KR102021680B1 - 세포 보존액 및 그 이용, 및 세포 보존액의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 보존액에 관한 것이다. 또, 본 발명은 세포 보존액을 이용하는 세포의 보존 방법, 고정 세포의 조제 방법 및 세포의 분석 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포 보존액의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

세포 보존액 및 그 이용, 및 세포 보존액의 제조 방법
본 발명은 세포 보존액에 관한 것이다. 또, 본 발명은 세포 보존액을 이용하는 세포의 보존 방법, 고정 세포의 조제 방법 및 세포의 분석 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포 보존액의 제조 방법에 관한 것이다.
세포를 분석하는 경우, 분석에 제공하기 전에 세포를 보존해 두는 것이 실시된다. 예를 들면, 생체로부터 채취된 세포를 분석하는 경우 생체로부터의 분리 후, 세포는 자기 분해를 시작하므로, 세포의 채취로부터 분석까지의 사이, 세포를 적절히 보존해 둘 필요가 있다.
특허문헌 1에는 분석 전에 세포를 세포 보존액에 보존해 두는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 1의 실시예 5에는 세포 보존액이, 1 mM 아세트산 마그네슘, 2 mM 아세트산 칼슘, 10 mM 염화칼륨, 0.1% 염화나트륨 및 20% 메탄올을 포함하는 것이 개시되어 있다.
미국 특허 제5,256,571호 명세서
본 발명자들은 종래의 세포 보존액으로 세포를 소정의 기간 보존하면, 상기 세포에 포함되는 핵산이 불안정하게 되어 분해되는 경우가 있는 것을 알아냈다. 따라서, 세포를 소정의 기간, 인 비트로에서 보다 안정하게 보존 가능한 세포 보존액의 개발이 요망된다.
본 발명은 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 수성 용매 중에 포함하고, 상기 2가 금속 이온의 농도가 약 6mmol/L 이상 약 82mmol/L 이하인 세포 보존액을 제공한다.
본 발명은 상기의 세포 보존액에, 인 비트로에서 세포를 침지시키는 것을 포함하는 세포의 보존 방법을 제공한다.
본 발명은 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 수성 용매 중에 혼합하는 것을 포함하는 세포 보존액의 제조 방법으로서, 세포 보존액에서의 2가 금속 이온의 농도가 약 6mmol/L 이상 약 82mmol/L 이하인 세포 보존액의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 세포와 상기의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써 세포를 고정하는 것을 포함하는 고정 세포의 조제 방법을 제공한다.
본 발명은 세포와, 상기의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써 세포를 고정하는 공정과, 이 공정에서 얻어진 고정 세포에 포함되는 핵산을 분석하는 공정을 포함하는 세포의 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 분석의 대상이 되는 세포를 분석에 제공할 때까지의 소정의 기간, 인 비트로에서 안정하게 보존하는 것을 가능하게 한다.
도 1은 본 실시 형태의 세포 보존액 또는 시판의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포로부터 추출한 DNA를, 아가로스 겔 전기 영동했을 때의 사진이다.
도 2a는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를 시판의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존하고, 상기 세포의 DNA에 포함되는 인간 파필로마 바이러스(HPV) 유래의 핵산을 하이브리드 캡쳐(HC) 법으로 검출했을 때의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 2b는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를 시판의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존하고, 상기 세포의 DNA에 포함되는 HPV 유래의 핵산을 HC법으로 검출했을 때의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를 본 실시 형태의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존하고, 상기 세포의 DNA에 포함되는 HPV 유래의 핵산을 HC법으로 검출했을 때의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를 본 실시 형태의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존하고, 상기 세포의 DNA에 포함되는 HPV 유래의 핵산을 HC법으로 검출했을 때의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 4는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를 본 실시 형태의 세포 보존액 또는 시판의 세포 보존액 중에 실온에서 2일간 보존한 후, 파파니콜로 염색했을 때의 사진이다.
도 5는 여러 가지 마그네슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 6은 본 실시 형태의 세포 보존액 중에 25℃에서 4시간 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램에서의, 2배체 세포 출현 영역을 나타내는 도이다.
도 7a는 여러 가지 마그네슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 25℃에서 4시간 또는 30℃에서 24시간 보존한 HeLa 세포에 대해서, 2배체 세포 출현 영역에서의 형광 면적의 변동 계수(CV)의 값을 나타내는 그래프이다.
도 7b는 여러 가지 마그네슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 30℃에서 24시간 보존한 HeLa 세포에 대해서, 2배체 세포 출현 영역에서의 형광 면적의 CV의 값을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 여러 가지 메탄올 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 8b는 여러 가지 메탄올 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 8c는 여러 가지 메탄올 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 9는 pH 6.4 또는 7.0의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 10은 여러 가지 칼슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 11은 시판의 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 12는 용기에 수용된 세포 보존액의 일례를 나타낸 개략도이다.
도 13은 여러 가지 칼슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 14는 마그네슘 이온 및 칼슘 이온을 포함하는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 15는 에탄올을 포함하는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 16은 실시예 1의 세포 보존액 또는 미국 특허 제5,256,571호 명세서에 개시된 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HeLa 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
도 17은 여러 가지 마그네슘 이온 농도를 가지는 세포 보존액 중에 소정의 조건 하에서 보존한 HUVEC 세포를 플로우 사이토 미터로 분석하여 얻은 형광 면적의 히스토그램이다.
[1. 세포 보존액]
본 실시 형태의 세포 보존액은 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 수성 용매 중에 포함하고, 상기 2가 금속 이온의 농도가 약 6mmol/L 이상 약 82mmol/L 이하인 것을 특징으로 한다.
탄소수 1~6의 저급 알코올(이하, 간단하게 「저급 알코올」이라고도 함)은 상온(25℃)에서 물과 임의의 비율로 혼화 가능하면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, n-아밀알코올, 이소아밀알코올, sec-아밀알코올, tert-아밀알코올, 1-에틸-1-프로판올, 2-메틸-1-부탄올, n-헥산올, 시클로헥산올 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 세포의 보존 및 고정에 관여하는 작용(탈수 작용 및 단백질의 응고 작용)의 관점에서, 메탄올 또는 에탄올이 바람직하고, 메탄올이 특히 바람직하다.
본 실시 형태에서, 저급 알코올은 1종만 이용해도 되고, 2종 이상 이용해도 된다. 2종 이상의 알코올은 임의의 비율로 혼합할 수 있다. 예를 들면, 메탄올과 에탄올을 임의의 비율로 혼합한 혼합 알코올을, 세포 보존액에 이용할 수 있다.
세포 보존액에서의 저급 알코올의 농도는 세포의 보존 기간, 세포의 분석 방법 등에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 농도가 너무 낮은 경우(예를 들면 약 20 체적% 보다 낮은 농도의 경우) 세포의 안정 보존이 어려워지고, 농도가 너무 높은 경우(예를 들면 약 60 체적% 보다 높은 농도의 경우) 세포가 과도하게 고정될 우려가 있다. 본 실시 형태에서는 저급 알코올의 농도는 통상 약 20 체적% 이상 약 60 체적% 이하이며, 바람직하게는 약 30 체적% 이상 약 50 체적% 이하이며, 특히 바람직하게는 약 40 체적% 이상 약 45 체적% 이하이다. 추가적인 실시 형태에서는 저급 알코올의 농도는 20 체적% 이상 60 체적% 이하이며, 바람직하게는 30 체적% 이상 50 체적% 이하이며, 특히 바람직하게는 40 체적% 이상 45 체적% 이하이다. 이러한 농도로 저급 알코올을 포함함으로써, 세포를 안정하게 보존하는 것이 가능해진다. 또, 정균 작용 또는 살균 작용도 기대할 수 있다. 또한 본 명세서에서는 「체적%」를 「v/v%」또는 「vol%」라고도 나타낸다.
2가 금속 이온은 세포의 형태 및 구성 성분의 유지에 영향을 미치지 않는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 세포의 배양 배지에도 첨가되는 금속 이온으로부터 선택해도 된다. 본 실시 형태에서는 2가 금속 이온으로서는, 예를 들면 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 아연 이온, 철(II) 이온, 구리 이온, 스트론튬 이온, 몰리브덴 이온 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 제2족 원소의 금속 이온이 바람직하다. 제2족 원소의 금속 이온으로서는 마그네슘 이온 및 칼슘 이온이 특히 바람직하다. 본 실시 형태에서, 2가 금속 이온은 1종만 이용해도 되고, 2종 이상 이용해도 된다.
본 실시 형태에서는 세포 보존액에서의 2가 금속 이온은 수성 용매에 가용인 2가 금속 화합물로부터 공급되는 것이 바람직하다. 이들 화합물로서는, 예를 들면 2가 금속의 무기산염 또는 유기산염을 들 수 있다. 2가 금속의 무기산염으로서는, 예를 들면 염산, 황산, 질산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등의 무기산과, 2가 금속의 염을 들 수 있다. 2가 금속의 유기산염으로서는, 예를 들면 아세트산, 구연산, 아스코르브산, 옥살산 등의 유기산과, 2가 금속의 염을 들 수 있다. 이들 중에서도 2가 금속의 무기산염이 바람직하고, 예를 들면 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼슘 등을 들 수 있다. 본 실시 형태에서는 2가 금속 화합물은 무수물이어도 되고, 수화물이어도 된다.
