；シート状ＥＣ ２ ＬＧ；ＨＰＶ；ＥＣ確認 ３ ＬＧ；ＨＰＶ；シート状ＥＣ；核及び細胞質のわずかな変性 室温 ０ １ ＬＧ；少数のＨＰＶ；少数の匙状細胞；活性ＥＣ ２ ＬＧ；ＨＰＶ；活性ＥＣ ３ ＬＧ；ＨＰＶ（異形性の特徴）；シート状ＥＣ；カンジダ菌確認 ３７℃ ０ １ ＬＧ；ＨＰＶ（異形性の特徴）；シート状ＥＣ；核にヒダが生じる ２ 少数のＬＧ；少数のＨＰＶ；ＥＣ確認 ３ ＬＧ；ＨＰＶ；ＥＣ確認 非常に良好な状態が、試験期間中を通して、維持され
た。何れの温度においても、異常な細胞学的特性が３週
間以上保持された。即ち、これらの結果からも、溶液Ａ
が細胞検体の採取及び移送に適していることがわかる。
【０００９】実施例４ 細胞保存溶液を以下のような組成で調製する。 脱イオン水 N/2 liter Na2EDTA・2H2O N×1.116g 氷酢酸 N×0.35ml メタノール (45-55%) ここで、Ｎは、最終的な溶液の量を示す。メタノールが
上記の所望のパーセント範囲になるように、メタノール
を加え、全量をＮにする。
【００１０】（参考例５） 細胞保存溶液を以下のような組成で調製する。 1mM 酢酸マグネシウム 2mM 酢酸カルシウム 10mM 塩化カリウム 0.1% 塩化ナトリウム 20% メタノール 本参考例の溶液組成中、カルシウム及びマグネシウムイ
オンは、細胞学的に重要な細胞の核形態を保存する役割
を果たす。酢酸は、緩衝剤として作用し、溶液のpHを安
定させると共に、カルシウム及びマグネシウムの析出を
防ぐ。一方、リン酸緩衝液を用いた場合には、カルシウ
ム、マグネシウムの析出が起こる。また、ナトリウム及
びカリウム塩は、細胞を安定化させ、ヘモグロビン等の
血清タンパク質の沈澱並びに凝集を防ぐ。更に、メタノ
ールは、赤血球の分解を助け、バクテリアの成長を阻害
し、細胞学的に重要な細胞を保持する。
【００１１】
【発明の効果】以上詳述したように、採取された細胞を
本発明のアルコール緩衝溶液に懸濁させることにより、
細胞の核構造を維持し、且つ、細胞膜をそのままに保っ
た状態で、染色等の分析が行われるまでの所定期間、細
胞を室温で保存することができる。また、本発明の溶液
は、検体中の微生物病原体を破壊し、レトロウィルス活
性を阻害し、検体から不用のタンパク質を除去する役割
も果たす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター エス． オード オランダ ベネブルーク 2121 シーエ イチ ラジェドビン 56 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 C12Q 1/02 G01N 1/28 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択した期間、哺乳類細胞を室温、イン
    ビトロ（生体外）で保存するための、アルコール緩衝水
    溶液であり、 哺乳類細胞を定着するために充分な量の水と混和可能な
    アルコールと、 前記細胞の前記水溶液中での凝集を防ぐために充分な量
    のキレート剤と、 一定期間、前記細胞を含む前記溶液のｐＨを４から７の
    範囲に保つ緩衝剤と、を含むことを特徴とする、溶液。
  2. 【請求項２】 前記アルコールが、エタノールと、イソ
    プロパノールと、メタノールとからなる群から選択され
    ることを特徴とする請求項１に記載の溶液。
  3. 【請求項３】 前記アルコールがメタノールであること
    を特徴とする請求項１に記載の溶液。
  4. 【請求項４】 前記キレート剤が、エチレンジアミン四
    酢酸（ＥＤＴＡ）とその塩類とからなる群から選択され
    ることを特徴とする請求項１に記載の溶液。
  5. 【請求項５】 前記キレート剤がエチレンジアミン四酢
    酸であることを特徴とする請求項１に記載の溶液。
  6. 【請求項６】 前記アルコールが、前記溶液の４５％乃
    至５５％を構成することを特徴とする請求項１に記載の
    溶液。
  7. 【請求項７】 前記アルコールが、前記溶液の５０％を
    構成することを特徴とする請求項１に記載の溶液。
  8. 【請求項８】 前記緩衝剤が、ＰＢＳと、トリス緩衝剤
    と、酢酸ナトリウムと、ＥＤＴＡとその塩類と、クエン
    酸とその塩類とからなる群から選択されることを特徴と
    する請求項１に記載の溶液。
  9. 【請求項９】 前記緩衝剤が酢酸ナトリウムであること
    を特徴とする請求項１に記載の溶液。
  10. 【請求項１０】 前記アルコールが、前記溶液の２０％
    を構成することを特徴とする請求項１に記載の溶液。
  11. 【請求項１１】 前記キレート剤がナトリウム塩とカリ
    ウム塩とからなる群から選択されるＥＤＴＡの塩である
    ことを特徴とする請求項１に記載の細胞溶液保存剤。
  12. 【請求項１２】 哺乳類組織細胞を、長期間、室温、イ
    ンビトロ（生体外）で保存するための方法であり、 ヒトの組織細胞の試料を提供する工程と、 前記の試料を提供する段階から一定期間後に、前記細胞
    を保存溶液に懸濁させる工程とを包含し、 前記保存溶液が、 前記細胞を定着させるために充分な量の水と混和可能な
    アルコールと、 前記細胞の凝集を防ぐために充分な量のキレート剤と、 前記細胞を含む前記溶液のｐＨを４から７の範囲に保つ
    緩衝剤と、を含むことを特徴とする細胞保存方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞懸濁を４乃至３８℃の範囲の
    温度に保つ工程を更に包含する、請求項１２に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 試料細胞中の、カンジダ・アルビカン
    ス、クロカビ、大腸菌、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌か
    らなる群から選択された病原菌を破壊する抗菌性溶液で
    あり、前記抗菌性溶液が一定期間は有効性であり、且
    つ、 前記細胞を凝集させずに定着するために充分な量の水と
    混和可能なアルコールと、 前記溶液内での細胞の凝集を防ぐために充分な量のキレ
    ート剤と、 前記の一定期間、前記試料細胞を含む溶液のｐＨを４か
    ら７の範囲に保つ緩衝剤と、 を含むことを特徴とする抗菌性溶液。
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