KR20090110841A - 우유 단백질을 함유하는 돼지 정자 희석 배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 정자를 위한 희석 배지에서 우유로부터의 단백질 부분의 적용을 개시한다. 이 단백질 부분을 함유하는 조성물은 개선되고 더 경제적인 효능을 보여준다. 본 발명은 주로 돼지의 인공 수정에서 적용되는 돼지 정자 세포의 생존 능력을 유지하고 및/또는 개선시키는 것을 목적으로 하는 돼지 정자를 위한 희석 배지에 관한 것이다. 그러나 본 발명은 다른 종들의 인공 수정 및 생체 밖 수정과 같은 생식 기술 또는 공정에 유용할 것으로 기대된다.

우유 단백질, 돼지 정자, 희석 배지, 인공 수정, 생식

Description

우유 단백질을 함유하는 돼지 정자 희석 배지{SWINE SPERM DILUTION MEDIA CONTAINING MILK PROTEIN}

본 발명은 가축의 인공수정을 위한 제제에서 정자 세포의 생존 능력을 증가시키고 및/또는 유지하기 위한 방법에 관한 것이다. 인공 수정(AI)은 가축의 번식에서 널리 허용되었고 포유동물에서의 생식을 개선시켰다. AI는 직접교배 이상의 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 단일 수컷으로부터 수집된 정액이 많은 암컷을 인공수정시키는데 사용될 수 있고, 따라서 개체군을 유지하는데 필요한 수컷의 수를 감소시킨다. AI는 또한 번식에 대해 더 큰 조절을 제공하며, 이는 더 큰 번식력 및 더 광범위하고 더 효율적인 유전자 또는 유전적으로 결정된 특성의 보급을 야기한다. 인공 수정을 실행하기 위해, 수컷으로부터 수집한 정액을 우선 신체의 외부에 저장한 후 선택된 암컷에 인공수정시킨다. 따라서, 인공 수정의 생식 성공은 신체 밖에서 합리적인 긴 시간 동안 정액의 만족스러운 보관에 크게 의존한다.

일반적으로, 인공 수정을 위한 정액은 그것이 적당한 액체 희석 배지로 희석된 후 저장된다. 희석 배지의 종류 및 저장 온도는 희석 배지에서 정자 세포의 생존 능력을 증가 및/또는 유지하는 것, 따라서, 그것의 수정 능력과 밀접한 관련을 가진다. 사용된 정액에 대한 처리 조건은 종에 따라 다양할 수 있다. 소 인공수정은 정자 세포의 상대적으로 낮은 농도를 필요로 하며, 적당한 샘플을 급속냉동시키 고 샘플의 수정 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않고 연장된 기간 동안 보관할 수 있다. 대조적으로, 돼지 정액은 이런 방법으로 처리될 수 없는데, 이는 암컷을 인공수정시키기 위해 더 많은 수의 정자 세포 및 더 큰 부피의 정액 또는 희석한 정액이 필요로 되기 때문이다. 돼지 정액은 일반적으로 적당한 액체 희석 배지로 희석되며 약 17℃의 보관 온도로 냉각된다. 배지는 그것의 원래 부피의 약 5 내지 20배로 샘플의 부피를 증가시키는 역할을 하며, 정자 세포의 생존 능력을 증가시키고 및/또는 유지하기 위한 영양소 및 보호 물질을 제공한다. 정자 세포 생존 능력의 상당한 손실이 바로 며칠 동안 정액을 저장한 후 일어나는데 정자 세포의 대사가 충분하게 억제될 수 없기 때문이다. 결국, 5일을 넘는 기간 동안 보관된 희석된 정액의 사용으로 인공수정에서 낮은 수정률에 직면한다. 돼지 정자 세포가 보관될 수 있는 상대적으로 짧은 시간은 AI를 위한 돼지 정자 세포의 사용 및 분배에 상당한 제약을 부과한다.