2가 금속 이온의 농도에 관해서, 본 발명자들은 저급 알코올을 주성분으로 하는 세포 보존액에서, 2가 금속 이온의 농도를 약 6mmol/L 이상 약 82mmol/L 이하로 함으로써, 세포 및 상기 세포에 포함되는 핵산을 소정의 기간, 인 비트로에서 안정하게 보존할 수 있는 것을 알아냈다. 본 실시 형태에서는 2가 금속 이온의 농도는 바람직하게는 약 6mmol/L 이상 약 80mmol/L 이하이며, 보다 바람직하게는 약 10mmol/L 이상 약 60mmol/L 이하이다. 추가적인 실시 형태에서는 2가 금속 이온의 농도는 6mmol/L 이상 82mmol/L 이하이며, 바람직하게는 6mmol/L 이상 80mmol/L 이하이며, 보다 바람직하게는 10mmol/L 이상 60mmol/L 이하이다. 또한 본 명세서에서는 「mmol/L」를 「mM」라고도 나타낸다. 본 실시 형태에서는 상기의 수성 용매에 가용인 2가 금속의 화합물, 특히 2가 금속의 무기산염을 세포 보존액에 용해시키고 있는 경우, 상기 세포 보존액에서의 2가 금속 이온의 농도는 당해 화합물의 농도로 나타내도 된다.
수성 용매는 상온(25℃)에서 저급 알코올과 임의의 비율로 혼화 가능하고, 세포의 형태 및 구성 성분의 유지에 영향을 미치지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 이들, 수성 용매로서는, 예를 들면 물, 생리 식염수, 완충액, 알부민 용액, 덱스트란 용액, 정상 인간 또는 포유동물 혈청 용액, 및 이들 조합을 들 수 있다.
수성 용매로서는 완충액을 이용하는 것이 바람직하다. 완충액으로서는 pH 6 이상 8 이하에서 완충 작용을 가지는 완충액이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 굿스 완충액, 인산 완충액(PBS), 이미다졸 완충액, 트리에탄올아민 염산염 완충액(TEA) 등을 들 수 있다. 굿스 완충액으로서는, 예를 들면 PIPES, MES, Bis-Tris, ADA, Bis-Tris-Propane, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, HEPPS, Tricine, Tris, Bicine, TAPS 등의 완충제의 수용액을 들 수 있다. 완충액 이외의 수성 용매를 이용하는 경우에는 세포 보존액에, 상기의 완충액에 이용되는 완충제를 첨가해도 된다.
본 실시 형태에서, 세포 보존액의 pH는 세포의 보존에 적절한 범위이면 되고, 통상 약 6 이상 약 8 이하이며, 바람직하게는 약 6.4 이상 약 7 이하이다. 추가적인 실시 형태에서는 세포 보존액의 pH는 6 이상 8 이하이며, 바람직하게는 6.4 이상 7 이하이다. 세포 보존액의 침투압은 세포의 보존을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 생리적으로 등장이어도 된다.
본 실시 형태의 세포 보존액은 필요에 따라 저급 알코올 및 2가 금속 이온 외에, 첨가제를 수성 용매 중에 포함하고 있어도 된다. 이들 첨가제로서는 세포의 고정, 세포의 보존 및 세포의 분석을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 무기 염류(염화나트륨, 염화칼륨 등), 당류(글루코스, 트레할로스 등), 방부제(아지화나트륨, 페닐메탄술포닐플루오라이드 등), 단백질 안정화제(소혈청 알부민 등), 소포제(에틸렌글리콜 등), 항생 물질(페니실린, 스트렙토마이신 등), 항진균제(암포테리신 B 등)라고 하는 공지의 물질을 들 수 있다.
본 실시 형태의 세포 보존액에 의해 보존되는 세포는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 다세포 생물의 세포, 단세포 생물의 세포, 배양 세포주 등일 수 있다. 다세포 생물의 세포로서는 생체로부터 채취된 세포여도 되고, 사체로부터 채취된 세포여도 된다. 다세포 생물의 세포로서는, 예를 들면 인간 등의 포유동물로부터 채취한 세포를 들 수 있다. 구체적으로는 자궁 경부 세포, 자궁 체부 세포, 구강 세포, 유선 세포, 갑상선 세포, 소변 중 세포, 객담 중 세포, 기관지 찰과 세포, 복강 세정액 중 세포, 체강액 중 세포 등이 예시된다. 또, 세포는 인간 등의 포유동물로부터 채취한 조직에 포함되는 세포여도 된다. 채취된 조직은 정상 조직이어도 되고, 병변 부위를 포함하는 조직이어도 된다. 채취된 조직에 포함되는 세포로서는, 예를 들면 초대 배양 세포, 제대에 포함되는 제대 정맥 내피 세포, 수술이나 생검에 의해 채취한 종양 조직에 포함되는 종양 세포 등을 들 수 있다. 세포는 트리코모나스 등의 원충이나 칸디다 등의 진균류여도 된다. 세포는 간세포나 iPS 세포 등 인 비트로에서 인공적으로 조제한 세포여도 된다. 세포의 성질은 특별히 한정되지 않고, 정상 세포, 불사화 세포, 암세포 등이어도 된다.
도 12에 본 실시 형태의 세포 보존액의 외관의 일례를 나타낸다. 도면 중, 11은 세포 보존액을 수용한 용기를 나타낸다. 본 실시 형태의 세포 보존액을 수용한 용기는 상자에 수용되어 사용자에게 제공되어도 된다. 이 상자에는 세포 보존액의 사용 방법 등을 기재한 첨부 문서가 동봉되어 있어도 된다. 또, 자궁 경부 세포의 보존을 위해서 본 실시 형태의 세포 보존액이 제공되는 경우에는 자궁 경부로부터 세포를 채취하기 위한 세포 채취 도구(예를 들면, 면봉, 브러쉬 등)가 동봉되어 있어도 된다.
[2. 세포 보존액의 제조 방법]
본 실시 형태의 세포 보존액의 제조 방법(이하, 간단하게 「제조 방법」이라고도 함)으로 대해서, 이하에 설명한다. 본 실시 형태의 제조 방법은 상기의 세포 보존액의 제조 방법으로서, 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 상기 2가 금속 이온의 농도가 약 6mmol/L 이상 약 82mmol/L 이하가 되도록 수성 용매 중에 혼합하는 것을 포함한다. 또한 탄소수 1~6의 저급 알코올 및 2가 금속 이온의 농도나 종류 등은 세포 보존액에 대해 서술한 것과 같다.
본 실시 형태에서는 2가 금속 이온으로서 수성 용매에 가용인 2가 금속 화합물(이하, 간단하게 「금속 화합물」이라고도 함)을 이용하는 것이 바람직하다. 또한 이 화합물은 세포 보존액에 대해 서술한 것과 같다. 본 실시 형태의 제조 방법에 이용되는 금속 화합물은 용액의 형태로 있어도 되고, 고체(분말 또는 결정 등)의 형상으로 있어도 된다.
본 실시 형태의 제조 방법에 이용되는 저급 알코올은 무수 알코올이어도 되고, 상기의 농도로 조정할 수 있는 한, 함수 알코올이어도 된다.
본 실시 형태에서, 저급 알코올과, 2가 금속 이온으로서의 금속 화합물을 수성 용매에 첨가하는 순서는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 저급 알코올과 수성 용매를 혼화하고 나서, 금속 화합물을 혼합하여도 되고, 금속 화합물과 수성 용매와 혼합하고 나서, 저급 알코올을 첨가해도 된다. 또, 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 실질적으로 동시에 수성 용매에 혼합하여도 된다. 혼합 조건은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상온·상압(예를 들면 25℃, 1 기압) 하에서 혼합을 실시하면 된다.
본 실시 형태에서는 상기와 같이 하여 얻어진 혼합액의 pH를, 수산화 나트륨 등의 알칼리 또는 염산 등의 산을 이용하여, 약 6 이상 약 8 이하, 특히 약 6.4 이상 약 7 이하로 조정하는 것이 바람직하다. 추가적인 실시 형태에서는 상기 혼합액의 pH를, 6 이상 8 이하, 특히 6.4 이상 7 이하로 조정하는 것이 바람직하다.
본 실시 형태에서는 필요에 따라 저급 알코올 및 2가 금속 이온 외에, 첨가제를 혼합하여도 된다. 또한 첨가제는 세포 보존액에 대해 서술한 것과 같다.
[3. 세포 보존액을 이용하는 세포의 보존 방법]
본 실시 형태의 세포의 보존 방법(이하, 간단하게 「보존 방법」이라고도 함)으로 대해서, 이하에 설명한다. 본 실시 형태의 보존 방법은 상기의 본 실시 형태의 세포 보존액에, 세포를 인 비트로에서 침지시키는 것을 포함한다.
본 실시 형태의 보존 방법에 이용되는 세포는 상기와 같다.
본 실시 형태에서는 세포를, 충분한 양(예를 들면, 세포의 체적의 100~1000 배량)의 세포 보존액에 인 비트로에서 침지함으로써, 세포를 고정한다. 그 후, 세포를 소정의 기간 보존할 수 있다. 필요에 따라 세포를 세포 보존액에 침지한 후, 상기 세포를 손상하지 않는 정도로 교반하여 현탁시켜도 된다. 세포 보존액에 침지하기 전에, PBS 등으로 세포를 세정해도 된다. 세포를 생체로부터 채취한 경우에는 세포는 곧바로 자기 분해를 시작해 세포나 핵 구조의 변형, 핵산이나 단백질 등의 세포 내용물의 분해·변성이 생기므로, 채취 후 늦어도 1분 이내에 세포 보존액에 침지하는 것이 바람직하다. 보존 용기는 덮개 또는 씰 등에 의해 밀폐 가능한 용기이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 바이알, 시험관, 마이크로 튜브, 마이크로 플레이트, 디쉬, 보틀 등을 들 수 있다.