본 발명은 돼지 정자 세포를 위한 액체 희석 배지를 포함하는 개선된 조성물을 제공한다. 돼지 정자 세포의 생존 능력을 증가 및/또는 유지하기 위해 다수의 특정 액체 배지 제형이 공지되어 있고 또는 상업적으로 이용가능하다. 전형적으로, 희석 배지 제형은 고체 형태(분말)로 제공되며, 사용을 위해 물에 용해된다. 표준 제형을 당업계에서 찾을 수 있다. 예를 들어, J.Gadea는 인공 수정 과정에서 사용되는 돼지 정액 희석 배지에서 최신의 지식을 재검토하였다. 효과적인 신선한 정액 희석 배지의 필요를 논의하였고 현재 이용가능한 희석 배지를 비교하였다 (http://www.engormix.com/semen_extenders_used_in_e_articles_87_POR.htm 참조). 돼지 정자 세포 희석 배지는 일반적으로 염, 에너지원(예를 들어, 글루코오스), 하나 이상의 항생물질 및 적어도 하나의 완충제(예를 들어, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES))를 함유하여 결과 용액이 6 내지 7.5의 pH 값을 가지도록 한 것이다. 추가 성분은 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 소 혈청 알부민(BSA)을 포함할 수 있다. 물에 용해되었을 때, 물질들의 결과 혼합물은 220 내지 380 밀리오스몰의 삼투압을 가지는 용액을 초래하여야 한다.

소 혈청 알부민(BSA)은 정자 세포의 생존 능력을 증가 및/또는 유지하기 위한 조성물에 광범위하게 사용되는 단백질이다. BSA는 수용액에서 거대분자를 안정화하고 또한 세포 배양 배지에서 널리 사용된다. BSA는 또한 다수의 독성 물질에 결합하고 희석 배지의 pH를 안정화한다. BSA의 특성은 정자 세포의 생존 능력을 증가 및/또는 유지하기 위해 특히 적당한 보호 물질을 만든다. 그러나, BSA의 사용은 2가지 중요한 결점을 가진다. 첫째, BSA는 소 혈청으로부터 분리되고 정제된다. 따라서, 특정 소 생성물, 가장 현저하게는 혈액 생성물의 사용은 광우병(Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE))의 발병과 관련되기 때문에 잠재적인 위협을 지닌다. 둘째, BSA의 분리 및 정제는 고가의 공정이고, 신뢰할 수 있는 품질과 성능을 가지는 생성물을 항상 초래하지는 않는다. 결과적으로, BSA의 비용가격은 상대적으로 높으며 돼지 정자 세포를 위한 희석 배지의 비용의 대부분을 구성한다. 지금까지 돼지 정자 세포 희석 배지에서 용도를 위한 BSA에 어떤 좋은 대안도 없었다. AI 산업에 BSA의 더 경제적이고 더 적절한 대체물을 제공하는 것은 본 발명의 주 목적이다.

본 발명은 액체 돼지 정자 세포 희석 배지에서 소 우유의 단백질-주로 BSA에 대한 대체물로서-의 용도에 관한 것이다. 우유 단백질은 상대적으로 저렴하며 널리 이용가능한 단백질 원이다. 우유 단백질은 우유로부터, 또는 소 우유로부터 제조된 치즈의 부산물인 훼이로부터 분리될 수 있는 단백질의 수집물에 대한 명칭이다. 이는 전형적으로 면역-글로불린, β-락토글로불린, α-락트알부민, 혈청 알부민, 및 다수의 다른 단백질의 혼합물이며, 그것들의 본래의 형태로 용해될 수 있다. 정자를 위한 희석 배지에서 우유 단백질의 사용은 이미 M.R.E.J. Cassou (특허 FR 1043684)에 의해 1953년에 기술되었다. Cassou는 소 정자를 희석시키기 위한 무지방 우유의 사용을 기술하였다. 더 최근에는 Batellier et al. (Theriogenology 48 (1997) pp 391-410; 특허 EP 0969850B1)의 광범위한 연구가 있다. 이들 연구들은 말 정자를 위한 희석 배지에서 우유의 카세인 부분의 사용을 주로 다룬다. 더 최근에는 L. de Backer en S. Poncelet (특허 NL 1024129A)의 연구가 있다. 이 특허에서 말 정자를 위한 희석 배지에서 무지방 우유 분말(Nestle제의 상표 Gloria)의 사용이 기술된다. 최종적으로, M.T. Pellicer-Rubio et al.의 연구는 염소 정자를 위한 희석 배지를 함유하는 우유의 사용을 기술한다(M.T. Pellicer-Rubio, T. Magallon and Y. Combarnous. Biology of Reproduction 57 (1997) 1023-1031). 상기-언급한 예와는 대조적으로 (탈지)우유 또는 카세인(원래 포스포카세인)은 17℃에서 돼지 정자 세포를 보존하는 것에 성공적으로 적용되지 않았다. 돼지 정자 세포의 냉동 보존을 위한 것이지만 (탈지) 우유 또는 카세인의 사용이 보고되었다. 그러나 이는 당업계에서 성공적으로 널리 적용되지 않았다.