세포를 세포 보존액에 침지할 때의 온도(세포를 세포 보존액에 접촉시킬 때의 온도)는 바람직하게는 35℃ 이하, 보다 바람직하게는 32℃ 이하, 추가로 바람직하게는 30℃ 이하이다. 세포를 세포 보존액에 침지할 때의 온도의 하한은 세포 보존액이나 세포의 동결 등에 의해 뒤의 분석 등에 악영향을 미치지 않으면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 온도의 하한은 1℃ 이상 또는 2℃ 이상이어도 된다. 본 실시 형태의 보존 방법은 상기의 온도에서 세포를 세포 보존액에 접촉시킴으로써, 세포를 고정하는 공정을 포함하고 있어도 된다.
세포의 보존 온도는 바람직하게는 35℃ 이하, 보다 바람직하게는 32℃ 이하, 추가로 바람직하게는 30℃ 이하이다. 본 실시 형태의 세포 보존액으로 세포를 보존하면, 냉장 보존뿐만 아니라 실온 보존이어도, 세포의 핵산을 안정하게 유지할 수 있다. 보존 온도의 하한은 세포 보존액이나 세포의 동결 등에 의해 뒤의 분석 등에 악영향을 미치지 않으면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 보존 온도의 하한은 1℃ 이상 또 2℃ 이상이어도 된다. 본 실시 형태의 보존 방법은 상기의 온도로 세포를 세포 보존액 중에 소정의 기간 보존하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 또한 세포와 세포 보존액의 접촉시의 온도와, 세포의 보존 온도와는 동일해도 되고, 상이해도 된다.
보존 기간 중에, 세포 보존액을 바꾸어도 된다. 바꾸는 빈도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 90일에 한 번 바꾸어도 된다.
[4. 세포 보존액을 이용하는 고정 세포의 조제 방법]
본 실시 형태의 고정 세포의 조제 방법(이하, 간단하게 「조제 방법」이라고도 함)으로 대해서, 이하에 설명한다. 본 실시 형태의 조제 방법은 세포와, 상기의 본 실시 형태의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써, 상기 세포를 고정하는 것을 포함한다. 또한 본 실시 형태의 조제 방법에 이용되는 세포는 본 실시 형태의 세포의 보존 방법에서 서술한 것과 같다.
본 실시 형태에서는 세포를, 충분한 양(예를 들면, 세포의 체적의 100~1000 배량)의 세포 보존액에 침지시킴으로써, 상기 세포와 세포 보존액을 접촉시켜도 된다. 혹은 세포를 빈 용기에 넣은 후, 여기에 충분한 양의 세포 보존액을 첨가하고, 상기 세포와 세포 보존액을 접촉시켜도 된다. 세포 보존액과 접촉시키기 전에, PBS 등으로 세포를 세정해도 된다. 세포는 곧바로 자기 분해를 시작해 세포나 핵 구조의 변형, 핵산이나 단백질 등의 세포 내용물의 분해·변성이 생기므로, 채취 후 늦어도 1분 이내에 세포 보존액과 접촉시키는 것이 바람직하다. 접촉에 이용하는 용기는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 바이알, 시험관, 마이크로 튜브, 마이크로 플레이트, 디쉬, 보틀 등을 들 수 있다. 필요에 따라 덮개 또는 씰 등에 의해 용기를 밀폐해도 된다.
본 실시 형태의 조제 방법에서는 세포 보존액과 접촉시킨 세포는 상기 세포 보존액에 포함되는 저급 알코올의 작용(탈수 작용 및 단백질의 응고 작용)에 의해 고정된다. 본 실시 형태에서, 세포가 충분히 고정된다면, 세포와 세포 보존액의 접촉 시간은 특별히 한정되지 않는다. 접촉시의 온도 조건은 상기의 본 실시 형태의 보존 방법에서 서술한 조건과 같다.
본 실시 형태에서는 얻어진 고정 세포를 그대로 또는 PBS 등으로 세정하고, 원하는 분석의 검체로서 이용할 수 있다. 혹은 분석에 제공할 때까지, 세포를 세포 보존액과 접촉시킨 상태로 보존해도 된다. 세포의 보존 조건에 대해서는 본 실시 형태의 보존 방법에 대해 서술한 것과 같다.
[5. 세포 보존액을 이용하는 세포의 분석 방법]
본 실시 형태의 세포의 분석 방법(이하, 간단하게 「분석 방법」이라고도 함)으로 대해서, 이하에 설명한다. 본 실시 형태의 분석 방법에서는 우선 세포와, 상기의 본 실시 형태의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써, 상기 세포를 고정한다. 세포, 세포 보존액 및 세포의 고정에 대해서는 지금까지 서술한 것과 같다.
그 다음에, 얻어진 고정 세포에 포함되는 핵산의 분석을 실시한다. 본 실시 형태에서는 핵산 분석에서 핵산의 양을 나타내는 정보를 취득하는 것이 바람직하다. 핵산의 양을 나타내는 정보의 형식은 특별히 한정되지 않고, 상기 정보를 취득하는 방법에 따라 적절히 결정할 수 있다. 핵산의 양을 나타내는 정보로서는, 예를 들면 측정값 등의 수치 정보여도 되고, 상기 수치 정보에 근거하여 취득되는 그래프 등의 도표여도 되며, 염색상이나 겔 전기영동의 사진 등의 화상 정보여도 된다.
고정 세포에 포함되는 핵산은 세포가 본래 가지고 있는 핵산이어도 되고, 유전자 도입 또는 바이러스 감염 등에 의해 외부로부터 도입된 핵산이어도 된다. 또, 핵산의 종류는 DNA 및 RNA의 어느 하나여도 된다. 본 실시 형태에서는 고정 세포에 포함되는 핵산은 상기 고정 세포로부터 추출한 핵산으로부터 합성되는 cDNA 또는 cRNA여도 된다.
본 실시 형태에서는 고정 세포에 포함되는 핵산을 분석하는 방법은 당해 기술에서 공지된 방법으로부터 선택할 수 있다. 이들 방법으로서는, 예를 들면 현미경 관찰, 플로우 사이토메트리, 핵산 증폭법(예를 들면 PCR법, RT-PCR법, 리얼타임 PCR법 등), 하이브리다이제이션법(예를 들면, 서던 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법 등), 마이크로 어레이법, 하이브리드 캡쳐(HC) 법(ClavelC.등, J.Clin.Pathol, vol.51, p.737-740 (1998) 참조) 등을 들 수 있다(Clavel C.등, J.Clin.Pathol, vol.51, p.737-740 (1998)는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다).
본 실시 형태에서는 고정 세포로부터 측정 시료를 조제하고, 이것을 분석하는 것이 바람직하다. 측정 시료는 고정 세포를 파쇄하여 조제해도 되고, 고정 세포를 파쇄하지 않고 조제해도 된다. 고정 세포를 파쇄하는 조제 수단으로서는, 예를 들면 고정 세포로부터 핵산을 추출하는 것을 들 수 있다. 고정 세포를 파쇄하지 않는 조제 수단으로서는, 예를 들면 고정 세포의 형태를 유지한 상태로 핵산을 염색하는 것을 들 수 있다.
세포로부터의 핵산의 추출 방법 자체는 당해 기술에서 공지이다. DNA를 추출하는 경우에는, 예를 들면 고정 세포와, 계면활성제(예를 들면 콜산나트륨, 도데실황산나트륨 등)를 포함하는 가용화액을 혼합한다. RNA를 추출하는 경우에는, 예를 들면 고정 세포와, 티오시안산구아니딘 및 계면활성제를 포함하는 가용화액을 혼합한다. 그리고, 얻어진 혼합액에 물리적 처리(교반, 호모게나이즈, 초음파 파쇄 등)를 실시하여, 생체 시료에 포함되는 핵산을 상기 혼합액 중에 유리시킴으로써, 핵산을 추출할 수 있다. 이 경우, 혼합액을 원심분리해 세포 파편을 침전시켜, 유리한 핵산을 포함하는 상청을 분석에 이용하는 것이 바람직하다. 또, 얻어진 상청을 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 정제해도 된다. 세포로부터의 핵산의 추출 및 정제는 시판의 키트를 이용해 실시할 수도 있다.
세포의 형태를 유지한 상태로 핵산을 염색하는 방법 자체는 당해 기술에서 공지이다. 예를 들면, 우선 고정 세포와, 계면활성제(예를 들면 노니뎃(등록 상표) P-40, Triton(등록 상표) X-100 등)를 포함하는 처리액을 접촉시킴으로써, 세포막에 핵산 염색용 색소를 통과할 수 있는 정도의 손상을 준다. 그리고, 처리 후의 고정 세포와 상기 색소의 용액을 접촉시킴으로써, 상기 고정 세포의 형태를 유지한 상태로 핵산을 염색할 수 있다.