우유의 다양한 성분은 정자 생존 능력에 유익하면서 해로운 것으로 알려져 있다. 최근 수년간 행해진 연구는 우유의 주요 단백질인 카세인이 보존 배지 내 정자에서 우유의 보호 효과를 초래함을 나타낸다. 난황 단백질과 유사한 방법으로, 카세인은 정자에 대한 지질-결합 단백질(정자막으로부터 콜레스테롤 및 인지질 제거를 유도하는 소위 BSP 단백질)의 패밀리의 구성원의 결합 및 정자 지질 손실을 감소시키는 한편, 보관 동안 정자 운동성 및 생존 능력을 유지한다. 카세인은 정자 보존 동안 정자 막 상의 BSP 단백질의 해로운 효과를 예방한다(A.Bergeron, Y.Brindle, P. Blondin, P. Manjunath, Biology of Reproduction 77, (2007) pp120-126; A. Bergeron, P. Manjunath. Molecular Reproduction and Development, Volume 73, 2007, pp 1338-1344). 놀랍게도, Batellier et al.은 훼이 단백질 농축물, 우유 미세 여과액 및 초미세 여과액이 4 또는 15℃에서 48 및 96 시간 보관 후 종마 정자 생존률을 감소시켰음을 발견하였다(F. Batellier, M. Magistrini, J. Fauquant, E. Palmer. Theriogenology 48 (1997) pp. 391-410). 우유 유장 단백질 또는 훼이 단백질의 사용은 따라서 당업자에게 유용할 것 같지 않다.

종마 및 황소와 같은 다수 종의 정자 세포에 대하여 5℃ 또는 그 부근의 온도에서 우유 함유 또는 카세인 함유 희석 배지의 성공적인 적용에도 불구하고, 돼지 정자 세포를 위한 액체 희석 배지에 대하여 유사하게 성공적인 적용은 결코 보고된 적이 없었다. 돼지 정자 세포는 그것들이 저온 쇼크에 극도로 취약하다는 점에서 많은 다른 종들의 정자 세포와 매우 다르다. 이런 이유로, 특정 종류의 포유동물에 적용할 수 있는 정자 희석 배지가 모든 포유 동물에 적용가능하다고 추정할 수 없고 따라서 당업자는 성공한 희석 배지를 한 종으로부터 다른 종으로 쉽게 바꿀 수 없다. 돼지 정자 세포는 많은 다른 포유동물과 비교하면, 막에서 다른 조성의 인지질을 가진다. 막 내부의 낮은 콜레스테롤/인지질 비율 및 콜레스테롤의 비대칭적 분포는 돼지 정자 세포가 차가운 온도에 매우 영향받기 쉽게 하여 증가된 막 침투성과 조절된 막 공정의 상실을 야기한다. 따라서, 사정액의 15℃로의 급속냉각 또는 15℃ 이하의 냉각은 생존 능력의 상실을 초래한다. 저온 쇼크를 피하기 위해, 사전-희석된 사정액은 수 시간 동안 15℃ 이상의 온도에서 더 양호하게 남겨져서 저온 저항을 유발한다. 실행에 있어서, 정액을 더 차가운 면과의 접촉을 피하도록 분리된 캔에 수집하고 이후의 희석을 35-37℃에서 희석 배지로 행하고 그 후 정액이 17℃까지 점진적으로 냉각되도록 한다. 희석된 정액의 추가 보관은 보관 시간을 연장하기에 충분한 조건인 정액 대사가 감소되는 온도인 17℃에서 행해진다. 12℃ 이하의 보관은 생체 밖 운동성 및 막 보전에 부정적인 효과를 가진다(P. Vyt. Thesis. Examination and storage of liquid porcine semen. Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University 2007).

본 발명은 액체 돼지 정자 세포 희석 배지, 특히 훼이로부터 유도된 단백질에서 소 우유로부터의 단백질- 주로 BSA에 대한 대체물로서 의도됨-의 적용에 관한 것이다. BSA가 상기 언급한 그것의 역할을 발휘하고 우유 단백질이 BSA의 기능을 대신하는 이용분야에서 BSA를 대신하기 위한 우유 단백질(카세인도, 우유 또는 훼이로부터의 다른 단백질도 아님)의 적용은 돼지 정자 세포 희석 배지에 대해서는 보고되지 않았다. 놀랍게도, 발명자들은 액체 희석 배지에서 돼지 정자 세포의 생존 능력을 증가시키고 및/또는 유지하는 것에 대해서 긍정적인 특성을 보이는 훼이로부터 유도된 특정 단백질의 부분을 발견하였다. 훼이로부터 유도된 이 특정 단백질 부분은 간단히 기술하기 위해 Porex라 명명하였다. Porex는 정자 세포 보관 동안 운동성으로써 나타나는 바와 같이, 그리고 분만율, 더 중요하게는, 한 배의 새끼 수로써 나타나는 바와 같이 돼지 정자 세포의 생존 능력을 증가시키고 및/또는 유지하는 것에 대해 BSA보다 우수한 성능을 보여주었다.

Porex는 훼이 농축물로부터 제조된다. 적당한 조건하에서 막 여과에 의한 Porex의 제조는 본 발명에 속한다. 당업계에는 수용성 우유 또는 훼이 단백질을 분리 및 정제하기 위한 다수의 방법이 있다. 이것들 중, 여과는 잘 공지되어 있으며 널리 사용되는 기술이다(Rombaut et al. J. Dairy Sci. 90 (2007) pp 1662-1673). 유동성 유제품 여과의 당업자들은 현존하는 여과 기술을 용이하게 사용할 수 있다. Porex를 제조하기 위해, 훼이 농축물은 먼저 200 마이크로미터의 구멍 크기를 가지는 막 필터를 사용하여 마이크로 여과한다. 이는 모든 더 작은 생활성 단백질을 통과시키는 한편, 미생물 또는 변성된 단백질로부터 어떤 미립자를 포획한다. 결과된 생활성 단백질은 한외여과로써 추가로 정제한다. 한외여과는 약 3000 내지 100,000 달톤의 분자량 컷오프 범위(MWCO)를 가지는 것을 특징으로 한다. Porex는 10,000 달톤의 MWCO를 사용하여 제조된다. 10,000 달톤의 구멍 크기를 가지는 필터는 훼이로부터의 미네랄 및 락토오스를 통과시키는 한편, 생활성 단백질은 더욱 농축된다. 농축된 단백질은 이후에 분무건조된다. 본 발명을 위해 적절한 Porex를 제조하기 위한 절대적 필요요건은 훼이의 가공 동안 pH 및 알맞은 온도를 유지하는 것이다. 마이크로 여과에 앞서 훼이 농축물을 66℃에 3분 동안 유지한다. 이후에 온도를 낮추고 22℃로 유지한다. 이 방법으로 정제된 Porex는 주로 β-락토글로불린, α-락트알부민 및 글리코마크로펩티드로 구성된다. 게다가, Porex는 또한 우유 중에 훨씬 낮은 농도로 발생하는 덜 흔한 단백질, 예로써, 락토페린 및 락토페록시다제를 함유한다. 이들 단백질은 제안된 액체 돼지 정자 세포 희석 배지에서 중요한 역할을 한다. Porex의 추가의 중요한 특성은 자유 또는 비결합 지방 및 미네랄의 부재이다. Porex는 단지 단백질에 결합된 극소량의 지방 및 미네랄을 함유한다.