핵산을 염색하기 위한 색소는 핵산의 분석 방법에 따라 공지의 핵산 염색용 색소로부터 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 정보의 취득에 광학 현미경을 이용하는 경우에는 핵산 염색용 색소로서 헤마톡실린, 피로닌 Y(피로닌 G), 메틸 그린 등을 들 수 있다. 또, 정보의 취득에 형광 현미경, 플로우 사이토 미터 등을 이용하는 경우에는 핵산 염색용 색소로서 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 형광 색소로서는, 예를 들면 프로피듐아이오다이드, 에티듐브로마이드, 에티듐아크리딘헤테로다이머, 에티듐디아지드, 에티듐호모다이머-1, 에티듐호모다이머-2, 에티듐모노아지드, Hoechst33342, Hoechst33258, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌·디히드로클로라이드(DAPI), 트리메틸렌비스[[3-[[4-[[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]메틸렌]-1,4-디히드로퀴놀린]-1-일]프로필]디메틸아미니움]·테트라요오드(TOTO-1), 4-[(3-메틸벤조티아졸-2(3H)-일리덴)메틸]-1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]퀴놀리늄·디요오드(TO-PRO-1), N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스[3-[4-[3-[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]-2-프로페닐리덴]-1,4-디히드로퀴놀린-1-일]프로필]-1,3-프로판디아미니움·테트라요오드(TOTO-3), 2-[3-[[1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]-1,4-디히드로퀴놀린]-4-일리덴]-1-프로페닐]-3-메틸벤조티아졸-3-이움·디요오드(TO-PRO-3) 등을 들 수 있다.
고정 세포로부터 추출한 핵산을 포함하는 측정 시료는 고정 세포에 포함되는 소정의 핵산을 검출하는 분석 방법(핵산 증폭법, 하이브리다이제이션법, 마이크로 어레이법, HC법 등)에 적합하다. 세포의 형태를 유지한 상태로 핵산 염색된 고정 세포를 포함하는 측정 시료는 개개의 세포에 포함되는 핵산의 정보를 취득하는 분석 방법(현미경 관찰, 플로우 사이토메트리 등)에 적합하다. 본 실시 형태에서는 분석의 목적에 따라 고정 세포로부터 적절한 측정 시료를 조제하고 분석을 실시하면 된다.
플로우 사이토메트리로 고정 세포에 포함되는 핵산을 분석하는 경우, 세포의 고정 공정과 상기 정보의 취득 공정의 사이에, 고정 세포에 포함되는 핵산을 염색하는 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 고정 세포에 포함되는 핵산의 염색에 대해서는 상술한 바와 같다. 염색된 고정 세포에 포함되는 핵산의 분석에는 현미경, 플로우 사이토메트리 등이 적합하게 이용된다. 핵산 염색용 색소에 의한 세포의 염색 강도는 주로 세포 내의 핵산의 양에 의존한다. 또한 크로마틴의 구조 등도 염색 강도(물들기 쉬움)에 관여하지만, 염색 강도는 핵산의 양에 가장 의존한다고 생각된다. 따라서, 현미경, 플로우 사이토메트리 등에 의해 세포의 염색 강도를 측정함으로써, 핵산의 양을 나타내는 정보를 취득할 수 있다. 구체적으로는 플로우 사이토메트리를 이용하는 경우, 염색한 고정 세포를 플로우 사이토 미터에 도입하고, 상기 세포로부터 생기는 형광 신호를 취득하며, 상기 형광 신호에 근거하여 핵산량을 나타내는 정보를 취득할 수 있다.
본 실시 형태에서는 플로우 사이토메트리에 의한 분석 방법으로서, 예를 들면 미국 특허 출원 공보 제2009/0091746호 명세서에 기재된 세포 분석 장치 또는 세포 분석 방법을 이용해도 된다(미국 특허 출원 공보 제2009/0091746호 명세서는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다). 구체적으로는 미국 특허 출원 공보 제2009/0091746호 명세서에서의 「측정 대상 세포(measurement target cell)」를 포함하는 복수의 세포를 본 실시 형태의 세포 보존액으로 고정하고, 상기 세포 분석 장치 또는 세포 분석 방법에 의해 분석할 수 있다.
플로우 사이토 미터에 의한 측정에서는 염색된 고정 세포를 포함하는 측정 시료를 플로우 사이토 미터의 플로우 셀에 도입하여, 상기 플로우 셀을 통과하는 세포에 광을 조사함으로써, 개개의 세포로부터 발생되는 광학적 정보(형광 정보 및 산란광 정보)를 취득할 수 있다.
본 실시 형태에서, 형광 정보는 상기의 형광 색소로 염색된 개개의 세포에 적당한 파장의 여기광을 조사하고, 여기된 형광을 측정해 얻어지는 정보(예를 들면, 파형, 형광 강도 등)이다. 이 형광은 형광 색소에 의해서 염색된 세포에 포함되는 핵산으로부터 발생되는 것이므로, 형광 정보는 고정 세포에 포함되는 핵산의 양을 반영한다. 또한 수광 파장은 사용한 형광 색소에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 실시 형태에서, 산란광 정보는 일반적으로 시판되는 플로우 사이토 미터로 측정할 수 있는 산란광이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 전방 산란광(예를 들면, 수광 각도 0~20도 부근), 측방 산란광(수광 각도 90도 부근) 등의 산란광의 펄스 폭, 산란광 강도 등을 들 수 있다. 당해 기술에서는 측방 산란광은 세포의 핵이나 과립 등의 내부 정보를 반영하고, 전방 산란광은 세포의 크기의 정보를 반영하는 것이 알려져 있다.
본 실시 형태에서는 플로우 사이토 미터의 광원은 특별히 한정되지 않고, 형광 색소의 여기에 적절한 파장의 광원이 선택된다. 예를 들면, 적색 반도체 레이저, 청색 반도체 레이저, 아르곤 레이저, He-Ne 레이저, 수은 아크 램프 등이 사용된다. 특히 반도체 레이저는 기체 레이저에 비해 매우 염가이므로 바람직하다.
본 실시 형태에서는 상기의 광학적 정보에 대해서, 예를 들면 신호의 파형 해석 등을 실시함으로써, 세포에 포함되는 DNA량, 핵의 크기, 세포의 크기 등을 반영한 특징 파라미터를 추출하고, 이들 특징 파라미터를 이용하여 세포의 암화·이형화를 판별해도 된다.
본 실시 형태의 분석 방법에서는 고정 세포에 포함되는 핵산을 분석하는 공정은 상기 고정 세포에 포함되는 소정의 핵산을 검출하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 이 경우, 측정 시료로서 고정 세포로부터 추출한 핵산을 포함하는 시료를 이용하는 것이 바람직하다.
본 실시 형태에서는 소정의 핵산은 특별히 한정되지 않고, 흥미 대상의 임의의 핵산을 검출해도 된다. 검출 방법은 특별히 한정되지 않지만, 소정의 핵산과 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드(프로브 또는 프라이머)를 이용하는 하이브리다이제이션법, 마이크로 어레이법, HC법, 핵산 증폭법 등이 바람직하다. 이들 폴리뉴클레오티드는 DNA여도 되고, RNA여도 된다. 또, 상기 폴리뉴클레오티드는 소정의 핵산의 염기 배열에 따라 당업자가 적절히 설계할 수 있다.
본 명세서에서, 「특이적으로 하이브리다이즈할 수 있다」란, 프로브 또는 프라이머로서의 상기의 폴리뉴클레오티드가, 엄격한(stringent) 조건 하에서, 소정의 핵산에 하이브리다이즈할 수 있는 것을 의미한다. 여기서, 엄격한 조건이란, 상기 폴리뉴클레오티드가 소정의 핵산에, 상기 소정의 핵산 이외의 핵산보다도 검출 가능하게 큰 정도(예를 들면, 백그라운드의 적어도 2배를 넘는)로 하이브리다이즈할 수 있는 조건이다. 또한 엄격한 조건은 통상 배열 의존성이며, 여러 가지 환경에서 상이하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정의 이온 강도 및 pH에서의 특정한 배열의 열적 융점(thermal melting point: Tm) 보다도, 약 5℃ 낮아지도록 선택된다. 이 Tm은 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 조성 하에서) 상기 소정의 핵산의 염기 배열에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 50%가 평형(平衡)하여 하이브리다이즈하는 온도이다.
본 실시 형태에서, 프로브는 당해 기술에서 공지된 표지 물질에 의해 표지되어도 된다. 이들 표지 물질로서는 32P, 35S, 3H 및 125I 등의 방사성 물질, 플루오레세인 및 Alexa Fluor(등록 상표) 등의 형광 물질, 알칼리포스파타제 및 호스래디쉬 퍼옥시다제 등의 효소, 2,4-디니트로페닐기 등의 합텐, 비오틴, 아비딘 등을 들 수 있다. HC법에 의해 핵산을 검출하는 경우에는 항DNA/RNA 하이브리드 항체를 이들 표지 물질에 의해 표지하는 것이 바람직하다. 또, 마이크로 어레이에 의해 핵산을 검출하는 경우에는 측정 시료 중의 핵산을, 상기의 표지 물질에 의해 표지하는 것이 바람직하다.
본 실시 형태에서, 핵산의 검출은 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. 하이브리다이제이션법에서는 소정의 핵산과 특이적으로 하이브리다이즈한 표지 프로브로부터 생기는 시그널을 검출함으로써, 상기 소정의 핵산을 검출할 수 있다. 마이크로 어레이법에서는 마이크로 어레이상에 배치된 프로브와 특이적으로 하이브리다이즈한 표지 핵산이 존재하는 경우에, 상기 표지 핵산으로부터 생기는 시그널을 검출함으로써, 상기 소정의 핵산을 검출할 수 있다. 또한 본 명세서에서, 「시그널을 검출한다」란, 시그널의 유무를 정성적으로 검출하는 것, 시그널 강도를 정량하는 것, 및 시그널의 강도를, 「시그널 발생하지 않음」, 「약」, 「강」 등과 같이 복수의 단계로 반정량적으로 검출하는 것을 포함한다.