Porex를 제조하기 위해 상기-언급된 공정은 고도로 정제된 비변형 및 비변성된, 100 밀리리터 당 30 그램 이하로 물에 용해성인 고유의 단백질 생성물을 야기한다. 전형적인 분석은 건조 Porex가 97% 단백질, 2.3% 회분, 및 0.3% 지방을 함유함을 보여준다. 단백질 부분은 46 ± 3% β-락토글로불린, 16 ± 2% α-락트알부민, 및 26 ± 2% 글리코마크로펩티드를 함유한다. 10% 나머지 부분은 수백의 다른 단백질 중에서, 소 혈청 알부민, 락토페린, 및 락토페록시다제를 함유한다.

본 발명은 다수의 단백질의 조화된 작용에 의해 정자 세포를 보호하는 기능을 하는 Porex를 함유하는 돼지 정자 세포를 위한 희석 배지를 포함하는 개선된 조성물을 제공한다. 이들 단백질 중 하나는 광범위한 물질들, 특히 많은 금속 및 장쇄 지방산, 레티노이드, 스테로이드, 및 콜레스테롤과 같은 소수성 분자들을 결합하는 β-락토글로불린이다. β-락토글로불린의 결합 특성은 연쇄적 산화 실행을 유지하고 정자 세포막을 손상시키게 되는 산화된 지질을 제거하는 것을 보조한다. Porex에 존재하는 또 다른 단백질은 α-락트알부민이다. 이 단백질은 항균 및 항-산화 특성을 가지며 금속과 결합한다. 글리코마크로펩티드는 항바이러스 및 항균 특성을 가진다. 소 혈청 알부민은 가역적으로 다양한 기질과 결합할 수 있다. 이는 또한 자유 라디칼을 격리하고 다양한 독성의 친유성 대사산물을 불활성화한다. 알부민은 지방산, 헤마틴, 빌리루빈에 대한 높은 친화도 및 약간 음으로 하전된 방향족 화합물에 대한 광범위한 친화도를 가진다. 이는 피리독실 포스페이트, 시스테인, 글루타티온 및 다양한 금속과 공유 애덕트를 형성한다. 락토페린은 항균제(antimicrobial agent)로서의 작용을 포함하는 다중 효과를 발휘하는 철 결합 단백질이다. 락토페록시다제는 항균제로서 확인되었다. 이는 광범위한 다양한 미생물에 살균과 정균이 되는 것을 증명하였다. 이들 단백질의 조화된 작용은 우유 유장에 존재하는 다수의 다른 단백질이 보조한다.

본 발명은 특히 다수의 독성 물질 및 산화에 대해 정자 세포를 보호하는 기능을 하는 Porex를 함유하는 돼지 정자 세포를 위한 희석 배지를 포함하는 개선된 조성물을 제공한다. 이것들은 정자 세포를 손상시킬 수 있는 다수의 독성 물질이 있다. 죽은 정자 세포 및 박테리아 및 백혈구와 같은 다른 세포들로부터의 대사산물, 박테리아로부터 생성된 독성 생성물, 미량의 중금속, 및 반응성 산소종 및 반응성 질소종과 같은 자유 라디칼이다.

정자발생 동안, 사정 및 희석 배지에 현탁 후, 그리고 암컷 생식관에 도입 후, 정자 세포는 자유 라디칼(반응성 산소종 및 반응성 질소종)에 의해 손상될 수 있다. 사정액에서, 희석 배지에서 및 암컷 생식관에서 정자 세포 - 수컷 생식 기관으로부터 생김 -는 다른 산화 상황이 존재하는 경우 새로운 생화학적 환경과 직면한다. 본원에서 Porex는 정자 세포를 산화로부터 보호하는 역할을 한다. 가장 중요하게는, Porex는 다수의 단백질, 특히 β-락토글로불린 및 락토페록시다제의 항-산화 작용에 의한 세포막 성분의 산화를 보호한다.