핵산 증폭법에서는 소정의 핵산의 염기 배열에 상보적인 프라이머를 이용한 증폭 후의 반응액을 겔 전기 영동하여 증폭 산물의 유무를 확인하여 증폭 산물이 존재하는 경우에, 상기 소정의 핵산을 검출할 수 있다. 혹은 SYBR(등록 상표) Green I 등의 DNA에 인터칼레이트하는 형광 물질 또는 TaqMan(상표) 프로브를 이용하는 리얼타임 PCR법에서는 증폭 후 또는 증폭 중의 반응액에서의 형광 물질 또는 프로브로부터의 시그널을 검출함으로써, 상기 소정의 핵산을 검출할 수 있다.
HC법에서는 소정의 핵산(DNA)과, 상기 핵산에 특이적으로 하이브리다이즈하는 RNA 프로브의 하이브리드를, 고상화 항체 및 표지 항체로 포착하고, 상기 표지 항체로부터 생기는 시그널을 검출함으로써, 상기 소정의 핵산을 검출할 수 있다.
본 실시 형태에서는 자궁 경부로부터 채취된 세포를 상기의 세포 보존액으로 고정하고, 상기 세포에 대해서, 소정의 핵산으로서 인간 파필로마 바이러스(HPV)에 유래하는 핵산을 검출해도 된다. HPV에 감염되면, HPV의 DNA가 숙주의 세포의 게놈 DNA에 포함된다. 따라서, 피검자의 자궁 경부로부터 채취된 세포에서, HPV에 유래하는 핵산이 검출된 경우, 상기 피검자는 HPV에 감염되어 있다고 판정할 수 있다.
HPV는 100 종류 이상의 서브타입으로 분류되고 있지만, 본 실시 형태에서는 검출 대상으로 하는 HPV는 특별히 한정되지 않고, 공지된 서브타입으로부터 임의로 선택할 수 있다. 예를 들면, 자궁경부암을 일으킬 가능성이 높다고 여겨지는 하이 리스크형 HPV에 유래하는 핵산을 검출해도 된다. 이들 하이 리스크형 HPV로서는 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68, HPV-73 및 HPV-82를 들 수 있다.
HPV에 유래하는 핵산의 검출 방법은 공지의 검출 방법으로부터 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 검출 대상으로 하는 HPV의 게놈 DNA를 증폭 가능한 프라이머를 이용하여, 핵산 증폭법에 따라 HPV에 유래하는 핵산을 검출해도 된다. 또, 상기의 HPV의 게놈 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브를 이용하여, 하이브리다이제이션법 또는 HC법에 의해 HPV 유래의 핵산을 검출해도 된다. 또한 프라이머 및 프로브는 HPV의 게놈 DNA의 염기 배열에 따라 당업자가 적절히 설계할 수 있다. 또, HPV 유래의 핵산의 검출에는 시판의 HPV 검출용 키트를 이용해도 된다.
본 실시 형태의 세포 보존액으로 고정한 세포는 상술한 핵산의 분석 방법뿐만 아니라, 세포, 핵 등의 크기나 형태를 분석하는 방법에도 제공할 수 있다. 세포, 핵 등의 크기나 형태를 분석하는 경우, 예를 들면 플로우 사이토 미터나 현미경을 이용할 수 있다.
플로우 사이토 미터를 이용하는 경우에는 핵을 형광 염색한 세포를 플로우 셀에 흘려, 개개의 세포에 광을 조사함으로써 산란광 정보나 형광 정보를 취득하고, 이것에 근거하여 이상(異常) 세포의 검출 등을 실시할 수 있다. 플로우 사이토 미터로서는, 예를 들면 미국 특허 출원 공보 제2015/0104786호 명세서에 기재된 장치를 이용할 수 있다(미국 특허 출원 공보 제2015/0104786호 명세서는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다). 또, 시판의 박리 세포 분석 장치인 LC-1000(시스멕스사)를 이용할 수도 있다.
또, 촬상 기능을 가지는 플로우 사이토 미터를 이용할 수도 있다. 플로우 셀을 흐르는 개개의 세포를 촬상해, 촬상된 세포를 병리 의사 등이 관찰함으로써, 이상 세포의 검출 등을 실시할 수 있다.
현미경을 이용하는 경우, 예를 들면 본 실시 형태의 세포 보존액으로 고정한 세포를 염색하고, 슬라이드 글라스에 세포를 도말하며, 이것을 현미경 관찰함으로써 세포가 분석된다. 현미경 관찰에서는 병리 의사 등이 현미경으로 관찰해도 되고, 촬상 기능을 가진 현미경으로 염색상을 촬영해, 촬영된 화상을 병리 의사 등이 관찰해도 된다. 이 슬라이드 글라스로의 도말은 병리 의사 등이 수작업으로 실시해도 되고, 표본 제작 장치로 자동적으로 실시해도 된다. 표본 제작 장치로서는 미국 특허 제5240606호 명세서에 기재된 장치를 이용할 수 있다(미국 특허 제5240606호 명세서는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다). 또, Thin Prep(등록 상표) 프로세서 등의 시판의 표본 제작 장치를 이용할 수도 있다.
추가로, 본 발명은 세포를 보존하기 위한 세포 보존액의 사용도 포함한다. 또, 본 발명은 고정 세포를 조제하기 위한 세포 보존액의 사용도 포함한다. 또, 본 발명은 세포를 분석하기 위한 세포 보존액의 사용도 포함한다. 보존, 고정 또는 분석되는 세포는 상기와 같다. 또, 세포 보존액의 조성도 상기와 같다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
본 실시 형태의 세포 보존액을 이용해 세포를 보존한 후, 상기 세포의 DNA의 보존 안정성을 검토했다. 비교를 위해, 시판의 세포 보존액을 이용하여 동일한 검토를 실시했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 1에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 조제했다(이하, 「실시예 1의 세포 보존액」이라고도 함). 이 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 이 세포 보존액의 pH는 6.7이었다. 시판의 세포 보존액으로서 PreservCyt(등록 상표)(홀로직사)를 이용했다. PreservCyt(등록 상표)의 상세한 조성은 공개되어 있지 않지만, 메탄올을 주성분으로 하는 수성 완충액인 것이 알려져 있다. 또한 ICP 발광 분광 분석 장치(에스아이아이나노테크놀로지사)를 이용한 조성 분석에 의하면, PreservCyt(등록 상표)로부터 2가 금속 이온은 검출되지 않았다.
Figure 112017071590228-pct00001
(1-2) 세포
세포 보존액으로 보존하는 세포로서 인간 자궁경부암 세포주 HeLa(아메리칸·타입·컬쳐·콜렉션(ATCC)으로부터 입수)를 이용했다. HeLa 세포는 소태자 혈청(FBS: 하이클론사)를 10% 함유하는 둘베코 개변(改變) 이글 배지(DMEM: 시그마 알드리치사)를 이용하여 37℃, 5% CO2 분위기 하에서 배양했다.
2. DNA의 보존 안정성의 검토
(2-1) 세포의 보존
배양한 HeLa 세포를 상법에 의해 회수해 계수했다. HeLa 세포(1×106개)를, 15mL 용량의 플라스틱 튜브(랩콘사)에 분주한 실시예 1의 세포 보존액(12 mL) 또는 시판의 세포 보존액(12 mL)에 첨가하고, 세포를 세포 보존액에 침지했다. 이들을 1℃ 또는 31℃의 온도 조건 하에서 2주간, 1개월간 또는 2개월간 보존했다. 또한 임상 현장에서는 세포의 보존은 일반적으로 냉장고 내(약 4℃)에서 실시된다. 본 실시예에서 설정한 온도 조건인 「1℃」는 이 냉장고의 온도보다도 낮은 온도이다. 또, 본 실시예에서는 세포 보존액이 임상 현장의 실온에서 이용될 수 있는지 여부를 검증하기 위해, 실온보다도 고온의 「31℃」에서도 실험을 실시했다.
(2-2) DNA 추출
HeLa 세포와 보존액을 포함하는 시료를, 10,000 rpm로 1분간 원심하여, 상청을 제거했다. 회수한 세포로부터, QIAamp DNA Mini Kit(키아젠사 제)를 이용해 DNA를 추출했다. 구체적인 조작은 당해 키트에 첨부된 메뉴얼에 따라서 실시했다. 또, 대조로서 실시예 1의 세포 보존액 또는 시판의 세포 보존액에 3시간 침지한 HeLa 세포(이하, 「고정 직후의 세포」라고도 말함)로부터, 상기와 동일하게 하여, DNA를 추출했다.
(2-3) 전기 영동
각 DNA 용액의 흡광도를 분광 광도계 nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific사 제)로 측정하여 DNA 농도를 취득했다. 아가로스 겔 전기 영동용 샘플을 각 샘플에 포함되는 DNA량이 500ng/레인이 되도록, DNA 용액으로부터 조제했다. 얻어진 샘플을, 0.5% 아가로스 겔에 전기 영동했다.