박테리아 및 박테리아성 독소는 대부분 포피로부터, 정액 처리로부터, 또는 증량제 제제에 사용되는 물로부터 기원한다. 또한, 희석 배지를 제조하는데 사용되는 화학물질은 박테리아 및 박테리아성 오염물로부터 자유롭지 않다. 종들에 따라서, 박테리아는 정자에 직접적인 효과에 의해 또는 환경을 산성화하는 것에 의해, 정액의 질에 해로운 효과, 즉, 표준 이하의 운동성, 세포 사멸 및 응집을 가진다. 돼지 정자 세포는 박테리아 독성 생성물에 극도로 취약하다. 돼지 정자 세포는, 많은 다른 포유동물과 비교할 때 막 내에 다른 조성의 인지질을 갖는데, 이것은 그것들을 또한 박테리아성 독소에 더 민감하게 한다. 친수성 독소는 막을 통과함으로써 더 쉽게 세포에 들어갈 수 있다. 가장 주목할 만한 것은, 돼지 정자 세포의 이런 예외적인 특성(박테리아성 독소에 매우 민감함)으로 인하여, 돼지 정자 운동성 억제 분석이 미토콘드리아 손상 독소의 특이적 검출에 유용한 분석으로 개발하였다(D. Hoornstra, M. A. Andersson, R. Mikkola, M. S. Salkinoja-Salonen. Toxicology in Vitro, 17 (2003), pp 745-751). BSA는 희석 배지로부터 대사 박테리아 생성물의 흡수로 인해서 특히 정자 생존률에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 믿어진다. 동일한 방법으로, 그러나 다른 단백질의 존재 때문에 더 효과적일 수 있는, Porex는 박테리아성 독소의 작용으로부터 돼지 정자 세포를 보호한다.

본 발명은 돼지 정자 세포에 특히 유용한 정자 세포 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 보관된 정자의 향상된 생존 능력은 운동성 결정에 의해서 및 - 당업자에게 더 결정적으로 - 산업적 설정에서 대규모의 AI 후 분만율, 및 한 배의 새끼 수의 산정에 의해 나타난다.

예시의 목적을 위해, 본 발명의 조성물은 이후에 수정을 위한 돼지 정자 세포를 보존하는 분야에서 그것의 유리한 사용으로써 예시될 것이다. 하기는 본 발명을 실시하는 방법의 예로서의 기술이다. 암컷 돼지의 인공 수정과 관련된 당업자는 배지를 제조하는 기술, 컴퓨터 보조 분석을 사용하는 일반 및 전진 운동성의 결정, 정액의 희석 및 보관, 및 암컷 돼지의 수정을 안다. 추가의 필요한 정보는 하기 3개의 실시예로 주어진다.

액체 배지에서 성분들의 농도는 리터 당 단위 질량의 수에 의해 표시된다. 당업자는 본 발명의 배지가 임의의 부피로 제조될 수 있음을 인식할 것이고, 본 발명은 1 리터 부피로 제조되는 배지로 제한되도록 의도되지 않는다. 추가로, 본 발명은 주어진 제형으로 제한되도록 의도되지 않는다. 어떤 양의 Porex 또는 우유로부터 또는 Porex로부터 분리된 카세인이 아닌 어떤 단백질의 함유하는 다른 제형들도 또한 사용될 수 있다.

실시예 1. 돼지 정액 희석 배지를 27.4 그램 글루코오스, 8 그램 시트르산 나트륨, 2.4 그램 EDTA, 1.2 그램 탄산수소나트륨, 0.4 그램 염화 칼륨, 0.6 그램 겐타마이신, 9 그램 HEPES, 및 1 그램 Porex의 조합에 980 밀리리터의 물을 첨가함 으로써 제조하였다. 이 조성물을 Porex 희석 배지로 명명한다. 기준으로서 - 상업적으로 이용가능한 희석 배지와의 비교용으로 - 광범위하게 허용되는 희석 배지 Beltsville Thawing Solution(BTS)이 사용되었다. BTS 배지를 36.4 그램 글루코오스, 6 그램 시트르산나트륨, 1.25 EDTA, 1.25 탄산수소나트륨, 0.75 그램 염화칼륨 및 0.6 그램 겐타마이신의 조합에 980 ml 물을 첨가함으로써 제조하였다. 정액을 12개의 무작위적으로 선택된, 성적으로 성숙한 수퇘지로부터 수집하였다. 정자를 Porex 희석 배지 및 BTS로 희석하였고, 일반 운동성 및 전진 운동성을 정액의 희석 후 제 1, 3, 5, 9 일에 평가하였다.

일반 운동성 데이터는 하기와 같다. BTS에 대해, 확인된 양호한 일반 운동성을 가지는 정자세포의 %는 희석 후 제 1, 3, 5, 9일에 각각 71.4, 70.4, 68.9, 47.9이었다. Porex 희석 배지에 대해 양호한 운동성을 가지는 정자 세포의 %는 희석 후 제 1, 3, 5, 9일에 대해 각각 85.0, 82.9, 80.5, 및 69.6이었다.

전진 운동성 데이터는 하기와 같다. BTS에 대해 양호한 전진 운동성을 가지는 정자 세포의 %는 희석 후 제 1, 3, 5, 9 일에 대해 각각 42.3, 37.8, 36.2, 24.3이었다. Porex 희석 배지에 대해, 양호한 전진 운동성을 가지는 정자 세포의 %는 희석 후 제 1, 3, 5, 9 일에 대해 각각 76.4, 73.4, 68.5, 및 57.5 이었다.

실시예 2. 이 실시예는 상업적 AI 사업소, 및 8개의 다른 돼지 농장에서 AI에 의해 수행되는 정액 수집, 희석 및 분배를 언급한다. 돼지 정액 희석 배지를 27.4 그램 글루코오스, 8 그램 시트르산 나트륨, 2.4 그램 EDTA, 1.2 그램 탄산수소나트륨, 0.4 그램 염화칼륨, 0.6 그램 겐타마이신, 9 그램 HEPES, 및 1 그램 우 유 Porex의 조합에 980 밀리리터의 물을 첨가함으로써 제조하였다. 4주의 기간 동안(2006년 5월) 정액을 5개의 다른 돼지 품종(피트레인, 요크, 달포, 프리뫼르, 햄프셔)의 28마리의 성적으로 성숙한 수퇘지로부터 수집하였다. 정자를 Porex 정자 희석 배지로 희석시키고 890마리의 암컷을 인공수정시켰다. 확인된 평균 분만율은 92.0%이었고, 확인된 평균의 한 배의 새끼 수는 13.8이었다.

실시예 3. 이 실시예는 상업적 AI 사업소 및 8개의 다른 돼지 농장에서 AI에 의해 수행되는 정액 수집, 희석 및 분배를 말한다. 돼지 정액 희석 배지를 27.4 그램 글루코오스, 8 그램 시트르산 나트륨, 2.4 그램 EDTA, 1.2 그램 탄산수소나트륨, 0.4 그램 염화칼륨, 0.6 그램 겐타마이신, 9 그램 HEPES, 및 1 그램 Porex의 조합에 980 밀리리터의 물을 첨가함으로써 제조하였다. 4 주의 기간 동안 (2006년 6월) 정액을 5개의 다른 돼지 품종(피트레인, 요크, 달포, 프리뫼르, 햄프셔)의 28마리의 성적으로 성숙한 수퇘지로부터 수집하였다. 정자를 Porex 희석 배지로 희석하였고 930 마리의 암컷을 인공수정시켰다. 확인된 평균 분만율은 91.0%이었고, 확인된 평균의 한 배의 새끼 수는 13.5이었다.

실시예 2 및 3은 분만율 및 한 배의 새끼 수가 돼지 사업에서 경제성 변수이기 때문에 당업자에게 실시예 1보다 더 결정적인 정보를 제공한다. 분만율 및 한 배의 새끼 수는 농장 관리에 따라 다양하기 때문에, 동일한 농장에서 희석 배지의 비교를 행하였다. 확인된 한 배의 새끼 수는 실시예 1에서 기술한 표준 BTS 희석 배지로 확인된 한 배의 새끼 수보다 0.6 마리 더 많았다. 확인된 평균 분만율은 BTS 희석 배지와 비교하여 Porex 희석 배지가 4% 더 높았다.