3. 결과
전기 영동의 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 시판의 세포 보존액을 이용한 경우에서는 일정 기간 보존한 세포로부터 취득한 DNA의 뉴클레오티드 길이는 고정 직후의 세포로부터 취득한 DNA에 비해 짧아지고 있어 DNA가 분해되고 있던 것을 알 수 있다. 이것은 시판의 세포 보존액에서는 보존 동안에 DNA가 적절히 유지되지 않았던 것을 나타내고 있다. 따라서, 시판의 세포 보존액을 이용한 경우, 보존 후의 세포의 DNA 분석을 적절히 실시할 수 없을 가능성이 있는 것이 시사된다. 이것에 비해서, 실시예 1의 세포 보존액을 이용한 경우에서는 어느 온도 조건 및 보존 기간이어도, 보존 후의 세포로부터 취득한 DNA의 뉴클레오티드 길이는 고정 직후의 세포로부터 취득한 DNA의 뉴클레오티드 길이와 거의 다르지 않았다. 따라서, 실시예 1의 세포 보존액을 이용하면, 세포를 일정 기간 보존한 후여도 DNA 분석을 적절히 실시할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 2
실시예 1의 세포 보존액을 이용해 세포를 보존한 후, 상기 세포의 DNA에 포함되는 소정의 핵산(HPV 유래의 핵산)을 검출함으로써, 세포 중의 DNA의 보존 안정성을 검토했다. 비교를 위해, 시판의 세포 보존액인 PreservCyt(등록 상표)(홀로직사)를 이용하여 동일한 검토를 실시했다.
1. 시판의 세포 보존액에 의한 DNA의 보존 안정성의 검토
(1-1) 세포의 보존
8명의 피검자의 자궁 경부로부터 자궁 경부 세포(8개 검체)를 채취했다. 8개 검체를 각각 PreservCyt(등록 상표)(12 mL)에 첨가하여, 세포를 세포 보존액에 침지했다. 각각의 검체를 3개로 등분하여 앨리? 1~3을 얻었다. 앨리? 1에 대해서는 세포 보존액으로 첨가 직후(고정 직후)에 후술의 핵산 검출을 실시했다. 앨리? 2에 대해서는 1℃에서 1개월간 또는 2개월간 보존한 후, 후술의 핵산 검출을 실시했다. 앨리? 3에 대해서는 31℃에서 1개월간 또는 2개월간 보존한 후, 후술의 핵산 검출을 실시했다. 각 검체의 검체 번호 및 보존 조건을 표 2에 나타낸다.
Figure 112017071590228-pct00002
(1-2) 핵산 검출
실시예 2에서는 자궁 경부 세포에 감염한 HPV에 유래하는 핵산을 하이브리드 캡쳐(HC) 법에 의해 검출했다. HC법의 사전 처리로서 HC2 Sample Conversion Kit(제품 번호 5127-1220, 키아젠사)를 이용하여, 각 앨리?에 포함되는 세포의 DNA를 추출했다. 구체적인 조작은 당해 키트에 첨부된 메뉴얼에 따라서 실시했다. 각 앨리?으로부터 얻은 DNA에 대해서, HPV-DNA 검출 키트인 HPV DNA 「키아젠」HCII(제품 번호 618915, 키아젠사)를 이용하여, HPV 유래의 핵산의 검출을 실시했다. 구체적인 조작은 당해 키트에 첨부된 메뉴얼에 따라서 실시했다.
(1-3) 결과
결과를 도 2a 및 도 2b에 나타낸다. 도면 중, 세로축은 HC법에 의해 측정된 화학 발광 강도(HC2 인덱스값)의 대수를 나타내고, 가로축의 「0 day」는 보존 기간이 0일(고정 직후)인 것을 나타내며, 「1m/2m」는 보존 기간이 1개월 또는 2개월인 것을 나타낸다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 앨리? 2의 HC2 인덱스값은 앨리? 1의 HC2 인덱스값보다도 저하되어 있는 경향이 있었다. 또, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 앨리? 3의 HC2 인덱스값은 앨리? 1의 HC2 인덱스값보다도 저하되어 있었다. 이들 결과는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를, 시판의 세포 보존액 중에 1℃ 또는 31℃에서 1개월간 또는 2개월간 보존한 것에 의해, 세포 중의 핵산이 분해된 것을 나타낸다.
2. 본 실시 형태의 세포 보존액에 의한 DNA의 보존 안정성의 검토
(2-1) 세포의 보존
상기의 8명과는 상이한 12명의 피검자의 자궁 경부로부터 자궁 경부 세포(12개 검체)를 채취했다. 12개 검체를 각각 실시예 1의 세포 보존액(12 mL)에 첨가하여, 세포를 세포 보존액에 침지했다. 각각의 검체를 3개로 등분하여, 앨리? 1~3을 얻었다. 앨리? 1에 대해서는 세포 보존액으로 첨가 직후(고정 직후)에, 세포를 회수해 -60℃에서 보존했다. 2개월 후, 앨리? 1로부터 회수한 세포에 대해서, 앨리? 2 및 3과 함께, 후술의 핵산 검출을 실시했다. 앨리? 2에 대해서는 1℃에서 2개월간 보존한 후, 후술의 핵산 검출을 실시했다. 앨리? 3에 대해서는 31℃에서 2개월간 보존한 후, 후술의 핵산 검출을 실시했다. 각 검체의 검체 번호 및 보존 조건을, 표 3에 나타낸다.
Figure 112017071590228-pct00003
(2-2) 핵산 검출
상기와 동일하게 하여, 자궁 경부 세포에 감염한 HPV에 유래하는 핵산을 하이브리드 캡쳐(HC) 법에 의해 검출했다. HC법의 사전 처리 및 HC법에 따르는 핵산의 검출은 각각, HC2 Sample Conversion Kit(키아젠사) 및 HPV DNA 「키아젠」HCII(키아젠사)를 이용해서 실시했다. 구체적인 조작은 각 키트에 첨부된 메뉴얼에 따라서 실시했다.
(2-3) 결과
결과를 도 3a 및 도 3b에 나타낸다. 도면 중, 세로축은 HC법에 의해 측정된 화학 발광 강도(HC2 인덱스값)를 나타내고, 가로축의 「0 day」는 보존 기간이 0일(고정 직후)인 것을 나타내며, 「2 m」는 보존 기간이 2개월인 것을 나타낸다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 앨리? 2의 HC2 인덱스값은 앨리? 1의 HC2 인덱스값과 거의 동등했다. 또, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 앨리? 3의 HC2 인덱스값은 앨리? 1의 HC2 인덱스값보다도 저하되어 있었다. 이들 결과는 피검자로부터 채취한 자궁 경부 세포를, 실시예 1의 세포 보존액 중에 1℃ 또는 31℃에서 2개월간 보존해도, 세포 중의 핵산을 적절히 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 3
실시예 1의 세포 보존액으로 보존한 세포가 세포 표본 염색에 적절한지를 검토했다. 비교를 위해, 시판의 세포 보존액인 PreservCyt(등록 상표)(홀로직사)로 보존한 세포를 이용했다.
1. 시판의 세포 보존액으로 보존한 세포의 염색
피검자의 자궁 경부로부터 채취한 세포를, PreservCyt(등록 상표)(20 mL) 중에 현탁하여, 실온에서 2일간 정치했다. 슬라이드 작성 장치 ThinPrep2000(홀로직사)를 이용하여, 세포 현탁액으로부터 세포를 부착시킨 슬라이드를 만들었다. 구체적인 조작은 당해 장치의 취급 설명서에 따라서 실시했다. 만든 슬라이드를, 하기의 표 4에 나타내는 절차에 따라서 파파니콜로 염색했다.
Figure 112017071590228-pct00004
2. 본 실시 형태의 세포 보존액으로 보존한 세포의 염색
피검자의 자궁 경부로부터 채취한 세포를, 실시예 1의 세포 보존액(20 mL) 중에 현탁하여, 실온에서 2일간 정치했다. 그리고, 세포 현탁액을 800 g로 10분간 원심하여, 상청을 제거했다. 침전물에 200μL의 탈이온수를 첨가해 현탁한 후, 얻어진 현탁액의 전량을, 슬라이드 글라스(BD 슈어 패스 프리-코티드 슬라이드, 벡톤·디킨손사)에 설치한 챔버(BD 세팅 챔버, 벡톤·디킨손사) 내에 첨가하여, 10분간 정치했다. 그 후, 슬라이드상의 세포를 95% 에탄올로 고정했다. 만든 슬라이드를 상기의 표 4에 나타내는 절차에 따라, 파파니콜로 염색했다.
3. 결과
결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 실시 형태의 세포 보존액으로 보존한 세포를 파파니콜로 염색하면, 시판의 세포 보존액으로 보존한 세포와 동등의 염색상이 얻어진다.
실시예 4
세포 보존액의 마그네슘 이온 농도와, 세포의 DNA의 안정성의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
실시예 4에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 5에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.6이었다.
Figure 112017071590228-pct00005
(1-2) 세포
세포 보존액으로 보존하는 세포로서 인간 자궁경부암 세포주 HeLa(ATCC로부터 입수)를 이용했다. HeLa 세포는 실시예 1과 동일하게 하여 배양했다.
(1-3) 시약 및 플로우 사이토 미터
염색액 및 RNA 제거제로서 GC-SEARCH KIT(시스멕스 주식회사)를 이용했다. 희석액으로서 GC-PACK(시스멕스 주식회사)를 이용했다. 플로우 사이토 미터로서 박리 세포 분석 장치 LC-1000(시스멕스 주식회사)를 이용했다.