상기 언급한 실시예에 기술한 작업 후, 2006년 7월 1일부터 2007년 12월 25일의 기간 동안 80,000회 수정을 실시예 2 및 3에 기술한 Porex 희석 배지를 사용하여 행하였다. 94.0 %의 평균 분만율 및 14.1 마리의 평균 한 배의 새끼 수를 확인하였다. 살아서 태어난 돼지의 수는 평균 13.4 마리였다. 살아서 태어난 돼지의 수는 돼지 성장 사업에서 가장 중요한 경제적 지표이다. 표준 희석 배지(BTS)를 사용하여 네덜란드에서 살아서 태어난 돼지의 수는 소프트웨어 Pigmanager를 기초로 한 Agrovision에 의해 공개된 데이터로부터 얻을 수 있다 (http://www.agrovision.nl/files/ksp20062007website01.pdf). 2006년 7월 1일부터 2007년 6월 30일의 기간 동안, 86%의 분만율, 13.1 마리의 한 배의 새끼 수, 및 12.5 마리의 살아서 태어난 돼지의 수가 확인되었다. 이는 Porex 희석 배지가 널리 사용되는 BTS보다 더 경제적인 희석 배지임을 보여준다.

본 발명의 구체예에 따라, 발명자들은 돼지 정자 세포의 생존 능력이 Porex를 함유하는 배지에서 희석에 의해 증가되고 및/또는 유지될 수 있어서 정자 세포의 수정 능력이 연장된 시간의 기간 동안 증가되고 및/또는 유지될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 BSA를 상표명 Porex인 우유 유장 단백질로 대체함으로써 더 경제적이고 우수한 희석 배지를 발견하였다.

결론

비록 본 발명의 단지 대표적인 구체예가 상기에 상세하게 기술되었다 할지라도, 당업자들은, 본 발명의 새로운 교시 및 이점으로부터 실질적으로 벗어나지 않고 많은 변형들이 가능함을 용이하게 인식할 것이다. 따라서, 모든 이러한 변형들 은 하기 청구항에 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (36)

1. Porex로 명명된 소 우유 단백질 부분을 함유하고, 그것의 제조는 본원에 기술된 훼이를 기초로 하는, 정자 세포 생존 능력을 유지하고 및/또는 증가시키는 것을 목적으로 한 액체 돼지 정자 세포 희석 배지를 포함하는 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 우유로부터 분리된 카세인 이외의 단백질을 함유하는, 정자 세포 생존 능력을 유지하고 및/또는 증가시키는 것을 목적으로 한 액체 돼지 정자 세포 희석 배지를 포함하는 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 7 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 7 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 7 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 포유동물 젖으로부터 분리된 카세인 이외의 단백질을 함유하는, 정자 세포 생존 능력을 유지하고 및/또는 증가시키는 것을 목적으로 한 액체 돼지 정자 세포 희석 배지를 포함하는 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 13 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 13 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 13 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 13 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. Porex로 명명된 소 우유 단백질 부분을 함유하고, 그것의 제조는 본원에 기술된 훼이를 기초로 하는, 돼지 생식 세포 또는 돼지 배아와 같은 세포의 군을 배양하고 사용하는 것을 목적으로 한 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제 19 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 19 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 19 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 19 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 돼지 생식 세포 또는 돼지 배아와 같은 세포의 군을 배양하고 사용하는 것을 목적으로 한, 소 우유로부터 분리된 카세인 이외의 단백질을 함유하는 조성물.
26. 제 25 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 제 25 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
28. 제 25 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
29. 제 25 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
30. 제 25 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
31. 돼지 생식 세포 또는 돼지 배아와 같은 세포의 군을 배양하고 사용하는 것을 목적으로 한, 포유동물 젖으로부터 분리된 카세인 이외의 단백질을 함유하는 조성물.
32. 제 31 항에 있어서, 세포는 말 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 31 항에 있어서, 세포는 소 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 제 31 항에 있어서, 세포는 양 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 31 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 31 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.