2. 세포의 보존 및 플로우 사이토메트리(FCM) 분석
세포 보존액 1~4의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 1℃ 또는 31℃에서 24시간 정치했다. 세포 현탁액을 10,000 rpm로 1분간 원심분리한 후, 상청을 제거했다. 세포를 포함하는 잔존액(30μL)에 희석액(1 mL)을 가해 10,000 rpm로 1분간 원심분리한 후, 상청을 제거했다. 세포를 포함하는 잔존액(30μL)에, 염색액, RNA 제거제, 및 희석액을 가해 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 개개의 세포로부터 검출된 형광 면적을 가로축에 취하고, 세포수를 세로축에 취한 빈도 분포(히스토그램)를 작성했다. 또한 형광 면적은 세포의 DNA량을 반영하는 지표이다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 5에 나타낸다. 여기서, 형광 면적의 히스토그램에 대해 설명한다. 형광 면적의 히스토그램에서는 통상 2개의 피크가 확인되는 것이 알려져 있다. 즉, 2배체 세포의 집단에 의해 형성되는 피크와, 세포 증식에 의해 4배체가 된 세포의 집단에 의해 형성되는 피크이다. DNA량은 4배체가 된 세포가 2배체 세포보다도 많다. 일반적으로, 2배체 세포의 DNA량은 일정한 것이 알려져 있다. 따라서, DNA가 안정한 경우, 2배체 세포의 형광 면적은 일정해지므로, 형광 면적의 히스토그램에서 2배체 세포의 피크가 샤프하게 출현한다. 한편으로, 형광 면적은 DNA량을 반영하는 지표인 점에서, DNA가 불안정화해 분해나 단편화가 생긴 경우, 2배체 세포의 DNA량은 일정해지지 않아, 형광 면적의 변동이 생긴다. 그 결과, 히스토그램에서, 2배체 세포의 피크는 샤프한 것은 없어진다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 1℃의 온도 조건에서는 세포 보존액 1~4의 어느 하나를 이용해 세포를 보존해도, 형광 면적의 히스토그램의 형상이 정상적이었다. 그러나, 2가 금속 이온 농도가 낮은 세포 보존액 1, 2 및 3을 이용해 31℃에서 세포를 보존하면, 히스토그램의 형상이 무너졌다. 이것에 비해서, 2가 금속 이온 농도를 20mmol/L로 한 세포 보존액 4를 이용한 경우에는 31℃의 온도 조건에서도, 히스토그램의 형상의 붕괴는 확인되지 않았다. 따라서, 2가 금속 이온 농도를 적절히 설정함으로써, 고온에서 보존하는 경우에도, 저온에서 보존한 경우와 동일하게 DNA를 안정하게 유지해, 히스토그램의 붕괴를 방지할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 5
세포 보존액의 마그네슘 이온 농도와, 세포의 DNA의 안정성의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
실시예 5에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 6에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.6이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00006
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 5~26의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 25℃에서 4시간 또는 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다. 히스토그램 형상의 안정성의 지표를, 다음과 같이 하여 산출했다. 또한 산출에 대한 설명을 위해, 도 6을 참조한다. 세포 보존액 14(MgCl2 농도가 20mmol/L)를 이용해 25℃에서 4시간 보존한 세포의 히스토그램으로부터, 2배체 세포 영역의 형광 면적의 최빈치(最頻値)를 산출했다. 최빈치는 도 6 중, 애로우 헤드로 나타내는 피크로 해당한다. 2배체 세포 영역의 형광 면적의 최빈치의 75%를 하한으로 하고, 2배체 세포 영역의 형광 면적의 최빈치의 125%를 상한으로 하는 2배체 세포 출현 영역을 정의했다. 이 영역은 도 6 중, 2개의 선에 낀 영역에 해당한다. 2배체 세포 출현 영역에서의 형광 면적의 변동 계수(CV)를 산출하고, 이것을 히스토그램의 형상의 안정성의 지표로 했다. 당해 영역에서의 형광 면적의 변동 계수(CV)의 값이 클수록, 2배체 세포에 대한 히스토그램의 형상이 무너지고 있는 것을 나타낸다.
3. 결과
결과를, 도 7a 및 도 7b에 나타낸다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 25℃에서 4시간 보존한 경우에는 0mmol/L~200mmol/L의 범위 중, 어느 염화마그네슘 농도의 세포 보존액을 이용해도, 2배체 세포 출현 영역에서의 CV의 값은 낮고, 또 염화마그네슘의 농도에 의한 CV의 값의 변동은 거의 확인되지 않았다. 한편, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 30℃에서 24시간 보존한 경우에는 2배체 세포 출현 영역에서의 CV의 값은 염화마그네슘 농도가 저가 또는 고가의 세포 보존액을 이용했을 때에 현저하게 증대했다. 이들 결과로부터, 세포 보존액 11~19를 이용한 경우, 즉 세포 보존액에서의 2가 금속 이온 농도가 6mmol/L~82mmol/L인 경우, 히스토그램 형상의 붕괴를 방지하는 효과가 있는 것이 확인되었다. 상술한 바와 같이, 형광 면적은 세포의 DNA량을 반영하는 지표인 점에서, DNA가 불안정화해 분해나 단편화가 생긴 경우, 2배체 세포의 DNA량은 일정해지지 않아, 형광 면적의 변동이 생긴다. 그 결과, 2배체 세포의 히스토그램의 형상이 무너진다. 따라서, 세포 보존액의 2가 금속 이온 농도를 6mmol/L~82mmol/L로 함으로써, 세포의 DNA의 안정화에 기여했다고 생각된다.
실시예 6
세포 보존액의 저급 알코올 농도와, 세포의 DNA의 안정성의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
실시예 6에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 7에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.7이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00007
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 27~46의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 8a, 도 8b 및 도 8c에 나타낸다. 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 세포 보존액의 2가 금속 이온 농도가 10mmol/L~60mmol/L일 때, 메탄올(MeOH) 농도가 38 v/v% ~ 48 v/v%여도, 형광 면적의 히스토그램의 형상은 양호하게 유지되었다. 또, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 세포 보존액의 2가 금속 이온 농도가 20mmol/L 또는 40mmol/L일 때, 메탄올 농도가 35 v/v% 또는 50 v/v%여도, 형광 면적의 히스토그램의 형상은 양호하게 유지되었다.
실시예 7
세포 보존액의 pH와, 세포의 DNA의 안정성의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
실시예 7에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 8에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 세포 보존액 47~50의 pH는 6.4이며, 세포 보존액 51~54의 pH는 7.0이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00008
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 47~54의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 9에 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 보존액의 2가 금속 이온 농도가 10mmol/L~60mmol/L일 때, pH가 6.4 또는 7.0이어도, 형광 면적의 히스토그램의 형상은 양호하게 유지되었다.
실시예 8
2가 금속 이온으로서 칼슘 이온을 이용하고, 세포 보존액의 칼슘 이온 농도와, 세포의 DNA의 안정성과의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
실시예 8에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화칼슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 9에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.7이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00009
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 55~57의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 1℃ 또는 31℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 10에 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 1℃의 온도 조건에서는 세포 보존액 55~57의 어느 하나를 이용해 세포를 보존해도, 형광 면적의 히스토그램의 형상이 정상적이었다. 그러나, 2가 금속 이온 농도가 낮은 세포 보존액 55 및 56을 이용해 31℃에서 세포를 보존하면, 히스토그램의 형상이 무너졌다. 이것에 비해서, 2가 금속 이온 농도를 20mmol/L로 한 세포 보존액 57을 이용한 경우에는 31℃의 온도 조건에서도, 히스토그램의 형상의 붕괴는 확인되지 않았다. 따라서, 2가 금속 이온 농도를 적절히 설정함으로써, 고온에서 보존하는 경우에도, 저온에서 보존한 경우와 동일하게 DNA를 안정하게 유지해, 히스토그램의 붕괴를 방지할 수 있는 것을 나타냈다.
비교예 1
시판의 세포 보존액을 이용해 보존한 세포에 대해서, DNA의 안정성을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
비교예 1에서는 시판의 세포 보존액으로서 PreservCyt(등록 상표)(홀로직사)를 이용했다. 또, 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
PreservCyt(등록 상표)에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 실온에서 30분간, 31℃에서 24시간 또는 31℃에서 7일간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 11에 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 실온에서 30분간의 보존 조건에서는 형광 면적의 히스토그램의 형상이 정상적이었다. 그러나, 31℃에서 24시간 또는 7일간의 보존 조건에서는 히스토그램의 형상이 무너졌다. 따라서, 시판의 세포 보존액은 본 실시 형태의 세포 보존액과는 상이하여, 31℃의 온도 조건에서의 보존에는 적합하지 않은 것을 알 수 있다.
실시예 9
세포 보존액의 칼슘 이온 농도와, 세포의 DNA의 안정성의 관련을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
실시예 9에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화칼슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 10에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.6이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00010
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 58~64의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 13에 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 칼슘 이온 농도가 6, 20 및 82mmol/L의 세포 보존액 60, 61 및 62를 이용해 30℃에서 세포를 보존한 경우에는 히스토그램의 형상이 양호했다. 상술한 바와 같이, 형광 면적은 세포의 DNA량을 반영하는 지표이다. 즉, 형광 면적의 히스토그램의 형상이 양호한 것은 보존 동안, 세포의 DNA가 안정하게 유지되고 있던 것을 나타낸다. 따라서, 칼슘 이온 농도를 적절히 설정함으로써, 30℃의 온도 조건에서 보존해도 세포의 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 10
2가 금속 이온으로서 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 모두를 포함하는 세포 보존액을 이용해 세포를 고정 및 보존했다. 보존한 세포의 DNA의 안정성을, 플로우 사이토메트리로 검토했다. 비교를 위해, 2가 금속 이온을 포함하지 않는 세포 보존액도 이용했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
실시예 10에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사), 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사) 및 염화칼슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 11에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.7이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00011
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 65 및 66의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 14에 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 2가 금속 이온을 포함하지 않는 세포 보존액 65를 이용해 30℃에서 세포를 보존하면, 히스토그램의 형상이 무너졌다. 이것에 비해서, 2가 금속 이온의 합계 농도가 20mmol/L의 세포 보존액 66을 이용한 경우에는 히스토그램의 형상이 양호했다. 따라서, 2종류의 2가 금속 이온을 적절한 농도로 포함하는 세포 보존액을 이용함으로써, 30℃의 온도 조건에서 보존해도 세포의 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 11
저급 알코올로서 에탄올을 포함하는 세포 보존액을 이용해 세포를 고정 및 보존했다. 보존한 세포의 DNA의 안정성을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
실시예 11에서는 에탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 12에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 이 세포 보존액의 pH는 6.7이었다. 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
Figure 112017071590228-pct00012
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 67에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 7일간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 15에 나타낸다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 저급 알코올로서 에탄올을 포함하는 세포 보존액 67로 세포를 보존한 경우, 히스토그램의 형상이 양호했다. 따라서, 에탄올 및 2가 금속 이온을 적절한 농도로 포함하는 세포 보존액을 이용함으로써, 30℃의 온도 조건에서 보존해도 세포의 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 것을 나타냈다.
비교예 2
본 실시 형태의 세포 보존액 및 특허문헌 1(미국 특허 제5,256,571호 명세서)의 실시예 5에 기재된 세포 보존액을 이용해 보존한 세포에 대해서, DNA의 안정성을 비교했다.
1. 재료
(1-1) 세포 보존액
본 실시 형태의 세포 보존액으로서 상기의 실시예 1의 세포 보존액을 이용했다. 또, 특허문헌 1의 실시예 5에 기재된 세포 보존액(이하, 「비교예 2의 세포 보존액」이라고도 함)으로서 하기의 조성의 세포 보존액을 조제했다. 또한 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
＜비교예 2의 세포 보존액＞
1 mM 아세트산 마그네슘 6수화물
2 mM 아세트산 칼슘 1수화물
10 mM 염화칼륨
0.1% 염화나트륨
20% 메탄올
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
실시예 1의 세포 보존액 및 비교예 2의 세포 보존액의 각각에 HeLa 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 7일간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 16에 나타낸다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 세포 보존액으로 세포를 30℃에서 7일간 보존한 경우에는 형광 면적의 히스토그램의 형상이 정상적이었다. 이것에 비해서, 비교예 2의 세포 보존액으로 세포를 보존한 경우에는 히스토그램의 형상이 무너졌다. 따라서, 미국 특허 제5,256,571호 명세서의 실시예 5에 기재된 세포 보존액은 본 실시 형태의 세포 보존액과는 상이하여, 30℃의 온도 조건으로의 보존에는 적합하지 않은 것을 알 수 있다.
실시예 12
마그네슘 이온을 포함하는 세포 보존액을 이용하고, 정상 조직 유래의 세포를 고정 및 보존했다. 보존한 세포의 DNA의 안정성을 플로우 사이토메트리로 검토했다.
1. 재료
(1.1) 세포 보존액
실시예 12에서는 메탄올(와코 준야쿠 공업 주식회사) 및 염화마그네슘(키시다 화학 주식회사)을, 이하의 표 13에 나타내는 조성이 되도록 혼합하여 세포 보존액을 조제했다. 이들 세포 보존액의 조제에서, 용매로서 물을 이용하고 완충제로서 PIPES(도진가가쿠 연구소)를 20 mM가 되도록 첨가했다. pH의 조정에는 NaOH 수용액을 이용했다. 어느 세포 보존액도 pH는 6.7이었다.
Figure 112017071590228-pct00013
(1-2) 세포, 시약 및 플로우 사이토 미터
세포 보존액으로 보존하는 정상 조직 유래의 세포로서 인간 제대 정맥 내피 세포주 HUVEC(ATCC로부터 입수)를 이용했다. HUVEC 세포는 실시예 1의 HeLa 세포의 배양과 동일하게 하여 배양했다. 시약 및 플로우 사이토 미터는 실시예 4와 같다.
2. 세포의 보존 및 FCM 분석
세포 보존액 68~71의 각각에 HUVEC 세포를 첨가해 현탁하여, 얻어진 세포 현탁액을 30℃에서 24시간 정치했다. 실시예 4와 동일하게 하여, 세포 현탁액으로부터 측정 시료를 조제했다. 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토 미터에 도입하고 광학 신호(형광 신호 및 전방 산란광 신호)를 취득했다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여, 형광 면적의 히스토그램을 작성했다.
3. 결과
작성한 형광 면적의 히스토그램을, 도 17에 나타낸다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 마그네슘 이온을 포함하지 않는 세포 보존액 68을 이용해 30℃에서 HUVEC 세포를 보존하면, 히스토그램의 형상이 무너졌다. 이것에 비해서, 마그네슘 이온 농도가 6, 20 및 82mmol/L의 세포 보존액 69, 70 및 71을 이용해 30℃에서 세포를 보존한 경우에는 히스토그램의 형상이 양호했다. 따라서, 본 실시 형태의 세포 보존액을 이용하면, 정상 조직 유래의 세포를 30℃의 온도 조건에서 보존해도 상기 세포의 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 것을 나타냈다.
11: 세포 보존액을 수용한 용기

Claims (25)

  1. 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 수성 용매 중에 포함하고, 상기 2가 금속 이온의 농도가 6mmol/L 이상 82mmol/L 이하인, 세포를 고정하여 보존하기 위한 세포 보존액.
  2. 청구항 1에 있어서,
    2가 금속 이온이 제2족 원소의 금속 이온인 세포 보존액.
  3. 청구항 1에 있어서,
    2가 금속 이온이 마그네슘 이온 및 칼슘 이온으로부터 선택되는 적어도 하나인 세포 보존액.
  4. 청구항 1에 있어서,
    2가 금속 이온의 농도가 6mmol/L 이상 80mmol/L 이하인 세포 보존액.
  5. 청구항 1에 있어서,
    2가 금속 이온의 농도가 10mmol/L 이상 60mmol/L 이하인 세포 보존액.
  6. 청구항 1에 있어서,
    저급 알코올이 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 적어도 하나인 세포 보존액.
  7. 청구항 1에 있어서,
    저급 알코올의 농도가 20 체적% 이상 60 체적% 이하인 세포 보존액.
  8. 청구항 1에 있어서,
    pH가 6 이상 8 이하인 세포 보존액.
  9. 청구항 1에 있어서,
    세포 보존액에 의해 보존되는 세포가 생체로부터 채취된 자궁 경부 세포, 자궁 체부 세포, 구강 세포, 유선 세포, 갑상선 세포, 소변 중 세포, 객담 중 세포, 기관지 찰과 세포, 복강 세정액 중 세포, 체강액 중 세포, 또는 채취된 조직에 포함되는 세포인 세포 보존액.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 세포 보존액에 인 비트로에서 세포를 침지시키는 것을 포함하는 세포의 보존 방법.
  11. 탄소수 1~6의 저급 알코올과, 2가 금속 이온을 수성 용매 중에 혼합하는 것을 포함하는, 세포를 고정하여 보존하기 위한 세포 보존액의 제조 방법으로서, 상기 세포 보존액에서의 2가 금속 이온의 농도가 6mmol/L 이상 82mmol/L 이하인 상기 세포 보존액의 제조 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    2가 금속 이온이 제2족 원소의 금속 이온인 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    2가 금속 이온이 마그네슘 이온 및 칼슘 이온으로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
  14. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    2가 금속 이온의 농도가 6mmol/L 이상 80mmol/L 이하인 방법.
  15. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    2가 금속 이온의 농도가 10mmol/L 이상 60mmol/L 이하인 방법.
  16. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    저급 알코올이 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 적어도 하나인 방법.
  17. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    세포 보존액에서의 저급 알코올의 농도가 20 체적% 이상 60 체적% 이하인 방법.
  18. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    세포 보존액의 pH가 6 이상 8 이하인 방법.
  19. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    세포 보존액에 의해 보존되는 세포가 생체로부터 채취된 자궁 경부 세포, 자궁 체부 세포, 구강 세포, 유선 세포, 갑상선 세포, 소변 중 세포, 객담 중 세포, 기관지 찰과 세포, 복강 세정액 중 세포, 체강액 중 세포, 또는 채취된 조직에 포함되는 세포인 방법.
  20. 세포와, 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써 상기 세포를 고정하는 것을 포함하는 고정 세포의 조제 방법.
  21. 세포와, 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 세포 보존액을 인 비트로에서 접촉시킴으로써 상기 세포를 고정하는 공정과,
    상기 공정에서 얻어진 고정 세포에 포함되는 핵산을 분석하는 공정을 포함하는 세포의 분석 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 분석 공정에서 상기 고정 세포에 포함되는 핵산의 양을 나타내는 정보가 취득되는 방법.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 고정 공정과 분석 공정의 사이에, 상기 고정 세포에 포함되는 핵산을 염색하는 공정을 추가로 포함하고,
    상기 분석 공정이, 염색된 세포를 플로우 사이토 미터에 도입하여 상기 세포로부터 생기는 광학적 정보를 취득하는 공정과, 상기 광학적 정보에 근거하여 상기 핵산을 분석하는 공정을 포함하는 방법.
  24. 청구항 21에 있어서,
    상기 분석 공정이 상기 고정 세포에 포함되는 소정의 핵산을 검출하는 공정을 포함하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 세포가 자궁 경부로부터 채취된 세포이며, 상기 소정의 핵산이 인간 파필로마 바이러스(HPV)에 유래하는 핵산인 방법.
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